Summary
Decellularized andaimes derivado de cartilagem podem ser usados como um andaime para guia de reparação da cartilagem e como um meio para regenerar o tecido osteocondral. Este documento descreve o processo de decellularization em detalhes e fornece sugestões para usar estes andaimes em configurações in vitro.
Abstract
Defeitos osteocondrais faltam capacidade intrínseca reparação suficiente para regenerar tecidos funcionalmente som do osso e cartilagem. Nesta medida, cartilagem pesquisa centrou-se no desenvolvimento de andaimes regenerativas. Este artigo descreve o desenvolvimento de andaimes que derivam-se completamente da matriz extracelular da cartilagem natural, vindo de um doador de equino. As aplicações potenciais dos andaimes incluem produzindo aloenxertos para reparação da cartilagem, servindo como um andaime para tecido osteocondral engenharia e fornecendo modelos in vitro para estudar a formação de tecido. Por decellularizing o tecido, as células do dador são removidas, mas muitas das dicas bioativas naturais são pensadas para ser mantido. A principal vantagem do uso de um andaime tão natural em comparação com um andaime produzido sinteticamente é que não mais functionalization de polímeros é necessária para a regeneração do tecido osteocondral unidade. Os matriz da cartilagem-derivado andaimes podem ser usados para a regeneração de tecidos do osso e cartilagem nas configurações tanto in vivo e in vitro.
Introduction
Defeitos da cartilagem articular no joelho causadas por eventos traumáticos podem levar ao desconforto e acima de tudo, podem ter um grande impacto na vida da população jovem e ativo1,2,3. Além disso, danos na cartilagem em uma idade jovem podem levar a um início mais rápido da osteoartrite mais tarde na vida4. Atualmente, a única terapia de resgate para osteoartrite generalizada do joelho é a cirurgia de substituição articular. Como a cartilagem é um tecido avascular, aneural e hipocelular, sua capacidade regenerativa é severamente limitada. Portanto, abordagens de medicina regenerativa são procuradas para ajudar e estimular a capacidade regenerativa do tecido nativo. Para esta finalidade, os andaimes são projetados e usados como qualquer célula-portador ou como um material indutivo que incita a diferenciação e regeneração do tecido nativo células5 do corpo.
Decellularized andaimes têm sido amplamente estudados dentro medicina regenerativa6. Teve algum sucesso, por exemplo, em ajudar a regeneração da pele7, estruturas abdominal8e tendões9. A vantagem de usar andaimes decellularized é sua origem natural e sua capacidade de reter as sugestões bioativas que atraem e induzem a diferenciação celular em linhagem adequada necessária para reparação de tecido6,10. Além disso, desde que a matriz extracelular (ECM) é um biomaterial natural, e decellularization impede uma resposta imune potencial removendo conteúdo celular ou genético, questões relativas à biocompatibilidade e biodegradabilidade são superados.
Andaimes de matriz de cartilagem-derivado (CDM) demonstraram chondrogenic grande potencial em experimentos in vitro, quando inoculado com células estromais mesenquimais11. Além disso, estes andaimes têm mostrado o potencial para o tecido ósseo de forma através da ossificação endocondral localizações ectópicas em configurações vivo em12. Como andaimes CDM orientar a formação de ambos nos ossos e tecido cartilaginoso, estes andaimes podem ter potenciais para reparação de defeitos osteocondrais além de reparação da cartilagem.
Este artigo descreve um protocolo adaptado de Yang et al (2010)13 para a produção de andaimes de MDL decellularized de equino sufocar a cartilagem. Estes andaimes são ricos em colágeno tipo II e desprovida de células e não contêm qualquer glicosaminoglicanos (GAGs) após decellularization. Experimentos in vitro e in vivo no reparo de defeito condral (osteo) podem ser realizados usando estes andaimes.
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Protocol
Para este protocolo, obteve-se asfixiar equinos cartilagem de cavalos que tinham morrido de outras causas de osteoartrite. Tecido foi obtido com a permissão dos proprietários, em conformidade com as normas de éticas institucionais.
