Summary
Decellularized хряща производные леса может использоваться как леска для восстановления хряща руководство и средства для регенерации ткани остеохондральные. Этот документ описывает процесс decellularization в деталях и предоставляет предложения использовать эти леса в настройках в пробирке.
Abstract
Остеохондральные дефекты отсутствие достаточного потенциала внутреннего ремонта для регенерации функционально звук костной и хрящевой ткани. В этой степени хряща исследования были направлены на развитие регенеративные подмостей. Эта статья описывает развитие лесов, которые полностью являются производными от природных хряща внеклеточного матрикса, приходя от лошадиного донора. Потенциальные приложения подмостей включают производство аллотрансплантация тканей для ремонта хряща, выступающей в качестве лески для ткани остеохондральные инженерии и предоставление в пробирке модели для изучения формирования тканей. Decellularizing ткани, клеток донора будут удалены, но многие из натуральных биоактивных подсказки, мысли будет сохранена. Главное преимущество использования такого природного леса по сравнению с синтетическим леску является для регенерации тканей остеохондральные диска без дальнейших функционализации полимеров. Подмости хряща производные матрица может использоваться для регенерации костной и хрящевой ткани в настройках и в естественных условиях, так и in vitro.
Introduction
Дефектов суставного хряща в колене, вызванные травматического события может привести к дискомфорту и прежде всего, могут иметь большое влияние на жизнь молодых и активного населения1,2,3. Кроме того повреждение хряща в молодом возрасте может привести к более быстрым началом остеоартрита позднее в жизни4. В настоящее время только бабло терапия для обобщенных Артроз коленного сустава является эндопротезирование хирургия. Как гипоклеточные, aneural и аваскулярный ткани хряща, его регенеративные способности крайне ограничена. Таким образом регенеративной медицины подходы стремились после помощи и стимулировать регенеративные способности родной ткани. Для этой цели подмости разработаны и используются как либо клетки перевозчика или индуктивный материал, который подстрекает к дифференциации и регенерации тканей родной клетки тела5.
Decellularized леса были широко изучены в регенеративной медицине6. Она имела некоторый успех, например, в пособничестве регенерации кожи7, брюшной структуры8и9сухожилий. Преимущество использования decellularized лесов является их естественного происхождения и их способность сохранить биологически активные сигналы, которые привлекают и побудить клеточная дифференцировка в соответствующие линии, необходимые для ткани ремонт6,10. Кроме того поскольку внеклеточного матрикса (ECM) является естественным биоматериала и decellularization предотвращает потенциальных иммунный ответ, удаляя содержимое сотовой или генетические, вопросы, касающиеся биосовместимость и способность к биологическому разложению преодолеваются.
Подмости хряща производные матрица (МЧР) показали большую хондрогенном потенциал в пробирке эксперименты, когда семенами с Мезенхимальные стромальные клетки11. Кроме того эти леса показали потенциал для формы костной ткани через endochondral окостенение на внематочная мест в в естественных условиях настройки12. Как руководство МЧР подмостей формирования обеих костей и хрящевой ткани, эти леса могут иметь потенциал для ремонта дефектов остеохондральные помимо хрящевой ткани.
Эта статья описывает протокол адаптированный Ян 13 et al. (2010) для производства decellularized МЧР подмости от лошадей задушить хряща. Эти леса богаты, коллаген типа II и лишенный клетки и не содержат каких-либо гликозаминогликанов (GAGs) после decellularization. В vitro и in vivo эксперименты по ремонту дефектов хондральные (Остео) может проводиться с использованием этих лесов.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Для этого протокола Коневодство задушить хряща был получен от лошадей, которые умерли от других причин, чем остеоартрита. Ткань была получена с разрешения владельцев, в соответствии с институциональной этических правил.
Примечание: Этот протокол описывает изготовление подмостей от decellularized лошадей хряща, который может использоваться для приложений, таких как платформы тканевой культуры в vitro или в естественных условиях имплантации в регенеративной медицине стратегии. Ферментативная обработка шаги должны выполняться в хронологическом порядке, описанные.
1. заготовка суставного хряща от доноров (трупных) суставов
- Впереди уборочной шага, подготовьте 1 Л хряща моющего раствора, состоящий из стерильных фосфат амортизированное saline (PBS), дополнены 100 ед/мл пенициллин 100 мкг/мл стрептомицина и 1% (v/v) амфотерицин B.
