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Biology

एम्फीबियन में डिम्बग्रंथि की निगरानी और नियंत्रण के लिए प्रजनन तकनीक

Published: May 12, 2019 doi: 10.3791/58675
Automatic Translation
1,2, 3, 2, 2, 4
1Reproductive Sciences, San Diego Zoo Institute for Conservation Research, 2Recovery Ecology, San Diego Zoo Institute for Conservation Research, 3Menagerie du Jardin des Plantes, Museum National d'Histoire Naturelle, 4Cincinnati Zoo & Botanical Garden, Center for Conservation and Research of Endangered Wildlife

Summary

उभयचर जीव विज्ञान का अध्ययन प्रजनन, शारीरिक, भ्रूण और विकासात्मक प्रक्रियाओं के बारे में बहुमूल्य जानकारी प्रदान करता है जो कई वर्गीकरण समूहों के जीवों को ड्राइव करते हैं। यहाँ, हम विभिन्न तरीकों कि उभयचर में डिम्बग्रंथि नियंत्रण और निगरानी का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है पर एक व्यापक गाइड पेश करते हैं.

Abstract

उभयचरों में डिम्बग्रंथि नियंत्रण और निगरानी के लिए एक बहुआयामी दृष्टिकोण की आवश्यकता होती है। वहाँ कई अनुप्रयोगों है कि सफलतापूर्वक प्रजनन व्यवहार और शारीरिक या आणविक अनुसंधान के लिए gametes और भ्रूण के अधिग्रहण प्रेरित कर सकते हैं. एम्फीबियन कशेरुकी अनुसंधान के एक-तिहाई तक योगदान देते हैं, और इस संदर्भ में रुचि प्रजनन प्रक्रियाओं और भ्रूणीय विकास के वैज्ञानिक समुदाय के ज्ञान में उनका योगदान है। हालांकि, इस ज्ञान के अधिकांश प्रजातियों की एक छोटी संख्या से ली गई है। हाल के दिनों में, दुनिया भर में उभयचरों के विनाश संरक्षणवादियों द्वारा बढ़ते हस्तक्षेप की आवश्यकता है। बंदी वसूली और आश्वासन कालोनियों कि विलुप्त होने के जोखिम के जवाब में उभरने के लिए जारी रखने के मौजूदा अनुसंधान और नैदानिक अनुप्रयोगों मानव देखभाल के तहत आयोजित उभयचरों के अस्तित्व और प्रजनन के लिए अमूल्य बना. किसी भी बंदी आबादी की सफलता अपने स्वास्थ्य और प्रजनन और व्यवहार्य वंश है कि आगे उनकी प्रजातियों के सबसे विविध आनुवंशिक प्रतिनिधित्व ले विकसित करने की क्षमता पर स्थापित किया गया है. शोधकर्ताओं और पशु चिकित्सकों के लिए, निगरानी और डिम्बग्रंथि के विकास और स्वास्थ्य को नियंत्रित करने की क्षमता है, इसलिए, जरूरी है. इस लेख का ध्यान विभिन्न सहायता प्राप्त प्रजनन तकनीकों को उजागर करना है जिनका उपयोग निगरानी करने के लिए किया जा सकता है और जहां उचित या आवश्यक हो, उभयचरों में डिम्बग्रंथि समारोह को नियंत्रित करें। आदर्श रूप में, किसी भी प्रजनन और स्वास्थ्य के मुद्दों को उचित बंदी के माध्यम से कम किया जाना चाहिए, लेकिन, किसी भी जानवर के साथ के रूप में, स्वास्थ्य और प्रजनन रोगों के मुद्दों अपरिहार्य हैं। गैर इनवेसिव तकनीक व्यवहार आकलन, दृश्य निरीक्षण और palpation और शरीर की स्थिति सूचकांक और अल्ट्रासाउंड की गणना के लिए morphometric माप शामिल हैं. इनवेसिव तकनीक हार्मोनल इंजेक्शन, रक्त नमूना, और सर्जरी शामिल हैं। डिम्बग्रंथि नियंत्रण आवश्यक आवेदन और ब्याज की प्रजातियों के आधार पर तरीकों की एक संख्या में प्रयोग किया जा सकता है।

Introduction

Amphibians लंबे समय अनुसंधान विषयों की एक विस्तृत श्रृंखला द्वारा महत्वपूर्ण जैविक और चिकित्सा मॉडल के रूप में मान्यता प्राप्त किया गया है. Xenopus laevis और एक्स उष्णकटिबंधीय, तेंदुए मेंढक ( पूर्व राणा) pipiens) और axolotl (एम्बीस्टोमा मैक्सिकनम) के रूप में विशेष प्रजातियों का अध्ययन करके प्राप्त डेटा के लिए लागू किया गया है मानव सहित अन्य कशेरुकी प्रजातियों की एक संख्या। पशु चिकित्सा, पशुपालन और सहायता प्रजनन तकनीक है कि इन और अन्य उभयचरों का अध्ययन करने से उभरा है सफल देखभाल, रखरखाव और कैद में दुर्लभ आबादी की स्थिरता के विकास के साथ काम सौंपा उन लोगों के लिए सहायता प्रदान 1 , २ , 3 , 4.

जोखिम उभयचर प्रजातियों1,2 में अनेक लोगों के विलुप्त होने के ज्वार को उलटने के लिए इन और पूर्व सिटू संरक्षण आधारित दृष्टिकोणों के समवर्ती उपयोग के लिए रुचि प्राप्त हो रहीहै. यह लेख अनुरानों और कावडों की मॉडल प्रजातियों में उभयचर डिम्बग्रंथि समारोह की निगरानी और नियंत्रण के लिए वर्तमान में उपलब्ध पद्धतियों को उपलब्ध कराता है. इसके अतिरिक्त, अंडे प्रतिधारण के एक आम प्रजनन विकृति को संबोधित करने के लिए मौजूदा तकनीक प्रस्तुत की है.

कई वर्गीकरण समूहों में के रूप में, उभयचर डिम्बग्रंथि नियंत्रण पर्यावरण और शरीर क्रिया विज्ञान के बीच कसकर सिंक्रनाइज़ बातचीत की एक श्रृंखला शामिल है. तापमान और photoperiod (लगभग संकेतों के रूप में जाना जाता है) आंख और मस्तिष्क जहां वे तेजी से आनुवंशिक, हार्मोनल और circadian प्रक्रियाओं (अंतिम संकेत)3,4में परिवर्तित कर रहे हैं द्वारा डीकोड कर रहे हैं. तरीकों की निगरानी और इस लेख में शामिल डिम्बग्रंथि समारोह को नियंत्रित करने के लिए इनवेसिव और गैर इनवेसिव तकनीक शामिल हैं. संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति (IACUC) अनुसंधान और शिक्षण आवश्यकताओं उन है कि कोई शारीरिक दर्द या मानसिक संकट के लिए कम से कम कारण होगा और कोई दर्द से राहत दवाओं की आवश्यकता के रूप में गैर इनवेसिव तकनीकों को परिभाषित5. यहाँ, गैर इनवेसिव तकनीक दृश्य निरीक्षण और palpation, व्यवहार टिप्पणियों, morphometric आकलन और अल्ट्रासाउंड शामिल हैं. इसके विपरीत, रक्त संग्रह की तकनीक, हार्मोन प्रशासन और सर्जरी (ओवेरीउच्टॉमी और बनाए रखा अंडे को हटाने) आक्रामक के रूप में वर्गीकृत कर रहे हैं क्योंकि वे कुछ दर्द या असुविधा में परिणाम और संज्ञाहरण या बाद प्रक्रियात्मक दवा चिकित्सा की आवश्यकता हो सकती है.

गैर इनवेसिव डिम्बग्रंथि निगरानी तकनीक आसानी से सबसे बंदी उभयचर ों के लिए दैनिक देखभाल दिनचर्या में शामिल किया जा सकता है. प्रजातियों पर निर्भर करता है, डिम्बग्रंथि gravidity अक्सर सरल दृश्य निरीक्षण (ग्लास मेंढक) द्वारा निर्धारित किया जा सकता है। अन्य मामलों में, palpation संकेत हो सकता है कि क्या एक महिला gravid है. विभिन्न शरीर की स्थिति सूचकांक (बीसीआई) जैसे वजन, स्नाउट यूरोस्टाइल लंबाई (एसयूएल), स्नाउट-वेंट लंबाई (एसवीएल) और मानक द्रव्यमान सूचकांक (एसएमआई) अंडे की उपस्थिति या अनुपस्थिति की भविष्यवाणी करने के लिए उपलब्ध हैं4,6,7, 8,9. हालांकि, ध्यान परिणामों की व्याख्या के साथ लिया जाना चाहिए क्योंकि अधिकांश उम्र, शरीर के आकार यासंरचना पर विचार नहीं करते हैं (जैसे, पानी डिम्बग्रंथि द्रव्यमान या वसा बनाम बनाए रखा) 6. निश्चित प्रजनन निदान अल्ट्रासाउंड के माध्यम से प्राप्त किया जा सकता है जिसमें अंडा विकास और डिम्बग्रंथि चक्र4,7के मंचन के बारे में अधिक गहराई से ज्ञान प्राप्त किया जा सकता है . अल्ट्रासाउंड प्रजनन रोगों और संबद्ध शारीरिक स्थितियों4,8 की पुष्टि करने और उनकी निगरानी करने का साधन भी प्रदान करताहै.