Nota: Este protocolo descreve a fabricação de andaimes da cartilagem de equina decellularized, que pode ser usado para aplicações como plataformas de cultura de tecidos in vitro ou para implantação na vivo em estratégias de medicina regenerativa. As etapas de tratamento enzimático devem ser realizadas descrito por ordem cronológica.
1. colheita de cartilagem Articular do doador (cadavéricos) articulações
- Em frente da etapa de colheita, preparar 1 L de cartilagem, solução de lavagem, consistindo de estéril fosfato salino (PBS), suplementado com 100 U/mL penicilina, 100 µ g/mL Estreptomicina e 1% (v/v) anfotericina b.
- Use luvas e avental durante todo o procedimento colheita, desde que o doador pode transportar patógenos.
- Obter uma articulação intacta (cadavérico) para isolamento de cartilagem.
Nota: Neste ponto, a pele ao redor da articulação ainda está intacta. Cartilagem de equinos asfixiar Obtida de cavalo foi usada no presente protocolo, mas outras articulações de outras espécies também podem ser usadas. - Retire a pele que fica ao redor da área comum de interesse usando um bisturi e uma pinça cirúrgica. Além disso, remova excessivo de gordura e o tecido muscular se necessário, sem danificar a articulação subjacente. Opcionalmente, transferi o cadáver preparado para uma câmara de segurança biológica.
- Para executar uma artrotomia, isto é, uma separação da articulação, primeiro defina o local onde a articulação articula-se através da realização de extensão e flexão da articulação.
- Remova cuidadosamente o mais camadas de gordura, músculos e tendões com um bisturi e pinça cirúrgica para abrir a área comum.
- Fazer uma incisão para alcançar a cavidade articular.
Nota: A cavidade articular é preenchida com líquido sinovial, que pode gotejar da cavidade ao realizar uma incisão correta. - Continue a abrir-se a articulação completamente cortando através dos tendões que manter a articulação unida.
- Inspecione a cartilagem por quaisquer danos macroscópicos.
Nota: Se a cartilagem articular não tem uma aparência brilhante e macia ou evidente bolhas, fissuras ou defeitos estão presentes, descarte a cartilagem. - Use um bisturi estéril para remover a cartilagem do osso subcondral. Corte todo o caminho até o osso subcondral também remover a zona profunda da cartilagem (Figura 1). Para impedir que a cartilagem da secagem, regularmente gotejamento cartilagem solução de lavagem na cartilagem.
Nota: Neste momento, não importa o tamanho das fatias de cartilagem. - Recolha as fatias de cartilagem em tubos de 50 mL contendo cartilagem previamente preparada (Figura 2A) de solução de lavagem.
- Depois de coletar a cartilagem de todas as áreas de interesse, snap congelar as fatias de cartilagem em nitrogênio líquido por 5 min.
- Transferir as fatias de cartilagem para tubos de 50 mL e imediatamente lyophilize as fatias de cartilagem por 24 h em um secador de gelo. Defina o congelamento secador a aproximadamente 0,090 mbar enquanto o condensador de gelo é-51 ° C (Figura 2B).
- Armazene as fatias de cartilagem no lugar seco à temperatura ambiente até nova utilização.
Nota: Até o ponto de formação do andaime, as soluções e a cartilagem não precisa ser preparado e Tratado de forma estéril.
2. criação de Decellularized partículas de cartilagem
- Mergulhe as fatias de cartilagem liofilizada em nitrogênio líquido.
- Diretamente moa as amostras manualmente ou por uma máquina de trituração. Quando as fatias de cartilagem afiar manualmente, use um almofariz e um pilão e moer as fatias por aproximadamente 45 min, até que eles são pulverizadas (Figura 2 e 2D). Quando moagem automaticamente, use uma máquina de trituração à velocidade pré-definida por alguns segundos até um minuto, até que as fatias de cartilagem snap-congelados são pulverizadas.