- Надевайте перчатки и пальто лаборатории в течение всей процедуры сбора урожая, так как донор может снести патогены.
- Получите нетронутыми (трупных) совместное для изоляции хряща.
Примечание: На данный момент кожа вокруг сустава до сих пор нетронутыми. Лошадиный задушить хряща, полученные от лошади использовался в настоящем Протоколе, но могут также использоваться другие суставы от других видов. - Удаление кожи, который расположен вокруг области совместных интересов с помощью скальпеля и хирургический пинцет. Кроме того удаление излишней жировой и мышечной ткани, при необходимости, без повреждения основной совместной. При необходимости передачи подготовленных труп биологической безопасности кабинета.
- Чтобы выполнить артротомии, т.е., разделение сустава, сначала определить местоположение, где совместное формулирует, выполняя расширение и сгибании сустава.
- Осторожно удалите более слои жира, мышц и сухожилий с скальпель и хирургический пинцет открыть совместный области.
- Сделайте надрез достичь полости сустава.
Примечание: Совместная полость заполняется с синовиальной жидкости, которая может капать из полости при выполнении правильный разрез. - Далее открыть совместное полностью, проходящем через сухожилий, которые держать совместных вместе.
- Осмотрите хряща для любой макроскопических ущерб.
Примечание: Если суставного хряща не имеют глянцевый и гладкий внешний вид, или если видно вздутий, щели или дефекты присутствуют, отбросить хряща. - Для удаления хряща из субхондральной кости используйте стерильным скальпель. Вырежьте все, вплоть до субхондральной кости также удалить глубокие зоны хряща (рис. 1). Чтобы предотвратить хряща от высыхания, регулярно капать хряща моющего раствора на хрящ.
Примечание: В это время не имеет значения размер кусочков хрящей. - Соберите фрагменты хряща в 50 мл пробирки, содержащие ранее подготовленных хряща моющего раствора (рис. 2A).
- После сбора хряща от всех представляющих интерес областях, оснастки заморозить фрагменты хряща в жидком азоте за 5 мин.
- Перенесите ломтики хряща в 50 мл трубки и сразу lyophilize фрагменты хряща для 24 h в заморозки сушка. Заход Замораживание сушки приблизительно 0.090 мбар а конденсатор льда-51 ° C (рис. 2B).
- Храните фрагменты хряща в сухом месте при комнатной температуре до дальнейшего использования.
Примечание: Вплоть до формирования эшафот решения и хряща, не должен быть подготовлен и стерильные обращение.
2. Создание Decellularized хряща частиц
- Погружайте лиофилизированные хряща ломтики в жидком азоте.
- Прямо шлифуют образцы вручную или путем фрезерный станок. При шлифовании фрагменты хряща вручную, используйте ступку и пестик и шлифуют ломтиками примерно 45 минут до тех пор, пока они являются вдувания (рис. 2 c и 2D). При шлифовании автоматически, используйте фрезерный станок с заданной скоростью в течение нескольких секунд до минуты, до тех пор, пока пылевидного хряща оснастки замороженные срезы.
Примечание: Предварительно охлаждения раствора или отсеке шлифовальных фрезерного станка, добавив жидкого азота. При использовании фрезы, убедитесь, что все частицы являются земли, и что без частицы остаются в нижней части секции измельчения. - Сито хряща частицы избавиться от больших частей, используя сито с размером ячейки 0,71 мм.
- Храните в сухом месте при комнатной температуре частицы.
3. ферментативный Decellularization с трипсином 0.25%-EDTA
- Подготовить раствор пищеварение, состоящий из трипсин 0.25% с ЭДТА, дополняется 100 ед/мл пенициллин 100 мкг/мл стрептомицина и 1% (v/v) амфотерицин B. магазина решение при 4 ° C.
Примечание: Trypin является протеазы, что ухудшает белки, проживающих в хрящевой ткани. Это ферментативный шаг откроет плотной хрящевой структуры. - Заполните трубы 50 мл с частицами вдувания хряща до объема приблизительно 7,5 мл трубки.
-
Инкубируйте хряща частиц с подготовленной пищеварение решения при 37 ° C для 24 часа в общей сложности, при обновлении пищеварение решение каждые 4 ч.
- Во-первых добавьте 30 мл раствора пищеварения каждый Тюбик 50 мл, содержащего частицы хряща.