स्वास्थ्य की स्थिति के बारे में जानकारी प्रदान करने के अलावा, रक्त नमूने प्रजनन हार्मोन को मापने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. यदि हार्मोन रूपरेखा अंतिम लक्ष्य है, यह तनाव से संबंधित प्रभावों है कि प्रणालीगत स्टेरॉयड डेटा भ्रमित हो सकता है से बचने के लिए महत्वपूर्ण है. जबकि एक संभावित शक्तिशाली निगरानी उपकरण, वहाँ अभी तक एक अध्ययन किसी भी उभयचर प्रजातियों में exogenous हार्मोन प्रशासन के लिए सहज endocrinological प्रतिक्रियाओं का प्रदर्शन किया जा रहा है. रक्त सुरक्षित रूप से कई साइटों से लिया जा सकता है; मेंढ़कों में इसमें अधर उदर शिरा , जिह्वा जाल, ऊरु शिरा और हृदय9,10शामिल हैं . Caudates में, रक्त अधर पूंछ नस से एकत्र किया जाता है. आक्रामकता की डिग्री, आवश्यक संयम की मात्रा, संवेदनाहारी की आवश्यकता, अंग की विनम्रता को लक्षित किया जा रहा है, और पशु के आकार पर विचार किया जा सकता है जब उभयचर रोगी के लिए एक संग्रह तकनीक का चयन. इस लेख में मुख्य रूप से फोर्ज़न एट अल9द्वारा वर्णित मेंढकों के चेहरे की जंभिका या पेशी मूत्रसेवद शिरा से रक्त संग्रह की तकनीक प्रस्तुत की जाएगी।

डिम्बग्रंथि नियंत्रण प्रजातियों विशिष्ट है और, इस तरह के रूप में, हार्मोन प्रोटोकॉल का परीक्षण किया और अनुकूलित किया जाना चाहिए. मौसमी और संबद्ध घूम हार्मोन वातावरण के अलावा, डिम्बग्रंथि नियंत्रण भी कसकर उम्र से जोड़ा जा सकता है, कैद में बिताए समय और दोहराया हार्मोन प्रशासन के लिए जोखिम, जिसके लिए साहित्य में कम जानकारी है11 , 12 , 13. प्रजनन व्यवहार, युग्मक उत्पादन, परिपक्वता और अंड-स्थिति प्राप्त करने के लिए हार्मोन उपचारों का कार्यान्वयन कैदसेजुड़ी सामान्य प्रजनन समस्याओं को हल करने के लिए एक व्यापक रूप से सूचित दृष्टिकोण बन गया है4 , 8,14,15,16. क्योंकि कशेरुकियों में प्रजनन को नियंत्रित करने के तंत्र अत्यधिक संरक्षित कर रहे हैं, वहाँ हार्मोन की एक संख्या हैं, neuropeptides और व्यावसायिक रूप से उपलब्ध दवाओं अन्य वर्गीकरण समूहों है कि भी मज़बूती से एक संख्या में इस्तेमाल किया जा सकता में चिकित्सकीय इस्तेमाल किया उभयचर जातियां (सारणी 1)। Gonadotropin जारी हार्मोन (GnRH) और मानव chorionic gonadotropin (एचसीजी) (या उसके बदलाव, अर्थात्, पीएमएसजी और ईसीजी)17,18,या तो व्यक्तिगत रूप से या संयोजन में, उभयचर captivebian में बड़े पैमाने पर इस्तेमाल किया गया है प्रजनन कार्यक्रम सहित: दक्षिणी रॉकी पर्वत बोरल (Anaxyrus boreas boreas)4,19,20; टॉड, डुस्की गोफर मेंढक, राणा सेवोसा (लंगहॉर्न एट अल., अप्रकाशित)7; खाड़ी तट वाटरडॉग, Necturus beyeri20; व्योमिंग टॉड, एनाक्सीरस बैक्सरी18; बुलफ्रॉग, राणा कैटेस्बीना21; अमेरिकी टॉड, एनाक्सीरस अमेरिकेस22; घास मेंढक, Lymnodyaster tasmaniensis23; कोकी, एल्यूथेरोडैक्टिलस कोकी24; Xenopus, Xenopus laevis25; गुंथर के टोडलेट, Pseduophryne guentheri26; उत्तरी तेंदुए मेंढक, Lithobates pipiens; अर्जेंटीना के हॉर्न्ड-फ्रॉग, सेरेटोफ्रिस अलंकृत; क्रैनवेल के सींग वाले-फ्रॉग, सी क्रैनवेली; अमेरिकी जमीन-फरो, ओडोन्टोथ्रीनस अमेरिकास27; और आग समन्दर (सालमन्ड्रा)228. स्टेरॉयड हार्मोन, प्रोजेस्टेरोन (P4) की तरह, कम आमतौर पर सूचित कर रहे हैं, लेकिन anurans की कुछ प्रजातियों में ओव्यूलेशन और oviposition प्राप्त करने में अच्छी प्रभावकारिता का प्रदर्शन कियाहै 16,18,29. Prostaglandins (विशेष रूप से Prostaglandin 2-अल्फा (पीजीएफ2 ])) corticosteroids30,31,32,34 के साथ साथ ovulation में शामिल हैं और के दौरान उच्च स्तर तक पहुँचने ओव्यूलेटरी चरण31|

इन विट्रो अध्ययनों में पीजीएफ2 ओव्यूलेशन31का एक शक्तिशाली प्रेरक है , जबकि विवो में यह राणा मस्कोसा4,30,32में रखे हुए अंडों की ओवीपोजिशन पैदा कर सकता है . पिट्यूटरी अर्क भी ओव्यूलेशन15,16,34के प्रभावी प्रेरक हैं ; तथापि, जैव सुरक्षा और रोग संचरण की संभावना से संबंधित चिंताएं इस दृष्टिकोण35पर विचार करते समय कैप्टिव प्रजनन कालोनियों के लिए अक्सर एक निवारक होती हैं.

इस लेख के अंतिम खंड शल्य चिकित्सा प्रक्रियाओं का विवरण और प्रजनन रोगों के संकल्प के साथ डिम्बग्रंथि के अध्ययन या सहायता का विस्तार करने के लिए वैकल्पिक दृष्टिकोण प्रदान करता है। डिम्बग्रंथि के भ्रूण अनुसंधान के लिए अंडाणु प्राप्त करने के लिए उभयचरों में सबसे अधिक प्रदर्शन किया जाता है। हालांकि, यह भी बनाए रखा अंडे के लिए एक उपाय प्रदान कर सकते हैं जब एक और विकल्प विफल. हालांकि इस प्रक्रिया आक्रामक है, पूर्ण संज्ञाहरण और चीरों की आवश्यकता के लिए अंडे जनता का पर्दाफाश, यह इच्छामृत्यु की आवश्यकता नहीं है. इसके अलावा, आंशिक अंडाशय के बाद, जानवरों को एक पूर्ण वसूली कर सकते हैं और प्रजनन के बाद सर्जरी8,36जारी रखने के लिए.

नीचे वर्णित प्रोटोकॉल डिम्बग्रंथि नियंत्रण और Anurans और Caudates में निगरानी के आक्रामक और गैर इनवेसिव तरीकों रूपरेखा. अनुरानों में तकनीकों को दर्शाने के लिए चुनी गई विशिष्ट प्रजातियों में आर. म्यूकोसा और एक्स लेविसशामिल हैं . नेक्टूरस मैकुलोसस, एन बेयरी, एन अलबामेसिस, और ए. मैक्सिकनम में काइडेट्स में इसी तरह की तकनीकों का वर्णन करने के लिए इस्तेमाल की जाने वाली प्रजातियां शामिल हैं।

Protocol

समन्दर प्रक्रियाओं सिनसिनाटी चिड़ियाघर और बॉटनिकल गार्डन (C$BG) संस्थागत देखभाल और उपयोग समिति (IACUC) प्रोटोकॉल 11-106, 13-110, 14-133, और 15-138 द्वारा अनुमोदित किया गया. सभी मेंढक और टॉड प्रक्रियाओं सैन डिएगो चिड़ियाघर ग्लोबल (एसडीजेडजी), संस्थागत देखभाल और उपयोग समिति (IACUC) प्रोटोकॉल द्वारा अनुमोदित किया गया: 15-001, 16-005 और 18-003.