Nota: Pre-legal a argamassa ou compartimento de moagem da máquina trituração pela adição de nitrogênio líquido. Ao usar uma máquina de trituração, certificar-se de que todas as partículas são terra, e que nenhuma partícula permanecer no fundo do compartimento de moagem. - Peneire as partículas de cartilagem para se livrar de peças maiores, usando uma peneira com uma malhagem de 0,71 mm.
- Armazene as partículas em lugar seco à temperatura ambiente.
3. enzimática Decellularization com tripsina 0.25%-EDTA
- Preparar a solução de digestão, consistindo de tripsina 0,25% com EDTA suplementado com 100 U/mL penicilina, 100 μg/mL Estreptomicina e 1% (v/v) anfotericina B. loja a solução a 4 ° C.
Nota: Trypin é uma protease que degrada proteínas residentes no tecido da cartilagem. Esta etapa enzimática abrirá a estrutura da cartilagem densa. - Encha os tubos de 50 mL com as partículas de cartilagem pulverizado até um volume de aproximadamente 7,5 mL por tubo.
-
Incube as partículas de cartilagem com a solução de digestão preparado a 37 ° C por 24 h no total, ao mesmo tempo refrescante a solução de digestão todas as 4h.
- Primeiro, adicione 30 mL da solução de digestão a cada tubo de 50 mL que contém partículas de cartilagem.
- Em seguida, resuspenda as partículas usando um vórtice ou pipeta para que todas as partículas estão expostas a solução enzimática.
- Incube as amostras por 4 h a 37 ° C em um rolo.
- Para atualizar a solução de digestão, centrifuga os tubos por 20 min a 3113 x g, para causar a sedimentação das partículas de cartilagem. Desprezar o sobrenadante.
Nota: O sobrenadante se tornará mais claro com cada período de incubação de tripsina. - Repita o passo 3.3.1–3.3.4 até as partículas têm sido incubadas com a solução de digestão por 6 ciclos de 4 h.
- Após o ciclo final, remover o sobrenadante após centrifugação e lavar as partículas em 30 mL da solução de lavagem duas vezes de cartilagem. Centrifugar as partículas por 20 min a 3113 x g, entre cada uma das lavagens.
4. enzimática Decellularization com tratamento de Nuclease
- Prepare uma solução de Tris-HCl pH 7,5 em água desionizada de 10 mM.
- Adicione 50 desoxirribonuclease U/mL e 1 ribonuclease U/mL A de tampão Tris-HCl, para obter a solução de nuclease.
Nota: Esta etapa é executada para degradar especificamente desoxirribonucleases e ribonucleases. - Para remover a cartilagem lavagem com solução de partículas de cartilagem (passo 3.4), centrifugar por 20 min a 3.113 x ge remover o sobrenadante.
- Adicione 30 mL da solução de nuclease para as partículas de cartilagem e mexa as partículas através da solução, certificando-se de que todas as partículas são expostas para a solução de nuclease.
- Incubar as amostras em um rolo de 4 h a 37 ° C.
- Remover a solução de nuclease por centrifugação as partículas de cartilagem por 20 min a 3.113 x g e descartar o sobrenadante.
- Lave as amostras adicionando 30ml de 10 mM Tris-HCl solução sem a desoxirribonuclease e ribonuclease às partículas de cartilagem. Resuspenda as partículas e deixar as amostras em um rolo para 20 h à temperatura ambiente.
5. detergente Decellularization
- Fazer a solução detergente dissolvendo-se 1% (v/v) em PBS Octoxinol-1.
- Remova a solução de Tris-HCl de partículas de cartilagem por centrifugação por 20 min a 3.113 x g e descartar o sobrenadante.
- Adicione 30 mL da solução detergente 1% preparado para as partículas de cartilagem. Resuspenda as partículas de cartilagem com cuidado para evitar a formação de espuma da solução.
Nota: Esta etapa divide as membranas celulares. - Incube as amostras em um rolo por 24 horas à temperatura ambiente em um rolo.
- Remover a solução detergente por centrifugação por 20 min a 3.113 x g e descartar o sobrenadante.
