Summary
Decellularized brusk-afledte stilladser kan bruges som et stillads til guide brusk reparation og som et middel til at regenerere osteochondral væv. Dette papir beskriver decellularization processen i detaljer og giver forslag til at bruge disse stilladser i in vitro-indstillinger.
Abstract
Osteochondral defekter mangler tilstrækkelig iboende reparation kapacitet til at regenerere funktionelt sund knogle og brusk væv. I dette omfang, har brusk forskning fokuseret på udviklingen af regenerativ stilladser. Denne artikel beskriver udviklingen af stilladser, der er helt afledt fra naturlige brusk ekstracellulære matrix, kommer fra en equine donor. Potentielle anvendelser af stilladser omfatter producerer allografts til brusk reparation, der tjener som et stillads til osteochondral tissue engineering, og leverer in vitro-modeller for at studere væv dannelse. Af decellularizing væv, donor cellerne er fjernet, men mange af de naturlige bioaktive stikord menes at være bevaret. Den vigtigste fordel ved at bruge sådan en naturlig stillads i forhold til en syntetisk fremstillet stillads er, at ingen yderligere functionalization af polymerer er forpligtet til at drive osteochondral væv revitalisering. Brusk-afledte matrix stilladser kan bruges til knogle og brusk væv revitalisering i både in vivo og in vitro-indstillinger.
Introduction
Ledbrusken fejl i knæet forårsaget af traumatiske begivenheder kan føre til ubehag, og frem for alt kan have en stor indvirkning på livet for de unge og aktive befolkning1,2,3. Derudover kan bruskskader i en ung alder føre til en hurtigere indsættende slidgigt senere i livet4. I øjeblikket er den eneste salvage terapi for generaliseret slidgigt i knæet fælles udskiftning kirurgi. Da brusk er en hypocellular, aneural og avascular væv, er dets regenerationsevne stærkt begrænset. Derfor, regenerativ medicin tilgange er søgt efter at støtte og stimulere den regenerative kapacitet af indfødte væv. Til dette formål, er stilladser designet og bruges som enten en celle-carrier eller som en induktiv materiale, der opildner differentiering og regeneration af væv af kroppens indfødte celler5.
Decellularized stilladser har undersøgt bredt inden for regenerativ medicin6. Det har haft nogle succes, for eksempel i medvirken regenerering af huden7og abdominal strukturer8sener9. Fordelen ved at bruge decellularized stilladser er deres naturlige oprindelse og deres evne til at bevare bioaktive stikord, der både tiltrækker og fremkalde Celledifferentiering af passende slægt kræves til væv reparation6,10. Desuden, da ekstracellulære matrix (ECM) er en naturlig biomateriale, og decellularization forhindrer en potentiel immunresponset ved at fjerne cellulært eller genetiske indhold, spørgsmål vedrørende biokompatibilitet og bionedbrydelighed er overvundet.
Brusk-afledte matrix (CDM) stilladser har vist stor chondrogenic potentiale i in vitro-eksperimenter når seedede med mesenchymale stromale celler11. Derudover har disse stilladser vist potentiale til form knoglevæv gennem endochondral ossifikation på ektopisk placeringer i in vivo indstillinger12. Som CDM stilladser guide dannelsen af både knogler og brusk væv, disse stilladser kan holde potentiale for osteochondral defekt reparation foruden brusk reparation.
I denne artikel beskrives en protokol, der er tilpasset fra Yang et al. (2010)13 til produktion af decellularized CDM stilladser fra heste kvæle brusk. Disse stilladser er rig på kollagen type II og blottet for celler, og indeholder ikke nogen glycosaminoglycans (GAGs) efter decellularization. Både in vitro- og in vivo forsøg på (osteo) chondral defekt reparation kan udføres ved hjælp af disse stilladser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
For denne protokol, blev equin knæ brusk fremstillet af heste, der døde af andre årsager end slidgigt. Væv blev opnået med tilladelse fra ejerne, i overensstemmelse med de institutionelle etiske regler.
Bemærk: Denne protokol beskriver fabrikation af stilladser fra decellularized equine brusk, som kan bruges til applikationer såsom in vitro vævskultur platforme eller for i vivo implantation i regenerativ medicin strategier. Enzymatisk behandling trin skal udføres i den beskrevne kronologiske rækkefølge.
1. høst af ledbrusken fra Donor (dødt) leddene
- Videre af trinnet høst forberede 1 L af brusk vask løsning, der består af steril fosfatbufferet saltopløsning (PBS), suppleret med 100 U/mL penicillin, 100 µg/mL streptomycin, og 1% (v/v) Amphotericin B.
