Summary
Decellularized Knorpel stammenden Gerüste als ein Gerüst, um Führer Knorpelreparatur sowie ein Mittel lässt sich um osteochondrale Gewebe zu regenerieren. Dieses Papier beschreibt den Decellularization Prozess im Detail und enthält Vorschläge, diese Gerüste in in-vitro-Einstellungen zu verwenden.
Abstract
Osteochondrale Defekte fehlen ausreichende intrinsische Reparatur Kapazität, funktionell gesunde Knochen und Knorpel Gewebe zu regenerieren. Insofern hat Knorpel Forschungsschwerpunkt auf die Entwicklung der regenerativen Gerüste. Dieser Artikel beschreibt die Entwicklung von Gerüsten, die vollständig aus natürlichen Knorpel extrazelluläre Matrix, aus einem equine Spender stammen. Mögliche Anwendungen der Gerüste sind produzieren Allografts für Knorpelreparatur, dienen als Gerüst für osteochondrale Tissue engineering und Bereitstellung von in-vitro-Modellen um Gewebeanordnung zu studieren. Von einem Gewebe, die Spenderzellen werden entfernt, aber viele der natürlichen bioaktiven Cues werden gedacht, um beibehalten werden. Der wesentliche Vorteil der Verwendung einer natürlichen Gerüst im Vergleich zu einem synthetisch hergestellten Gerüst ist, dass keine weiteren Funktionalisierung von Polymeren Laufwerk osteochondrale Geweberegeneration erforderlich ist. Die Knorpel-abgeleitete Matrix-Gerüste können für Knochen und Knorpel Geweberegeneration in in vivo und in vitro-Einstellungen verwendet werden.
Introduction
Mängel der Gelenkknorpel im Knie verursacht durch traumatische Ereignisse können zu Unbehagen führen, und vor allem können haben einen großen Einfluss auf das Leben der jungen und aktiven Bevölkerung1,2,3. Darüber hinaus kann Knorpelschäden an einem jungen Alter zu einen schnelleren Wirkungseintritt Arthrose später im Leben4führen. Derzeit ist die einzige Salvage-Therapie für generalisierte Osteoarthritis des Knies Gelenkersatz. Knorpel ist ein Hypocellular, Aneural und avaskuläre Gewebe, ist seine Regenerationsfähigkeit stark eingeschränkt. Regenerative Medizin Ansätze sind daher begehrt zu helfen und die Regenerationsfähigkeit der nativen Gewebe zu stimulieren. Zu diesem Zweck sind Gerüste entwickelt und verwendet als entweder Zellträger oder als eine induktive Material, die stachelt Differenzierung und Regeneration des Gewebes durch den Körper native Zellen5.
Decellularized Gerüste sind weit verbreitet in der regenerativen Medizin6untersucht worden. Es hatte einige Erfolge, beispielsweise bei der Unterstützung der Regeneration der Haut7, Abdominal-Strukturen8und Sehnen9. Der Vorteil der Verwendung decellularized Gerüste ist ihre natürlichen Ursprungs und ihre Fähigkeit, bioaktive Hinweise zu behalten, die sowohl anziehen und Zelldifferenzierung in der entsprechenden Linie für Gewebe-Reparatur-6,-10erforderlich induzieren. Darüber hinaus sind da extrazellulärer Matrix (ECM) eine natürliche Biomaterialien ist und Decellularization eine mögliche Immunantwort verhindert durch Entfernen von zellulären oder genetischen Inhalten, Fragen der Biokompatibilität und biologische Abbaubarkeit überwinden.
Knorpel-abgeleitete Matrix (CDM) Gerüste haben große Chondrogenic im in-vitro-Experimente, wenn mit mesenchymaler Stromazellen Zellen11ausgesät gezeigt. Darüber hinaus haben diese Gerüste das Potenzial, Form Knochengewebe durch Endochondral Verknöcherung auf ektopische Standorte in in-vivo Einstellungen12gezeigt. CDM-Gerüste führt die Bildung von beide Knochen und Knorpelgewebe, diese Gerüste Potenzial für osteochondrale defekt Reparatur neben Knorpelreparatur halten können.
Dieser Artikel beschreibt ein Protokoll adaptiert von Yang Et Al. (2010)13 für die Herstellung von decellularized CDM-Gerüste von Equine ersticken Knorpel. Diese Gerüste sind reich an Kollagen Typ II und frei von Zellen und enthalten Glykosaminoglykane (GAGs) nach Decellularization. In vitro und in vivo Experimente an (Osteo) Chondral defekt Reparatur können mit diesen Gerüsten durchgeführt werden.
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Protocol
Für dieses Protokoll wurde Pferde equine Knie Knorpel entnommen, die aus anderen Ursachen als Arthrose gestorben war. Gewebe wurde mit Erlaubnis der Besitzer, im Einklang mit den institutionellen ethischen Regelungen erhalten.
