Summary
Decellularized 연골 파생 된 건설 기계 osteochondral 조직을 재생 하 가이드 연골 수리를 발판으로 및 수단으로 사용할 수 있습니다. 이 종이 decellularization 프로세스를 자세히 설명 하 고 생체 외에서 설정에서 이러한 건설 기계를 사용 하 여 제공 합니다.
Abstract
Osteochondral 결함 기능 소리 뼈와 연골 조직을 재생 하기 충분 한 내장 복구 용량을 부족 합니다. 이 정도로 연골 연구 재생 장비의 개발에 집중 했다. 이 문서는 완전히 말 기증자에서 오는 자연 연골 세포 외 매트릭스에서 파생 된 장비의 개발을 설명 합니다. 장비의 잠재 애플리케이션으로 이식 연골 수리, osteochondral 조직 공학, 생체 외에서 모델 연구 조직 형성을을 제공 하 고 발판으로 봉사에 대 한 생산. Decellularizing 조직, 여 기증자 세포 제거 됩니다, 하지만 많은 천연 생리 활성 신호 유지 될 것으로 생각 되. 종합적으로 생산된 비 계에 비해 자연 비 계를 사용 하 여의 주요 장점은 고분자의 아무 더 기능화 드라이브 osteochondral 조직 재생 하는 데 필요한입니다. 연골에서 파생 된 매트릭스 건설 기계는 vivo에서 그리고 생체 외에서 설정에서 뼈와 연골 조직 재생을 위해 사용할 수 있습니다.
Introduction
충격적인 사건으로 인 한 무릎 관절 연골 결함, 불편으로 이어질 수 있습니다 그리고 특히 젊고 활동적인 인구1,2,3의 생활에 큰 영향을 미칠 수 있습니다. 또한, 젊은 나이에 연골 손상을 인생4나중에 관절염의 더 급속 한 발병 될 수 있습니다. 현재, 무릎의 일반화 된 관절염에 대 한 유일한 구조 치료는 합동 보충 수술입니다. 연골은 hypocellular, aneural, 및 avascular 조직, 재생 능력은 심각 하 게 제한 됩니다. 따라서, 재생 의학 접근은 원조 하 고 네이티브 조직의 재생 능력을 자극 후 모색. 이 목적을 위해 건설 기계 설계 되며 신체의 기본 셀5중 세포 운반대로 또는 차별화와 조직의 재생을 incites 유도 물자로 사용.
Decellularized 건설 기계 재생 의학6내에서 널리 공부 되었습니다. 그것은 했다 약간의 성공을, 예를 들어 피부7,8, 복 부 구조 및 힘 줄9의 재생성을 방 조에. Decellularized 건설 기계를 사용 하 여의 장점은 그들의 자연적인 근원 및 그들의 능력을 모두 유치 하 고 조직 수리6,10에 필요한 적절 한 혈통으로 세포 분화를 유도 하는 생리 활성 신호 유지. 또한, 세포 외 기질 (ECM)은 자연 소재 decellularization 세포 또는 유전자 콘텐츠를 제거 하 여 잠재적인 면역 반응을 방지 하는 때문에, 생체 적합성 및 biodegradability에 관한 문제는 극복 됩니다.
연골에서 파생 된 매트릭스 (CDM) 건설 기계 mesenchymal stromal 세포11시드 때 체 외 실험에서 잠재적인 큰 chondrogenic을 보여왔다. 또한, 이러한 건설 기계 vivo에서 설정12소성 위치에 endochondral 나오고 통해 양식 뼈 조직에 잠재력을 보여왔다. CDM 건설 기계 가이드의 형성 둘 다 뼈 고 연골 조직, 이러한 건설 기계 연골 수리 이외에 osteochondral 결함 수리에 대 한 잠재적인 취소 될 수 있습니다.
이 문서에서는 설명 합니다 양에서 적응 프로토콜 외. (2010)13 말에서 decellularized CDM 장비의 생산에 대 한 억압 연골. 이 건설 기계 콜라겐 유형 II에 셀, 없는 풍부 하 고 decellularization 후 어떤 있다 (개 그)를 포함 하지 않습니다. 이러한 건설 기계를 사용 하 여 (osteo) chondral 결함 수리에 생체 외에서 그리고 vivo에서 실험을 수행할 수 있습니다.
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Protocol
이 프로토콜에 대 한 말 억압 연골 관절염 보다 다른 원인에서 죽 었다는 말에서 얻은 했다. 조직 기관 윤리 규정에 따라 소유자의 허가 함께 얻은 것입니다.
