Summary
Decellularized kıkırdak elde edilen iskele osteokondral doku yeniden oluşturmak için kılavuz kıkırdak onarım için bir iskele ve bir araç olarak kullanılabilir. Bu yazıda ayrıntılı decellularization işlemini açıklar ve bu iskele tüp bebek ayarları'nda kullanmak için öneriler sunar.
Abstract
Osteokondral kusurları işlevsel olarak ses kemik ve kıkırdak doku yeniden oluşturmak için yeterli iç onarım kapasitesi değildir. Bu ölçüde, kıkırdak araştırma rejeneratif iskele geliştirilmesi üzerinde odaklanmıştır. Bu makale tamamen doğal kıkırdak hücre dışı matriks, at bir donörün geliyor türetilir iskele gelişimi anlatılmaktadır. İskele potansiyel uygulamalar allogrefler kıkırdak onarım, mühendislik ve doku oluşumu çalışmaya tüp bebek modelleri sağlayarak osteokondral doku için bir iskele olarak hizmet için üreten içerir. Doku decellularizing tarafından donör hücreleri kaldırılır, ancak birçok doğal biyoaktif sopasıyla korunabilmesi için düşünce. Sentetik üretilen bir iskele ile karşılaştırıldığında doğal bir iskele kullanmanın ana avantajı yok daha fazla functionalization polimerlerin sürücü osteokondral doku rejenerasyonu için gerekli olmasıdır. Kıkırdak kaynaklı matris iskele içinde vivo ve tüp bebek ayarlarında kemik ve kıkırdak doku rejenerasyonu için kullanılabilir.
Introduction
Travmatik olaylardan kaynaklanan diz eklem kıkırdak kusur rahatsızlık için yol açabilir ve her şeyden önce genç ve aktif nüfus1,2,3hayatlarını üzerinde büyük bir etkisi olabilir. Ayrıca, Genç yaşta kıkırdak hasarı daha hızlı başlangıçlı osteoartrit hayatı4sonraki bölümlerinde yer alan neden olabilir. Şu anda, sadece Hurda tedavi Genelleştirilmiş osteoartrit diz eklem replasmanı cerrahidir. Kıkırdak hypocellular, aneural ve avasküler doku olduğu için yeniden üretim kapasitesini ciddi sınırlıdır. Bu nedenle, rejeneratif tıp yaklaşımları sonra yardımcı olmak ve yerel doku Yenileyici kapasiteli uyarmak için aranır. Bu amaçla, iskele tasarlanmış ve farklılaşma ve doku rejenerasyonu kışkırtırız endüktif bir malzeme olarak ya da ya da bir hücre taşıyıcı olarak vücudun doğal hücreleri5tarafından kullanılabilir.
Decellularized iskele rejeneratif tıp6içinde yaygın olarak inceledik. Bu bir başarı, örneğin, cilt7, karın yapıları8ve tendon9rejenerasyon yardım elde etti. Decellularized iskele kullanmanın avantajı doğal kökenlerine ve hem çekmek ve hücre farklılaşması doku onarım6,10için gerekli uygun lineage içine neden biyoaktif ipuçlarını korumak için kendi kapasitesi var. Ayrıca, hücre dışı matriks (ECM) doğal bir biomaterial ve decellularization hücresel veya genetik içeriği kaldırarak potansiyel bir bağışıklık yanıtı engeller olduğundan, biyouyumluluk ve biodegradability ile ilgili konular üstesinden vardır.
Kıkırdak kaynaklı matris (CDM) iskele büyük chondrogenic ile mezenkimal stromal hücre11numaralı seribaşı zaman tüp bebek deneylerde potansiyel göstermiştir. Buna ek olarak, bu iskele ektopik konumlardaki içinde vivo ayarları12formu kemik doku ile endochondral ossifikasyon potansiyeline göstermiştir. CDM iskele oluşumu rehber olarak her ikisi de kemik ve kıkırdak doku, bu iskele osteokondral defekt tamir yanı sıra kıkırdak onarım için potansiyel tutabilir.
Bu makalede, Yang sayfasından uyarlanmış bir protokol et al. (2010)13 üzerinden atlar decellularized CDM iskele imalatı için diz kıkırdak. Bu iskele kollajen tip II ve hücreleri yoksun zengindir ve herhangi bir glikozaminoglikan (GAG) decellularization sonra içermez. Tüp bebek ve içinde vivo deneyler (osteo) kıkırdak defekt tamir bu iskele kullanarak yapılabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Bu iletişim kuralı için at bastırmak kıkırdak diğer nedenlerle daha osteoartrit ölmüştü atlar üzerinden elde edildi. Doku kurumsal etik kuralları doğrultusunda sahiplerinin izni ile elde edildi.
Not: Bu iletişim kuralı içinde vitro doku kültürü platformlar gibi uygulamalar için veya rejeneratif tıp stratejileri içinde vivo implantasyonu için kullanılabilir decellularized at kıkırdak üzerinden iskele imalatı açıklar. Enzimatik tedavi adımların açıklandığı kronolojik olarak gerçekleştirilmesi gerekir.