Hinweis: Dieses Protokoll beschreibt die Herstellung von Gerüsten aus decellularized equine Knorpel, die für Anwendungen wie in Vitro Zellkultur-Plattformen oder in Vivo Implantation in regenerative Medizin Strategien verwendet werden können. Die enzymatische Behandlungsschritte müssen in der beschriebenen Reihenfolge durchgeführt werden.
1. Gewinnung von Gelenkknorpel aus Spender (Cadaveric) Gelenke
- Vor der Ernte Schritt bereiten Sie 1 L des Knorpels Waschlösung, bestehend aus sterilen Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS), ergänzt mit 100 U/mL Penicillin, 100 µg/mL Streptomycin und 1 % (V/V) Amphotericin b.
- Tragen Sie Handschuhe und einen Laborkittel während der gesamten Ernteverfahren, da der Spender Krankheitserreger in sich tragen kann.
- Erhalten Sie ein intakt (cadaveric) Gelenk Knorpel isoliert.
Hinweis: An dieser Stelle ist die Haut um das Gelenk noch intakt. Equine Knie Knorpel entnommen Pferd wurde in dieses Protokoll verwendet, aber andere Gelenke von anderen Tierarten können auch verwendet werden. - Entfernen Sie die Haut, die rund um den gemeinsamen Bereich befindet, mit einem Skalpell und eine chirurgische Pinzette. Darüber hinaus entfernen Sie übermäßiges Fett und Muskel Gewebe bei Bedarf ohne Beschädigung der zugrunde liegenden gemeinsamen. Übertragen Sie die vorbereiteten Kadaver optional zum biologischen Sicherheitsschrank
- Ausführen einer Arthrotomie, d.h., eine Trennung des Gelenks, definieren Sie zunächst den Speicherort, wo das Gelenk artikuliert durch Erweiterung und Beugung des Gelenks.
- Entfernen Sie vorsichtig mehrere Schichten von Fett, Muskeln und Sehnen mit einem Skalpell und chirurgische Pinzette, die Lötstelle zu öffnen.
- Machen Sie einen Schnitt, der Gelenkspalt zu erreichen.
Hinweis: Der Gelenkspalt ist mit Gelenkflüssigkeit, die aus dem Hohlraum abtropft, bei der Durchführung eines korrekten Schnitt gefüllt. - Weiterhin geöffnet, das Gelenk vollständig durch Durchtrennung der Sehnen, die das Gelenk zusammenhalten.
- Den Knorpel für makroskopische Schäden zu überprüfen.
Hinweis: Verwerfen Sie wenn der Gelenkknorpel nicht über ein glänzend und glatt aussehen oder offensichtlich Blasenbildung, Risse oder Mängel vorhanden sind, den Knorpel. - Verwenden Sie ein steriles Skalpell, um den Knorpel aus dem subchondralen Knochen zu entfernen. Schneiden Sie hinunter den subchondralen Knochen, auch die tiefen Zone des Knorpels (Abbildung 1) zu entfernen. Damit den Knorpel nicht austrocknen, regelmäßig Tropfen Sie Knorpel Waschlösung auf den Knorpel.
Hinweis: Zu diesem Zeitpunkt spielt die Größe der Knorpel Scheiben keine Rolle. - Sammeln Sie die Knorpel-Scheiben in 50 mL Röhrchen mit vorbereiteten Knorpel Waschlösung (Abbildung 2A).
- Nach dem Sammeln des Knorpels aus allen Bereichen des Interesses, Snap freeze Knorpel Scheiben in flüssigem Stickstoff für 5 min.
- Die Knorpel-Scheiben in 50 mL Röhrchen übertragen und sofort lyophilize die Knorpel-Scheiben für 24 h in einer Gefriertrocknungsanlage. Stellen Sie das Einfrieren Trockner auf ca. 0,090 Mbar während der Eis-Kondensator-51 ° C (Abb. 2 b) ist.
- Lagern Sie die Knorpel-Scheiben bis zur Weiterverwendung an einem trockenen Ort bei Raumtemperatur.
Hinweis: Bis zu dem Punkt der Gerüst-Formation haben die Lösungen und Knorpel nicht vorbereitet und in eine sterile Weise behandelt werden.
2. Erstellen von Decellularized Knorpel Partikel
- Eintauchen der lyophilisierter Knorpel Scheiben in flüssigem Stickstoff.
- Schleifen Sie direkt die Proben entweder manuell oder durch eine Fräsmaschine. Wenn der Knorpel Scheiben von hand Schleifen, verwenden Sie einen Mörser und Stößel und Schleifen Sie die Scheiben ca. 45 Minuten, bis sie pulverisiert (Abbildung 2 und 2D) sind. Beim Schleifen von automatisch verwenden Sie eine Fräsmaschine mit der voreingestellten Geschwindigkeit für ein paar Sekunden bis zu einer Minute, bis die Snap eingefroren Knorpel Scheiben pulverisiert werden.