참고: 이 프로토콜에 체 외 조직 문화 플랫폼 등 응용 프로그램에 대 한 또는 vivo에서 이식 재생 의학 전략에 대 한 사용할 수 있는 decellularized 말 연골에서 장비의 제조를 설명 합니다. 설명 시간 순서 대로 효소 처리 단계를 수행 해야 합니다.
1. 기증자 (시체) 관절에서 관절 연골의 수확
- 앞서 수확 단계 준비 솔루션을 세척, 멸 균 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS), 100 U/mL 페니실린, 100 µ g/mL 스, 및 1% (v/v) 암포 B. 보충 구성 된 연골의 1 L
- 때문에 기증자는 병원 균을 수행할 수 있습니다 전체 수확 절차 중 장갑 및 실험실 외 투를 착용 합니다.
- 연골 격리에 대 한 손상 (시체) 공동 얻을.
참고: 이 시점에서, 관절 주위 피부는 그대로 이다. 말에서 얻은 말 억압 연골이이 프로토콜에서 사용 되었다 그러나 다른 종에서 다른 관절을 사용할 수 있습니다. - 메스와 수술 족집게를 사용 하 여 관심 있는 공동 영역 주위에 피부를 제거 합니다. 또한, 기본 관절 손상 없이 과도 한 지방과 근육 조직이 필요한 경우 제거 합니다. 필요에 따라 생물 안전 캐비닛을 준비 시체를 전송 합니다.
- arthrotomy, 즉 수행, 공동의 분리 먼저 공동 확장 및 관절의 굴곡을 수행 하 여 articulates 위치를 정의 합니다.
- 조심 스럽게 지방, 근육, 그리고 힘 줄 메스와 공동 영역을 열고 수술 트위터의 더 많은 레이어를 제거 합니다.
- 공동 구멍을 도달 하는 절 개를 확인 합니다.
참고: 공동 구멍은 정확한 절 개를 수행할 때 구멍에서 똑 수 있는 활 액 액체, 가득 합니다. - 여 합동을 완전히 함께 관절을 유지 하는 힘 줄을 통해 절단 하 여 계속 합니다.
- 거시적인 손상 연골을 검사 합니다.
참고: 관절 연골에는 광택 하 고 부드러운 외관 또는 분명 젖어, clefts, 또는 결함이 있는 경우 연골을 삭제 합니다. - 마찰의 뼈에서 연골을 제거 하는 살 균 메스를 사용 합니다. 마찰의 뼈 연골 (그림 1)의 깊은 영역 제거까지 잘라. 연골 밖으로 건조 하지 않도록 하려면 정기적으로 연골 연골에 솔루션을 세척 똑.
참고: 이 시점에서 연골 조각의 크기는 중요 하지 않습니다. - 세척 솔루션 (그림 2A) 이전 준비 연골을 포함 하는 50 mL 튜브에 연골 조각을 수집 합니다.
- 관심의 모든 영역에서 연골을 수집 후 스냅 연골 조각 5 분 액체 질소에서 동결.
- 50 mL 튜브로 연골 조각을 전송 및 즉시 동결 건조 기에서 24 h에 대 한 연골 슬라이스를 lyophilize. 동결 건조 기에서 설정 약 0.090 mbar 얼음 콘덴서는-51 ° C (그림 2B).
- 추가 사용까지 연골 조각 실 온에서 건조 한 장소에 저장 합니다.
참고: 비 계 형성의 지점 솔루션 및 연골 필요가 없습니다 준비 하 여 살 균 방식에서으로 처리.
2. 만들기 Decellularized 연골 입자
- 액체 질소에서 동결 건조 된 연골 조각을 submerse합니다
- 수동으로 또는 밀링 기계에 직접 샘플을 갈기. 연골 조각 손으로 연 삭, 박격포 및 방 앗 공이 사용 하 여 고 분쇄 (그림 2C 및 2D) 때까지 약 45 분에 대 한 슬라이스를 갈기. 자동 연 삭 할 때 최대 1 분, 스냅-냉동 연골 조각 분쇄 된 때까지 몇 초 동안 미리 설정된 속도에 밀링 기계를 사용 합니다.
참고: 액체 질소를 추가 하 여 박격포 또는 융기의 분쇄 구획을 멋진 사전. 밀링 기계를 사용 하면 모든 입자는 지상, 그리고 아무 입자 연 삭 구획의 바닥에 남아 있는지 확인 합니다. - 0.71 m m 매쉬의 크기와 체를 사용 하 여 큰 부품의 제거를 연골 입자 체질.