-
Para remover todos os restos das soluções decellularization, lave as partículas de cartilagem em 6 ciclos de 8 h em 30 mL de solução de lavagem de cartilagem. Realize a lavagem em um rolo à temperatura ambiente.
- Para mudar para a próxima lavagem, centrifugar a suspensão por 20 min a 3.113 x g, desprezar o sobrenadante e Adicionar nova cartilagem, solução de lavagem.
- Deixe a última lavagem dos tubos e armazenar as partículas de cartilagem decellularized a-80 ° C.
6. Criando andaimes das partículas Decellularized
- Se as partículas foram armazenadas a-80 ° C, descongele tubos fechados que contêm partículas de cartilagem em água quente antes de criar os andaimes.
- Transferi as partículas de cartilagem com uma concha pequena para um molde cilíndrico, por exemplo, um tubo de ensaio plástico com um diâmetro de 8 mm e uma altura de 2 cm.
- Ao colocar as partículas de cartilagem no molde plástico, pressione todas as bolhas de ar para fora para evitar cáries no cadafalso e encher o molde até a borda.
Nota: Será mais difícil tomar os andaimes fora um molde metal depois da formação do andaime, que pode levar a rachaduras no cadafalso. - Congelar os moldes com partículas de cartilagem para min 10 a-20 ° C.
- Lyophilize os andaimes de cartilagem dentro seus moldes por 24 h em um secador de gelo.
- Após a liofilização, pegue o andaime fora do molde (Figura 3) e cross-link-los com radiação ultravioleta (UV) luz à distância de 30 cm e 365 nm durante a noite.
- Para utilizar os andaimes para cultura de células in vitro ou in vivo implantação, esterilize os andaimes com, por exemplo, gás de (EtO) de óxido de etileno.
Nota: Esterilização EtO é executada por uma parte externa.
7. caracterização dos andaimes Decellularized com colorações histológicas
Nota: Para garantir a completa decellularization e visualizar o caráter natural restante da cartilagem, executar várias colorações histológicas antes de usar os andaimes em qualquer experimento, incluindo hematoxilina e eosina (H & E) coloração para garantir decellularization, safranina-O coloração para visualizar a presença residual de mordaça, colágeno tipo I imuno-histoquímica para diferenciar entre o conteúdo de colágeno e colágeno tipo II imuno-histoquímica para diferenciar entre o conteúdo de colágeno.
- Corte os andaimes em fatias finas de aproximadamente 3 mm com um bisturi.
Nota: Se os andaimes são cortados em tamanhos maiores ou menores, as durações dos ciclos de desidratação precisam ser adaptado. - Incorporar os andaimes em uma queda de 4% (p/v) alginato e induzir o cross-linking, adicionando um volume semelhante de 3,7% em buffer não formol que contém 20 mM CaCl2.
Nota: Incorporação de alginato torna as fatias de andaime mais rígida em comparação com as etapas de lavagem antes da incorporação de parafina. No caso que os andaimes têm sido célula-semeado ou na vivo implantado, incorporação de alginato não é necessário, como a composição dos andaimes será resistente o suficiente devido à incorporação de ECM pelas células. - Desidratar as amostras por colocando-os em uma série de etanol gradual, começando com uma hora ciclos de 70%, 96%, 96%, 100% e 100% de etanol, seguido por dois ciclos de 1h de xileno e terminando com dois ciclos de 1h de parafina a 60 ° C.
- Após desidratação, parafina-incorporar as amostras em um molde e arrefecer as amostras.
- Corte as amostras com um micrótomo em fatias de 5 μm de espessura.
- Antes de coloração, hidratar as amostras, colocando-os em uma série de etanol classificados retornado. Comece com duas lavagens de xileno por 5 min, seguido por 2 lavagens de etanol 100%, 95% e 70% por 3 min por lavagem. Finalmente, lave as amostras 3 vezes em água por 2 min.