जानवरों की देखभाल और उपचार को राष्ट्रीय प्राकृतिक इतिहास संग्रहालय (पेरिस) की नैतिक समिति द्वारा अनुमोदित किया गया था (म्युज़ियम नेशनल डी'हिस्टोयर नेचुरले-मनगरी डु जार्डिन डेस प्लांट्स (MNHN), संस्थागत और राष्ट्रीय दिशानिर्देशों के अनुसार (आयोग डे G[nie G]tticue, दिशा D[partementale des Services V]t]rinaires, यूरोपीय संघ के निर्देश 2010/ C75-05-01-2 प्रयोगात्मक और अन्य वैज्ञानिक प्रयोजनों के लिए इस्तेमाल किया कशेरुकी जानवरों के लिए यूरोपीय कन्वेंशन के लिए. इस अध्ययन में प्रयुक्त सभी प्रोटोकॉलों को संदर्भ संख्या 68-037 के अंतर्गत अनुमोदित किया गया था।

1. गैर इनवेसिव डिम्बग्रंथि निगरानी तकनीक

  1. दृश्य निरीक्षण और palpation
    1. नीचे वर्णित तीन तरीकों में से एक में महिला Anuran पकड़ो.
      1. मेंढक या टॉड के पैरों को अंगूठी और छोटी उंगली से सुरक्षित करें, तर्जनी और मध्यमा उंगली के साथ मेंढक के शरीर के पृष्ठीय पक्ष (एब्डोमेन) का समर्थन करते हुए और अंगूठे के साथ अधर पक्ष (चित्र 1क)।
      2. मेंढक या अपने पेट पर एक अंगूठे के साथ प्रमुख हाथ में टॉड पकड़ो और उंगलियों के बाकी जानवर के पीछे सुरक्षा. जानवर के पेट को स्पर्श करने के लिए गैर-प्रमुख हाथ का उपयोग करके महसूस करें कि यदि उपचर्मीय ऊबड़-खाबड़पन है (चित्र 1ख)।
      3. मेंढक या हाथ की हथेली पर टॉड के पेट को आराम, सामने हाथ तर्जनी पर लिपटा और उसके ऊपरी पीठ पर एक अंगूठे.
    2. चूंकि Caudates प्रकृति में पूरी तरह से जलीय हैं, नीचे वर्णित दो विधियों में से एक द्वारा दृश्य निरीक्षण प्रदर्शन.
      1. टैंक पानी युक्त एक अलग 4 एल कंटेनर के लिए पशु ले जाएँ। कंटेनर पकड़ो (lid सुरक्षित) ऊपर और नीचे पर टॉर्च चमक उपस्थिति कल्पना करने के लिए /
      2. MS222 में एनेस्थेटाइज़ (0.5 g/ त्याने मिथेनसल्फोनेट, 0.5 एम नाहको3) के साथ बफर किया। प्रेरण के बाद, अपनी पीठ पर जानवर बारी बारी से और पेट की जांच.
  2. Morphometric आकलन
    1. अनुरानस
      नोट: संज्ञाहरण की आवश्यकता नहीं है.
      1. कैलिपर्स का उपयोग करके, मुंह की नोक से जानवर को मापें, शरीर के केंद्र के साथ-साथ पूंछ की नोक पर SUL और SVL प्राप्त करने के लिए (चित्र 2A, B)।
      2. एक डिजिटल परिशुद्धता पैमाने पर एक प्लास्टिक कंटेनर तर. जानवर को टार्ड कंटेनर में रखें और वजन करें (चित्र 2ग) ।
      3. बड़े जानवरों के लिए, bullfrogs की तरह, या जब क्षेत्र में वजन प्राप्त करने, एक फांसी पैमाने का उपयोग करें (चित्र 2डी).
      4. कई anuran प्रजातियों में के रूप में, आर Muscosa वयस्क महिलाओं को पुरुषों से उनके बड़े आकार और हाथ पर वैवाहिक (थंब) पैड की कमी से भेद (चित्र 3) .
      5. निम्नलिखित सूत्र द्वारा समग्र स्वास्थ्य के मूल मूल्यांकन के रूप में शरीर की स्थिति की गणना करें:
        Fulton के सूचकांक: K ] द्रव्यमान ] लंबाई3
        नोट: Fulton सूचकांक बड़े पैमाने पर और लंबाई से संबंधित मात्रा का एक आयामी संतुलन का उपयोग करता है जहां 3 स्केलिंग प्रतिपादक है कि बड़े पैमाने पर और लंबाई समलंबाई से संबंधित है.
    2. काडेट्स
      1. गैर-एनेस्थेटाइज्ड जानवर को अंदर रखने से पहले एक खाली बैग के साथ टैर स्केल। अतिरिक्त जल का परिचय न करने का ध्यान रखें (चित्र 2D) और जानवरों को रोका जा रहा करने के लिए एक तनाव प्रतिक्रिया के रूप में बलगम स्रावित के रूप में जल्दी से कार्य.
      2. एक फिर से सील प्लास्टिक बैग के तल पर या एक अलग प्लास्टिक कंटेनर है कि विस्तारित कैलिपर्स को समायोजित कर सकते हैं में एक सीधे स्थिति में व्यक्तियों immobilizing द्वारा वयस्क उपाय प्राप्त करें.
      3. कैलिपर्स के साथ शरीर की लंबाई को मापें (चित्र 2ई)
      4. वृद्धि की निगरानी के लिए snout की नोक से पूंछ (SVL) की नोक के लिए caudate उपाय.
  3. व्यवहार अवलोकन
    1. शारीरिक रूप से वास्तविक समय में जानवरों का निरीक्षण या व्यवहार रिकॉर्ड करने के लिए एक वीडियो कैमरा का उपयोग करें।
    2. पशुओं के रिकार्ड प्रेक्षण व्यवहारों को वर्गीकृत करते हैं तथा एथोग्राम का निर्माण करते हैं (चित्र 4)।
    3. प्रजनन व्यवहार को वर्गीकृत करें
      नोट: चित्र 4 एनुरेन्स में पाए गए एक प्रकार के प्रजनन व्यवहार का उदाहरण देता है।
  4. अल्ट्रासाउंड
    नोट: पसंद के अल्ट्रासाउंड ट्रांसड्यूसर, इस उदाहरण में, 7.5 मेगाहर्ट्ज रैखिक या एक बहु आवृत्ति (10-6 मेगाहर्ट्ज) सूक्ष्म-उत्तल, Necturus के लिए सिफारिश की है और एक 10 मेगाहर्ट्ज जांच और पानी घुलनशील, आर muscosaके लिए नमक मुक्त जेल . salamanders पर अल्ट्रासाउंड प्रदर्शन संज्ञाहरण की आवश्यकता हो सकती है (निर्देशों के लिए धारा 1.5 देखें).
    1. अनुरानस
      1. दो लोगों का उपयोग कर आर muscosa पर अल्ट्रासाउंड प्रदर्शन (चित्र 5A) .
      2. पहला व्यक्ति: प्रमुख हाथ से जानवर को पकड़ो और जानवर के पेट में पानी में घुलनशील, नमक मुक्त जेल लागू करें।
      3. दूसरा व्यक्ति (अल्ट्रा-सोनोग्राफर): प्रमुख हाथ में 10 मेगाहर्ट्ज जांच लें और इसे जांच और जेल के बीच अच्छा संपर्क बनाने के लिए सुनिश्चित करने के लिए पेट पर लागू करें।
      4. पूरे अंडाशय कल्पना करने के लिए जानवर के पेट मिडलाइन के केंद्र की ओर हाथ गड्ढे के ठीक नीचे से अंदर की ओर स्लाइड करें।
      5. अल्ट्रा-सोनोग्राफर: फ्रेम फ्रीज और अल्ट्रासाउंड पर वांछित छवियों पर कब्जा करने के लिए गैर प्रमुख हाथ का प्रयोग करें।
      6. 4 जीनस के लिए स्थापित ग्रेडिंग प्रणाली द्वारा डिम्बग्रंथि चक्र के चरण को वर्गीकृत करें (सारणी 2, चित्र 5B-F)।
      7. प्रक्रिया के अंत में किसी भी जेल बंद जानवर कुल्ला.
    2. काडेट्स
      1. टैंक के पानी के 2 एल से भरा 4 एल आयताकार कंटेनर के लिए गैर-एनेस्थेटाइज्ड नेकट्यूरस को स्थानांतरित करें।
      2. कमरे की रोशनी बंद करके पशु आंदोलन को कम करें और/या जानवर के सिर पर एक हाथ कप।
      3. ट्रांसड्यूसर को शरीर की दीवार से 1-2 बउ की दूरी पर स्थित करें।
      4. अधर मध्यरेखा स्तर पर हृदय को फोरलम्ब्स में का पता लगाएँ और फिर ट्रांसड्यूसर को दूर कीजिए और डिम्बग्रंथि ऊतक7की जांच करें .
      5. जीनस4 के लिए स्थापित ग्रेडिंग प्रणाली के अनुसार महिलाओं को वर्गीकृत करें (चित्र 6क, बी, सी)।
      6. जब जानवर के शरीर ट्रांसड्यूसर के लिए एक कोण पर है छवियों पर कब्जा करके मध्य से देर से gravid चरण में अंडे का सटीक उपाय प्राप्त (यानी, रैखिक नहीं, लेकिन मामूली चाप; चित्र 6ख) । अन्यथा, ओवरलैपिंग रोम व्यक्तिगत अंडे के आकार में अंतर करना मुश्किल बनाते हैं।
  5. एनेस्थेटिक प्रेरण और वसूली
    1. अनुरानस
      1. MS222 में एनेस्थेटाइज़ (0.5 g/ त्रिकेन मिथेनसल्फोनेट बफर (0.5 एम नाहको3) जैसा कि पहले बताया गया था।
      2. जिस डिग्री के लिए जानवर एनेस्थेटाइज़्ड बन गया है, उसके प्राथमिक संकेतक के रूप में सही प्रतिवर्त का उपयोग करें। पलटा का पूरा नुकसान गहरी संज्ञाहरण की स्थिति को दर्शाता है.
      3. पानी स्नान आधारित संज्ञाहरण (एमएस-222) से जानवर निकालें एक बार सही पलटा खो दिया है.
      4. जानवर को एक गीले (एनेस्थेटिक-फ्री डी-क्लोरिनेट पानी के साथ) तौलिया पर रखें।
      5. पूरी शल्य चिकित्सा प्रक्रिया के दौरान पशु नम रखने के लिए सुनिश्चित करें।
      6. कफ फुलाना बिना लाल रबर कैथेटर, uncuffed ट्यूब या शास्त्रीय कफ endotracheal ट्यूबों के साथ छोटे उभयचर intubate।
      7. 0.5-1% isoflurane के साथ ऑक्सीजन (0.5-0.75 L/min) का एक कम प्रवाह प्रदान करें।
      8. प्रक्रिया के बाद isoflurane बंद करो, लेकिन 1 मिनट के लिए ऑक्सीजन के प्रवाह रखना.
      9. जानवर को उत्तेजित करें और 2 मिनट के लिए संवेदनाहारी मुक्त dechlorinated पानी के साथ अच्छी तरह से जानवर कुल्ला।
      10. जानवर को वि-क्लोरिनेट पानी की एक उथले मात्रा में या एक गीला तौलिया पर रखें।
      11. धीरे लंबा करने के लिए एक पिछले अंग पर खींच कर पशु की वसूली का मूल्यांकन करें। अंग के किसी भी जवाब संकुचन वापसी पलटा इंगित करता है.
      12. इस तरह के gular श्वसन (गला आंदोलन) और सही पलटा के रूप में वसूली के अन्य संकेतकों की निगरानी करें।
      13. उभयचर बरामद जब सजगता के सभी वापस आ गए हैं पर विचार करें, और दिल और श्वसन दर पूर्व संवेदनाहारी मूल्यों को लौट आए हैं.
    2. काडेट्स
      1. MS222 में एनेस्थेटाइज नेकटूरस और एम्बीस्टोमा (0.5 g/L के Tricaine methanesulfonet, एक 4 एल आयकार टैंक में 0.5 एम NaHCO3, (MS222) के साथ बफर.
      2. टैंक में एक वायु पत्थर (1 इंच) और हवा पंप रखें और पर्याप्त ऑक्सीजन प्रदान करने के लिए इसे निरंतर प्रवाह पर चालू करें।
      3. जब अंग समारोह और सही पलटा खो रहे हैं, पानी स्नान आधारित संज्ञाहरण (एमएस-222) से जानवर को हटा दें और एक गीला पर जानवर डाल (एनेस्थेटिक मुक्त de-chlorinated पानी के साथ) तौलिया.
      4. टैंक के पानी की निचोड़ बोतल के साथ त्वचा और गिल नमी बनाए रखें।
      5. जानवर को ठीक करने के लिए, ध्यान से यह एक 4 एल प्लास्टिक एक हवा के पत्थर के साथ टैंक पानी के 2 एल से भरा कंटेनर में नीचे अधर पक्ष जगह है।
        नोट: वसूली गिल चमकती के साथ शुरू होता है, अपनी पूंछ को स्थानांतरित करने और आगे और अंगों के अंत में कार्यात्मक आंदोलन को प्रेरित करने की क्षमता के बाद।
      6. अपने मूल आवास टैंक के लिए पशु लौटें और अगले 24 एच पर बारीकी से नजर रखने के लिए।
        नोट: उभयचरों के लिए संज्ञाहरण के अन्य तरीकों मौजूद हैं और इन राइट और व्हिटेकर8में वर्णित हैं.