- 실 온에서 건조 한 장소에 입자를 저장 합니다.
3. 효소 Decellularization 트립 신으로 0.25%-EDTA
- EDTA와 100 U/mL 페니실린, 100 μ g/mL 스, 1% (v/v) 암포 B. 저장소 솔루션 4 ° c.에 보충으로 0.25 %trypsin 이루어져 소화 솔루션 준비
참고: Trypin은 연골 조직에 있는 단백질을 저하 효소 이다. 이 효소 단계는 조밀한 연골 구조를 열 것 이다. - 50 mL 튜브 튜브 당 약 7.5 mL의 볼륨까지 분쇄 연골 입자 채우십시오.
-
새로 고치 소화 솔루션 마다 4 h 동안 총에서 24 h에 대 한 37 ° C에서 준비 된 소화 솔루션 연골 입자를 품 어.
- 먼저, 연골 입자를 포함 하는 각 50 mL 튜브에 소화 솔루션의 30 mL를 추가 합니다.
- 그런 다음 모든 입자는 효소 솔루션에 노출 되도록 소용돌이 또는 피펫으로 사용 하 여 입자를 resuspend.
- 롤러에 37 ° C에서 4 h에 대 한 샘플을 품 어.
- 소화 솔루션을 새로 고치려면, 연골 입자의 침전을 3113 x g 20 분에 대 한 튜브 원심. 폐기는 상쾌한.
참고: 상쾌한 모든 트립 신 잠복기와 명확 하 게 될 것 이다. - 3.3.1–3.3.4 단계를 반복 하 여 입자 4 h의 6 주기 위한 소화 솔루션 incubated 되어 있다.
- 마지막 주기 이후 centrifuging 후는 상쾌한을 제거 하 고 두 번 솔루션을 세척 하는 연골의 30 mL에 입자를 세척 합니다. 3113 x g는 세척의 각각 사이 20 분 동안 입자 원심
4. 효소 Decellularization Nuclease 치료
- 10 mM Tris HCl 해결책 pH 이온된 수 7.5에서 준비 합니다.
- 50 U/mL deoxyribonuclease 및 1 U/mL ribonuclease A nuclease 솔루션을 얻기 위해 Tris HCl 버퍼에 추가 합니다.
참고: 이 단계는 특히 deoxyribonucleases와 ribonucleases를 저하 수행 됩니다. - 연골 입자 (3.4 단계)에서 솔루션을 세척 하는 연골을 제거 하려면 3,113 x g에 20 분 동안 원심 하 고는 상쾌한을 제거 합니다.
- 연골 입자에 nuclease 솔루션의 30 mL를 추가 하 고 모든 입자 nuclease 솔루션에 노출 되어 있는지 확인 하 고 솔루션을 통해 입자를 저 어.
- 4 h 37 ° c.에 대 한 롤러에 샘플을 품 어
- 3,113 x g 에서 20 분 동안 연골 입자 centrifuging 여 nuclease 솔루션을 제거 하 고 삭제는 상쾌한.
- 연골 입자에 10 mm Tris HCl 솔루션 deoxyribonuclease ribonuclease A 없이 30 mL를 추가 하 여 샘플을 씻으십시오. 입자를 resuspend 하 고 실 온에서 20 h에 대 한 롤러에 샘플을 둡니다.
5. 세제 Decellularization
- Octoxynol-1 PBS에서 1% (v/v)을 용 해 하 여 세제 솔루션을 확인 합니다.
- 3,113 x g 에서 20 분 동안 centrifuging와 삭제는 상쾌한 연골 입자에서 Tris HCl 솔루션을 제거 합니다.
- 연골 입자에 준비 된 1% 세제 용액 30 mL를 추가 합니다. 솔루션의 거품을 피하기 위해 부드럽게 연골 입자 resuspend
참고: 이 단계는 세포 막 분해. - 롤러는 롤러에 실 온에서 24 h에 대 한 샘플을 품 어.
- 세제 솔루션 3,113 x g 에서 20 분 동안 원심 분리 하 여 제거 하 고 삭제는 상쾌한.
-
Decellularization 솔루션의 나머지의 모든을 제거 하려면 솔루션을 세척 하는 연골의 30 mL에 8 h 6 사이클에서 연골 입자를 씻어. 실 온에서 롤러 세척을 수행 합니다.