Nota: No caso de usar alginato para processar amostras para incorporação de parafina, certifique-se de lavar o alginato com ácido cítrico de 10 milímetros antes da reidratação das secções de parafina. - Manchar as amostras com hematoxilina e eosina, safranina-O, colágeno I e colágeno II como descrito anterior11.
8. caracterização dos andaimes Decellularized com análises quantitativas
- Obter digests de papaína dos andaimes conforme descrito anteriormente,11.
- Realize um ensaio com um kit de quantificação de DNA baseado em fluorescência para medir o teor de DNA dobro-Costa dos andaimes para garantir a completa decellularization. Siga o protocolo fornecido pelo fabricante. Expresse a quantidade de DNA por peso seco do cadafalso.
- Realize um ensaio de dimethylmethylene azul para quantificar o restante dos GAGs dentro do andaime, conforme descrito anteriormente,11. Expresse a quantidade na mordaça por DNA.
9. propagação dos andaimes Decellularized
- Corte esterilizados andaimes da etapa 6,7 em 3mm fatias grossas.
- Transferi os andaimes em separado poços de uma placa de 6.
- Re-hidratar por pipetagem 1 mL de meio em cima do andaime andaimes com meio de cultura celular e deixe de molho por 30 min. Use condrócitos ou médio de expansão de células-tronco mesenquimais (MSC).
Nota: Utilize o mesmo meio para reidratação de andaime quanto a cultura celular das células que será propagada. Condrócito expansão medium consiste em meios de comunicação modificados de Dulbecco (DMEM) com 10% inactivadas pelo calor fetal de soro bovino (FBS), 100 penicilina U/mL, 100 μg/mL Estreptomicina e 10 ng/mL fator de crescimento de fibroblastos-2 (FGF-2). MSC expansão medium consiste em mínimo essencial média alfa (a-MEM) com 10% inactivadas pelo calor FBS, 0,2 mM 2-fosfato de ácido L-ascórbico, 100 U/mL penicilina, estreptomicina 100 de μg/mL e 10 ng/mL FGF-2. - Prepare 3 x 106 células em 100 μL de meio, que é o volume necessário para cada andaime com um diâmetro de 8 mm e uma altura de 3 mm.
Nota: Vários tipos de células de diferentes espécies podem ser usados para propagação. Quando usando condrócitos ou células estromais mesenquimais, isole as células, como descrito anteriormente,11. Quando usando condrócitos, certifique-se de que eles não foram ampliados após a passagem de P1 a fim de minimizar o número de condrossarcoma condrócitos. Ao usar células estromais mesenquimais, eles devem ser testados na sua capacidade de diferenciação da linhagem multi, como descrito anteriormente,14. - Pipetar 50 μL de preparada a suspensão de células em cima do andaime previamente embebido e incubar o andaime para 1 h a 37 ° C.
- Cuidadosamente Ligue o andaime de cabeça para baixo, pipetar os restantes 50 μL de suspensão de células deste lado do andaime e incubar durante 1 h a 37 ° C.
- Após a incubação, adicionar 3 mL de meio para os poços e cultura os andaimes célula-semeado a 37 ° C. Lidar com a placa de cultura com cuidado para evitar o desprendimento das células.
- Cultura os andaimes para o período de tempo necessário para o experimento e mudar o meio 2-3 vezes por semana. Pipeta lentamente e o mais distante longe do cadafalso quanto possível.
- Após o cultivo de célula-semeado cadafalso, cortado ao meio, os andaimes e processá-las para histologia e análises bioquímicas.
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Representative Results
Decellularization de andaimes CDM sempre deve ser confirmado usando colorações histológicas, bem como usando a quantificação de DNA para medir a quantidade de restos de DNA. Decellularization insuficiente pode levar a respostas imunológicas indesejáveis que influenciam os resultados em configurações em vivo15,16,17. Para este método de decellularization específicos, o DNA foi abaixo da escala da deteção, que começou em 13,6 ± 2,3 ng/mg peso seco-DNA (n = 3). Decellularization completo usando este protocolo conduzirá à produção de um andaime que é rica em colágeno tipo II (Figura 4) e não tem células (Figura 4A) ou GAGs (Figura 4B). Cartilagem de equina saudável é exibida como comparação, manchada de safranina-O (Figura 5A) e colágeno II (Figura 5B).