- Bære handsker og en lab coat under proceduren hele høst, da donor kan bære patogener.
- Opnå en intakt (dødt) fælles for brusk isolation.
Bemærk: På dette tidspunkt, er huden omkring leddet stadig intakt. Equine knæ brusk fra hest blev brugt i denne protokol, men andre samlinger fra andre arter kan også bruges. - Fjerne huden der ligger omkring det fælles område af interesse ved hjælp af en skalpel og kirurgisk pincet. Derudover fjerne overdreven fedt- og muskelvæv væv, eventuelt uden at skade den underliggende fælles. Valgfrit, overføre den forberedte Kadaver til en biologisk sikkerhed kabinet.
- For at udføre en artrotomi, dvs., en adskillelse af fælles, først definere den placering, hvor fælles artikulerer ved at udføre udvidelse og fleksion af leddet.
- Fjern forsigtigt flere lag af fedt, muskler og sener med en skalpel og kirurgisk pincet til at åbne op for det fælles område.
- Gøre et snit til at nå den fælles hulrum.
Bemærk: Den fælles hulrum er fyldt med synovial væske, som kan dryppe fra hulrummet, når du udfører et korrekt snit. - Fortsætte med at åbne fælles helt ved at skære gennem de sener, der holder leddet sammen.
- Inspicere brusk til makroskopisk skader.
Bemærk: Hvis ledbrusken ikke har en blank og glat udseende eller hvis tydeligt blærer, kløfter, eller defekter er til stede, kassere brusk. - Bruge en steril skalpel til at fjerne brusk fra subchondral knogle. Skåret helt ned til subchondral knogle også fjerne den dybe zone af brusk (figur 1). For at forhindre brusk fra udtørring, dryppe jævnligt brusk vask løsning på brusk.
Bemærk: På dette tidspunkt, er størrelsen af brusk skiver ligegyldigt. - Indsamle brusk skiver i 50 mL rør indeholdende tidligere forberedt brusk vask løsning (figur 2A).
- Når brusken fra alle områder af interesse, fryse snap brusk skiver i flydende kvælstof i 5 min.
- Overføre brusk skiver til 50 mL rør og straks lyophilize brusk skiver i 24 timer i en fastfrysning tørretumbler. Angive fryse tørretumbler på ca 0.090 mbar mens is kondensatoren er-51 ° C (figur 2B).
- Gemme brusk skiver på et tørt sted ved stuetemperatur indtil videre brug.
Bemærk: Frem til stillads dannelse har løsninger og brusk ikke udarbejdet og behandlet i et sterilt måde.
2. oprettelse af Decellularized brusk partikler
- Neddyppes frysetørrede brusk skiver i flydende kvælstof.
- Direkte male prøverne enten manuelt eller af en fræser. Når slibning brusk skiver i hånden, brug en morter og støder og slibe skiver i ca 45 min, indtil de er pulveriseret (figur 2 c og 2D). Når slibning automatisk, skal du bruge en fræser med forudindstillede hastighed i et par sekunder til et minut, indtil skiverne er snap-frosne brusk er pulveriseret.
Bemærk: Pre cool mørtel eller formaling maskine slibning rummet ved at tilføje flydende kvælstof. Når du bruger en fræser, Sørg for at alle partikler er jorden, og at ingen partikler forbliver i bunden af den slibning rum. - Sigten brusk partikler til at slippe af med større dele ved hjælp af en sigte med en maskestørrelse på 0.71 mm.
- Gemme partiklerne på et tørt sted ved stuetemperatur.
3. enzymatisk Decellularization med Trypsin 0.25%-EDTA
- Forbered fordøjelsen løsning, bestående af 0,25% trypsin med EDTA suppleret med 100 U/mL penicillin, 100 μg/mL streptomycin, og 1% (v/v) Amphotericin B. butik løsning ved 4 ° C.
Bemærk: Trypin er en protease, der nedbryder proteiner bosat i brusk væv. Denne enzymatiske skridt vil åbne den tætte brusk struktur. - Fylde 50 mL rør med pulveriseret brusk partikler op til et volumen på ca. 7,5 mL pr tube.
-
Inkuber brusk partikler med rede fordøjelsen løsning ved 37 ° C i 24 timer i alt, mens forfriskende fordøjelsen løsning hver 4 h.
- Først, tilsættes 30 mL af fordøjelsen løsning til hver 50 mL tube, som indeholder brusk partikler.