- 다음 세척을 변경 하려면, 원심 3,113 x g에서 20 분 동안 정지 하 고 삭제는 상쾌한 신선한 연골 세척 솔루션 추가.
- 마지막 세척 튜브에 두고-80 ° c.에 decellularized 연골 입자 저장
6. Decellularized 입자에서 건설 기계를 만들기
- 입자-80 ° C에 저장 된, 하는 경우는 건설 기계를 만들기 전에 따뜻한 물에 연골 입자를 포함 하는 닫힌된 튜브를 녹여.
- 원통형 금형, 예를 들어 8 m m의 직경 2 cm의 높이와 플라스틱 병에 작은 국자와 연골 입자를 전송 합니다.
- 플라스틱 금형에 연골 입자를 배치할 때 모든 공기-거품 밖으로 비 계에 구멍을 피하기 위해 누르고 가장자리까지 금형을 채우기.
참고: 그것은 발판에 있는 균열으로 이어질 수 있는 비 계 형성 후 건설 기계 금속 금형을 더 어려울 것 이다. - -20 ° c.에서 10 분 동안 연골 입자와 금형을 고정
- 동결 건조 기에서 24 h에 대 한 그들의 금형 내 연골 건설 기계를 lyophilize.
- 후 동결은, 금형 (그림 3) 비 계 하 고 자외선 (UV) 빛 30 cm 거리와 365와 함께 그들을 상호 링크 nm 하룻밤.
- 생체 외에서 세포 배양 또는 vivo에서 주입은 건설 기계를 사용, 가스로, 예를 들면, 에틸렌 산화물 (토) 건설 기계를 소독.
참고: EtO 살 균은 외부 자에 의해 수행 됩니다.
7. 조직학 Stainings와 Decellularized 장비의 특성
참고: 완전 한 decellularization를 보장 하 고 연골의 나머지 자연 문자 시각화 하 되며 고 오신 (H & E) 되도록 얼룩을 포함 하 여 어떤 실험에는 건설 기계를 사용 하기 전에 여러 조직학 stainings를 수행 decellularization, Safranin-O 잔여 개 그 존재를 시각화 하기 위해 얼룩, 교원 질 유형 I immunohistochemistry 콜라겐 콘텐츠 및 콜라겐 유형 II immunohistochemistry 콜라겐 콘텐츠를 구분 하는 것.
- 메스와 함께 약 3 m m의 얇은 조각에는 건설 기계를 절단.
참고: 경우는 건설 기계는 큰 또는 작은 크기에, 탈수 사이클의 기간 적응 시킬 필요가 있다. - 4% (w/v) alginate 방울에는 건설 기계를 포함 하 고 추가 비슷한 양의 3.7% 버퍼링 되지 않은 포 르 말린 20 m m CaCl2를 포함 하 여 교차 연결 유도.
참고: Alginate 포함 파라핀 포함 이전 세척 단계에 비해 더 엄격한 비 계 조각을 합니다. 경우는 건설 기계는 셀-시드 또는 vivo에서 이식, alginate 포함 필요 하지 않습니다는 장비의 구성 셀에 의해 ECM 설립으로 인해 충분히 방지 될 것 이다. - 등급된 에탄올 시리즈에 그들을 배치, 70%, 96%의 한 시간 주기 시작, 96%, 100%, 100% 에탄올, 크 실 렌의 2 개의 1 시간 주기 및 60 ° c.에 파라핀의 2 개의 1 시간 주기 끝나는 샘플을 탈수
- 탈수, 후 형에서 샘플 파라핀 포함 하 고 샘플을 진정.
- 5 μ m 두께의 조각에 톰으로 샘플을 잘라.
- 얼룩이 지기 전에 반환 된 등급된 에탄올 시리즈에 그들을 배치 하 여 샘플을 rehydrate. 100%, 95%, 및 70% 에탄올 세척 당 3 분의 2 세척 뒤 5 분 동안 크 실 렌의 두 세척 시작. 마지막으로, 샘플 3 시간 2 분 동안 물에에서 씻는 다.
참고: Alginate를 사용 하 여 샘플 파라핀 포함에 대 한 처리를 하는 경우 재 파라핀 섹션의 이전 10 m m 구 연산 산 alginate 씻어 있는지 확인 합니다. - 얼룩 hematoxylin와 오신, 샘플 Safranin O, 콜라겐, 그리고 콜라겐 II 이전 설명된11.
8. 정량 분석 Decellularized 장비의 특성
- 앞에서 설명한11장비의 papain 다이제스트를 얻습니다.