O andaime deve exibir uma porosidade macroscopicamente homogênea. Bolhas de ar levarão a facilmente detectáveis grandes buracos no cadafalso e são, portanto, cuidadosamente removidas. Estes grandes buracos no cadafalso podem ter um impacto negativo sobre as propriedades mecânicas e levar a penhora de célula não-homogênea após a semeadura. Produção bem sucedida de cadafalso também envolve uma etapa de liofilização duração de pelo menos 24 h; Isto levará a um andaime que tem uma aparência branca (Figura 3). Em caso de insuficiente liofilização, os andaimes terá uma cor amarelada e sem poros claros podem ser observados.
Em ordem para o andaime deve ser usado para in vivo , aplicações e célula-propagação in vitro, integração do celular com o andaime, bem como a funcionalidade celular, deve ser mostrado. Aqui, os andaimes foram semeadas com MSCs que produziu ECM após 4 (Figura 6A-D) e 6 (Figura 6E-H) semanas de cultivo in vitro. Formação de mordaça, colágeno II e um periférico colágeno I, bem como a presença de células, foi mostrado. Além disso, a especificidade de colágeno II é exibida na Figura 5B, onde cartilagem mas não osso está manchada positivo para colágeno II em um plugue osteocondrais.
Figura 1: Equine joelho depois de retirar a cartilagem da cheio-espessura. A cartilagem é removida os côndilos usando um bisturi até atingir a camada de cartilagem calcificada que não pode ser cortada com um bisturi. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: etapas sequenciais na criação de decellularized partículas derivadas da cartilagem matriz. (A) cartilagem fatias que foram retiradas os côndilos são lavadas em uma solução de antibiótico-infundido. (B) cartilagem fatias são liofilizadas e agora têm uma aparência branca e papel-like. (C) Snap-congelamento da cartilagem liofilizada é realizada antes (D) partículas de cartilagem pulverização por mão-fresamento usando um almofariz e um pilão. Passo D também pode ser feito com a moagem automática. Esta figura foi modificada de Benders et al.11. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: O produto final, um andaime de matriz de cartilagem-derivado decellularized. Este andaime cilíndrico é 2 cm de altura e tem um diâmetro de 8 mm. O andaime possui uma estrutura porosa claro. As imagens esquerda e direita exibir um andaime de dois ângulos diferentes. Observe que não há grandes buracos estão presentes na superfície do cadafalso como todas as bolhas de ar foram removidas antes da liofilização. Esta figura foi modificada de Benders et al.11. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: caracterização histológica do cadafalso. (A) H & E mancha mostra ECM partículas de tamanhos diferentes e a ausência de células. (B) coloração de safranina-O mostra que não há piadas foram mantidas no processo de decellularization. (C) colágeno tipo II immunolocalization revela que as partículas decellularized são ricas em colágeno tipo II. Escala de barras = 500 µm. Esta figura foi modificada de Benders et al.11. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: representação histológica de cartilagem saudável equina. (A) um osteocondrais plug corado com safranina-O e Fast Green mostra osso sem GAGs (verde), cartilagem com GAGs (vermelhos) e a camada de cartilagem calcificada no meio. (B), A ficha de II-manchado osteocondrais colágeno manchas cartilagem mas não osso. Escala de barras = 500 µm. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 6: formação de Neo-matriz no cadafalso após 4 e 6 semanas de cultura usando células estromais mesenquimais. Depois de 4 (A-D) e 6 semanas (E-H) da cultura, matriz recém-formado é rico em células (A + E), colágeno II B + F e GAGs (C + G), como pode ser observado com H & E, colágeno II e citológicas de safranina-O, respectivamente. Além disso, colágeno eu está presente após 6 semanas (H) e 4 (D) na periferia do cadafalso. Densidade de células, bem como a quantidade de deposição da matriz é maior na periferia. Escala de barras = 500 µm. Esta figura foi modificada de Benders et al.11. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
A ECM da cartilagem articular é muito denso e bastante resistente a tratamentos enzimáticos diferentes. O protocolo de decellularization de várias etapas descrito neste artigo aborda tal resistência e com êxito gera matrizes decellularized. Para conseguir isso, o processo se estende durante vários dias. Muitos processos de decellularization têm sido propostos para os diferentes tipos de tecidos,18, e este artigo descreve um protocolo apropriado para o decellularization da cartilagem. Neste protocolo, é, no entanto, necessário seguir o tratamento enzimático com as etapas de detergente para remover todas as células. A quantidade de DNA é diminuída notavelmente nos primeiros passos que envolvem o tratamento com tripsina e deixando de fora estes passos não resultará em adequada decellularization11.