2. इनवेसिव डिम्बग्रंथि मॉनिटर और नियंत्रण तकनीक

नोट: इस प्रक्रिया Forzn एट अल से अनुकूलित किया गया है10.

  1. प्रमुख हाथ में मेंढक पकड़ो, और एक बाँझ पोंछे या धुंध के साथ मेंढक के चेहरे के venipuncture पक्ष सूखी.
  2. चेहरे को त्वचा के पार dispersing से बहुत ज्यादा dispersing से बचने के लिए सूखी.
  3. सुई डालें (26 G 1/2" और 27 G 1/2"), bevel ऊपर की ओर का सामना करना पड़ के साथ, त्वचा के माध्यम से जहां आंख और ऊपरी जबड़े रिज के आसपास उठाया त्वचा को पूरा करने के लिए एक त्रिकोण का बिंदु बनाने के लिए (पीला रूपरेखा) (चित्र 7A) के पास चेहरे का उपयोग वेना कक्षीय पीछे.
  4. दाईं आंख के नीचे और ऊपरी जबड़े रिज के ऊपर चेहरे की नस पंचर, आंख के मध्य रेखा से 1-2 मिमी के बीच वापस शुरू (चित्र 7A) .
    नोट: छोटे मेंढ़कों के लिए (20 ग्राम के तहत), सम्मिलन बिंदु आंख के मिडलाइन के नीचे सीधे एक स्थिति के करीब ले जाएँ।
  5. ट्यूब में रक्त के प्रवाह में मदद करने के लिए गुरुत्वाकर्षण सक्षम करने के लिए नीचे microhematocrit ट्यूब कोण। पंचर के तुरंत बाद रक्त प्रवाह होना चाहिए (चित्र 7 बी,सी) ।
  6. रक्त प्रवाह के पहले संकेत पर, पंचर स्थल पर माइक्रोहेमाटोक्रिट ट्यूब की नोक रखें और संग्रह के लिए उपयुक्त पात्र में रक्त और ट्यूबों की 1-2 पूर्ण माइक्रोहेमेटोक्रिट ट्यूब एकत्र करें (चित्र 7 बी,ब्) ।
  7. यदि रक्त आसानी से प्रवाह नहीं करता है, या मात्रा बहुत कम है, सुई की प्रविष्टि थोड़ा बदलाव या चेहरे के दूसरे पक्ष में सुई डालने.
  8. कम से कम 20 s के लिए पंचर साइट के लिए मजबूती से धुंध दबाने से खून बह रहा बंद करो।
  9. पंचर साइट फिर से खोलने नहीं करता है की पुष्टि करने के लिए 10 मिनट के लिए पानी से बाहर मेंढक छोड़ दें।
  10. प्रत्येक मेंढक नमूने के लिए एक नई सुई और नए microhematocrit ट्यूबों का प्रयोग करें.

3. हार्मोन प्रेरण

  1. हार्मोन की तैयारी
    1. अधिकतम प्रभाव सुनिश्चित करने के लिए उपयोग करने से पहले तुरंत हार्मोन इंजेक्शन तैयार करें।
    2. तालिका 1में सूचीबद्ध चयन से किसी हार्मोन का चयन करें।
    3. शरीर के वजन 16 के $L अथवा एमएल/ग्राम काउपयोग करके इंजेक्ट किए जाने वाले हार्मोन की सांद्रता निर्धारित की जाए।
    4. निम्नलिखित में से एक में हार्मोन को पतला करें: पानी, फॉस्फेट बफर्ड नमकीन (पीबीएस), नमकीन उभयचर रिंगर समाधान (SARS) या नमकीन।
    5. मेंढकों के लिए 200 डिग्री सेल्सियस की इंजेक्शन मात्रा से अधिक न करें जिसका वजन 30-70 ग्राम और 80-110 ग्राम (व्यक्तिगत अवलोकन)16के लिए 300 डिग्री सेल्सियस है।
    6. 10-100 ग्राम से लेकर किसी भी जानवर के हार्मोन प्रशासन के दौरान एक जानवर को सही रखने के लिए, अनुभाग 1.1 में वर्णित धारण करने के लिए किसी भी उपयुक्त तरीकों का उपयोग करें।
  2. अनुरानस
    1. शरीर के वजन की गणना प्रति ग्राम का उपयोग करके प्रति व्यक्ति आवश्यक सांद्रता की गणना करें (g/
    2. बस प्रशासन से पहले, पसंद के एक बाँझ diluent में पुनर्गठन.
    3. सुनिश्चित करें कि इंजेक्शन से पहले सिरिंज में कोई बुलबुले नहीं बचे हैं।
    4. गैर प्रमुख हाथ में सुरक्षित रूप से जानवर पकड़ो और प्रमुख हाथ से इंजेक्शन प्रशासन।
    5. हार्मोन विनिर्देशों के अनुसार इंजेक्शन प्रशासन. एनुरेन्स में सबसे आम इंजेक्शन उप-त्वचा, अंत: पेरिटोनियल या इंट्रा पेशी (चित्र 8) होते हैं।
    6. पेट के निचले भाग में या पीठ के पैर के पास शरीर के पृष्ठीय पक्ष के निचले भाग में आईपी इंजेक्शन का प्रबंध करें (चित्र 9) .
    7. इंट्रा-मस्क्युलर इंजेक्शन को बेहतर ढंग से पिछले पैरों में प्रशासित करें।
  3. काडेट्स (Necturus)
    1. ऊपर वर्णित शरीर के वजन विधि प्रति ग्राम के अनुसार बाँझ पानी में पसंद के हार्मोन का पुनर्गठन.
    2. Necturus के मामले में, 1.7-2.3 ग्राम GnRH / जी शरीर के वजन की खुराक का उपयोग करें.
    3. संवेदनाहारी कक्ष से Necturus निकालें और शल्य चिकित्सा पर्दे के साथ कवर एक 45 डिग्री सतह पर जगह है।
    4. जानवर को सिर के साथ नीचे की ओर इशारा करते हुए रखते हैं।
    5. 15-20 डिग्री कोण पर पेट (पिछली पैर का काउडल) के पीछे के चक्रकेपास करें। सिरिंज में हवा का परिचय न करने के लिए सावधान रहें।
    6. इंसुलिन सिरिंज और 27-30 जी सुई का उपयोग करके इंजेक्शन (आईपी)।
    7. इंसुलिन सिरिंज और 27-30 जी सुई का उपयोग करके हार्मोन को इंजेक्ट करें।