1. donör (kadavra) eklem gelen eklem kıkırdak hasat
- Devam Çözüm yıkama, 100 U/mL penisilin, 100 µg/mL streptomisin ve %1 (v/v) amfoterisin b ile desteklenmiş steril fosfat tamponlu tuz (PBS), oluşan kıkırdak 1 L hasat adımında, hazırlamak
- Donör patojenler taşıyabilen bu yana tüm toplama işlemi sırasında eldiven ve önlük giymek.
- Bir sağlam (kadavra) eklem kıkırdak yalıtım için edinin.
Not: Bu noktada, eklem çevresindeki deri dokunulmamış olarak kalmışsa. At bastırmak kıkırdak attan elde edilen bu protokol için kullanılan, ancak diğer eklem diğer türlerden de kullanılabilir. - Bir neşter ve cerrahi bir cımbız kullanarak ilgi ortak alan bulunan deri kaldırmak. Buna ek olarak, gerekirse, aşırı yağ ve kas dokusu temel ortak zarar vermeden kaldırmak. İsteğe bağlı olarak, hazırlanan kadavra bir biyolojik güvenlik kabin aktarın.
- Bir ayrılık eklem, bir arthrotomy, yani gerçekleştirmek için ilk olarak nerede uzantısı ve fleksiyon eklem yaparak ortak dile konum tanımlayın.
- Yağ, kas ve tendon eklem alanını açmak için cerrahi cımbız bir neşter ile daha fazla katman dikkatli bir şekilde çıkarın.
- Eklem boşluğu ulaşmak için bir kesi yapmak.
Not: Eklem boşluğu boşluğundan doğru bir kesi işlemi sırasında damla synovial sıvı ile doldurulur. - Ortak bir arada tutmak tendonlar ile kesme tarafından ortak kadar tamamen açmaya devam edin.
- Kıkırdak makroskopik herhangi bir zarar için kontrol edin.
Not: Eklem kıkırdak parlak ve pürüzsüz bir görünüme sahip değilse veya belirgin kabarma, clefts veya kusurları varsa, kıkırdak atmak. - Steril neşter subchondral kemik kıkırdak kaldırmak için kullanın. Ayrıca kıkırdak (Şekil 1) derin bölgesini kaldırmak için ta subchondral kemiğine kadar kesti. Kıkırdak kurumasını önlemek için düzenli olarak çözüm üzerinde kıkırdak yıkama kıkırdak damla.
Not: Şu anda, kıkırdak dilimleri boyutu önemli değildir. - Kıkırdak dilimleri önceden hazırlanmış kıkırdak çözüm (Şekil 2A) yıkama içeren 50 mL tüpler toplamak.
- Kıkırdak ilgi tüm alanları topladıktan sonra ek dondur kıkırdak dilimleri 5 min için sıvı azot.
- Kıkırdak dilimleri 50 mL tüpler içine aktarmak ve hemen bir donma kurutma makinesi kıkırdak dilimler için 24 saat lyophilize. Buz kondansatör-51 ° C (Şekil 2B) ise donma kurutma makinesi yaklaşık 0,090 mbar ayarlayın.
- Kıkırdak dilimleri kadar daha fazla kullanmak, oda sıcaklığında kuru bir yerde saklayın.
Not: İskele oluşumu noktaya kadar çözümler ve kıkırdak hazırlanacak ve steril bir şekilde tedavi gerekmez.
2. oluşturma kıkırdak parçacıklar Decellularized
- Sıvı azot liyofilize kıkırdak dilim submerse.
- Doğrudan örnekleri el ile veya bir freze tezgahı eziyet. Kıkırdak dilimleri el ile bileme, harç ve havaneli kullanın ve bunlar toz (Şekil 2C ve 2D) kadar yaklaşık 45 dakika için dilimleri eziyet. Otomatik olarak taşlama, freze makinesi ek donmuş kıkırdak dilimleri toz haline kadar bir dakika kadar birkaç saniye için önceden ayarlanmış kendi hızda kullanın.
Not: Harç veya Freze taşlama bölmesinin sıvı azot ekleyerek önceden ne yapıyorsun? Freze makinesi kullanırken, tüm parçacıklar zemin vardır ve hiçbir parçacıklar taşlama bölmenin alt kısmında kalmak emin olun. - Daha büyük bölümlerini bir elek ile 0,71 mm kafes boyutu kullanarak kurtulmak için kıkırdak parçacıklar elek.
- Parçacıklar, oda sıcaklığında kuru bir yerde saklayın.
3. tripsin ile enzimatik Decellularization 0.25%-EDTA
- % 0.25 tripsin 100 U/mL penisilin, 100 μg/mL streptomisin ve %1 (v/v) Amfoterisin B. mağaza 4 ° C'de çözüm ile takıma EDTA ile oluşan sindirim çözüm hazırlamak
Not: Trypin ikamet eden kıkırdak dokusunda proteinleri alçaltır bir proteaz var. Enzimatik bu adımı yoğun kıkırdak yapı açılır. - 50 mL tüpler yaklaşık 7.5 mL tüp başına hacmi kadar toz kıkırdak parçacıkları ile doldurun.