- Затем Ресуспензируйте частицы с помощью вихревого или пипетки так, что все частицы подвергаются ферментативной решения.
- Проинкубируйте образцы для 4 ч при 37 ° C на ролике.
- Чтобы обновить решение пищеварение, центрифуга трубы для 20 минут 3113 x g вызывать оседания частиц хряща. Выбросите супернатант.
Примечание: Супернатант станет яснее с каждый трипсина инкубационный период. - Повторите шаг 3.3.1–3.3.4 до тех пор, пока частицы были инкубировали с пищеварением решения для 6 циклов 4 ч.
- После окончательной цикла удалить супернатант после центрифугирования и мыть частицы в 30 мл моющего раствора дважды хряща. Центрифуга частиц для 20 минут 3113 x g между каждым из стирок.
4. ферментативный Decellularization с лечением Нуклеаза
- Подготовка 10 мм трис-HCl решение при pH 7.5 в деионизированной воде.
- Добавьте 50 дезоксирибонуклеаза ед/мл и 1 ед/мл рибонуклеазы А в буфер Tris-HCl, чтобы получить решение нуклеиназы.
Примечание: Этот шаг выполняется специально деградировать deoxyribonucleases и рибонуклеаз. - Чтобы удалить хряща, моющего раствора из хряща частиц (шаг 3.4), центрифуги для 20 минут, 3 113 x gи удалить супернатант.
- Добавить 30 мл раствора нуклеиназы частиц хряща и размешать частицы через решение, убедившись, что все частицы подвергаются к решению нуклеиназы.
- Проинкубируйте образцы на ролике за 4 ч при 37 ° C.
- Удаление решения нуклеиназы центрифугированием хряща частиц для 20 минут, 3 113 x g и удалить супернатант.
- Стирать образцы, добавив 30 мл 10 мм трис-HCl решение без дезоксирибонуклеаза и рибонуклеазы А частицы хряща. Ресуспензируйте частицы и оставить образцы на рольганг для 20 ч при комнатной температуре.
5. стиральный порошок Decellularization
- Сделать стиральный раствор, растворяя 1% (v/v) octoxynol-1 в PBS.
- Удаление решения трис-HCl из хряща частиц, центрифугирование для 20 минут, 3 113 x g и отменяя супернатант.
- Добавьте 30 мл приготовленного раствора моющего средства 1% частиц хряща. Ресуспензируйте хряща частицы осторожно, чтобы избежать пенообразования решения.
Примечание: Этот шаг разрушает клеточные мембраны. - Проинкубируйте образцы на ролике за 24 ч при комнатной температуре на ролике.
- Удалить моющим центрифугированием для 20 минут, 3 113 x g и удалить супернатант.
-
Чтобы удалить все остатки decellularization решений, мыть хряща частиц в 6 циклов 8 h 30 мл моющего раствора хряща. Выполните Стиральная ролика при комнатной температуре.
- Чтобы изменить следующий мыть, центрифуга подвеска для 20 минут, 3 113 x g, удалить супернатант и добавить свежие хряща моющего раствора.
- Оставьте последний мыть в трубах и хранить decellularized хряща частицы-80 ° c.
6. Создание леса из Decellularized частиц
- Если частицы были сохранены при температуре-80 ° C, оттепель закрытые трубы, которые содержат частицы хряща в теплой воде перед созданием подмостей.
- Передать хряща частиц с ковшик цилиндрической формы, например, пластиковый флакон с диаметром 8 мм и высотой 2 см.
- При размещении хряща частиц в пластиковые плесень, нажмите все-пузырьки воздуха, чтобы избежать пустот в леса и заполнить форму до края.
Примечание: Это будет более трудно принять леса из металлической формы после формирования эшафот, что может привести к трещинам в эшафот. - Замораживание формы с частицами хряща для 10 мин при-20 ° C.
- Lyophilize хряща леса в пределах их формы для 24 h в заморозки сушка.
- После лиофилизации, возьмите леска из формы (рис. 3) и перекрестные ссылки их с ультрафиолетового (УФ) света на расстоянии 30 см и 365 Нм на ночь.
- Чтобы использовать подмости для культуры в пробирке клеток или в естественных условиях имплантации, стерилизуйте подмости с, например, этилен оксид (ВЭТО).
Примечание: EtO стерилизации производится с внешней стороны.