- Derefter resuspend partikler ved hjælp af en vortex eller pipette, således at alle partikler er udsat for en enzymatisk rengøringsopløsning.
- Inkuber prøver i 4 timer ved 37 ° C på en rulle.
- Hvis du vil opdatere fordøjelsen løsning, der centrifugeres rør i 20 min. på 3113 x g at forårsage sedimentation af brusk partikler. Supernatanten.
Bemærk: Supernatanten vil blive klarere med hver trypsin inkubationstid. - Gentag trin 3.3.1–3.3.4, indtil partiklerne har været inkuberet med fordøjelsen løsning 6 cyklusser af 4 h.
- Efter den sidste cyklus, Fjern supernatanten efter centrifugering og vaske partiklerne i 30 mL af brusk vask løsning to gange. Der centrifugeres partikler i 20 min. på 3113 x g mellem hver af vasker.
4. enzymatisk Decellularization med nukleasen behandling
- Forberede en 10 mM Tris-HCl løsning på pH 7,5 i ionbyttet vand.
- Tilføje 50 U/mL deoxyribonuclease og 1 U/mL ribonuklease eller RNAase A til Tris-HCl buffer, at opnå nukleasen løsning.
Bemærk: Dette trin er udført for at specifikt forringe deoxyribonucleases og ribonukleaser. - Hvis du vil fjerne brusk vask løsning fra brusk partikler (trin 3,4), centrifugeres i 20 min. ved 3,113 x g, og Fjern supernatanten.
- Der tilsættes 30 mL af nukleasen løsning til brusk partikler og rør partikler gennem opløsningen, og sørg for, at alle partikler er udsat for nukleasen løsning.
- Inkuber prøver på en valse i 4 timer ved 37 ° C.
- Fjern nukleasen løsning ved centrifugering brusk partikler i 20 min. på 3,113 x g og supernatanten.
- Vask prøverne ved at tilføje 30 mL i 10 mM Tris-HCl løsning uden deoxyribonuclease og ribonuklease eller RNAase A brusk partikler. Resuspend partikler og forlade prøverne på en valse i 20 timer ved stuetemperatur.
5. vaskemiddel Decellularization
- Gøre den rengøringsmiddel ved at opløse 1% (v/v) octoxynol-1 i PBS.
- Fjerne Tris-HCl løsning fra brusk partikler ved centrifugering i 20 min. på 3,113 x g og kassere supernatanten.
- Der tilsættes 30 mL af den forberedte 1% rengøringsmiddel til brusk partikler. Resuspend brusk partikler forsigtigt for at undgå skumdannelse af løsningen.
Bemærk: Dette trin nedbryder cellemembraner. - Inkuber prøver på en valse i 24 timer ved stuetemperatur på en rulle.
- Fjerne den rengøringsmiddel ved centrifugering i 20 min. på 3,113 x g og supernatanten.
-
For at fjerne alle rester af decellularization løsninger, skal du vaske brusk partikler i 6 cyklusser af 8 h i 30 mL af brusk vask løsning. Udføre vask på en rulle ved stuetemperatur.
- For at skifte til den næste vask, centrifugeres suspension for 20 min på 3,113 x g, supernatanten og tilføje frisk brusk vask løsning.
- Forlader den sidste vask i rør og gemme decellularized brusk partikler ved-80 ° C.
6. at skabe stilladser fra de Decellularized partikler
- Hvis partiklerne er blevet gemt på-80 ° C, tø de lukkede rør, der indeholder brusk partiklerne i varmt vand før du opretter stilladser.
- Overføre brusk partikler med en lille slev til en cylindrisk skimmel, for eksempel et plastik hætteglas med en diameter på 8 mm og en højde på 2 cm.
- Når du placerer brusk partikler i den plast støber, tryk på alle luftboblerne ud for at undgå hulrum i skafottet, og fyld formen indtil kanten.
Bemærk: Det vil være vanskeligere at tage stilladser ud af en metal skimmelsvamp efter stillads formation, som kan føre til sprækker i skafottet. - Fryse forme med brusk partikler i 10 min ved-20 ° C.
- Lyophilize brusk stilladser inden for deres forme til 24 h i en fastfrysning tørretumbler.
- Efter ingot, tage stillads af skimmel (figur 3) og krydse-link dem med ultraviolet (UV) lys på 30 cm afstand og 365 nm natten over.
- For at bruge stilladser til in vitro-cellekultur eller in vivo implantation, sterilisere stilladser med eksempelvis ethylen oxid (EO) gas.
Bemærk: EtO sterilisation udføres af en ekstern part.