4. सर्जरी

  1. सामान्य शल्य चिकित्सा तैयारी और प्रक्रिया
    1. aseptic प्रक्रियाओं को बनाए रखने के लिए, शल्य साइट को अलग करने के लिए स्पष्ट बाँझ प्लास्टिक पर्दे का उपयोग करें। आसपास की त्वचा को नम रखकर वाष्पीकरण को कम करें।
    2. किसी भी सामग्री है कि बाँझ पानी के साथ पशु की त्वचा से संपर्क करेंगे नम. एक नंबर 15 या संख्या 11 स्केलपेल ब्लेड के साथ त्वचा चीरा बनाओ.
      नोट: ठंड इस्पात, रेडियोसर्जरी या डायोड लेजर का एक संयोजन। हल्के रक्तस्रावी प्रक्रिया में हेमोस्टेसिस इलेक्ट्रोक्यूटर या डायोड लेजर द्वारा प्राप्त किया जा सकता है।
    3. रक्त हानि का ट्रैक रखने वाले छोटे जहाजों के लिए स्थानीयकृत दबाव के आवेदन की अनुमति देने के लिए कपास से बने भाले या applicators का उपयोग करें।
    4. मानक धुंध वर्गों के बजाय छोटे सीमित स्थान ों का प्रबंधन करने के लिए कपास से बने भाले या applicators का उपयोग करें।
    5. 1 किलो से कम वजन वाले जानवरों पर सर्जरी करते समय ठीक, छोटे सुझावों के साथ नेत्र चिकित्सा उपकरणों जैसे सूक्ष्म उपकरणों का उपयोग करें।
    6. चीरों के विभिन्न आकारों को फिट करने के लिए प्लास्टिक, स्व-धारण रिट्रैक्टर (उदा., लोन स्टार रिट्रैक्टर) का उपयोग करें।
    7. सीलोमिक चीरों को वापस लेने के लिए पलक आकुंचकों का उपयोग करें।
    8. आवर्धन इंस्ट्रूमेंटेशन का प्रयोग करें जहां छोटे रोगियों पर सर्जरी करने के लिए आवश्यक हो।
      नोट: Analgesia उभयचरों में किसी भी शल्य प्रक्रिया के साथ आवश्यक है. सर्जरी के दौरान पर्याप्त analgesia प्रशासन के लिए विफलता सामान्य कार्यों की देरी वापसी के साथ जुड़ा हुआ है. इसके अलावा, एनेस्थेटिक औषधों के प्रभाव को प्रबल करता है (सारणी 3)34.
  2. अनुरानस
    1. एक बार एक्स लेविस को चरण 1.5-1 में वर्णित एनेस्थेटाइज किया गया है, तो पशु को पृष्ठीय पुनर्पदीकरण में रखें (चित्र 10ए, C)।
    2. शल्य चिकित्सा स्थल पर 10-15 s या 0.75% chlorhexidine समाधान के लिए साइट पर पतला povidone-आयोडीन समाधान (1/10) के साथ नम बाँझ धुंध पोंछते द्वारा एक साथ शल्य क्षेत्र को तैयार करें35सर्जरी से पहले कम से कम 10 मिनट के लिए शल्य चिकित्सा साइट पर chlorhexidine समाधान .
    3. एक बोल्ड स्ट्रोक के साथ मध्य सीलोम (कंधे और क्लोका के बीच) में एक 3 मिमी पैरामिडत्वचा त्वचा चीरा बनाओ एक नंबर 15 या नंबर 11 स्केलपेल का उपयोग कर एक साफ चीरा छोड़ने के साथ।
      नोट: एक त्वचा चीरों के लिए भी एक डायोड लेजर का उपयोग कर सकते हैं.
    4. पेट की झिल्ली को ऊपर उठाना, बनाने और चीरा और ध्यान से विच्छेदन एक नंबर 15 या नंबर 11 स्केलपेल का उपयोग कर। (चित्र 10 B,डी)।
    5. पलक retractors (या किसी भी उपयुक्त उपकरण) के साथ पेलोमिक चीरों को वापस लें।
    6. किसी भी रक्त वाहिकाओं को लिगाटिंग के बिना अंडे के द्रव्यमान का एक हिस्सा उत्पादित करें।
    7. पूर्ण अंडाशय के लिए, रक्त वाहिकाओं के आस-पास के इलेक्ट्रोक्युटरी या लेजर डायोड द्वारा कॉटराइज़ करें (चित्र 11)।
    8. monofilament सीवन का उपयोग करना, एक बाधित, everting सीवन पैटर्न के साथ बंद celiotomy चीरा.
  3. काडेट्स
    1. एक बार ए. mexicanum एनेस्थेटाइज़ किया गया है, यह सही पार्श्व recumbency में जगह है, बाएँ श्रोणि अंग बस पूंछ आधार के खिलाफ रखा के साथ.
    2. 10-15 s. वैकल्पिक रूप से, 0.75% chlorhexidine समाधान में भिगो बाँझ धुंध का उपयोग करें और कम से कम 10 मिनट के लिए शल्य साइट पर जगह के लिए साइट पर पतला povidone-आयोडीन समाधान (1:10) के साथ नम बाँझ धुंध रखकर शल्य क्षेत्र aseptically तैयार करें शल्य चिकित्सा से पहले (चित्र 12क)36,37 .
    3. शरीर को तीन बराबर भागों में विभाजित करने के लिए कंधे और पिछले अंगों के बीच एक रेखा खींचें (चित्र 12ख)।
    4. दूसरे और तीसरे भागों के बीच चीरा साइट बनाओ.
    5. अंतर्निहित मांसपेशियों को पकड़ें और गुपहिये से दूर उठें।
    6. सीलोमिक पेशी के माध्यम से और सीओलोमिक गुहा में छोटे hemostats मजबूर.
    7. पलक retractors (या किसी भी उपयुक्त सामग्री) के साथ coelomic चीरों को वापस लेने (चित्र 12C) .
    8. पूर्ण अंडाशय के लिए, रक्त वाहिकाओं के आस-पास के इलेक्ट्रोक्युटरी या लेजर डायोड द्वारा कॉटरइज करें (चित्र 12D)।
    9. monofilament सीवन का उपयोग करना, एक बाधित, everting सीवन पैटर्न के साथ बंद celiotomy चीरा.

Representative Results

Morphometrics और प्रजनन

उभयचरों में मादा प्रजनन स्थिति का दृश्य प्रजातियों पर निर्भर करता है। सबसे प्रभावी विधि अल्ट्रासाउंड है; तथापि, कुछ प्रजातियां उनकी त्वचा की पारदर्शिता की अलग-अलग डिग्री दिखा सकती हैं (चित्र 13क, बी, ब्)। दृश्य निरीक्षण अक्सर स्पष्ट रूप से एक gravid और गैर-ग्रेविड महिला के बीच मतभेद ों को स्पष्ट रूप से वर्णन कर सकते हैं जब त्वचा अर्द्ध-translucent है के रूप में एन alabamensis और एन maculosus में मनाया (चित्र 13A, बी); या कांच मेंढक द्वारा दर्शाए अनुसार पारदर्शी (चित्र 13ग) एन beyeri के पेट पर अंधेरे देखा त्वचा रंगइस इस आकलन किया जा करने के लिए निषिद्ध करता है। आर muscosaमें, त्वचा पारदर्शी नहीं है, लेकिन ध्यान देने योग्य मतभेद महिलाओं है कि उन है कि हाल ही में oviposited है क्योंकि त्वचा flaccid है की तुलना में gravid हैं के बीच पता लगाया जा सकता है, और जानवर पतली लग रहा है (पीला रेखा) एक की तुलना में स्त्री जो ग्रेविड (नीली रेखा) है (चित्र 13D) अनुभव के साथ हैंडलर खुद को एक बड़ी महिला और एक gravid एक लेकिन gravid चरण की पुष्टि अल्ट्रासाउंड की आवश्यकता होगी के बीच अंतर के साथ परिचित कर सकते हैं। उभयचरों में शरीर द्रव्यमान सूचकांकों की गणना अनेक सूत्रों का उपयोग करके की जा सकती है लेकिन प्रजनन के लिए भविष्य कहनेवाला उपकरण के रूप में उनका अनुप्रयोग विवादास्पद है। आर muscosaपर मामले में, Fulton सूचकांक के बीच संबंध, स्वास्थ्य और प्रजनन की स्थिति स्पष्ट नहीं है.