- 형광 기반 DNA 정량화 키트 완전 한 decellularization를 위해 장비의 이중 가닥 DNA 콘텐츠를 측정 하는 시험을 수행 합니다. 제조업체에서 제공 하는 프로토콜을 따릅니다. 발판의 건조 중량 당 DNA의 양을 표현 한다.
- 앞에서 설명한11비 계, 내 개 그의 나머지를 계량 블루 dimethylmethylene 분석 결과 수행 합니다. DNA 당 개 그에 금액을 표현.
9. Decellularized 장비의 시드
- 3 m m로 6.7 단계에서 소독된 건설 기계 두꺼운 조각 잘라.
- 6 잘 플레이트의 별도 우물에 건설 기계를 전송 합니다.
- 발판 위에 매체의 pipetting 1 mL로 세포 배양 매체와 건설 기계를 rehydrate 하 고 30 분 동안 담가 보자 chondrocyte 또는 중간 엽 줄기 세포 (MSC) 확장 매체를 사용 하 여.
참고: 동일한 매체를 사용 하 여 시드할 수 세포의 세포 배양에 관해서는 비 계 재에 대 한. 10% 열 비활성화 태아 둔감 한 혈 청 (FBS), 100 U/mL 페니실린, 100 μ g/mL 스와 10 ng/mL 섬유 아 세포 성장 인자-2 (FGF-2) Dulbecco의 수정된 미디어 (DMEM) Chondrocyte 확장 매체에 의하여 이루어져 있었다. MSC 확장 매체 구성 최소 필수 중간 알파 (-MEM) 10% 열 비활성화 FBS, 0.2 m m L-아 스 코르 빈 산 2 인산, 100 U/mL 페니실린, 100 μ g/mL 스, 그리고 10 ng/mL FGF-2. - 3 m m의 높이와 직경 8 mm 각 비 계에 대 한 필요한 볼륨은 매체의 100 μ에서 3 x 106 셀을 준비 합니다.
참고: 다른 종에서 여러 세포 유형 시드에 사용할 수 있습니다. Chondrocytes 또는 중간 엽 기질 세포를 사용할 경우 앞에서 설명한11로 셀을 분리. Chondrocytes, 사용 하는 경우는 그들이 하지 확장 되어 P1 통행 과거 dedifferentiated chondrocytes의 수를 최소화 하려면 있는지 확인 합니다. 중간 엽 기질 세포를 사용할 경우 앞에서 설명한14멀티 혈통 차별화에 대 한 그들의 능력에 테스트 되어야 한다. - 피펫으로 50 μ의 세포 현 탁 액 미리 젖된 비 계 위에 준비 하 고 37 ° c.에 1 시간에 대 한 비 계를 품 어
- 조심 스럽게 아래로, 세포 현 탁 액의 피펫으로 나머지 50 μ 거꾸로 비 계 발판의이 측면에 바뀌고 1 h 37 ° c.에 품 어
- 부 화, 후 웰 스, 매체의 3 mL를 추가 하 고 37 ° c.에 셀 시드 건설 기계 문화 셀의 분리를 피하기 위해 부드럽게 문화 접시를 처리 합니다.
- 실험에 필요한 시간 동안에 건설 기계를 문화 고 2-3 회 매체를 변경 합니다. 피펫으로 천천히 그리고 최대한 발판에서 떨어져.
- 셀 시드 발판의 경작, 후에 건설 기계를 반으로 잘라 고 조직학 및 생화학 분석에 대 한 그들을 처리 합니다.
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Representative Results
조직학 stainings를 사용 하 여 뿐만 아니라 DNA 잔재의 양을 측정 하 DNA 정량화를 사용 하 여 CDM 장비의 decellularization 항상 확인 되어야 한다. 부족 한 decellularization vivo에서 설정15,,1617결과 영향을 주는 원치 않는 면역학 응답 발생할 수 있습니다. 이 특정 decellularization 메서드에 대 한 DNA 검출 범위 13.6 ± 2.3 ng/mg DNA/드라이 무게에서 시작 되었다 (n = 3). 이 프로토콜을 사용 하 여 전체 decellularization는 풍부한 콜라겐 유형 II (그림 4C) 이며 세포 (그림 4A) 나 개 (그림 4B) 그 발판의 생산으로 이어질 것입니다. 건강 한 말 연골 비교, Safranin-O (그림 5A)과 콜라겐 II (그림 5B)에 대 한 얼룩으로 표시 됩니다.