7. karakterisering af Decellularized stilladser med histologiske Stainings
Bemærk: At sikre komplet decellularization og at visualisere de resterende naturlige karakter af brusk, udføre flere histologiske stainings før du bruger stilladser i enhver eksperiment, herunder hæmatoxylin og eosin (H & E) farvning for at sikre decellularization, Safranin-O farvning for at visualisere resterende GAG tilstedeværelse, kollagen type I-Immunohistokemi til at skelne mellem kollagen indhold og kollagen type II Immunohistokemi til at skelne mellem kollagen indhold.
- Skær stilladser i tynde skiver på ca 3 mm med en skalpel.
Bemærk: Hvis stilladser er skåret i større eller mindre størrelser, skal varigheder af dehydrering cykler tilpasses. - Integrere stilladser i en dråbe af 4% (w/v) calciumalginat og fremkalde danne tvaerbindinger ved at tilføje et tilsvarende volumen på 3,7% ikke-buffered formalin, der indeholder 20 mM CaCl2.
Bemærk: Calciumalginat indlejring gør stillads skiver mere stiv i forhold til vask trin før paraffin indlejring. I tilfælde af stilladser har været celle-seedede eller i vivo implanteret, er natriumalginat indlejring ikke nødvendigt, da sammensætningen af stilladser bliver resistente nok på grund af ECM indlemmelse af celler. - Dehydrere prøverne ved at placere dem i en gradueret ethanol serie, begyndende med en time cyklusser af 70%, 96%, 96%, 100% og 100% ethanol, efterfulgt af to 1t cyklusser af xylen, og slutter med to 1t cyklusser af paraffin ved 60 ° C.
- Efter dehydrering, paraffin-integrere prøverne i en støbeform og afkøle prøverne.
- Skær prøverne med en mikrotom i skiver 5 μm tykt.
- Før farvning, rehydrere prøverne ved at placere dem i en returnerede sorterede ethanol serie. Start med to skylninger xylen i 5 min, efterfulgt af 2 vasker 100%, 95% og 70% ethanol i 3 min. pr. vask. Endelig, vaske prøver 3 gange i vand i 2 min.
Bemærk: I tilfælde af bruge natriumalginat til at behandle prøver til paraffin indlejring, Sørg for at vaske af natriumalginat med 10 mM citronsyre inden rehydrering af sektionerne paraffin. - Pletten prøver med hæmatoxylin og eosin, Safranin-O, kollagen, og kollagen II som tidligere beskrevet11.
8. karakterisering af Decellularized stilladser med kvantitative analyser
- Få papain fordøjer af stilladser som tidligere beskrevet11.
- Udføre en assay med en fluorescens-baseret DNA kvantificering kit til at måle den dobbelt-strenget DNA indhold af stilladser til at sikre komplet decellularization. Følg den protokol, der er leveret af producenten. Express DNA beløb pr. tørvægt af skafottet.
- Udføre en dimethylmethylene blå assay for at kvantificere den resterende del af GAGs inden for skafottet, som tidligere beskrevet11. Express beløbet i GAG pr. DNA.
9. såning af Decellularized stilladser
- Skære steriliseret stilladser fra trin 6,7 i 3 mm tykke skiver.
- Overføre stilladser i separate brønde i en 6-godt plade.
- Rehydrere stilladser med cellekulturmedium af pipettering 1 mL medium oven på skafottet og lad det trække i 30 min. bruge enten Chondrocyt eller mesenchymale stamceller (MSC) ekspansion medium.
Bemærk: Brug den samme medium til stillads rehydrering som for cellekultur af de celler, der vil være seedet. Chondrocyt ekspansion medium består af Dulbeccos modificerede medier (DMEM) med 10% varme-inaktiverede føtal bovint serum (FBS), 100 U/mL penicillin, 100 μg/mL streptomycin og 10 ng/mL fibroblast vækstfaktor-2 (FGF-2). MSC ekspansion medium består af minimum afgørende medium alpha (a-MEM) med 10% varme-inaktiverede FBS, 0,2 mM L-ascorbinsyre syre 2-fosfat, 100 U/mL penicillin, 100 μg/mL streptomycin og 10 ng/mL FGF-2. - Forbered 3 x 106 celler i 100 μL af medium, som er den nødvendige volumen for hver stillads med en diameter på 8 mm og en højde på 3 mm.