प्रजनन व्यवहार और अल्ट्रासाउंड

हमारे परिणाम बताते हैं कि अवस्थिति की भविष्यवाणी के लिए आर मस्कोसा में प्रजनन व्यवहार ों की विशेषता कैसे की जाए (चित्र 4)। कुछ घंटों से लेकर कई सप्ताह तक चलने वाले कई चरणों में, अदालती जहां एक पुरुष सक्रिय रूप से एक महिला का पीछा करता है (चित्र 4A), पुरुष mounts और मजबूती से महिला की पीठ पर clasps, amplexus कहा जाता है (चित्र 4B)। एक बार amplexed, जोड़ी के लिए amplexus में रह सकते हैं 1 - 5 सप्ताह और जोड़ी amplexus के अलावा अन्य व्यवहार प्रदर्शित करेगा. एम्प्लेक्सस एक बहुत सक्रिय व्यवहार है जिसमें पुरुष महिला को एक नरम पम्पिंग तरीके से निचोड़ता है (चित्र 4C; महिला के चारों ओर घूम रहा है और हाथ से खड़े व्यवहार को प्रदर्शित करने के लिए शुरुआत आवर्तक रूप (चित्र 4D, ई); और oviposition के समय के करीब, महिला, एक हाथ खड़े में, सतहों के खिलाफ निर्भर करेगा कि वह पर अंडे छड़ी कर सकते हैं, जबकि पुरुष उसके पेट जोरदार पंप (इस उदाहरण में यह भी महिला के नीचे से नीचे की ओर रगड़ महिला का निरीक्षण करने के लिए संभव है उसके हाथ cloaca की ओर गड्ढे. यह एक यांत्रिक तरीका हो सकता है जिसके साथ अंडे को अंडवाहिनी के नीचे धकेलना ) (चित्र 4 एफ,जी) ।

इस अध्ययन से पता चलता है कि कैसे अल्ट्रासाउंड जानकारी प्रदान कर सकते हैं जिसके साथ महिला आर muscosa और Necturus में प्रजनन स्थिति का पता लगाने के लिए. विकास के चार चरणों में आर मस्कोसा (चित्र 5 C,D,E,F) में प्रतिनिधित्व किया जाता है और इसी प्रकार Necturus4 में विशेषता है (चित्र 6A, B, C) . इसके अतिरिक्त, अवशिष्ट अंडों को अंडे प्रतिधारण के लिए निष्कासित नहीं किया जा सकता है (चित्र 5जी, चित्र 15क, बी)। चरण 1 में एक अंडाशय को सीधे अंडीय स्थिति के बाद दिखाया जाता है जहां कूपों की कल्पना करना कठिन होता है (चित्र 5ं) चरण 2 को प्रतिध्वनिक बिंदुओं (सफेद फ्लेक) की उपस्थिति द्वारा निरूपित किया जाता है जो अंडाशय में फैला हुआ है (चित्र 5D) । चरण 2 और 3 अंधेरे केन्द्रों के साथ बड़े, गोल प्रतिध्वनिजनक डॉट्स द्वारा प्रतिनिधित्व कर रहे हैं कि बड़े कूप के लिए yoked माध्यम का प्रतिनिधित्व करते हैं (चित्र 5E, एफ). 2013-2017 से, बंदी महिला Necturus एक मासिक आधार पर अल्ट्रासोनोग्राफी द्वारा जांच की गई. प्रत्येक परीक्षा के दौरान व्यक्तियों को जीनस के लिए स्थापित प्रजनन मानदंडों के अनुसार एक ग्रेड स्कोर सौंपा गया (तालिका 2)। प्रत्येक वर्ष नए अंडों का विकास करने वाली महिलाओं का प्रतिशत औसत 88.2 - 3.01% (सारणी 5) है। जबकि अंडा विकास अधिक था, अंड-स्थिति सुनिश्चित नहीं की गई थी (चित्र 16)। अधिकांश मादाएं जिन्हें अंडपोजिशन की गई थी, उन्होंने अंडों का पूरा पूरक जमा किया, जबकि कुछ व्यक्तियों ने अंडे के केवल एक अंश को ही जमा किया। उन आर Muscosa और Necturus महिलाओं शरीर गुहा में तरल पदार्थ लाभ के साथ बनाए रखा अंडे के साथ concomitant बाहर नेत्रहीन फट रक्त वाहिकाओं के साथ संगत त्वचा पर लाल धब्बे के साथ बढ़े हुए थे (चित्र 14A, बी ) . द्रव प्रतिधारण की डिग्री अल्ट्रासाउंड के माध्यम से आगे मूल्यांकन किया जा सकता है (चित्र 15B) . दोनों प्रजातियों में, बनाए रखा अंडे atresia लिया या एक अधिक प्रतिध्वनिजन्य उपस्थिति पर ले लिया (चित्र 14C, डी , चित्र 15A) .

हार्मोन प्रशासन

इंजेक्शन के प्रकार की गहराई के आधार पर कोण और सुई की गहराई अलग अलग होंगे. अधिकांश इंजेक्शन के लिए सुई की गहराई से अधिक की जरूरत नहीं 1 -2 मिमी गहरी जब आर muscosa के रूप में प्रजातियों के साथ काम कर रहे हैं, लेकिन प्रवेश के कोण में अलग अलग होंगे. Prostaglandin इंजेक्शन की आवश्यकता एक इंट्रा-मस्क्युलर (im) सुई प्रविष्टि 90 डिग्री पर angled, आर muscosa के पिछले पैर में, जबकि इंट्रा-पेरिटोनियल (आईपी) इंजेक्शन, इंट्रा-मस्क्युलर इंजेक्शन के लिए एक समान गहराई के साथ, के क्षेत्र में प्रशासित किया गया 45 डिग्री पर प्रगुही गुहा (चित्र 10)। एम्फीप्लेक्स के प्रशासन को नियंत्रण की तुलना में हार्मोन-उपचारित महिलाओं द्वारा जमा किए गए अंडों की संख्या में वृद्धि करने में कोई महत्वपूर्ण प्रभाव नहीं पड़ा (P र् 0.547), और न ही भ्रूणों की संख्या में कोई अंतर था जो कि cleaved (P ] 0.673) या टैडपोल (P ] (तालिका 4 ) () आम तौर पर, महिलाओं के ovipositing का प्रतिशत 2011 में 80% से 2014 में 28% की कमी आई. 2015 में ovipositing महिलाओं की संख्या 2013 की तुलना में काफी अधिक था (पी $ 0.0002), 2013 (पी $ 0.0001) और 2014 (पी $ 0.0026) लेकिन नहीं 2011 (पी $ 0.0885), इस विचार की पुष्टि है कि इस प्रजाति की महिलाओं को सालाना नस्ल और हार्मोनल refi refi की आवश्यकता हो सकती है कि वार्षिक रूप से प्रजनन नहीं कर सकते हैं और प्रोटोकॉल refires निमेंट. अंडे प्रतिधारण के लक्षण के साथ आर muscosa महिलाओं के लिए, PGF2 के इंट्रा-मस्क्युलर इंजेक्शन degenerating अंडे के निष्कासन को प्रेरित करने में एक 60% सफलता दर थी. तथापि, 5 में से 1 मादाओं ने इंजेक्शन लगाया, पीजीएफ2 पूर्ण निष्कासन का कारण बनने के लिए पर्याप्त नहीं था और निम्नलिखित प्रजनन के मौसम तक कुछ अंडे मादा के अंदर बने रहे। सत्रह Necturus महिलाओं LHRH/ (GnRH) प्राप्त किया और 13 एक नियंत्रण के रूप में सेवा करने के लिए बाँझ पानी का एक शर्म इंजेक्शन प्राप्त (तालिका 5) . कुल में, सात महिला Necturus (द ] 4 alabamensis, n ] 2 beyeri, n ] 1 maculosus) oviposit ग्यारह पूर्ण क्लच कि दोनों GnRH इलाज के लिए जिम्मेदार ठहराया गया पर चला गया (n ] 6) और नियंत्रण (द ] 5) व्यक्तियों. तीन मादाएं (द र् 2 बीयरी, द र् 1 मैकुलोसस) अवपोजिट पांच आंशिक क्लच (चित्र 13) . यह परिघटना बहिर्जात हार्मोन उपचार से संबद्ध प्रतीत नहीं हुई क्योंकि तीन नियंत्रण महिलाएं इसी प्रकार आंशिक क्लच जमा करती हैं (सारणी 5) . Oviposition पांच वर्षों के दौरान एक 37 दिन (3/31-5/7) समय सीमा पर हुई (तालिका 5). LHRH/GnRH इलाज (41 ] 13.08%, सीमा 17-67%) के बीच अंडस्थिति दरों में कोई अंतर नहीं था (पी $ 0.194) और नियंत्रण (66.75 $ 11.79%, सीमा 50-100%) महिलाओं. LHRH/GnRH इलाज महिलाओं अंडे जमा एक औसत 7.44 - 1.41 (रेंज 3-13) दिन के बाद इंजेक्शन. प्रजातियों की पूरी तरह से जलीय प्रकृति और संज्ञाहरण के बिना मैन्युअल रूप से नियंत्रित करने में असमर्थता को देखते हुए यह आईपी हार्मोन इंजेक्शन प्रदर्शन करने से पहले sedation का एक उचित स्तर सुनिश्चित करने के लिए आवश्यक था (देखें अनुभाग 3.2 संज्ञाहरण पर निर्देश के लिए).