발판은 거시적 균질 다공성을 표시 해야 합니다. 기포는 비 계에 쉽게 감지 큰 구멍으로 이어질 것입니다 하 고 따라서, 신중 하 게 제거. 발판에 이러한 큰 구멍 기계적 성질에 해로운 영향을 미칠 하 고 휘도가 셀 첨부 파일 시드 시 발생할 수 있습니다. 발판의 성공적인 생산 또한 적어도 24 h;에 대 한 지속적인 동결 단계를 포함 한다 이 흰색 모양 (그림 3) 비 계를 이어질 것입니다. 부족 한 동결은 경우는 건설 기계 노란 색깔 있고 아니 분명 모 관찰 될 수 있다.
Vivo에서 사용 되는 비 계에서 응용 프로그램 및 생체 외 세포 시드, 세포 기능, 뿐만 아니라 비 계, 셀 통합 표시 되어야 합니다. 여기, 건설 기계 4 (그림 6A-D)와 6 (그림 6E-H) 후 ECM 생산 MSCs와 시드 했다 생체 외에서 배양의 주. 개 그, 콜라겐 II, 그리고 주변 콜라겐의 형성, 나 뿐만 아니라 세포의 존재를 표시 했다. 또한, 콜라겐 II의 특이성은 그림 5B, 어디 연골만 하지 뼈는 스테인드 콜라겐 II는 osteochondral 플러그에 대 한 긍정적인에 표시 됩니다.
그림 1: 전체 두께 연골을 제거 후 말 무릎. 연골은 메스를 사용 하 여 잘라낼 수 없는 석 회 질된 연골 계층에이 때까지 메스를 사용 하 여 condyles에서 제거 됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2: 순차적 단계 만드는 연골에서 파생 된 매트릭스 입자 decellularized. (A) 연골 슬라이스는 condyles에서 제거 된 항생제 주입 용액에 세척 된다. (B) 연골 슬라이스는 동결 건조 된, 그리고 지금 백색과 종이 같은 외관. (C) 스냅-냉동 동결 건조 된 연골의 바로 전에 (D) 수행된 분쇄 연골 입자 손을-밀링 박격포 및 방 앗 공이 사용 하 여 이다. D 단계 밀링 자동으로 할 수 있습니다. 이 그림은 벤더의 외11에서 수정 되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3: 최종 제품, decellularized 연골 파생 매트릭스 비 계. 이 원통형 비 계 높이 2 c m 이며 직경 8 mm 있다. 발판 분명 다공성 구조를 하고있다. 왼쪽 및 오른쪽 사진 두 가지 다른 각도에서 비 계를 표시 합니다. 참고 큰 구멍이 있는지 발판의 표면에 모든 공기 방울의 동결은 전에 제거 했다. 이 그림은 벤더 외.11에서 수정 되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 4: 발판의 조직학 특성화. (A) H & E 다양 한 크기의 쇼 ECM 입자와 셀의 부재를 얼룩. (B) decellularization 과정에 없는 개 그 유지 되었지만 보여줍니다 Safranin O 얼룩. (C) 콜라겐 유형 II immunolocalization decellularized 입자는 풍부한 콜라겐 유형 II에에서 보여준다. 스케일 바 = 500 µ m. 이 그림은 벤더 외.11에서 수정 되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 5: 말 건강 한 연골의 조직학 표현. (A)는 osteochondral 플러그 Safranin O와 빠른 그린 쇼 뼈 개 그 (녹색), 개 그 (빨간색)와 연골 사이 석 회 질된 연골 레이어 없이 스테인드. (B) 콜라겐 II 스테인드 osteochondral 플러그 얼룩 연골 그러나 뼈 아닙니다. 스케일 바 = 500 µ m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 6: 중간 엽 기질 세포를 사용 하 여 문화의 4 개 그리고 6 주 후 발판에 네오-매트릭스 형성. 4 (A D) 문화 (E-H) 6 주 후에, 새로 형성된 된 매트릭스는 셀 (A + E), 콜라겐 II (B + F), 풍부와 개 그 (C + G), H & E, 콜라겐 II와 Safranin O stainings, 각각 관찰 될 수 있습니다. 또한, 콜라겐 나은 현재 4 (D)와 6 (H) 주 후 발판의 주변에서. 주변에서 매트릭스 증 착의 금액으로 세포 밀도 높은 수준 이다. 스케일 바 = 500 µ m. 이 그림은 벤더에서 수정 된 외11. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
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Discussion
관절 연골의 ECM은 매우 조밀 하 고 아주 다른 효소 치료에 탄력. 이 문서에서 설명 하는 여러 단계 decellularization 프로토콜 같은 저항을 해결 하 고 성공적으로 decellularized 행렬을 생성 합니다. 달성 하기 위하여는, 과정은 몇 일 동안 걸쳐. 다른 유형의 조직18, 많은 decellularization 프로세스를 제안 하 고이 문서 연골의 decellularization에 대 한 적합 한 프로토콜을 설명 합니다. 그러나이 프로토콜에서는,, 모든 셀을 제거 하기 위하여 세제 단계 효소 치료를 수행 하는 데 필요한입니다. DNA의 양을 트립 신와 함께 치료를 포함 하는 처음 몇 단계에서 현저 하 게 점감 하 고이 단계를 나가는 하지 귀 착될 것 이다 적절 한 decellularization11.