-
Kıkırdak parçacıkları ile hazırlanan sindirim çözüm için toplam 24 h 37 ° C'de sindirim çözüm her 4 h yenilenirken kuluçkaya.
- İlk olarak, 30 mL sindirim çözeltisi kıkırdak parçacıklar içerir her 50 mL tüp ekleyin.
- O zaman, parçacıklar böylece tüm parçacıklar enzimatik solüsyona maruz kalan bir girdap ya da damlalıklı kullanarak resuspend.
- Örnekleri bir rulo üzerinde 37 ° C'de 4 h için kuluçkaya.
- Sindirim çözüm yenilemek için sedimantasyon kıkırdak parçacıkların neden 3113 x g de 20 dk için tüpler santrifüj kapasitesi. Süpernatant atmak.
Not: Süpernatant her tripsin kuluçka süresi ile daha net olacak. - Adım 3.3.1–3.3.4 4 h 6 devredir parçacıklar sindirim çözüm ile inkübe kadar yineleyin.
- Son döngüsü sonra süpernatant centrifuging sonra kaldırmak ve parçacıkları 30 mL çözüm iki kez yıkama kıkırdak yıkayın. Parçacıklar 3113 x g her yıkar bir de 20 dk santrifüj kapasitesi.
4. enzimatik Decellularization nükleaz tedavi ile
- 10 mM Tris-HCl çözüm pH 7.5 deiyonize su hazırlamak.
- 50 U/mL deoksiribonükleaz ve 1 U/mL ribonükleaz A nükleaz çözüm elde etmek için Tris-HCl tampon için ekleyin.
Not: Bu adım, özellikle deoksiribonükleazlar ve ribonükleazlar aşağılamak için gerçekleştirilir. - Kıkırdak parçacıklar (adım 3.4) çözümden yıkama kıkırdak kaldırmak için 3,113 x gde 20 dk santrifüj kapasitesi ve süpernatant kaldırın.
- Kıkırdak parçacıkları 30 mL nükleaz çözeltisi ekleyin ve tüm parçacıklar nükleaz çözüm maruz kalır emin çözümü üzerinden parçacıklar karıştırın.
- Örnekleri için 4 h 37 ° C'de bir rulo üzerinde kuluçkaya
- 20 dk 3,113 x g de kıkırdak parçacıklar centrifuging tarafından nükleaz çözümü kaldırmak ve süpernatant atın.
- Örnekleri kıkırdak parçacıklar 10 mM Tris-HCl çözüm deoksiribonükleaz ve ribonükleaz A olmadan 30 mL ekleyerek yıkayın. Parçacıklar resuspend ve örnekleri bir rulo için oda sıcaklığında 20 h bırakmaktır.
5. deterjan Decellularization
- Deterjan solüsyonu octoxynol-PBS içinde 1 %1 (v/v) çözülerek olun.
- Tris-HCl çözüm 3,113 x g de 20 dakika centrifuging ve süpernatant atarak kıkırdak parçacıklar kaldırın.
- Hazırlanan % 1 deterjan solüsyonu 30 mL kıkırdak parçacıkları ekleyin. Yavaşça çözümü köpük önlemek için kıkırdak parçacıkları resuspend.
Not: Bu adım hücresel zarları tatili. - Bir rulo üzerinde oda sıcaklığında 24 h için bir rulo üzerinde örnekleri kuluçkaya.
- Santrifüjü 3,113 x g de 20 dk için deterjan solüsyonu kaldırmak ve süpernatant atın.
-
Tüm decellularization çözümleri kalıntıları kaldırmak için Çözüm yıkama kıkırdak 30 ml 8 h 6 döngüleri kıkırdak parçacıklar yıkayın. Oda sıcaklığında bir rulo üzerinde çamaşır gerçekleştirin.
- Sonraki yıkamaya değiştirmek için süspansiyon 3,113 x gde 20 dk santrifüj kapasitesi, süpernatant atmak ve taze kıkırdak Çözüm yıkama ekleyin.
- Son yıkama tüplerde bırakın ve decellularized kıkırdak parçacıklar-80 ° C'de depolayın
6. Decellularized parçacıkları iskele oluşturma
- Parçacıklar-80 ° C'de depolanan, iskele oluşturmadan önce sıcak suda kıkırdak parçacıkları içeren kapalı tüpler çözülme.
- Kıkırdak parçacıkların küçük bir kepçe ile silindirik bir kalıp, örneğin, bir plastik şişe 8 mm çapında ve 2 cm yüksekliği ile aktarın.
- Kıkırdak parçacıklar plastik kalıp içine yerleştirirken, iskele içinde boşluklar önlemek için tüm hava-kabarcıklar dışarı basın ve kalıp kenarına kadar doldurun.