Hinweis: Kühlen Sie durch Zugabe von flüssigem Stickstoff es zum Mörtel oder das Mahlfach der Fräsmaschine vor. Wenn eine Fräsmaschine verwenden, stellen Sie sicher, dass alle Partikel sind Boden und keine Partikel im unteren Teil das Mahlfach bleiben. - Die Knorpel-Partikel get rid of größere Teile durch ein Sieb mit einer Maschenweite von 0,71 mm Sieb.
- Lagern Sie die Partikel an einem trockenen Ort bei Raumtemperatur.
(3) enzymatische Decellularization mit Trypsin 0.25%-EDTA
- Bereiten Sie die Verdauung-Lösung, bestehend aus 0,25 % Trypsin mit EDTA ergänzt mit 100 U/mL Penicillin, 100 μg/mL Streptomycin und 1 % (V/V) Amphotericin b Store die Lösung bei 4 ° C.
Hinweis: Trypin ist eine Protease, die Proteine, die in das Knorpelgewebe degradiert. Diese enzymatische Schritt öffnet sich die dichten Knorpel Struktur. - Die pulverisierte Knorpel Partikel bis zu einem Volumen von etwa 7,5 mL pro Tube 50 mL Röhrchen einfüllen.
-
Inkubieren Sie die Knorpel-Partikel mit der vorbereiteten Verdauung-Lösung bei 37 ° C für 24 h insgesamt, während der Aktualisierung der Aufschlusslösung alle 4 h.
- Fügen Sie zunächst 30 mL der Lösung Verdauung zu jeweils 50 mL-Tube, die Knorpel Partikel enthält.
- Dann erneut die Partikel mithilfe eines Wirbel oder pipettieren, so dass alle Partikel, die enzymatische Lösung ausgesetzt sind.
- Inkubieren Sie die Proben für 4 h bei 37 ° C auf einer Walze.
- Zum Aktualisieren der Aufschlusslösung Zentrifugieren der Rohre für 20 min bei 3113 X g Sedimentation der Knorpel Partikel verursachen. Verwerfen Sie den überstand.
Hinweis: Der Überstand wird mit jedem Trypsin Inkubationszeit klarer. - Wiederholen Sie Schritt 3.3.1–3.3.4, bis die Teilchen mit der Verdauung-Lösung für 6 Zyklen von 4 h inkubiert worden sind.
- Nach dem letzten Zyklus den Überstand nach Zentrifugieren entfernen und die Partikel in 30 mL des Knorpels Waschlösung zweimal waschen. Zentrifugieren Sie die Partikel für 20 min bei 3113 X g zwischen den einzelnen Waschungen.
(4) enzymatische Decellularization mit Nuklease Behandlung
- Bereiten Sie eine 10 mM Tris-HCl-Lösung bei pH 7,5 in entionisiertem Wasser.
- Der Tris-HCl-Puffer, der Nuklease-Lösung zu erhalten fügen Sie 50 U/mL Deoxyribonuclease und 1 U/mL Ribonuklease A hinzu.
Hinweis: Dieser Schritt wird durchgeführt, um insbesondere Deoxyribonucleases und Ribonuclease verschlechtern. - Um den Knorpel Waschlösung aus Knorpel Partikel (Schritt 3.4) zu entfernen, für 20 min bei 3.113 X gZentrifugieren und den Überstand zu entfernen.
- Die Knorpel-Partikel 30 mL der Nuklease-Lösung hinzu und rühren Sie die Partikel durch die Lösung, um sicherzustellen, dass alle Partikel die Nuklease-Lösung ausgesetzt sind.
- Inkubieren Sie die Proben auf einer Walze für 4 h bei 37 ° c
- Die Nuklease-Lösung durch die Knorpel-Partikel für 20 min bei 3.113 X g Zentrifugieren entfernen und entsorgen des Überstands.
- Waschen Sie die Proben durch Zugabe von 30 mL 10 mM Tris-HCl-Lösung ohne die Deoxyribonuclease und Ribonuklease A auf die Knorpel-Partikel. Aufschwemmen Sie die Partikel und lassen Sie die Proben auf einer Walze für 20 h bei Raumtemperatur.
5. Reinigungsmittel Decellularization
- Machen Sie die Reinigungslösung durch Auflösen von 1 % (V/V) Octoxynol-1 mit PBS-Puffer.
- Entfernen Sie die Tris-HCl-Lösung von den Knorpel-Teilchen indem für 20 min bei 3.113 X g Zentrifugieren und den Überstand verworfen.
- 30 mL die vorbereitete Reinigungslösung von 1 % auf die Knorpel-Partikel hinzugeben. Aufschwemmen der Knorpel Partikel vorsichtig, um zu vermeiden, Schäumen der Lösung.
Hinweis: Dieser Schritt bricht Zellmembranen. - Inkubieren Sie die Proben auf einer Walze für 24 h bei Raumtemperatur auf einer Walze.