Bemærk: Flere celletyper fra forskellige arter kan bruges til såning. Når du bruger chondrocytter eller mesenchymale stromale celler, isolere cellerne som tidligere beskrevet11. Når du bruger chondrocytter, Sørg for, at de ikke blevet udvidet forbi P1 passage for at minimere antallet af dedifferentiated chondrocytter. Når du bruger mesenchymale stromale celler, skal de blive testet på deres evne til multi lineage differentiering, som tidligere beskrevet14. - Med pipette overfoeres 50 μL forberedt cellesuspension oven på den pre-gennemblødt stillads og inkuberes stillads i 1 timer ved 37 ° C.
- Forsigtigt slå stillads på hovedet ned, afpipetteres de resterende 50 μL af cellesuspension på denne side af skafottet og Inkuber i 1 time ved 37 ° C.
- Efter inkubering tilsættes 3 mL medium brønde og kultur de celle-seedede stilladser ved 37 ° C. Håndtere kultur pladen forsigtigt for at undgå udstationering af celler.
- Kultur stilladser i perioden, der kræves til eksperimentet og ændre mediet 2 – 3 gange om ugen. Med pipette overfoeres langsomt og så langt væk fra stillads som muligt.
- Efter dyrkning af celle-seedede skafottet, halveret stilladser og behandle dem for både histologi og biokemiske analyser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Decellularization af CDM stilladser skal altid bekræftes ved hjælp af histologiske stainings samt ved hjælp af DNA kvantificering til at måle mængden af DNA rester. Utilstrækkelig decellularization kan føre til uønskede immunologiske reaktioner, der påvirker resultaterne i in vivo indstillinger15,16,17. For denne særlige decellularization metode, DNA var under registreringsområde, som startede på 13,6 ± 2.3 ng/mg DNA/tør vægt (n = 3). Fuld decellularization bruger denne protokol vil føre til produktion af et stillads, der er rig på kollagen type II (figur 4 c) og har ingen celler (figur 4A) eller GAGs (figur 4B). Sunde heste brusk vises som sammenligning, farvet for Safranin-O (figur 5A) og kollagen II (figur 5B).
Skafottet skal vise en makroskopisk homogen porøsitet. Luftbobler vil føre til en let kan påvises store huller i skafottet og er, derfor, omhyggeligt fjernet. Disse store huller i skafottet kan have en skadelig indvirkning på de mekaniske egenskaber og føre til storaftagere celle udlæg efter såning. Vellykket produktion af skafottet også indebærer en freeze-drying trin varig i mindst 24 timer; Dette vil føre til et stillads, der har en hvid udseende (figur 3). I tilfælde af utilstrækkelig ingot, stilladser vil have en gullig farve og ingen tydelige porer kan observeres.
I orden til stillads skal anvendes til in vivo skal applikationer og in vitro celle-såning, celle integration med stillads, samt cellulære funktioner, vises. Her, stilladser var seedet med MSC'er, der producerede ECM efter 4 (Figur 6A-D) og 6 (figur 6E-H) uger af in vitro dyrkning. Dannelsen af GAG, kollagen II og en perifer kollagen jeg, samt tilstedeværelsen af celler, blev vist. Derudover vises specificiteten af kollagen II i figur 5B, hvor brusk men ikke knogle er plettet positive for kollagen II i en osteochondral-stik.