7. характеристика Decellularized леса с гистологическим Stainings
Примечание: Для обеспечения полной decellularization и визуализировать оставшиеся естественный характер хряща, выполните несколько гистологические stainings перед использованием подмости в любом эксперименте, включая гематоксилином и эозином (H & E) пятная для обеспечения decellularization, Safranin-O пятнать визуализировать остаточного присутствия кляп, коллаген типа I иммуногистохимия различать содержание коллагена и коллаген типа II иммуногистохимия различать содержание коллагена.
- Вырежьте подмости в тонкими ломтиками примерно в 3 мм с помощью скальпеля.
Примечание: Если подмости вырезаны в больших или меньших размеров, длительности циклов обезвоживания должны быть адаптированы. - Внедрить подмости в капле 4% (w/v) Альгинатные и побудить cross-linking путем добавления аналогичный объем 3,7% без буферизации формалин, содержащий 20 мм CaCl2.
Примечание: Альгинат Встраивание делает эшафот ломтики более жесткие по сравнению с стиральная шаги до внедрения парафина. В случае подмости были клетки семенами или в vivo имплантируются альгинат встраивание не является необходимым, как состав подмостей будет достаточно устойчивы, за счет включения ECM клетками. - Обезвоживает образцы, поместив их в серии градуированных этанола, начиная с циклами один час, 70%, 96%, 96%, 100% и 100% этанола, следуют два цикла 1 h ксилол и заканчивая двух циклов 1 h парафина на 60 ° C.
- После обезвоживания парафин внедрить образцы в плесень и охлаждения образцов.
- Вырежьте образцы с микротом ломтиками толщиной 5 мкм.
- До окрашивания, увлажняет образцы, помещая их в серии возвращенные градуированных этанола. Начните с двумя моет ксилоле на 5 мин, следуют 2 моет 100%, 95% и 70% этанола 3 мин в мыть. Наконец стирайте образцы 3 раза в воде в течение 2 мин.
Примечание: В случае использования альгината для обработки образцов для встраивания парафин, убедитесь, что смывать альгината с лимонной кислотой 10 мм до регидратации парафиновых срезах. - Пятно образцы с гематоксилином и эозином, Safranin-O, коллаген I и коллаген II как предыдущий описано11.
8. характеристика Decellularized леса с количественного анализа
- Получите папаин дайджесты подмостей, как описано выше11.
- Выполните assay с комплектом количественного определения ДНК на основе флуоресценции, измерить содержание ДНК двухручьевой лесов для обеспечения полной decellularization. Следуйте протокола, предусмотренного заводом-изготовителем. Экспресс количество ДНК в сухой вес эшафот.
- Выполните dimethylmethylene синий пробирного для количественного определения оставшуюся часть приколов в пределах леса, как описано выше11. Экспресс сумма в кляп в ДНК.
9. посев Decellularized подмостей
- Вырежьте стерилизованные подмости от шага 6.7 в 3 мм толщиной ломтиками.
- Передача лесов в отдельных скважинах 6-ну плиты.
- Увлажняет подмости с клетки культуры среднего дозирования 1 мл среды на вершине эшафот и дайте ему впитаться в течение 30 мин использовать хондроцитов или расширение среды мезенхимальных стволовых клеток (МСК).
Примечание: Используйте той же среде для регидратации леску для клеточной культуры клеток, которые будет заполнена. Расширение среднего хондроцитов состоит из Дульбекко изменение средств массовой информации (DMEM) с 10% тепло инактивированная плода бычьим сывороточным (ФБС), 100 ед/мл пенициллин, стрептомицин 100 мкг/мл и 10 нг/мл фибробластический фактор роста-2 (FGF-2). MSC расширения среды состоит из минимум основных средних альфа (MEM) с 10% тепло инактивированная FBS, 0,2 мм L-Аскорбиновая кислота 2-фосфат, пенициллин 100 ед/мл, 100 мкг/мл стрептомицина и 10 нг/мл ФБП-2. - Подготовка 3 х 106 клеток в 100 мкл среды, которая является требуемый объем для каждого леса с диаметром 8 мм и высотой 3 мм.