- Die Reinigungslösung durch Zentrifugation für 20 min bei 3.113 X g entfernen und entsorgen des Überstands.
-
Entfernen Sie alle Reste der Decellularization Lösungen gewaschen Sie die Knorpel-Partikel in 6 Zyklen von 8 h 30 ml des Knorpels Waschlösung werden. Durchführen Sie waschen auf einer Walze bei Raumtemperatur.
- Um in der nächsten Wäsche zu ändern, die Aufhängung für 20 min bei 3.113 X gZentrifugieren, überstand verwerfen und frischen Knorpel Waschlösung hinzufügen.
- Verlassen der letzten Wäsche in den Rohren und speichern die decellularized Knorpel Partikel bei-80 ° C.
6. erstellen Gerüste von den Decellularized Partikeln
- Wenn die Partikel bei-80 ° C gelagert worden, tauen Sie die geschlossenen Röhren, die den Knorpel Partikel in warmem Wasser enthalten, vor dem Erstellen der Gerüste.
- Übertragen Sie die Knorpel-Partikel mit einer kleinen Kelle auf eine zylindrische Form, z. B. ein Kunststoff Fläschchen mit einem Durchmesser von 8 mm und einer Höhe von 2 cm.
- Beim Platzieren von Knorpel-Partikel in der Kunststoff-Formenbau, drücken Sie alle Luftblasen, um Hohlräume in das Gerüst zu vermeiden, und füllen Sie die Form bis zum Rand zu.
Hinweis: Es wird immer schwieriger, die Gerüste aus einer Metallform nach Gerüst Bildung nehmen, die zu Rissen in dem Schafott führen kann. - Frieren Sie die Formen mit Knorpel Partikel für 10 min bei-20 ° C.
- Lyophilize der Knorpel Gerüste innerhalb ihrer Formen für 24 h in einer Gefriertrocknungsanlage.
- Nach der Gefriertrocknung, nehmen das Gerüst aus der Form (Abbildung 3) und vernetzen sie mit Ultraviolett (UV) Licht im Abstand von 30 cm und 365 nm über Nacht.
- Um die Gerüste für in-vitro-Zellkultur oder in-vivo Implantation verwenden, Sterilisieren Sie die Gerüste mit, zum Beispiel Ethylen Oxid (EtO) Gas.
Hinweis: EtO Sterilisation erfolgt durch eine externe Partei.
(7) Charakterisierung der Decellularized Gerüste mit histologischen Färbungen
Hinweis: Komplette Decellularization zu gewährleisten und den verbleibenden natürlichen Charakter des Knorpels zu visualisieren, führen Sie mehrere histologische Färbungen vor der Verwendung der Gerüste in jedem Experiment, einschließlich Hämatoxylin und Eosin (H & E) Färbung, um sicherzustellen Decellularization, Safranin-O Färbung um GAG Restpräsenz zu visualisieren, Kollagen Typ I Immunohistochemistry Unterscheidung zwischen Kollagengehalt und Kollagen Typ II Immunohistochemistry zwischen Kollagengehalt unterscheiden.
- Schneiden Sie die Gerüste in dünne Scheiben von ca. 3 mm mit einem Skalpell.
Hinweis: Die Gerüste in größeren oder kleineren Größen geschnitten werden, wenn die Dauer der Austrocknung Zyklen angepasst werden. - Betten Sie die Gerüste in einem Rückgang von 4 % (w/V) Alginat ein und induzieren Sie Vernetzung durch Zugabe von einem ähnlichen Volumen von 3,7 % nicht gepuffert Formalin, die 20 mM CaCl2enthält.
Hinweis: Einbetten von Alginat macht die Gerüst Scheiben mehr starr im Vergleich zu den Waschschritten vor Paraffin einbetten. Im Fall, dass die Gerüste Zelle ausgesät haben wurden oder in Vivo implantiert, ist die Einbettung von Alginat nicht erforderlich, da die Zusammensetzung der Gerüste resistent genug durch ECM-Aufnahme durch die Zellen werden. - Austrocknen der Proben durch Einlagerung in eine abgestufte Ethanol-Reihe, beginnend mit einer einstündigen Zyklen von 70 %, 96 %, 96 %, 100 % und 100 % Ethanol, gefolgt von zwei 1 h-Zyklen von Xylol und endend mit zwei 1 h-Zyklen von Paraffin bei 60 ° C.
- Nach Austrocknung Paraffin-Einbetten der Proben in einer Form und kühlen die Proben ab.
- Schneiden Sie die Proben mit ein Mikrotom in 5 μm dicke Scheiben.
- Rehydrieren Sie vor der Färbung die Proben werden, indem sie in einer Reihe zurückgegebene abgestufte Ethanol. Beginnen Sie mit zwei Wäschen von Xylol für 5 min, gefolgt von 2 Wäschen von 100 %, 95 % und 70 % Ethanol für 3 min pro Waschgang. Schließlich waschen Sie die Proben 3 Mal in Wasser 2 min. lang.