Note que este protocolo baseia-se a decellularization do tecido cartilaginoso equina. A atividade de soluções de enzima utilizada foi encontrada suficiente para a remoção adequada dos condrócitos a equinos. No entanto, apesar da conservação da composição matriz em toda a espécie, o protocolo pode ter que ser ajustada para decellularization da cartilagem dos outros animais devido às diferenças no montante de residentes naturalmente condrócitos19. Por exemplo, cartilagem de animais menores é conhecida por ter um teor mais elevado de célula e pode, portanto, requerem um processo mais agressivo de decellularization. Uma razão especial para escolhendo equina cartilagem para criar decellularized de andaimes é essa semelhança clara mostrar de cartilagem equinos e humanos em espessura, densidade celular e bioquímica maquiagem20.
Para garantir um produto reprodutível, vários critérios de avaliação podem ser importantes para determinar se decellularization completa foi alcançado. Neste protocolo, tanto uma coloração H & E e quantificação bioquímica foram usados para avaliar a quantidade residual de DNA no produto final. Outros pesquisadores também têm propostas para determinar o tamanho do DNA restante, com um máximo de 200 bp de comprimento para qualidade controle21, ou uma quantidade de DNA residual de menos de 50 ng/mg secar tecido peso18,22. Independentemente disso, alterações ao protocolo devem sempre ser acompanhadas com avaliação histológica e ensaios quantitativos para determinar o efeito da decellularization, bem como os restantes produtos de ECM.
A principal limitação do presente protocolo é que, o procedimento de decellularization completa, envolvendo a exposição a tripsina leva a perda extensa de GAGs. Apesar de tripsina não cleave GAGs, a razão para a perda de GAGs pode ser a abertura acima do tecido da cartilagem por tripsina clivagem de proteínas que ancoram ou encapsulam GAGs. Componentes de ECM como GAGs são importantes para reter a água na cartilagem articular e, portanto, desempenham um papel significativo na resistência biomecânica do tecido4. Protocolos que visam reduzir a perda de GAGs durante todo o processo de decellularization irão afectar o rigor do processo de decellularization.
Após decellularization, função e integração de células foram mostrados na célula-semeado andaimes. Pesquisa anterior mostrou que a produção de matriz pelos condrócitos neste andaime é insatisfatória, especialmente quando comparado com a deposição de matriz abundante por células estromais mesenquimais11. Como tecido de cartilagem, como é depositado no cadafalso, esta nova matriz é geralmente primeiro depositado na periferia do andaime antes de invadir o resto dos andaimes. Isto pode ser observado claramente nas fatias histológicas onde uma periferia da célula-ricos, em vez de um centro rico em células, é frequentemente visto (Figura 6). No entanto, este efeito pode ser reduzido quando utilizando biorreatores de perfusão para célula semeadura e reforçar a troca de nutrientes. Como ocorre a deposição de matriz, os andaimes também assumirá uma aparência mais brilhante, tornando-se mecanicamente mais consistente e menos quebradiço. Como tal, podem ser facilmente cortados com um bisturi sem caindo aos pedaços. As propriedades da matriz recém-formado podem ser avaliadas usando colorações histológicas e ensaios quantitativos. Como não GAGs são deixados após o processo de decellularization, todas as piadas que podem ser medidas quantitativamente será um produto de neosynthesis.