Figur 1: Equine knæ efter fjernelse fuld-tykkelse brusk. Brusk er fjernet fra condyles ved hjælp af en skalpel, indtil de forkalkede brusk lag, der ikke kan skæres ved hjælp af en skalpel er nået. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: sekventielle trin i oprettelsen af decellularized brusk-afledte matrix partikler. (A) brusk udsnit, der er blevet fjernet fra condyles er vasket i et antibiotikum-infunderes løsning. (B) brusk skiver er frysetørret, og nu har en hvid og papir-lignende udseende. (C) Snap-frysning af frysetørrede brusk er udført lige før (D) pulverisering brusk partikler af hånd-fræsning ved hjælp af en morter og pistil. Trin D kan også gøres med automatiske fræsning. Dette tal er blevet ændret fra BenderSørensen et al.11. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: det endelige produkt, en decellularized brusk-afledte matrix stillads. Denne cylindriske stillads er 2 cm høj og har en diameter på 8 mm. Skafottet har en klar porøse struktur. Den venstre og højre billede viser et stillads fra to forskellige vinkler. Bemærk at ingen store huller er til stede på overfladen af skafottet som alle luftboblerne blev fjernet før ingot. Dette tal er blevet ændret fra Benders et al.11. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: histologisk karakterisering af skafottet. (A) H & E farvning viser ECM partikler i forskellige størrelser og fraværet af celler. (B) Safranin-O farvning viser, at ingen GAGs er bevaret i decellularization processen. (C) kollagen type II immunolocalization afslører, at de decellularized partikler er rig på kollagen type II. Skalere barer = 500 µm. Dette tal er blevet ændret fra Benders et al.11. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5: histologisk repræsentation af sunde heste brusk. (A) en osteochondral plug farves med Safranin-O og hurtigt grøn viser knogle uden GAGs (grøn), brusk med GAGs (rød) og forkalkede brusk lag i mellem. (B) en kollagen II-farvede osteochondral plug pletter brusk men ikke knogle. Skalere barer = 500 µm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 6: Neo-matrix dannelse på skafottet efter 4-6 uger af kultur ved hjælp af mesenchymale stromale celler. Efter 4 (A-D) og 6 (E-H) uger af kultur, nydannede matrix er rigt på celler (A + E), kollagen II (B + F), og GAGs (C + G), som kan iagttages med H & E, kollagen II og Safranin-O stainings, henholdsvis. Derudover kollagen jeg er til stede efter både 4 (D) og 6 (H) uger i periferien af skafottet. Celle tæthed samt mængden af matrix deposition er højere i periferien. Skalere barer = 500 µm. Dette tal er blevet ændret fra Benders et al.11. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
ECM af ledbrusken er meget tætte og meget modstandsdygtige over for forskellige enzymatiske behandlinger. Multi-trins decellularization protokollen beskrevet i denne artikel omhandler sådanne modstand og genererer held decellularized matricer. For at opnå det, processen strækker sig over flere dage. Mange decellularization processer er blevet foreslået for forskellige typer af væv18, og i denne artikel beskrives en protokol, der er egnet til decellularization af brusk. I denne protokol er det dog nødvendigt at følge den enzymatiske behandling med vaskemiddel trin for at fjerne alle celler. Mængden af DNA er faldet bemærkelsesværdigt i de første par skridt involverer behandling med trypsin, og udelade disse skridt ikke vil resultere i ordentlig decellularization11.
Bemærk, at denne protokol er baseret på decellularization af equine brusk væv. Aktiviteten af enzymet løsninger anvendes blev fundet tilstrækkelige til passende fjernelse af den jævndøgn chondrocytter. Men trods bevarelse af matrix sammensætning på tværs af arter, protokollen kan have justeres for decellularization af brusk fra andre dyr på grund af forskelle i mængden af naturligt bosat chondrocytter19. For eksempel, brusk af mindre dyr er kendt for at have et højere celleindhold af, og kan derfor kræve en mere aggressiv decellularization proces. En særlig grund til at vælge heste brusk til at oprette decellularized stilladser er at heste og menneskelige brusk viser klart lighed i tykkelse, celle tæthed og biokemisk make-up20.
For at sikre en reproducerbar produkt, kan flere vurderingskriterier være vigtig for at bestemme om komplet decellularization er opnået. I denne protokol, blev både en H & E farvning og biokemiske kvantificering brugt til at vurdere det resterende beløb af DNA i slutproduktet. Andre forskere har også foreslået at bestemme størrelsen af de resterende DNA, med et maksimum på 200 bp i længden for kvalitet kontrollerer21, eller en resterende DNA beløb på mindre end 50 ng/mg tørre væv vægt18,22. Ændringer til protokollen skal uanset hvad, altid følges op med histologiske evaluering og kvantitative analyser at fastslå effekten af decellularization, samt de resterende ECM produkter.
Den største begrænsning af denne protokol er at den grundige decellularization procedure som indebaerer udsaettelse for trypsin fører til omfattende tab af GAGs. Selvom trypsin ikke spaltes GAGs, kan årsagen til tabet af GAGs være åbningen op af brusk væv af trypsin holde proteiner, der anker eller indkapsle GAGs. ECM komponenter som GAGs er vigtige for at bevare vand i ledbrusken, og derfor spiller en væsentlig rolle i den biomekaniske modstandsdygtighed af væv4. Protokoller, der har til formål at mindske tabet af GAGs under hele decellularization vil påvirke grundigheden af decellularization processen.