Hinweis: Stellen Sie bei der Verwendung von Alginat, um Proben für Paraffin einbetten zu verarbeiten sicher, das Alginat mit 10 mM Zitronensäure vor Rehydratation von Paraffin Abschnitte abwaschen. - Färben Sie die Proben mit Hämatoxylin und Eosin, Safranin-O, Kollagen I und Kollagen II als vorherigen beschriebenen11.
(8) Charakterisierung der Decellularized Gerüste mit quantitativen Analysen
- Erhalten Sie Papain verdaut die Gerüste wie oben beschrieben11.
- Führen Sie einen Test mit einem Fluoreszenz-basierte DNA Quantifizierung Kit zur Messung der Doppel-Strang DNA-Gehalt von Gerüsten, vollständige Decellularization zu gewährleisten. Das Protokoll des Herstellers zu folgen. Drücken Sie die Menge an DNA pro Trockengewicht des Gerüstes.
- Führen Sie einen blauen Dimethylmethylene-Assay um den Rest der GAGs in das Gerüst zu quantifizieren, wie zuvor beschrieben11. Den Betrag in GAG pro DNA ausdrücken.
9. Aussaat Decellularized Gerüste
- Schneiden Sie sterilisierte Gerüste aus Schritt 6,7 in 3 mm dicke Scheiben.
- Die Gerüste in separaten Brunnen von einem 6-Well-Platte zu übertragen.
- Gerüste mit Zellkulturmedium durch Pipettieren 1 mL des Mediums auf dem Schafott rehydrieren und lassen Sie es für 30 min. Einweichen Knorpelzelltransplantation oder mesenchymalen Stammzellen (MSC) Ausbau Medium verwenden.
Hinweis: Verwenden Sie das gleiche Medium für Gerüst Rehydratation für Zellkultur der Zellen, die ausgesät werden. Knorpelzelltransplantation Erweiterung Medium besteht aus Dulbeccos veränderten Medien (DMEM) mit 10 % Hitze-inaktivierten fetalen bovine Serum (FBS), 100 U/mL Penicillin, 100 μg/mL Streptomycin und 10 ng/mL Fibroblasten Wachstumsfaktor-2 (FGF-2). MSC Erweiterung Medium besteht aus mindestens wesentliche mittlere Alpha (MEM) mit 10 % Hitze-inaktivierten FBS, 0,2 mM L-Ascorbinsäure Säure 2-Phosphat, 100 U/mL Penicillin, 100 μg/mL Streptomycin und 10 ng/mL FGF-2. - Bereiten Sie 3 x 106 Zellen in 100 μl Medium, welches das erforderliche Volumen für jedes Gerüst mit einem Durchmesser von 8 mm und einer Höhe von 3 mm ist.
Hinweis: Für die Aussaat können mehrere Zelltypen aus verschiedenen Arten verwendet werden. Bei Verwendung von Chondrozyten oder mesenchymaler Stromazellen Zellen Isolieren Sie die Zellen wie oben beschrieben11. Bei der Verwendung von Chondrozyten stellen Sie sicher, dass sie nicht hinter der P1-Passage um Minimierung der Anzahl von entdifferenzierten Chondrozyten erweitert wurden. Wenn Sie mesenchymale Stromazellen Zellen verwenden, müssen sie auf ihre Fähigkeit zur Differenzierung der Multi-Linie, wie zuvor beschrieben14getestet werden. - Pipettieren 50 μL der Zellsuspension auf dem eingeweichter Gerüst vorbereitet und das Gerüst für 1 h bei 37 ° c inkubieren
- Vorsichtig drehen Sie das Gerüst auf den Kopf nach unten, pipettieren die restlichen 50 μL der Zellsuspension auf dieser Seite des Gerüstes und 1 h bei 37 ° c inkubieren
- Nach der Inkubation der Brunnen 3 mL Medium hinzu, und Kultur der Zelle ausgesät Gerüste bei 37 ° C. Behandeln Sie die Kultur-Platte sanft um die Loslösung der Zellen zu vermeiden.
- Kultur der Gerüste für die Zeit, die für das Experiment benötigt und das Medium 2 – 3 Mal pro Woche zu verändern. Pipettieren langsam und so weit weg von dem Gerüst wie möglich.
- Nach der Kultivierung von Zellen ausgesät Gerüst, Halbierung der Gerüste und für Histologie und biochemische Analysen zu verarbeiten.