이 프로토콜은 말 연골 조직의 decellularization 기반 참고. 사용 되는 효소 솔루션의 활동 말 chondrocytes의 적절 한 제거에 대 한 충분 한 발견 됐다. 그러나, 종에 걸쳐 매트릭스 성분의 보존에도 불구 하 고 프로토콜 자연스럽 게 chondrocytes19거주 금액 차이로 인해 다른 동물에서 연골의 decellularization에 대 한 조정할 수 있을 수 있습니다. 예를 들어 작은 동물의 연골 높은 셀 콘텐츠 알려져 있으며, 따라서 해야 더 적극적인 decellularization 과정. Decellularized 건설 기계를 만드는 말 연골을 선택 하기 위한 특정 이유는 두께, 세포 밀도, 그리고 생 화 확 적인 메이크업20그 말과 인간의 연골 쇼 분명 닮았다.
재현할 수 제품을 보장 하기 위해, 몇 가지 평가 기준을 완료 decellularization 달성 여부를 결정 하는 것이 중요 있을 수 있습니다. 이 프로토콜에는 H & E 염색와 생화학 정량화는 최종 제품에 DNA의 잔여 금액을 평가 하 사용 되었다. 다른 연구원은 또한 200의 최대 나머지 DNA의 크기를 결정 제안 했다 품질에 대 한 길이에서 혈압 제어21또는 미만 50 ng/mg의 잔여 DNA 양을 건조 조직 무게18,22. 관계 없이, 프로토콜을 변경 해야 합니다 항상 추적 조직학 평가와 나머지 ECM 제품 뿐 아니라 decellularization의 효과 결정 하기 위해 양적 분석 실험.
이 프로토콜의 주요 제한은, 트립 신에 노출 관련 된 철저 한 decellularization 절차 개 그의 광범위 한 손실로 연결입니다. 트립 신 개 그 쪼개 다 하지 않습니다, 비록 개 그의 손실에 대 한 이유 앵커 또는 발언 금지를 캡슐화 하는 단백질 절단형 트립 신에 의해 연골 조직의 최대 개방을 수 있습니다. ECM 구성 요소 개 그 같은 관절 연골에서 물을 유지에 대 한 중요 하 고 따라서 조직4의 biomechanical 복구에서 중요 한 역할. Decellularization 과정을 통해 개 그의 손실을 줄이기 위해 목표로 프로토콜 decellularization 프로세스의 철저를 영향을 줍니다.
Decellularization, 후 셀 통합 및 기능 셀 시드 건설 기계에 표시 되었습니다. 이전 연구는 중간 엽 기질 세포11풍부한 매트릭스 증 착에 비교 될 때 특히 chondrocytes이 비이 계에 의해 매트릭스 생산, 만족 하지 않습니다 보이고 있다. 으로 같은 연골 조직을 발판에 입금 됩니다,이 새로운 매트릭스는 장비의 나머지를 침입 하기 전에 발판의 주변에 먼저 입금 일반적으로 됩니다. 이 셀 풍부한 센터, 보다는 오히려 셀 풍부한 주변 자주는 조직학 조각에 명확 하 게 관찰 될 수 있다 (그림 6) 본. 그러나 때 영양소 교류를 강화 하는 관류 bioreactors 시드 셀 사용 하 여이 효과 줄일 수 있습니다. 매트릭스 증 착 발생는 건설 기계 또한 기계적으로 더 일관 되 고 덜 취 성 되 고 번지르르한 외모를 가정 합니다. 이와 같이, 그들은 잘릴 수 있다 쉽게 붕괴 하지 않고 메스를 사용 하 여. 새로 형성된 된 매트릭스의 속성 조직학 stainings와 양적 분석을 사용 하 여 평가할 수 있습니다. 아니 개 그는 decellularization 과정 후 남아 있다, 양이 많게 측정 될 수 있다 개 그의 모든 neosynthesis의 제품 될 것입니다.