रक्त संग्रह, संज्ञाहरण और सर्जरी

इस लेख में रक्त नमूना तकनीक Forzan एट अल से लिया गया था 201310 और एक प्रभावी तरीका आर muscosa से कम से कम इनवेसिवऔर तनाव के साथ रक्त इकट्ठा करने के लिए साबित कर दिया है. माइक्रोहेमाटोक्रिट ट्यूबों का उपयोग करते हुए प्लाज्मा या सीरम का लगभग 35-45 डिग्री सेल्सियस पूरे रक्त के 70 डिग्री सेल्सियस पर एकत्र किया जा सकता है (चित्र 7)। आर muscosa में अधिकतम संग्रह मात्रा मेंढक के 10 ग्राम प्रति 10 g, मेंढक 40 ग्राम और बड़ा के लिए मेंढक प्रति 4 ट्यूब ों के लिए 1 पूर्ण microhematocrit ट्यूब था. यह एक रूढ़िवादी संग्रह मात्रा 0.7 एमएल प्रति 100 ग्राम, 100 ग्राम प्रति 1.0 एमएल की अधिकतम सिफारिश का 70% था (एलेंडर और फ्राई, 2008 से adapted)13.

संज्ञाहरण और उभयचर में सर्जरी शायद ही कभी सूचित कर रहे हैं, लेकिन यह ध्यान दें कि खुराक और प्रभावकारिता एक प्रजाति विशेष तरीके से अलग अलग होंगे महत्वपूर्ण है. उदाहरण के लिए Bombina Orientalis में, MS222 एक बहुत कम प्रभाव पड़ता है, यहां तक कि उच्च खुराक के साथ (1 g/L) जबकि बोरियल toads में, Anaxyrus boreas,1 g/L तेज है (मिनट की बात) और लंबे समय तक चलने (3 + ज) (Calatayud, व्यक्तिगत अवलोकन). आर muscosa में, संज्ञाहरण ए boreas boreas के लिए रिपोर्ट खुराक की आवश्यकता है और इसी तरह के प्रभाव और वसूली बार है. संज्ञाहरण से पहले उपवास उभयचर आमतौर पर आवश्यक नहीं है क्योंकि उनका गला सामान्य संज्ञाहरण के तहत भी कसकर बंद रहता है। हालांकि, यदि आवश्यक समझा, खासकर अगर संवेदनाहारी प्रक्रिया को सेलोमिक सर्जरी शामिल है, जानवरों को संज्ञाहरण से पहले 24 ज उपवास किया जा सकता है।

सर्जरी के दौरान, सही पलटा प्राथमिक सूचक है कि जानवर एनेस्थेटाइज़्ड बन गया है। सही पलटा क्षमता और आसानी की डिग्री है जिसके साथ एक जानवर अपनी पीठ पर रखा जा रहा है के बाद एक ईमानदार स्थिति में लौट सकते हैं। प्रतिवर्त की हानि संज्ञाहरण की एक हल्की अवस्था का पता चलता है. एक शल्य विमान वापसी प्रतिवर्त के नुकसान से संकेत दिया है जो इसे सीधा करने के लिए अंग पर हल्के से खींच भी शामिल है और जानवर नहीं लंबे समय तक इसे वापस लेने में सक्षम किया जा रहा7. प्रजनन सर्जरी कोई भारी बाधाओं और उभयचर रोगियों मुख्य रूप से अच्छी तरह से उच्च कशेरुकियों की तुलना में रक्त की हानि सहन को सहन ठीक है. सर्जरी जल्दी से आगे बढ़ना चाहिए, शुरू से अंत तक लगभग 15 मिनट तक चलने. कदम लगभग इस प्रकार के रूप में समय पर किया जाना चाहिए: और प्रारंभिक चीरा और और lt के लिए 1 मिनट; celiotomy और retractor प्रविष्टि के लिए 2 मिनट, और lt; 2-3 मिनट के लिए अलग होने के लिए प्रति अंडाशय और lt; पोत सीवन या cauterization और त्वचा सीवन के लिए 1 मिनट; 4 मिनट. MS222 प्रोटोकॉल के साथ सर्जरी के बाद कुल वसूली समय लगभग 45 मिनट हैं, लेकिन यह प्रजातियों विशेष हो सकता है. ए में बोरास बोरस और आर muscosa वसूली बार अब हो सकता है, अप करने के लिए 1 - 2 ज. सर्जरी करते समय, फेफड़ों, जठरांत्र संबंधी मार्ग या एक distended मूत्राशय puncturing से बचने के लिए, और मैक्रोस्कोपिक ग्रंथियों, लिम्फ दिल, और रक्त वाहिकाओं, विशेष रूप से मध्य-वेंट्रल नसों को नुकसान नहीं करने के लिए लिया जाना चाहिए। मौसम के आधार पर, बड़े वसा निकायों की उपस्थिति अन्य अंगों के दृश्य मुश्किल बना सकते हैं. एक बार जाहिरा तौर पर जाग, अंग उत्तेजना के लिए एक जानवर की प्रतिक्रियाओं, इस तरह के एक पीठ अंग की एक कोमल खींच करने के लिए प्रतिरोध या पलक जब आंख के आसपास के क्षेत्र को प्रेरित किया जाता है के रूप में (व्यक्तिगत अवलोकन), वापसी प्रतिक्रियाओं के रूप में वर्गीकृत कर रहे हैं. सहित अन्य वसूली संकेतकों के साथ सही पलटा, वापसी सजगता और gular आंदोलनों, वसूली के महत्वपूर्ण संकेतक हैं.