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Representative Results
Decellularization CDM Gerüste muss immer bestätigt werden, mit histologischen Färbungen sowie die Verwendung von DNA-Quantifizierung, um die Menge an DNA-Reste zu messen. Unzureichende Decellularization kann zu unerwünschten Immunreaktionen führen, die Einfluss auf die Ergebnisse in in-vivo Einstellungen15,16,17. Für diese spezifische Decellularization-Methode, DNA war unter den Erfassungsbereich, begonnene bei 13,6 ± 2,3 ng/mg DNA/trocken Gewicht (n = 3). Volle Decellularization unter Verwendung dieses Protokolls führt zu die Produktion von einem Gerüst, das reich an Kollagen Typ II (Abbildung 4) und hat keine Zellen (Abb. 4A) oder GAGs (Abbildung 4 b). Gesunde Pferde Knorpel wird als Vergleich, gebeizt für Safranin-O (Abb. 5A) und Kollagen II (Abb. 5 b) angezeigt.
Das Gerüst muss eine makroskopisch homogene Porosität angezeigt werden. Luftbläschen führt zu leicht nachweisbar große Löcher in das Gerüst und sind daher sorgfältig entfernt. Diese große Löcher in das Gerüst können wirken sich nachteilig auf die mechanischen Eigenschaften und führen zu inhomogenen Zellhaftung bei der Aussaat. Erfolgreiche Produktion des Gerüstes beinhaltet auch einen Gefriertrocknung Schritt mindestens 24 Stunden lang; Dies führt zu einem Gerüst, das ein weißes Erscheinungsbild (Abbildung 3). Im Falle einer unzureichenden Lyophilisierung die Gerüste haben eine gelbliche Farbe und keine klare Poren können beobachtet werden.
In Reihenfolge für das Gerüst für in Vivo zu verwendende muss Anwendungen und in-vitro-Zelle-säen, Zelle Integration mit dem Gerüst sowie zelluläre Funktionen angezeigt werden. Hier wurden Gerüste mit MSCs, die ECM nach 4 (Abbildung 6A-D) und 6 (Abbildung 6E-H) produziert ausgesät Wochen der in-vitro-Kultivierung. Bildung von Knebel, Kollagen II und eine periphere Kollagen ich, ebenso wie das Vorhandensein von Zellen, wurde gezeigt. Darüber hinaus ist die Spezifität von Kollagen II angezeigt, in Abbildung 5 b, wo Knorpel aber nicht Knochen positiv für Kollagen II in eine osteochondrale Stecker verschmutzt ist.
Abbildung 1: Equine Knie nach dem Entfernen der voll-dicke Knorpel. Der Knorpel ist entfernt von der Kondylen mit einem Skalpell, bis die verkalkten Knorpelschicht, die mit einem Skalpell geschnitten werden kann nicht erreicht wird. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 2: sequentielle Schritte bei der Erstellung decellularized Knorpel abgeleitet Matrix Teilchen. (A) Knorpel Scheiben, die aus der Kondylen entfernt wurden in eine Antibiotika-Infusion-Lösung gewaschen. (B) Knorpel Scheiben sind lyophilisiert, und jetzt weiße und Papier-wie aussehen. (C) Snap-Einfrieren von lyophilisierter Knorpel ist vor (D) durchgeführten vibrationsarmer Knorpel Partikel durch Hand-Fräsen mit einem Mörser und Stößel. Schritt D kann auch mit automatischen Fräsen erfolgen. Diese Zahl wurde von Benders Et Al.11geändert. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 3: das Endprodukt, ein decellularized Knorpel abgeleitet Matrix Gerüst. Diese zylindrischen Gerüst ist 2 cm hoch und hat einen Durchmesser von 8 mm. Das Gerüst hat eine klare poröse Struktur. Die linke und rechte Bild zeigt ein Gerüst aus zwei verschiedenen Blickwinkeln. Beachten Sie, dass keine großen Löcher an der Oberfläche des Gerüstes vorhanden sind, da alle Luftblasen vor Lyophilisierung entfernt wurden. Diese Zahl wurde von Benders Et Al.11geändert. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 4: histologische Charakterisierung des Gerüstes. (A) H & E Färbung zeigt ECM Partikel unterschiedlicher Größe und das Fehlen von Zellen. (B) Safranin-O Färbung zeigt, dass keine GAGs dabei Decellularization beibehalten wurden. (C) Kollagen Typ II Immunolocalization zeigt, dass die decellularized Partikel reich an Kollagen Typ II sind. Skalieren von Balken = 500 µm. Diese Zahl wurde von Benders Et Al.11geändert. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 5: histologische Darstellung der gesunden Pferden Knorpel. (A) eine osteochondrale Stecker mit Safranin-O und schnell grün zeigt Knochen ohne GAGs (grün), Knorpel mit GAGs (rot) und die verkalkte Knorpelschicht zwischen befleckt. (B) ein Kollagen II-gefärbten osteochondrale Stecker Flecken Knorpel aber nicht Knochen. Skalieren von Balken = 500 µm. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 6: Neo-Matrixbildung auf dem Gerüst nach 4 bis 6 Wochen der Kultur mit mesenchymaler Stromazellen Zellen. Nach 4 (A-D) und 6 (E-H) Wochen Kultur, neu gebildete Matrix ist reich an Zellen (A + E), Kollagen II (B + F) und GAGs (C + G), mit H & E, Kollagen II und Safranin-O Keramikschalen bzw. beobachtet werden können. Darüber hinaus Kollagen I ist vorhanden nach 4 (D) und 6 (H) Wochen in der Peripherie des Gerüstes. Zelldichte sowie die Menge der Matrix Deposition liegt an der Peripherie zur Verfügung. Skalieren von Balken = 500 µm. Diese Zahl wurde von Benders geändert Et Al.11. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