Not: İskele çatlaklar yol açabilir iskele kuruluşundan sonra iskele metal bir kalıp dışarı çekmek daha zor olacak. - Kalıpları kıkırdak parçacıklar-20 ° C'de 10 dakika ile dondurma
- Kıkırdak iskele 24 h için onların kalıplar içinde bir donma kurutma makinesi lyophilize.
- Lyophilization sonra İskele kalıp (Şekil 3) dışarı almak ve onları ultraviyole (UV) ışık 30 cm mesafe ve 365 ile bölünmelerini gecede nm.
- İn vitro hücre kültür veya içinde vivo implantasyon için iskele kullanabilmek için örneğin, etilen oksit (EtO) gaz ile iskele sterilize.
Not: EtO Sterilizasyon harici bir şahıs tarafından gerçekleştirilir.
7. Decellularized iskele histolojik Stainings ile karakterizasyonu
Not: Tam decellularization emin olmak için ve geri kalan doğal karakter kıkırdak görselleştirmek için birkaç histolojik stainings iskele Hematoksilen ve eozin (H & E) emin olmak için boyama da dahil olmak üzere herhangi bir deneyde, kullanmadan önce gerçekleştirmek decellularization, Safranin-O kalan GAG varlığı görselleştirmek için boyama, kollajen tip ı kollajen içerik ve kollajen tip II immünhistokimya kollajen içerik arasında ayırt etmek için birbirinden ayırmak için immünhistokimya.
- İskele bir neşter ile yaklaşık 3 mm ince dilimler kesin.
Not: İskele daha büyük veya daha küçük boyutlarda kesilir, dehidrasyon devir sürelerini adapte gerekir. - İskele %4 (w/v) aljinat bir düşüş katıştırmak ve 20 mM CaCl2içeren % 3.7 sigara tamponlanmış formalin benzer bir hacmi ekleyerek cross-linking teşvik.
Not: Aljinat katıştırma iskele dilimleri daha sert parafin katıştırma önce çamaşır adımları göre yapar. İskele bileşimi nedeniyle ECM birleşme hücreleri tarafından yeterince dayanıklı olarak iskele hücre-tohumlari durumda veya implante vivo içinde aljinat katıştırma çok gerekli değildir. - Örnekleri kurutmak kademeli etanol serideki yerleştirerek, bir saatlik döngüleri ile başlayan % 70, % 96, ksilen iki 1s döngüsü tarafından takip ve parafin 60 ° C'de iki 1s döngüleri ile biten % 96, % 100 ve % 100 etanol,
- Dehidratasyon sonra parafin katıştırmak-örnekler bir kalıp içine ve örnekleri soğuması.
- Örnekleri ile bir microtome 5 mikron kalın dilim içinde kesmek.
- Örnekleri boyama önce döndürülen kademeli etanol serideki yerleştirerek suyla temasa. Ksilen 2 yıkama yıkama başına 3 min için % 100, % 95 ve % 70 etanol ardından 5 min için iki yıkama başlayın. Son olarak, örnekleri 3 kez suda 2 dakika yıkayın.
Not: Parafin katıştırma için örnekleri işlemek için aljinat kullanmadan durumunda, Sıvı parafin bölümlerin önce 10 mM sitrik asitle aljinat kapalı yıkamak emin olun. - Hematoksilen ve eozin, örnekleriyle leke Safranin-O, kollajen ben ve kollajen önceki açıklanan11olarak II.
8. Decellularized iskele kantitatif analizleri ile karakterizasyonu
- Daha önce11açıklandığı gibi iskele papain digests edinin.
- Bir tahlil tam decellularization emin olmak için iskele iki iplikçikli DNA içeriği ölçmek için floresans tabanlı DNA miktar kiti ile gerçekleştirin. Üretici tarafından sağlanan iletişim kuralı izleyin. DNA'ın iskele kuru ağırlığının başına miktar hızlı.
- GAGs iskele içinde kalan11daha önce açıklandığı gibi ölçmek için bir dimethylmethylene mavi tahlil gerçekleştirin. GAG DNA ücret tutarı hızlı.
9. Decellularized iskele tohum
- Steril iskele adım 6,7 içine 3 mm kalın dilimler kesin.
- 6-şey plaka ayrı Wells iskele aktarın.
- Hücre kültür orta ile iskele tarafından orta iskele üstüne pipetting 1 mL suyla temasa ve 30 dk. için emmek izin kondrosit veya mezenkimal kök hücre (MSC) genişleme orta kullanın.
Not: aynı orta numaralı seribaşı hücreleri hücre kültürü gelince iskele rehidrasyon için kullanın. Kondrosit genişleme orta % 10 ısı inaktive fetal Sığır serum (FBS), 100 U/mL penisilin, 100 μg/mL streptomisin ve 10 ng/mL fibroblast büyüme faktörü-2 (FGF-2) ile Dulbecco'nın değiştirilmiş medya (DMEM) oluşur. Yüksek lisans genişleme orta oluşur en az % 10 ile temel orta alpha (a-MEM) ısı-inaktive FBS, 0.2 mM L-askorbik asit 2-fosfat, 100 U/mL penisilin, 100 μg/mL streptomisin ve 10 ng/mL FGF-2. - 3 x 106 hücrelerde her iskele çapı 8 mm ve 3 mm yüksekliğe için gerekli birim orta 100 μL hazırlayın.