이 decellularization 프로토콜을 사용 하 여 생산 하는 건설 기계는 상용 솔루션을 제공 하 고 이식 전에 셀 시드의 필요성 없이 이식 될 수 있다. 그러나, (osteo) chondral 결함에 대 한 치료로 적용, biomechanical 속성 관절 로드의 초기 단계에서 구조물의 들여쓰기의 기회를 줄이기 위해 향상 된 해야한다. 상단, 또는 다른 강화 전략에 보호 층을 가진 공동 이식 구현 할 수 있습니다. 미래에, 더 상세 프로토콜의 발판의 재생 잠재력을 강화 수 있습니다. 예를 들어, , 개 그, 콜라겐 섬유 방향, 또는 다른 생체 재료와 함께의 보전이 건설이 기계를 강화 하기 위해 고정 수 있습니다 도움이 될 개선 하 고 매끄럽게 재생 관절 표면 수 있도록. 따라서, 이러한 건설 기계 (osteo) chondral 결함. 의 치료에 대 한 재생 이식의 다음 세대의 구성 요소로 서 역할을 할 수 있습니다.
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Disclosures
저자 들은 아무 경쟁 금융 관심사 선언 합니다.
Acknowledgments
저자는 건설 기계 생산에 W. 부팅을 인정 하 고 싶습니다. K.E.M. 벤더 대학 의료 센터에서 알렉산더 Suerman Stipendium에 의해 지원 됩니다. R. Levato와 J. Malda 네덜란드 관절염 재단에 의해 지원 됩니다 (부여 계약 공동-14-1-001, LLP-12, 각각).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cadaveric joint | This can be obtained as rest material from the local butcher or veterinary center. | ||
| Sterile phosphate-buffered saline (PBS) | |||
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140 | |
| Amphotericin B | Thermo Fischer Scientific | 15290026 | |
| Liquid nitrogen | |||
| Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red | Thermo Fischer Scientific | 25200072 | |
| Tris-HCl pH 7.5 | |||
| Deoxyribonuclease I from bovine pancreas | Sigma-Aldrich | DN25 | |
| Ribonuclease A from bovine pancreas | Sigma-Aldrich | R6513 | |
| Triton X-100 (octoxynol-1) | Sigma-Aldrich | X100 | |
| Papain | Sigma-Aldrich | P3125 | |
| Trisodium citrate dihydrate | Sigma-Aldrich | S4641 | |
| Alginate | Sigma-Aldrich | 180947 | |
| Formalin | |||
| CaCl2 | |||
| Ethanol | |||
| Xylene | |||
| Paraffin | |||
| Ethylene oxide sterilization | Synergy Health, Venlo, the Netherlands | ||
| Multipotent Stromal cells/chondrocytes from equine donors | MSCs and chondrocytes can be isolated from donor joints that are rest material, coming from the local butcher or veterinary center. | ||
| MEM alpha | Thermo Fischer Scientific | 22561 | |
| L-ascorbic acid 2-phosphate | Sigma-Aldrich | A8960 | |
| DMEM | Thermo Fischer Scientific | 41965 | |
| Heat inactivated bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | 10735086001 | |
| Fibroblast growth factor-2 (FGF-2) | R & D Systems | 233-FB | |
| DNA quantification kit (Quant-iT PicoGreen dsDNA Reagent) | Thermo Fischer Scientific | P7581 | |
| 1,9-Dimethyl-Methylene Blue zinc chloride double salt | Sigma-Aldrich | 341088 | |
| Freeze-dryer | SALMENKIPP | ALPHA 1-2 LD plus | |
| Analytical mill | IKA | A 11 basic | |
| mortar/pestle | Haldenwanger 55/0A | ||
| Roller plate | CAT | RM5 | |
| Centrifuge (for 50 mL tubes) | Eppendorf | 5810R | |
| Capsule (cylindric mold) | TAAB | 8 mm flat | |
| Superlite S UV | Lumatec | 2001AV | |
| Incubator | |||
| Microtome | |||
| Sieve (mesh size 0.71 mm) | VWR | 34111229 | |
| Scalpel | |||
| Scalpel holder | |||
| Small laddle |
References
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