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Discussion
Das ECM des Gelenkknorpels ist sehr dicht und sehr widerstandsfähig gegenüber verschiedenen enzymatischen Behandlungen. In diesem Artikel beschriebenen mehrstufigen Decellularization-Protokoll befasst sich mit solchen Widerstand und erfolgreich erzeugt decellularized Matrizen. Um dies zu erreichen, erstreckt sich der Prozess über mehrere Tage. Viele Decellularization Prozesse sind für verschiedene Arten von Gewebe18vorgeschlagen worden, und dieser Artikel beschreibt ein Protokoll für die Decellularization des Knorpels. In diesem Protokoll ist es jedoch notwendig, die enzymatische Behandlung mit Reinigungsmittel Schritte folgen, um alle Zellen zu entfernen. Die Menge an DNA ist bemerkenswert in den ersten Schritten bei der Behandlung mit Trypsin vermindert, und verlassen Sie diese Schritte ergeben sich nicht ordnungsgemäße Decellularization11.
Beachten Sie, dass dieses Protokoll auf der Decellularization von equine Knorpelgewebe basiert. Die Aktivität des Enzyms Lösungen verwendet wurde für die angemessene Entfernung von equinen Chondrozyten ausreichend gefunden. Allerdings müssen das Protokoll trotz der Erhaltung der Matrix Komposition über Artgrenzen für Decellularization des Knorpels von anderen Tieren aufgrund der Unterschiede in der Höhe natürlich wohnen Chondrozyten19angepasst werden. Zum Beispiel Knorpel von kleineren Tieren ist bekannt, dass eine höhere Zellinhalt und erfordern daher einen aggressiveren Decellularization Prozess. Ein besonderer Grund für die Auswahl der Pferde Knorpel decellularized Gerüste zu erstellen ist, dass Pferde und menschliche Knorpel zeigen klare Ähnlichkeit in Dicke, Zelldichte und biochemische Make-up20.
Um einen reproduzierbaren Produkt zu gewährleisten, möglicherweise mehrere Bewertungskriterien wichtig um festzustellen, ob komplette Decellularization erreicht worden ist. In diesem Protokoll wurden ein H & E Färbung und biochemische Quantifizierung verwendet, um die verbleibende Menge an DNA im Endprodukt auszuwerten. Andere Forscher haben auch vorgeschlagen, bestimmen die Größe der verbleibenden DNA mit maximal 200 bp in der Länge für Qualität kontrollieren21oder eine Restmenge von DNA von weniger als 50 ng/mg trocknen Gewebe Gewicht18,22. Unabhängig davon müssen Änderungen des Protokolls mit histologischen Auswertung und quantitativen Assays zu bestimmen, die Wirkung der Decellularization, sowie die restlichen ECM-Produkten immer weiterverfolgt werden.
Die Haupteinschränkung dieses Protokolls ist, dass die gründliche Decellularization Verfahren unter Beteiligung der Exposition gegenüber Trypsin zu umfangreichen GAGs führt. Obwohl Trypsin nicht GAGs zu Spalten, kann der Grund für den Verlust von GAGs die Eröffnung bis von Knorpelgewebe durch Trypsin Spaltung von Proteinen, die Anker oder Kapseln GAGs. ECM-Komponenten wie GAGs sind wichtig für die Beibehaltung von Wasser im Gelenkknorpel und daher eine bedeutende Rolle in der biomechanischen Belastbarkeit der Gewebe4. Protokolle, die auf den GAGs während des Decellularization-Prozesses zu reduzieren werden die Gründlichkeit des Decellularization Prozesses beeinflussen.
Nach Decellularization wurden in Zellen ausgesät Gerüste Zelle Integration und Funktion gezeigt. Die bisherige Forschung hat gezeigt, dass Matrix Produktion von Chondrozyten auf diesem Gerüst unbefriedigend, vor allem im Vergleich zur reichlich Matrix Ablagerung von mesenchymalen Zellen Stromazellen11. Da Knorpel-ähnliches Gewebe auf dem Schafott hinterlegt ist, diese neue Matrix in der Regel zuerst in der Peripherie des Gerüstes lagert sich vor eindringenden ans Ende der Gerüste. Dies kann auf die histologischen Scheiben, wo eine Zelle-reiche Peripherie, anstatt ein Zelle-Reich-Center oft ist, deutlich beobachtet werden (Abbildung 6) zu sehen. Jedoch kann dieser Effekt reduziert werden, wenn Perfusion Bioreaktoren für Zelle Aussaat und Nährstoffaustausch zu verbessern. Als Matrix Ablagerung auftritt, übernimmt die Gerüste auch eine glänzender aussehen, immer mehr mechanisch konsistente und weniger spröde. So können sie problemlos geschnitten werden, mit einem Skalpell, ohne auseinander zu fallen. Die Eigenschaften der neu gebildeten Matrix können mit histologischen Färbungen und quantitativen Assays beurteilt werden. Da keine GAGs nach dem Decellularization-Prozess übrig sind, werden alle GAGs, die quantitativ messbar sind ein Produkt der Neosynthesis.