Not: Birden çok hücre tipleri farklı türlerden tohum için kullanılabilir. Kondrosit veya mezenkimal stromal hücre kullanırken, yukarıda açıklanan11hücreleri izole. Kondrosit kullanırken, onlar P1 geçit dediferansiye kondrosit sayısını en aza indirmek için genişletilmiş değil emin olun. Mezenkimal stromal hücre kullanırken, onlar yukarıda açıklanan14olarak çoklu soy ayırt etme yeteneklerini üzerinde test edilmelidir. - Damlalıklı 50 μL, hazırlanan hücre süspansiyon öncesi iskele üstüne ve 37 ° C'de 1 h için iskele kuluçkaya
- Dikkatlice ters iskele aşağı, damlalıklı kalan 50 μL hücre süspansiyon bu iskele tarafında açmak ve 37 ° C'de 1 h için kuluçkaya
- Kuluçka sonra orta 3 mL wells için ekleyin ve 37 ° C'de hücre numaralı seribaşı iskele kültür Yavaşça dekolmanı hücrelerin önlemek için kültür plaka başa.
- Deney için gerekli olan süre için iskele kültür ve Orta 2-3 kez bir hafta değiştirin. Damlalıklı yavaş yavaş ve çok uzak gelen mümkün olduğunca iskele.
- Hücre numaralı seribaşı iskele kültür sonra iskele yarım kesilmiş ve onları Histoloji ve biyokimyasal analizler için süreç.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
CDM iskele decellularization her zaman histolojik stainings kullanarak hem de DNA'sı kalıntıları miktarını ölçmek için DNA miktar kullanarak onaylanması gerekmektedir. Yetersiz decellularization içinde vivo ayarları15,16,17sonuçlarında etkileyen istenmeyen immünolojik yanıt-e doğru yol açabilir. Bu belirli decellularization Yöntem için 13,6 ± 2.3 ng/mg DNA/Kuru ağırlık başladı algılama mesafesi aşağıda DNA'sı (n = 3). Bu iletişim kuralını kullanan tam decellularization kollajen tip II (Şekil 4 c) zengin ve hiçbir hücreleri (Şekil 4A) veya GAGs (Şekil 4B) sahip bir iskele üretimi için yol açacaktır. Sağlıklı at kıkırdak karşılaştırma, lekeli Safranin-O (Şekil 5A) ve kollajen II (Şekil 5B) olarak görüntülenir.
İskele macroscopically homojen bir gözeneklilik görüntülemeniz gerekir. Hava kabarcıkları iskele kolayca detectable büyük delikler yol açar ve bu nedenle, dikkatli bir şekilde kaldırılır. İskele bu büyük delikler'ın mekanik özellikleri üzerinde zararlı bir etkisi ve tohum üzerine inhomogeneous hücre ek yol. Başarılı iskele imalatı da en az 24 saat süren bir freeze-drying adımı içerir; Bu beyaz görünüme (Şekil 3) sahip bir iskele yol açacaktır. Yetersiz lyophilization durumunda iskele sarımsı bir renk olacak ve hiçbir açık gözenekleri görülebilmektedir.
Vivo için kullanılmak üzere iskele amacıyla uygulamalar ve tüp bebek hücre-tohum, hücre hücresel işlevler, yanı sıra iskele entegrasyon gösterilmelidir. Burada, iskele ECM (Şekil 6A-D) 4 ve 6 (Şekil 6E-H) sonra üretilen MSCs ile seribaşı tüp bebek kültür hafta. GAG, kollajen II ve periferik kollajen oluşumu ben hem hücreleri, varlığı gösterildi. Ayrıca, kolajen II özgüllük Şekil 5Bnerede kıkırdak ama değil kemik kollajen II bir osteokondral fiş için olumlu lekeli, görüntülenir.