Efter decellularization, har vist celle integration og funktion i celle-seedede stilladser. Tidligere forskning har vist, at matrix produktion af chondrocytter på denne stillads er utilfredsstillende, især når man sammenligner med rigelige matrix deposition af mesenchymale stromale celler11. Da brusk-lignende væv er deponeret på skafottet, er denne nye matrix generelt først deponeres i periferien af skafottet før invaderer resten af stilladser. Dette kan ses tydeligt på de histologiske skiver hvor en celle-rige periferien, snarere end en celle-rige center, er ofte set (figur 6). Denne effekt kan dog nedsættes, når du bruger perfusion bioreaktorer til celle såning og øge næringsstof exchange. Som matrix deposition opstår, vil stilladser også antage en blankere udseende, bliver mere mekanisk konsekvent og mindre sprødt. Som sådan, kan de nemt skæres ved hjælp af en skalpel uden at falde fra hinanden. Egenskaberne for den nydannede matrix kan evalueres ved hjælp af både histologiske stainings og kvantitative assays. Som ingen GAGs er tilbage efter decellularization processen, bliver alle de GAGs, der kan måles kvantitativt et produkt af neosynthesis.
Stilladser fremstillet ved hjælp af denne decellularization protokol giver en off-the-shelf løsning og kan implanteres uden nødvendighed af celle-seeding forud for implantation. Dog når det anvendes som en behandling for (osteo) chondral defekter, vil de biomekaniske egenskaber skulle styrkes for at mindske risikoen for indrykning af konstruktionen i de tidlige faser af artikulær lastning. Co implantation med beskyttende lag på toppen eller andre forstærkning strategier skal implementeres. I fremtiden, kan yderligere finjustering af protokollen forbedre skafottet regenerativ potentiale. For eksempel, opbevaring af GAGs, bevarelse af kollagen fiber orientering eller kombineret med andre biomaterialer at styrke disse stilladser kan være gavnligt at give mulighed for en forbedret og glat folier artikulære overflade. Derfor, disse stilladser kan spille en rolle som komponenter af den næste generation af regenerativ grafts til behandling af (osteo) chondral defekter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer, at de har ingen konkurrerende finansielle interesser.
Acknowledgments
Forfatterne vil gerne anerkende W. Boot for bistand til fremstilling af stilladser. K.E.M. Benders understøttes af Alexandre Suerman Stipendium fra University Medical Center. R. Levato og J. Malda understøttes af den hollandske Arthritis Foundation (tilskudsaftaler CO-14-1-001 og LLP-12, henholdsvis).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cadaveric joint | This can be obtained as rest material from the local butcher or veterinary center. | ||
| Sterile phosphate-buffered saline (PBS) | |||
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140 | |
| Amphotericin B | Thermo Fischer Scientific | 15290026 | |
| Liquid nitrogen | |||
| Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red | Thermo Fischer Scientific | 25200072 | |
| Tris-HCl pH 7.5 | |||
| Deoxyribonuclease I from bovine pancreas | Sigma-Aldrich | DN25 | |
| Ribonuclease A from bovine pancreas | Sigma-Aldrich | R6513 | |
| Triton X-100 (octoxynol-1) | Sigma-Aldrich | X100 | |
| Papain | Sigma-Aldrich | P3125 | |
| Trisodium citrate dihydrate | Sigma-Aldrich | S4641 | |
| Alginate | Sigma-Aldrich | 180947 | |
| Formalin | |||
| CaCl2 | |||
| Ethanol | |||
| Xylene | |||
| Paraffin | |||
| Ethylene oxide sterilization | Synergy Health, Venlo, the Netherlands | ||
| Multipotent Stromal cells/chondrocytes from equine donors | MSCs and chondrocytes can be isolated from donor joints that are rest material, coming from the local butcher or veterinary center. | ||
| MEM alpha | Thermo Fischer Scientific | 22561 | |
| L-ascorbic acid 2-phosphate | Sigma-Aldrich | A8960 | |
| DMEM | Thermo Fischer Scientific | 41965 | |
| Heat inactivated bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | 10735086001 | |
| Fibroblast growth factor-2 (FGF-2) | R & D Systems | 233-FB | |
| DNA quantification kit (Quant-iT PicoGreen dsDNA Reagent) | Thermo Fischer Scientific | P7581 | |
| 1,9-Dimethyl-Methylene Blue zinc chloride double salt | Sigma-Aldrich | 341088 | |
| Freeze-dryer | SALMENKIPP | ALPHA 1-2 LD plus | |
| Analytical mill | IKA | A 11 basic | |
| mortar/pestle | Haldenwanger 55/0A | ||
| Roller plate | CAT | RM5 | |
| Centrifuge (for 50 mL tubes) | Eppendorf | 5810R | |
| Capsule (cylindric mold) | TAAB | 8 mm flat | |
| Superlite S UV | Lumatec | 2001AV | |
| Incubator | |||
| Microtome | |||
| Sieve (mesh size 0.71 mm) | VWR | 34111229 | |
| Scalpel | |||
| Scalpel holder | |||
| Small laddle |
References
- Dunlop, D. D., et al. Risk factors for functional decline in older adults with arthritis. Arthritis and rheumatism. 52 (4), 1274-1282 (2005).