Hergestellt unter Verwendung dieses Protokolls Decellularization Gerüste bieten eine Standardlösung und können ohne die Notwendigkeit der Zelle vor der Implantation Aussaat implantiert werden. Jedoch als eine Behandlung Chondral Mängelhaftung (Osteo) aufgetragen, müssen die biomechanischen Eigenschaften verbessert werden, um die Chance der Einzug des Konstrukts in den frühen Phasen der Gelenkknorpel Belastung zu vermindern. Co Implantation mit Schutzschichten auf Ober- oder andere Verstärkung Strategien kann umgesetzt werden müssen. In Zukunft kann weitere Verfeinerung des Protokolls das regenerative Potential des Gerüstes verbessern. Zum Beispiel kann, die Beibehaltung der GAGs, die Erhaltung der Faserorientierung Kollagen oder Kombination mit anderen Biomaterialien, diese Gerüste zu verstärken, um eine verbesserte und reibungslos regenerierte Gelenkfläche ermöglichen vorteilhaft. Infolgedessen können diese Gerüste als Komponenten der nächsten Generation von regenerativen Grafts zur Behandlung von (Osteo) Chondral Mängel. eine Rolle spielen.
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Disclosures
Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessenkonflikte.
Acknowledgments
Die Autoren möchten W. Boot für Hilfe bei der Herstellung der Gerüste zu bestätigen. K.E.M. Benders stützt sich auf die Alexandre Suerman Stipendium vom University Medical Center. R. Levato und J. Malda werden von der niederländischen Arthritis Foundation unterstützt (Finanzhilfevereinbarungen CO-14-1-001 und LLP-12, beziehungsweise).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cadaveric joint | This can be obtained as rest material from the local butcher or veterinary center. | ||
| Sterile phosphate-buffered saline (PBS) | |||
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140 | |
| Amphotericin B | Thermo Fischer Scientific | 15290026 | |
| Liquid nitrogen | |||
| Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red | Thermo Fischer Scientific | 25200072 | |
| Tris-HCl pH 7.5 | |||
| Deoxyribonuclease I from bovine pancreas | Sigma-Aldrich | DN25 | |
| Ribonuclease A from bovine pancreas | Sigma-Aldrich | R6513 | |
| Triton X-100 (octoxynol-1) | Sigma-Aldrich | X100 | |
| Papain | Sigma-Aldrich | P3125 | |
| Trisodium citrate dihydrate | Sigma-Aldrich | S4641 | |
| Alginate | Sigma-Aldrich | 180947 | |
| Formalin | |||
| CaCl2 | |||
| Ethanol | |||
| Xylene | |||
| Paraffin | |||
| Ethylene oxide sterilization | Synergy Health, Venlo, the Netherlands | ||
| Multipotent Stromal cells/chondrocytes from equine donors | MSCs and chondrocytes can be isolated from donor joints that are rest material, coming from the local butcher or veterinary center. | ||
| MEM alpha | Thermo Fischer Scientific | 22561 | |
| L-ascorbic acid 2-phosphate | Sigma-Aldrich | A8960 | |
| DMEM | Thermo Fischer Scientific | 41965 | |
| Heat inactivated bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | 10735086001 | |
| Fibroblast growth factor-2 (FGF-2) | R & D Systems | 233-FB | |
| DNA quantification kit (Quant-iT PicoGreen dsDNA Reagent) | Thermo Fischer Scientific | P7581 | |
| 1,9-Dimethyl-Methylene Blue zinc chloride double salt | Sigma-Aldrich | 341088 | |
| Freeze-dryer | SALMENKIPP | ALPHA 1-2 LD plus | |
| Analytical mill | IKA | A 11 basic | |
| mortar/pestle | Haldenwanger 55/0A | ||
| Roller plate | CAT | RM5 | |
| Centrifuge (for 50 mL tubes) | Eppendorf | 5810R | |
| Capsule (cylindric mold) | TAAB | 8 mm flat | |
| Superlite S UV | Lumatec | 2001AV | |
| Incubator | |||
| Microtome | |||
| Sieve (mesh size 0.71 mm) | VWR | 34111229 | |
| Scalpel | |||
| Scalpel holder | |||
| Small laddle |
References
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