Şekil 1: tam kalınlıkta kıkırdak çıkardıktan sonra Equine diz. Kıkırdak bir neşter kullanarak kesmek değil kalsifiye kıkırdak tabaka ulaşıncaya kadar bir neşter kullanarak condyles kaldırılır. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 2: oluşturma sıralı adımları kıkırdak kaynaklı matris parçacıkları decellularized. (A)kıkırdak condyles kaldırılan dilimler antibiyotik-infüzyon çözümünü yıkanmış. Dilimleri liyofilize ve şimdi beyaz ve kağıt benzeri bir görünüm var (B) kıkırdak. (C) ek-donma lyophilized kıkırdak (D) önce gerçekleştirilen ezildiği kıkırdak moleküller tarafından el-freze bir harç ve havaneli kullanarak var. Adım D otomatik freze ile de yapılabilir. Bu rakam Benders vd.11değiştirildi. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 3: nihai ürün, bir decellularized kıkırdak kaynaklı matris iskele. Bu silindirik iskele 2 cm yüksekliğinde ve 8 mm çapında. İskele açık gözenekli bir yapısı vardır. Sol ve sağ resmi bir iskele iki farklı açılardan görüntüleme. Hepsi hava kabarcıkları lyophilization önce kaldırılmadı gibi büyük yeşil iskele yüzeyde mevcut olduğunu unutmayın. Bu rakam bükücüler vd.11' den değiştirildi. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 4: iskele histolojik karakterizasyonu. (A) H & E gösterir ECM parçacıklar farklı boyutlarda ve hücrelerin yokluğu boyama. (B) Safranin-O boyama gösterir hiçbir GAGs decellularization süreç içinde muhafaza edilmiştir. (C) kolajen tip II immunolocalization ortaya decellularized parçacıklar kollajen tip II zengindir. Ölçek çubukları 500 µm =. Bu rakam bükücüler vd.11' den değiştirildi. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 5: sağlıklı at kıkırdak histolojik gösterimini. (A) bir osteokondral tak GAGs (yeşil), kıkırdak ile GAGs (kırmızı) ve damarların kıkırdak tabaka arasında olmadan Safranin-O ve hızlı yeşil gösterir kemiğiyle lekeli. (B) A kollajen II lekeli osteokondral tak kıkırdak ama değil kemik lekeleri. Ölçek çubukları 500 µm. = Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 6: iskele Neo-matris oluşumu mezenkimal stromal hücreler kullanarak kültür 4 ila 6 hafta sonra. 4 (A-D) ve 6 (E-H) hafta kültür sonra yeni kurulan matris hücreleri (A + E), kollajen II (B + F), zengin ve GAGs (C + H & E, kollajen II ve Safranin-O stainings, sırasıyla görülebilir gibi G),. Ayrıca, kolajen ben mevcut 4 (D) ve 6 (H) hafta sonra iskele çevre. Hücre yoğunluğu yanı sıra matris biriktirme miktarı yüksek çevre. Ölçek çubukları 500 µm =. Bu rakam bükücüler değiştirildi vd.11. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Eklem kıkırdak ECM çok yoğun ve farklı enzimatik tedavi için oldukça esnek. Bu makalede açıklanan multi-step decellularization iletişim kuralı böyle direnç giderir ve başarılı bir şekilde decellularized matrisler oluşturur. Bunu başarmak için birkaç gün içinde işlem yayılmıştır. Birçok decellularization süreçleri doku18farklı türleri için önerilen ve kıkırdak decellularization için uygun bir protokol bu makalede. Bu protokol için bu, ancak, tüm hücreleri kaldırmak için deterjan adımlarla enzimatik tedavi takip etmek gereklidir. DNA miktarı son derece tripsin tedaviyle ilgili ilk kaç adımda azalır ve bu işlemleri bırakarak uygun decellularization11' oluşturmayacaktır.
Not Bu protokolü at kıkırdak doku decellularization üzerinde dayanır. Kullanılan enzim çözümleri etkinlik at kondrosit yeterli kaldırılması için yeterli bulundu. Ancak, matris kompozisyon türlerin karşıdan karşıya koruma rağmen protokol decellularization doğal olarak kondrosit19ikamet eden tutarında farklılıklar nedeniyle diğer hayvanlardan kıkırdak için ayarlanması gerekebilir. Örneğin, kıkırdak daha küçük hayvanların daha yüksek bir hücre içeriğini sahip olduğu bilinmektedir ve bu nedenle, bir daha Agresif decellularization isteyebilir. Decellularized iskele oluşturmak için at kıkırdak seçtiğiniz için belirli bir nedeni o at ve insan kıkırdak Haritayı açık benzerlik kalınlığı, hücre yoğunluğu ve biyokimyasal makyaj20olduğunu.
Bir tekrarlanabilir ürün emin olmak için birkaç değerlendirme kriterleri tam decellularization elde olup olmadığını belirlemek önemli olabilir. Bu protokol için hem bir H & E boyama ve biyokimyasal miktar DNA kalıntı miktarı son ürünü olarak değerlendirmek için kullanılmıştır. Diğer araştırmacılar da kalan DNA, boyutu en fazla 200 olarak önerilen bp kalite için uzunluğu kontrol21veya daha az 50 ng/mg bir kalıntı DNA miktarı kuru doku ağırlık18,22. Ne olursa olsun, protokol için değişiklik her zaman histolojik değerlendirme ve decellularization etkisi, hem de kalan ECM ürünleri belirlemek için nicel deneyleri ile Takibi gerekir.
Ana bu protokolü tripsin maruz içeren kapsamlı decellularization yordam GAGs geniş kaybına yol açar kısıtlamasıdır. Tripsin GAGs ayırmak değil de, GAGs kaybı nedeni açılış kadar çapa veya GAGs kapsülleyen proteinler fizyon tripsin tarafından kıkırdak dokusunun olabilir. ECM bileşenleri GAGs gibi eklem kıkırdak suda tutmak için önemlidir ve bu nedenle doku4biyomekanik esneklik önemli bir rol oynamaktadır. GAGs kaybı decellularization sürecinde azaltmak amacıyla iletişim kuralları decellularization işlemi titizlik etkiler.