- Fitzpatrick, K., Tokish, J. M. A military perspective to articular cartilage defects. The journal of knee surgery. 24 (3), 159-166 (2011).
- Flanigan, D. C., Harris, J. D., Trinh, T. Q., Siston, R. A., Brophy, R. H. Prevalence of chondral defects in athletes' knees: a systematic review. Medicine and science in sports and exercise. 42 (10), 1795-1801 (2010).
- Martel-Pelletier, J., Boileau, C., Pelletier, J. P., Roughley, P. J. Cartilage in normal and osteoarthritis conditions. Best practice & research. Clinical rheumatology. 22 (2), 351-384 (2008).
- Vinatier, C., et al. Cartilage tissue engineering: towards a biomaterial-assisted mesenchymal stem cell therapy. Current stem cell research & therapy. 4 (4), 318-329 (2009).
- Taylor, D. A., Sampaio, L. C., Ferdous, Z., Gobin, A. S., Taite, L. J.
- Vashi, C. Clinical Outcomes for Breast Cancer Patients Undergoing Mastectomy and Reconstruction with Use of DermACELL, a Sterile, Room Temperature Acellular Dermal Matrix. Plastic Surgery International. 2014 (704323), 1-7 (2014).
- Satterwhite, T. S., et al. Abdominal wall reconstruction with dual layer cross-linked porcine dermal xenograft: the "Pork Sandwich" herniorraphy. Journal of plastic, reconstructive & aesthetic surgery : JPRAS. 65 (3), 333-341 (2012).
- Martinello, T., et al. Successful recellularization of human tendon scaffolds using adipose-derived mesenchymal stem cells and collagen gel. Journal of tissue engineering and regenerative medicine. 8 (8), 612-619 (2014).
- Benders, K. E., et al. Extracellular matrix scaffolds for cartilage and bone regeneration. Trends in biotechnology. 31 (3), 169-176 (2013).
- Benders, K. E., et al. Multipotent Stromal Cells Outperform Chondrocytes on Cartilage-Derived Matrix Scaffolds. Cartilage. 5 (4), 221-230 (2014).
- Gawlitta, D., et al. Decellularized cartilage-derived matrix as substrate for endochondral bone regeneration. Tissue engineering. Part A. 21 (3-4), 694-703 (2015).
- Yang, Z., et al. Fabrication and repair of cartilage defects with a novel acellular cartilage matrix scaffold. Tissue engineering. Part C, Methods. 16 (5), 865-876 (2010).
- Pittenger, M. F., et al. Multilineage potential of adult human mesenchymal stem cells. Science. 284 (5411), 143-147 (1999).
- Meyer, S. R., et al. Decellularization reduces the immune response to aortic valve allografts in the rat. The Journal of thoracic and cardiovascular surgery. 130 (2), 469-476 (2005).
- Brown, B. N., Valentin, J. E., Stewart-Akers, A. M., McCabe, G. P., Badylak, S. F. Macrophage phenotype and remodeling outcomes in response to biologic scaffolds with and without a cellular component. Biomaterials. 30 (8), 1482-1491 (2009).
- Keane, T. J., Londono, R., Turner, N. J., Badylak, S. F. Consequences of ineffective decellularization of biologic scaffolds on the host response. Biomaterials. 33 (6), 1771-1781 (2012).
- Crapo, P. M., Gilbert, T. W., Badylak, S. F. An overview of tissue and whole organ decellularization. Biomaterials. 32 (12), 3233-3243 (2011).
- Malda, J., et al. Of mice, men and elephants: the relation between articular cartilage thickness and body mass. PloS One. 8 (2), e57683 (2013).
- Malda, J., et al. Comparative study of depth-dependent characteristics of equine and human osteochondral tissue from the medial and lateral femoral condyles. Osteoarthritis and Cartilage. 20 (10), 1147-1151 (2012).
- Londono, R., Badylak, S. F. Biologic scaffolds for regenerative medicine: mechanisms of in vivo remodeling. Annals of biomedical engineering. 43 (3), 577-592 (2015).
- Gilbert, T. W. Strategies for tissue and organ decellularization. Journal of cellular biochemistry. 113 (7), 2217-2222 (2012).