Os andaimes produzidos usando este protocolo decellularization fornecem uma solução de prateleira e podem ser implantados sem a necessidade de célula-semear antes da implantação. No entanto, quando aplicada como um tratamento para os defeitos de condral (osteo), as propriedades biomecânicas terá que ser melhorado para diminuir a possibilidade de recuo da construção em fases precoces da carga articular. Implantação de co com camadas protetoras em cima, ou outras estratégias de reforço pode precisar de ser implementado. No futuro, refinamento do protocolo pode reforçar o potencial regenerativo do cadafalso. Por exemplo, a retenção de GAGs, a preservação da orientação de fibras de colagénio, ou em combinação com outros biomateriais para reforçar estes andaimes pode ser benéfica para permitir uma superfície articular melhorada e lisamente regenerada. Consequentemente, estes andaimes podem desempenhar um papel como componentes da próxima geração de enxertos regenerativas para o tratamento de defeitos de condral (osteo).
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Disclosures
Os autores declaram que eles têm não tem interesses financeiro concorrente.
Acknowledgments
Os autores gostaria de reconhecer o Boot W. para assistência na produção dos andaimes. K.E.M. Benders é suportado pelo Alexandre Suerman Stipendium do University Medical Center. Levato R. e J. Malda são suportados pela Fundação holandesa de artrite (conceder acordos CO-14-1-001 e LLP-12, respectivamente).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cadaveric joint | This can be obtained as rest material from the local butcher or veterinary center. | ||
| Sterile phosphate-buffered saline (PBS) | |||
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140 | |
| Amphotericin B | Thermo Fischer Scientific | 15290026 | |
| Liquid nitrogen | |||
| Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red | Thermo Fischer Scientific | 25200072 | |
| Tris-HCl pH 7.5 | |||
| Deoxyribonuclease I from bovine pancreas | Sigma-Aldrich | DN25 | |
| Ribonuclease A from bovine pancreas | Sigma-Aldrich | R6513 | |
| Triton X-100 (octoxynol-1) | Sigma-Aldrich | X100 | |
| Papain | Sigma-Aldrich | P3125 | |
| Trisodium citrate dihydrate | Sigma-Aldrich | S4641 | |
| Alginate | Sigma-Aldrich | 180947 | |
| Formalin | |||
| CaCl2 | |||
| Ethanol | |||
| Xylene | |||
| Paraffin | |||
| Ethylene oxide sterilization | Synergy Health, Venlo, the Netherlands | ||
| Multipotent Stromal cells/chondrocytes from equine donors | MSCs and chondrocytes can be isolated from donor joints that are rest material, coming from the local butcher or veterinary center. | ||
| MEM alpha | Thermo Fischer Scientific | 22561 | |
| L-ascorbic acid 2-phosphate | Sigma-Aldrich | A8960 | |
| DMEM | Thermo Fischer Scientific | 41965 | |
| Heat inactivated bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | 10735086001 | |
| Fibroblast growth factor-2 (FGF-2) | R & D Systems | 233-FB | |
| DNA quantification kit (Quant-iT PicoGreen dsDNA Reagent) | Thermo Fischer Scientific | P7581 | |
| 1,9-Dimethyl-Methylene Blue zinc chloride double salt | Sigma-Aldrich | 341088 | |
| Freeze-dryer | SALMENKIPP | ALPHA 1-2 LD plus | |
| Analytical mill | IKA | A 11 basic | |
| mortar/pestle | Haldenwanger 55/0A | ||
| Roller plate | CAT | RM5 | |
| Centrifuge (for 50 mL tubes) | Eppendorf | 5810R | |
| Capsule (cylindric mold) | TAAB | 8 mm flat | |
| Superlite S UV | Lumatec | 2001AV | |
| Incubator | |||
| Microtome | |||
| Sieve (mesh size 0.71 mm) | VWR | 34111229 | |
| Scalpel | |||
| Scalpel holder | |||
| Small laddle |
References
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