Decellularization sonra hücre entegrasyon ve işlevi, hücre numaralı seribaşı iskele gösterilmiştir. Önceki araştırmalar, matris üretim kondrosit bu iskele üzerinde tarafından özellikle bol matris ifade mezenkimal stromal hücre11tarafından karşılaştırıldığında yetersiz, göstermiştir. Kıkırdak benzeri doku iskele üzerinde yatırılır gibi bu yeni matris genellikle ilk iskele çevre iskele kalan işgal önce yatırılır. Bu açıkça bir hücre zengini Merkezi yerine bir hücre-zengin çevre nerede kez histolojik dilimleri üzerinde görülebilir (Şekil 6) gördüm. Ancak, perfüzyon Biyoreaktörler tohum hücrenin ve besin değişimi geliştirmek amacıyla kullanırken bu etki azaltılabilir. İskele matris ifade gerçekleştiği sırada, mekanik olarak daha tutarlı ve daha az kırılgan hale parlak bir görünüm de kabul eder. Bu nedenle, onlar kolayca ayrı düşmeden bir neşter kullanarak kesilebilir. Yeni kurulan matrisin özelliklerini de histolojik stainings ve kantitatif testleri kullanılarak değerlendirilebilir. Hiçbir GAGs decellularization işleminden sonra bıraktığınız tüm kantitatif ölçülebilir GAGs neosynthesis bir ürün olacak.
Bu decellularization protokolü kullanılarak üretilen iskele kapalı bir çözüm sağlar ve hücre tohum implantasyonu önce gerekliliği olmadan implante. Ancak, (osteo) kıkırdak kusurları için bir tedavi olarak uygulandığında, biyomekanik özellikleri girinti artiküler yükleme erken aşamalarında yapı olasılığını azaltmak için geliştirilmiş olması gerekir. Koruyucu katmanları üst veya diğer güçlendirme stratejileri ile ortak implantasyon uygulanması gerekebilir. Gelecekte, daha fazla ayrıntılandırma Protokolü'nün iskele rejeneratif potansiyelini arttırmak. Örneğin, bu iskele güçlendirmek için GAGs, kollajen lif yönü veya diğer Biyomalzeme ile birlikte korunması tutma için bir geliştirilmiş ve sorunsuz rejenere eklem yüzeyi izin vermek yararlı olabilir. Sonuç olarak, bu iskele bileşenleri rejeneratif Greftler (osteo) kıkırdak kusurları. tedavisi için bir nesil olarak bir rol oynayabilir
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar onlar rakip hiçbir mali çıkarları var bildirin.
Acknowledgments
Yazarlar W. önyükleme için iskele imalatı yardım kabul etmek istiyorum. K.E.M. su bükücüler Alexandre Suerman Stipendium Üniversitesi Tıp Merkezi tarafından desteklenmektedir. R. Levato ve J. Malda Hollandalı Artrit Vakfı tarafından desteklenmektedir (CO-14-1-001 ve LLP-12, sırasıyla vermek).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cadaveric joint | This can be obtained as rest material from the local butcher or veterinary center. | ||
| Sterile phosphate-buffered saline (PBS) | |||
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140 | |
| Amphotericin B | Thermo Fischer Scientific | 15290026 | |
| Liquid nitrogen | |||
| Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red | Thermo Fischer Scientific | 25200072 | |
| Tris-HCl pH 7.5 | |||
| Deoxyribonuclease I from bovine pancreas | Sigma-Aldrich | DN25 | |
| Ribonuclease A from bovine pancreas | Sigma-Aldrich | R6513 | |
| Triton X-100 (octoxynol-1) | Sigma-Aldrich | X100 | |
| Papain | Sigma-Aldrich | P3125 | |
| Trisodium citrate dihydrate | Sigma-Aldrich | S4641 | |
| Alginate | Sigma-Aldrich | 180947 | |
| Formalin | |||
| CaCl2 | |||
| Ethanol | |||
| Xylene | |||
| Paraffin | |||
| Ethylene oxide sterilization | Synergy Health, Venlo, the Netherlands | ||
| Multipotent Stromal cells/chondrocytes from equine donors | MSCs and chondrocytes can be isolated from donor joints that are rest material, coming from the local butcher or veterinary center. | ||
| MEM alpha | Thermo Fischer Scientific | 22561 | |
| L-ascorbic acid 2-phosphate | Sigma-Aldrich | A8960 | |
| DMEM | Thermo Fischer Scientific | 41965 | |
| Heat inactivated bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | 10735086001 | |
| Fibroblast growth factor-2 (FGF-2) | R & D Systems | 233-FB | |
| DNA quantification kit (Quant-iT PicoGreen dsDNA Reagent) | Thermo Fischer Scientific | P7581 | |
| 1,9-Dimethyl-Methylene Blue zinc chloride double salt | Sigma-Aldrich | 341088 | |
| Freeze-dryer | SALMENKIPP | ALPHA 1-2 LD plus | |
| Analytical mill | IKA | A 11 basic | |
| mortar/pestle | Haldenwanger 55/0A | ||
| Roller plate | CAT | RM5 | |
| Centrifuge (for 50 mL tubes) | Eppendorf | 5810R | |
| Capsule (cylindric mold) | TAAB | 8 mm flat | |
| Superlite S UV | Lumatec | 2001AV | |
| Incubator | |||
| Microtome | |||
| Sieve (mesh size 0.71 mm) | VWR | 34111229 | |
| Scalpel | |||
| Scalpel holder | |||
| Small laddle |
References
- Dunlop, D. D., et al. Risk factors for functional decline in older adults with arthritis. Arthritis and rheumatism. 52 (4), 1274-1282 (2005).