Примечание: Несколько типов клеток из разных видов могут использоваться для заполнения. При использовании хондроцитов или Мезенхимальные стромальные клетки, изолируйте клетки как описано11. При использовании хондроцитов, убедитесь, что они не были расширены мимо P1 проход для того, чтобы свести к минимуму количество Дедифференцированная хондроцитов. При использовании мезенхимальных стромальных клеток, они должны испытываться на их способности для дифференциации мульти линии, как описано выше14. - Накапайте 50 мкл готовую суспензию клеток на вершине предварительно замоченные эшафот и инкубировать леска для 1 ч при 37 ° C.
- Осторожно поверните леску вверх вниз, накапайте оставшиеся 50 мкл суспензии клеток на этой стороне леса и инкубировать 1 час при температуре 37 ° C.
- После инкубации добавить 3 мл среды скважин и культура клетки посеян подмости на 37 ° C. Обработайте пластину культуры осторожно, чтобы избежать отряд клеток.
- Культура подмости для периода времени, необходимого для выполнения эксперимента и изменить среднего 2 – 3 раза в неделю. Накапайте медленно и насколько далеко от леса как можно скорее.
- После культивирования клеток посеян эшафот, разрезать пополам подмостей и обрабатывать их для гистологии и биохимические анализы.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Decellularization МЧР подмостей всегда должна быть подтверждена с помощью гистологические stainings, а также с помощью ДНК количественной оценки для измерения количества ДНК останков. Недостаточная decellularization может привести к нежелательным иммунологических ответов, которые влияют на результаты в в естественных условиях параметры15,16,17. Для этого конкретного decellularization метода ДНК была ниже дальность обнаружения, который начался в 13,6 нг/мг ± 2.3 ДНК/сухой вес (n = 3). Полное decellularization, используя этот Протокол приведет к производству эшафот, что богат коллаген типа II (рис. 4 c) и не имеет клеток (рис. 4A) или приколами (рис. 4B). Здоровых лошадей хряща отображается как сравнение, витражи для Safranin-O (Рисунок 5A) и коллагена II (Рисунок 5B).
Леска должна отображать макроскопически однородные пористость. Пузырьки воздуха приведет к легко обнаружить большие отверстия в леса и таким образом, тщательно удаляются. Эти большие отверстия в леска может иметь пагубное влияние на механические свойства и привести к неоднородной ячейки вложение после посева. Успешное производство эшафот также предполагает Плаурайта шаг, продолжительностью не менее 24 ч; Это приведет к леске, имеет белый внешний вид (рис. 3). В случае недостаточной лиофилизации подмости будут иметь желтоватый цвет и может наблюдаться не ясно поры.
В порядке на эшафот чтобы использоваться для в vivo приложений и посева в пробирке клеток, клеток интеграции с лесов, а также клеточных функций, должны быть показаны. Здесь, подмостки были посеяны с MSCs, которые произведены ECM после 4 (Рис. 6A-D) и 6 (Рисунок 6E-H) недель в пробирке культивирования. Формирование кляп, коллаген II и периферийных коллаген я, а также наличие клеток, был показан. Кроме того специфика коллагена II отображается Рисунок 5B, где хряща, но не кости окрашенные позитивные для коллагена II в остеохондральные вилки.
Рисунок 1: Коневодство колена после удаления полный толщины хряща. Хрящ удаляется из мыщелок, с помощью скальпеля, пока не будет достигнуто Кальцифицированный хрящевой слой, который не могут быть сокращены с помощью скальпеля. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2: последовательные шаги в создании decellularized хряща производные матрица частиц. (A) хряща, фрагменты, которые были удалены из мыщелков промывают в растворе антибиотик проникнуты. (B) хряща фрагменты являются лиофилизированный и теперь имеют белый и бумаги как вид. (C) Snap замораживание лиофилизированные хряща является осуществляется прямо перед (D) мельницы хряща частицы фрезерованием вручную, используя ступку и пестик. Шаг D также может быть сделано с автоматической фрезерования. Эта цифра была изменена от Бендерs et al.11. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3: конечный продукт, decellularized хряща производные матрица леску. Это цилиндрические эшафот — 2 см в высоту и имеет диаметр 8 мм. Леска имеет четкую пористую структуру. Фотография слева и справа отображать леску с двух разных точек зрения. Обратите внимание, что не большие отверстия на поверхности эшафот присутствуют, как все пузырьки воздуха были удалены до лиофилизация. Эта цифра была изменена Benders et al.11. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 4: Гистологическая характеристика эшафот. (A) H & E окрашивание шоу ECM частицы разных размеров и отсутствие клеток. (B) Safranin-O пятнать показывает, что без приколов, были сохранены в процессе decellularization. (C) коллаген типа II immunolocalization показывает, что decellularized частицы богаты коллаген типа II. Масштаб баров = 500 мкм. Эта цифра была изменена Benders et al.11. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 5: гистологические представление здоровых лошадей хряща. (A) остеохондральные вилка витражи с Safranin-O и быстро зеленый показывает кости без приколов (зеленый), хряща с приколами (красный) и кальцинированная хряща слоя между ними. (B) коллагена II-окрашенных остеохондральные вилка пятна хряща, но не кости. Масштаб баров = 500 мкм. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 6: формирование нео матрица на эшафот после 4 и 6 недель культуры с использованием мезенхимальных стромальных клеток. После 4 (A-D) и 6 (E-H) недель культуры, недавно сформированной матрица богат в клетках (A + E), коллаген II (B + F) и приколов (C + G), как можно наблюдать с H & E, коллаген II и Safranin-O stainings, соответственно. Кроме того коллаген я присутствует после 4 (D) и (H) 6 недель на периферии эшафот. На периферии выше плотность клеток, а также количество матрицы осаждения. Масштаб баров = 500 мкм. Эта цифра была изменена с Трубогибы et al.11. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
ECM суставного хряща, очень плотные и очень устойчивы к различных ферментных методов лечения. Многоступенчатые decellularization протокол, описанные в этой статье рассматривается такое сопротивление и успешно создает decellularized матрицы. Для достижения этого, этот процесс охватывает в течение нескольких дней. Для различных типов тканей18были предложены многие процессы decellularization, и в этой статье описывается протокол для decellularization хряща. В этом протоколе это, однако, необходимо следовать Ферментативная обработка с моющим шаги, чтобы удалить все клетки. Количество ДНК заметно уменьшается в первые несколько шагов, связанных с лечением трипсином, и не оставляя эти шаги приведут к правильной decellularization11.
Обратите внимание, что этот протокол основан на decellularization лошадей хрящевой ткани. Активность фермента решений был найден для надлежащего удаления лошадиный хондроцитов достаточно. Однако несмотря на сохранение матрицу состава различных видов, протокол может потребоваться скорректировать для decellularization хряща от других животных из-за различий в размере естественно проживало хондроцитов19. Например хряща мелких животных как известно, имеют более высокое содержание ячейки и могут таким образом, требуют более агрессивной decellularization процесса. Особое причина выбора лошадей хряща для создания decellularized леса является четкое сходство показать что лошадей и человеческого хряща толщина, плотность клеток и биохимический состав20.
Чтобы обеспечить воспроизводимость продукции, некоторые критерии оценки могут быть важно определить, был ли достигнут полный decellularization. В настоящем Протоколе как H & E окрашивание и биохимические количественной оценки были использованы для оценки остаточное количество ДНК в конечный продукт. Другие исследователи также предложили определить размер оставшихся ДНК, с максимум 200 bp в длину для качества контроля21, или остаточных ДНК количество менее 50 ПГ/мг сухой ткани вес18,22. Независимо от того изменения в протокол всегда следует с гистологическим оценки и количественных анализов для определения эффекта decellularization, а также остальных продуктов ECM.
Основное ограничение этого протокола является, что, тщательно decellularization процедура с участием подверженности трипсина приводит к гибели приколами. Даже несмотря на то, что трипсин не прилепится приколами, причиной потери приколами может быть открытие хрящевой ткани трипсином, рассекая белки, которые якорь или инкапсулировать приколами. Компоненты ECM как приколами имеют важное значение для сохранения воды в суставного хряща и поэтому играют значительную роль в биомеханических устойчивость ткани4. Протоколы, которые направлены на сокращение потерь GAGs на протяжении всего процесса decellularization будут влиять на тщательность процесса decellularization.
После decellularization клеток интеграции и функции показали в клетки посеян подмостей. Предыдущие исследования показали, что матрица производства хондроцитов на этом эшафот является неудовлетворительным, особенно по сравнению с обильным матрицы осаждения Мезенхимальные стромальные клетки11. Как хрящевой ткани осаждается на эшафот, эта новая матрица обычно сначала откладывается в периферии леска до вторжения остальная часть леса. Это можно ясно наблюдать на гистологических срезах, периферии клетки-богатые люди, вместо того, чтобы центр ячейки богатых, где часто видели (рис. 6). Однако этот эффект может быть снижена при использовании перфузии биореакторов для заполнения ячейки и активизировать обмен питательных веществ. Как происходит матрицы осаждения, подмости также возьмет глянцевая внешний вид, став более механически последовательной и менее хрупким. Таким образом они могут быть легко режется с помощью скальпеля не разваливается. Свойства новообразованной матрицы может оцениваться с использованием гистологических stainings и количественных анализов. Поскольку без приколов остаются после процесса decellularization, все шутки, которые могут быть количественно измерить будет продуктом neosynthesis.