- Fitzpatrick, K., Tokish, J. M. A military perspective to articular cartilage defects. The journal of knee surgery. 24 (3), 159-166 (2011).
- Flanigan, D. C., Harris, J. D., Trinh, T. Q., Siston, R. A., Brophy, R. H. Prevalence of chondral defects in athletes' knees: a systematic review. Medicine and science in sports and exercise. 42 (10), 1795-1801 (2010).
- Martel-Pelletier, J., Boileau, C., Pelletier, J. P., Roughley, P. J. Cartilage in normal and osteoarthritis conditions. Best practice & research. Clinical rheumatology. 22 (2), 351-384 (2008).
- Vinatier, C., et al. Cartilage tissue engineering: towards a biomaterial-assisted mesenchymal stem cell therapy. Current stem cell research & therapy. 4 (4), 318-329 (2009).
- Taylor, D. A., Sampaio, L. C., Ferdous, Z., Gobin, A. S., Taite, L. J.
- Vashi, C. Clinical Outcomes for Breast Cancer Patients Undergoing Mastectomy and Reconstruction with Use of DermACELL, a Sterile, Room Temperature Acellular Dermal Matrix. Plastic Surgery International. 2014 (704323), 1-7 (2014).
- Satterwhite, T. S., et al. Abdominal wall reconstruction with dual layer cross-linked porcine dermal xenograft: the "Pork Sandwich" herniorraphy. Journal of plastic, reconstructive & aesthetic surgery : JPRAS. 65 (3), 333-341 (2012).
- Martinello, T., et al. Successful recellularization of human tendon scaffolds using adipose-derived mesenchymal stem cells and collagen gel. Journal of tissue engineering and regenerative medicine. 8 (8), 612-619 (2014).
- Benders, K. E., et al. Extracellular matrix scaffolds for cartilage and bone regeneration. Trends in biotechnology. 31 (3), 169-176 (2013).
- Benders, K. E., et al. Multipotent Stromal Cells Outperform Chondrocytes on Cartilage-Derived Matrix Scaffolds. Cartilage. 5 (4), 221-230 (2014).
- Gawlitta, D., et al. Decellularized cartilage-derived matrix as substrate for endochondral bone regeneration. Tissue engineering. Part A. 21 (3-4), 694-703 (2015).
- Yang, Z., et al. Fabrication and repair of cartilage defects with a novel acellular cartilage matrix scaffold. Tissue engineering. Part C, Methods. 16 (5), 865-876 (2010).
- Pittenger, M. F., et al. Multilineage potential of adult human mesenchymal stem cells. Science. 284 (5411), 143-147 (1999).
- Meyer, S. R., et al. Decellularization reduces the immune response to aortic valve allografts in the rat. The Journal of thoracic and cardiovascular surgery. 130 (2), 469-476 (2005).
- Brown, B. N., Valentin, J. E., Stewart-Akers, A. M., McCabe, G. P., Badylak, S. F. Macrophage phenotype and remodeling outcomes in response to biologic scaffolds with and without a cellular component. Biomaterials. 30 (8), 1482-1491 (2009).
- Keane, T. J., Londono, R., Turner, N. J., Badylak, S. F. Consequences of ineffective decellularization of biologic scaffolds on the host response. Biomaterials. 33 (6), 1771-1781 (2012).
- Crapo, P. M., Gilbert, T. W., Badylak, S. F. An overview of tissue and whole organ decellularization. Biomaterials. 32 (12), 3233-3243 (2011).
- Malda, J., et al. Of mice, men and elephants: the relation between articular cartilage thickness and body mass. PloS One. 8 (2), e57683 (2013).
- Malda, J., et al. Comparative study of depth-dependent characteristics of equine and human osteochondral tissue from the medial and lateral femoral condyles. Osteoarthritis and Cartilage. 20 (10), 1147-1151 (2012).
- Londono, R., Badylak, S. F. Biologic scaffolds for regenerative medicine: mechanisms of in vivo remodeling. Annals of biomedical engineering. 43 (3), 577-592 (2015).
- Gilbert, T. W. Strategies for tissue and organ decellularization. Journal of cellular biochemistry. 113 (7), 2217-2222 (2012).