Подмости изготавливаются с использованием этого decellularization протокола обеспечивают готовые решения и может быть имплантирован без необходимости заполнения ячейки до имплантации. Однако когда применяется для лечения дефектов хондральные (Остео), биомеханических свойств придется укрепить уменьшить шанс отступа конструкции на ранних этапах суставной загрузки. Совместное имплантации с защитных слоев на верхней части, или другие стратегии укрепления может потребоваться быть реализованы. В будущем дальнейшего уточнения протокола может повысить регенеративный потенциал лесов. К примеру, сохранение приколами, сохранение ориентации волокон коллагена, или комбинации с другими биоматериалов для укрепления этих лесов может быть полезным для улучшения и плавно регенерации суставной поверхности. Следовательно эти леса могут играть роль в качестве компонентов следующего поколения регенеративной имплантатов для лечения дефектов (Остео) хондральные.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы заявляют, что они не имеют никаких финансовых интересов.
Acknowledgments
Авторы хотели бы признать W. загрузки для помощи в производстве подмостей. K.E.M. Трубогибы поддерживается Alexandre Suerman обладательница от Медицинский центр университета. Р. Левато и J. Malda поддерживаются Голландский фонд артрит (грантовые соглашения CO-14-1-001 и ТОО-12, соответственно).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cadaveric joint | This can be obtained as rest material from the local butcher or veterinary center. | ||
| Sterile phosphate-buffered saline (PBS) | |||
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140 | |
| Amphotericin B | Thermo Fischer Scientific | 15290026 | |
| Liquid nitrogen | |||
| Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red | Thermo Fischer Scientific | 25200072 | |
| Tris-HCl pH 7.5 | |||
| Deoxyribonuclease I from bovine pancreas | Sigma-Aldrich | DN25 | |
| Ribonuclease A from bovine pancreas | Sigma-Aldrich | R6513 | |
| Triton X-100 (octoxynol-1) | Sigma-Aldrich | X100 | |
| Papain | Sigma-Aldrich | P3125 | |
| Trisodium citrate dihydrate | Sigma-Aldrich | S4641 | |
| Alginate | Sigma-Aldrich | 180947 | |
| Formalin | |||
| CaCl2 | |||
| Ethanol | |||
| Xylene | |||
| Paraffin | |||
| Ethylene oxide sterilization | Synergy Health, Venlo, the Netherlands | ||
| Multipotent Stromal cells/chondrocytes from equine donors | MSCs and chondrocytes can be isolated from donor joints that are rest material, coming from the local butcher or veterinary center. | ||
| MEM alpha | Thermo Fischer Scientific | 22561 | |
| L-ascorbic acid 2-phosphate | Sigma-Aldrich | A8960 | |
| DMEM | Thermo Fischer Scientific | 41965 | |
| Heat inactivated bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | 10735086001 | |
| Fibroblast growth factor-2 (FGF-2) | R & D Systems | 233-FB | |
| DNA quantification kit (Quant-iT PicoGreen dsDNA Reagent) | Thermo Fischer Scientific | P7581 | |
| 1,9-Dimethyl-Methylene Blue zinc chloride double salt | Sigma-Aldrich | 341088 | |
| Freeze-dryer | SALMENKIPP | ALPHA 1-2 LD plus | |
| Analytical mill | IKA | A 11 basic | |
| mortar/pestle | Haldenwanger 55/0A | ||
| Roller plate | CAT | RM5 | |
| Centrifuge (for 50 mL tubes) | Eppendorf | 5810R | |
| Capsule (cylindric mold) | TAAB | 8 mm flat | |
| Superlite S UV | Lumatec | 2001AV | |
| Incubator | |||
| Microtome | |||
| Sieve (mesh size 0.71 mm) | VWR | 34111229 | |
| Scalpel | |||
| Scalpel holder | |||
| Small laddle |
References
- Dunlop, D. D., et al. Risk factors for functional decline in older adults with arthritis. Arthritis and rheumatism. 52 (4), 1274-1282 (2005).
- Fitzpatrick, K., Tokish, J. M. A military perspective to articular cartilage defects. The journal of knee surgery. 24 (3), 159-166 (2011).
- Flanigan, D. C., Harris, J. D., Trinh, T. Q., Siston, R. A., Brophy, R. H. Prevalence of chondral defects in athletes' knees: a systematic review. Medicine and science in sports and exercise. 42 (10), 1795-1801 (2010).
- Martel-Pelletier, J., Boileau, C., Pelletier, J. P., Roughley, P. J. Cartilage in normal and osteoarthritis conditions. Best practice & research. Clinical rheumatology. 22 (2), 351-384 (2008).
- Vinatier, C., et al. Cartilage tissue engineering: towards a biomaterial-assisted mesenchymal stem cell therapy. Current stem cell research & therapy. 4 (4), 318-329 (2009).
- Taylor, D. A., Sampaio, L. C., Ferdous, Z., Gobin, A. S., Taite, L. J.
- Vashi, C. Clinical Outcomes for Breast Cancer Patients Undergoing Mastectomy and Reconstruction with Use of DermACELL, a Sterile, Room Temperature Acellular Dermal Matrix. Plastic Surgery International. 2014 (704323), 1-7 (2014).
- Satterwhite, T. S., et al. Abdominal wall reconstruction with dual layer cross-linked porcine dermal xenograft: the "Pork Sandwich" herniorraphy. Journal of plastic, reconstructive & aesthetic surgery : JPRAS. 65 (3), 333-341 (2012).
- Martinello, T., et al. Successful recellularization of human tendon scaffolds using adipose-derived mesenchymal stem cells and collagen gel. Journal of tissue engineering and regenerative medicine. 8 (8), 612-619 (2014).
- Benders, K. E., et al. Extracellular matrix scaffolds for cartilage and bone regeneration. Trends in biotechnology. 31 (3), 169-176 (2013).
- Benders, K. E., et al. Multipotent Stromal Cells Outperform Chondrocytes on Cartilage-Derived Matrix Scaffolds. Cartilage. 5 (4), 221-230 (2014).
- Gawlitta, D., et al. Decellularized cartilage-derived matrix as substrate for endochondral bone regeneration. Tissue engineering. Part A. 21 (3-4), 694-703 (2015).
- Yang, Z., et al. Fabrication and repair of cartilage defects with a novel acellular cartilage matrix scaffold. Tissue engineering. Part C, Methods. 16 (5), 865-876 (2010).
- Pittenger, M. F., et al. Multilineage potential of adult human mesenchymal stem cells. Science. 284 (5411), 143-147 (1999).
- Meyer, S. R., et al. Decellularization reduces the immune response to aortic valve allografts in the rat. The Journal of thoracic and cardiovascular surgery. 130 (2), 469-476 (2005).
- Brown, B. N., Valentin, J. E., Stewart-Akers, A. M., McCabe, G. P., Badylak, S. F. Macrophage phenotype and remodeling outcomes in response to biologic scaffolds with and without a cellular component. Biomaterials. 30 (8), 1482-1491 (2009).
- Keane, T. J., Londono, R., Turner, N. J., Badylak, S. F. Consequences of ineffective decellularization of biologic scaffolds on the host response. Biomaterials. 33 (6), 1771-1781 (2012).
- Crapo, P. M., Gilbert, T. W., Badylak, S. F. An overview of tissue and whole organ decellularization. Biomaterials. 32 (12), 3233-3243 (2011).
- Malda, J., et al. Of mice, men and elephants: the relation between articular cartilage thickness and body mass. PloS One. 8 (2), e57683 (2013).
- Malda, J., et al. Comparative study of depth-dependent characteristics of equine and human osteochondral tissue from the medial and lateral femoral condyles. Osteoarthritis and Cartilage. 20 (10), 1147-1151 (2012).
- Londono, R., Badylak, S. F. Biologic scaffolds for regenerative medicine: mechanisms of in vivo remodeling. Annals of biomedical engineering. 43 (3), 577-592 (2015).
- Gilbert, T. W. Strategies for tissue and organ decellularization. Journal of cellular biochemistry. 113 (7), 2217-2222 (2012).