प्रशासन
सामान्य नाम प्रजातियां हार्मोन प्रक्रिया प्राइमिंग यौगिक प्राइमिंग खुराक की सूचना दी प्राइमिंग खुराक की संख्या समय (ovulatory खुराक से पहले) कंपाउंड (एस) अंतिम ovulatory/oviposition के लिए प्रशासित खुराक संदर्भ
प्योर्टो रिको क्रेस्टेड टॉड पेल्टोफ्रीन लीमर जीएनआरएच और एचसीजी Ip एचसीजी 1.5 आईयू/ २ एचसीजी - 48 GnRH; एचसीजी; जीएनआरएचए + एचसीजी 0.2 $g; 4 IU; 0.5 डिग्री जी + 4 आईयू कैलाटायड एट अल. अप्रकाशित
पहाड़ पीले पैर मेंढक राणा मस्कोसा एम्फीप्लेक्स, लुट Ip GnRHa (des-Gly10, D-Ala6, Pro-NHEt9-GnRH) 0.4 ग्राम/ 1 24 GnRH + एमईटी 1 x 0.4 ग्राम/ग्राम + 10 ग्राम/ कैलाटायड एट अल., 2018
पीजीएफ2] Im पीजीएफ 2] 5 एनजी/ 1 48 पीजीएफ 2] 5 एनजी/
दक्षिणी रॉकी पर्वत बोरल टॉड एनाक्सीरस बोरियास एचसीजी, जीएनआरएच Ip एचसीजी 3.7 आईयू/ २ 96, 24 एचसीजी + जीएनआरएचए 13.5 IU/g + 0.4 g/ कैलाटायुड एट अल., 2015
उत्तरी क्रिकेट मेंढक एक्रिस क्रिपिटियन एम्फीप्लेक्स पानी में जोड़ा (10 एमएल) कोई नहीं कोई नहीं 0 ना GnRH + एमईटी 0.17 [g + 0.42 [g / स्नाइडर एट अल., 2012
उत्तरी तेंदुए मेंढक लिथोबेट्स पिपिएन्स एम्फीप्लेक्स Ip कोई नहीं कोई नहीं 0 24 GnRH + एमईटी 1 x 0.4 ग्राम/ग्राम + 10 ग्राम/ Trudeau एट अल., 2010
अर्जेंटीना सींग का मेंढक सेराटोफिर्स ऑर्नेटा एम्फीप्लेक्स Ip कोई नहीं कोई नहीं 0 24 GnRH + एमईटी 1 x 0.4 ग्राम/ग्राम + 10 ग्राम/
क्रैनवेल का सींग दारमंडा सेरेटोफ्रिस क्रैनवेली एम्फीप्लेक्स Ip कोई नहीं कोई नहीं 0 24 GnRH + एमईटी 1 x 0.4 ग्राम/ग्राम + 10 ग्राम/
अमेरिकी जमीन मेंढक ओडोन्टोथ्रीनस अमेरिकनस एम्फीप्लेक्स Ip कोई नहीं कोई नहीं 0 24 GnRH + एमईटी 1 x 0.4 ग्राम/ग्राम + 10 ग्राम/
दुस्की गोफर मेंढक राणा सेवोसा एचसीजी, जीएनआरएच Ip एचसीजी 3.7 आईयू/ २ 96 , 24 GnRH + एचसीजी 1 x 0.4 ग्राम/ग्राम + 13.5 IU/ ग्राहम एट अल., 2018
आम कोकी एल्यूथेरोडैक्टिलस कोवी मछली, एवियन, स्तनधारी और GnRH (डी-आला, des-Gly, eth LHRH), एचसीजी अनुसूचित जाति एमएलएचआरएच;  एलएचआर; fLHRH; GnRHa; एचसीजी कोई नहीं 0 ना एमएलएचआरएच;  एलएचआर; fLHRH; GnRHa; एचसीजी 7[g, 33]g; 28 डिग्री; 7[g, 20]g; 5, 10, 15, 20 ग्राम; 165 आईयू माइकल एट अल 2004
गुंथर का टोडलेट स्यूडोफ्रिन गुन् थेरी जी एनआरएच जीएनआरएचए 0.4 ग्राम/ 1 26 प्रधानमंत्री के साथ या उसके बिना GnRHa 0.4 ग्राम/ सिला 2010
कोरोबोरी मेंढक स्यूडोफ्रिन कोरोबोरी लुसिरिन अनुसूचित जाति लुसिरिन 1 $g 1 26 लुसिरिन 5 डिग्री बायर्न और सिला, 2010
उत्तरी कोरोबोरे मेंढक स्यूडोफ्रिन पेंगिली GnRHa GnRH (डी-आला, des-Gly, eth LHRH) टा कोई नहीं कोई नहीं 0 ना जीएनआरएचए 0.5 -2.0 ग्राम/ सिला एट अल., 2017
खाड़ी तट वाटरडॉग नेक्टूरस बेयरी [des-Gly10, D-Ala6]-Lrh-RH ethylamide ऐसीटेट नमक हाइड्रेट Ip कोई नहीं कोई नहीं 0 ना एलएचआरएच 100 $g / 500 $L Stoops एट अल., 2014
दक्षिणी घंटी मेंढक / लिटोरिया रैनिफॉर्मिस des-Gly10, D- Ala6-[LHRH] अनुसूचित जाति कोई नहीं कोई नहीं 0 ना des-Gly10, D- Ala6-[LHRH] 50 ग्राम मान एट अल., 2010
Fowler के टॉड एनाक्सीरस फाउलेरी GnRH, एचसीजी, पी 4 Ip एचसीजी 3.7 आईयू/ ब्राउन एट अल., 2006
एक्सोटोटल (मैक्सिकन समन्दर) ऐम्बीस्टोमा मैक्सिकनम फॉलिकल-उत्तेजक हार्मोन Im कोई नहीं कोई नहीं 0 ना Fsh 400IU ट्रॉटियर और आर्मस्ट्रांग, 1974
अफ्रीकी पंजों मेंढे मेंढ़क एक्सेनोपस लेविस एचसीजी और पी 4 पानी जोड़ा; Ip पीएमएसजी, एचसीजी मार्क , 2016
टाइगर समन्दर ऐम्बीस्टोमा टिग्रिनम एचसीजी, एलएच
व्योमिंग टॉड एनाक्सीरस बैक्सरी एचसीजी, जीएनआरएचए, पी 4 Ip एचसीजी + जीएनआरएचए 100 IU + 0.8 $g 1 72 एचसीजी + जीएनआरएचए 100 IU + 0.8 $g ब्राउन एट अल., 2006
उत्तरी तेंदुए मेंढक लिथोबेट्स पिपिएन्स पिट्यूटरी निकालने (पीई), पी 4, टेस्टोस्टेरोन (टी), corticosterone [सी], एम्फीप्लेक्स, डोमेरिडोन (डी) अनुसूचित जाति, आईपी कोई नहीं कोई नहीं 0 ना PE, PE+T, PE+P4, PE+C; एम्फीप्लेक्स, जीएनआरएच + डी 1 एमएल में $100 IU (LHRH); पीई + 0.002 डिग्री ग्राम/ पीई+ 0.01mg/50mL; पीई+ 0.1mg/50mL; 0.4 ग्राम/ग्राम + 10 ग्राम/  0.4 ग्राम/जी + डी राइट, 1961; फोर्ट, 2000; Trudeau एट अल., 2013
जमीन मेंढक लिम्नोडाइनेस् टेस्मेनीन्सिस पिट्यूटरी अर्क, एचसीजी, जीएनआरएचए, पीजेड Ip जीएनआरएचए 0.9-1.2[g/g + P] 10 g/ 1 20 पीई; पीई + एचसीजी; GnRH + पी$ पीई वॉल; पीई वॉल + 100 IU एचसीजी; GnRH (0.9-1.2 g/g) + P$ (10$g/ क्लू एट अल., 2018
हरे और गोल्डन बेल मेंढक लिटोइया ऑरे जी एनआरएच Ip जीएनआरएचए 10 ग्राम 1 72 जीएनआरएचए + एचसीजी 20 ग्राम + 300 आईयू क्लू एट अल., 2018
ग्रेट बार्ड मेंढक मिक्सोफीज फैसिओलेटस एचसीजी और पीएमएसजी अनुसूचित जाति पीएमएसजी, एचसीजी 50 IU और 25 IU; 1x100 आईयू 2; २ पीएमएसजी-144 और 96;  एचसीजी-24 एचसीजी 100IU क्लू एट अल., 2012
अधिक हार्मोन प्रोटोकॉल और प्रजातियों के लिए राइट और Whitaker, 2001 देखें

तालिका 1: Amphibian प्रजातियों और exogenous हार्मोन के कुछ उन पर परीक्षण के रूप में साहित्य में सूचना दी. मानव कोरियोनिक गोनाडोट्रोपिन (एचसीजी); गोनाडोट्रोपिन विमोचन-हार्मोन (GnRH); ल्यूटेनिंग हार्मोन-रिलीजिंग हार्मोन (LHRH); पत्र मी, ए और च 'मलमल', 'एवियन' और 'मछली' का प्रतिनिधित्व करते हैं; गर्भवती घोड़ी सीरम गोनाडोट्रोपिन (पीएमएसजी); प्रोजेस्टेरोन (पी 4); कूप-उत्तेजक हार्मोन FSH; पिट्यूटरी निकालने (पीई); टेस्टोस्टेरोन (टी); कॉर्टिकोस्टेरोन (सी)। डोपामाइन विरोधी सूचीबद्ध में शामिल हैं: domperidone (डी); पिमोज़ाइड (पी); मेटोक्लोप्रामाइड (एमईटी)। एम्फीप्लेक्स का नाम जीएनआरएच और मेटोक्लोप्रामाइड27 से बना एक यौगिक को दिया जाता है। Lucrin सक्रिय घटक के साथ एक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध GnRH एगोनिस्ट है Leuprorelin एसीटेट जा रहा है. 4 , 7 , 17 , 18 , 19 , 20 , 26 , 27 , 38 , 39 , 40 , 41 , 42 , 43 , 44 , 45

ग्रेड प्रजनन स्थिति विवरण
0 गैर-ग्रेविड कोई अंडे दिखाई देते हैं.
1 प्रारंभिक ग्रेविड अंडे दिखाई (1-2mm आकार में) अंडे के साथ जुड़े कोई अलग प्रतिध्वनिजन रेखा.
२ मिड ग्रेविड अंडे आकार में 2-3 मिमी, अलग प्रतिध्वनिजन रेखा (ओं) प्रत्येक अंडे के साथ जुड़े.
3 देर gravid अंडे आकार में 4-5 मिमी, प्रतिध्वनिजनक लाइनों अभी भी दिखाई, अंडे की anechoic उपस्थिति में वृद्धि के रूप में चिह्नित.
4 बनाए रखा अंडे आंतरिक अंडा संरचना में मौजूद प्रतिध्वनिजन सामग्री की विभिन्न डिग्री, अक्रिस्टलीय आकार पर ले। कुछ बहुत प्रतिध्वनिजन्य हो सकता है और शरीर गुहा में द्रव प्रतिधारण के साथ जुड़े.

तालिका 2: ग्रेडिंग प्रणाली बंदी महिला Necturus की प्रजनन स्थिति स्कोर करने के लिए इस्तेमाल किया और राणा मस्कोसा अल्ट्रासोनोग्राफी द्वारा।

दवा खुराक और मार्ग टिप्पणियाँ - संदर्भ
बुप्रेनोर्फिन 50 mg/Kg (इंट्रेलोमिक) एक पूर्वी लाल-स्पॉटेड न्यूट(नॉटोथैलमस विराइड्सेंस) में प्रायोगिक अध्ययन । सर्जरी से पहले एनलजेसिया दिया जाना चाहिए। (कोएलर, 2009)
बुरपोल 1 - 10 mg/Kg (आईएम या इंट्रेसलोमिक) वहाँ विभिन्न विशिष्ट जिम्मेदारी हैं. यह 1 मिलीग्राम/किलोग्राम से शुरू करने की सलाह दी जाती है।
बुरपोल 0.5 mg/L (बाथ) एक पूर्वी लाल-स्पॉटेड न्यूट(नॉटोथैलमस विराइड्सेंस) में प्रायोगिक अध्ययन । (कोएलर, 2009)
फेनिल 1 मिलीग्राम/किग्रा Analgesia और 4 ज, naltrexone द्वारा विरोध (स्टीव्स, 1997)
मेलोक्सीकैम 0.1 से 0.2 मिलीग्राम/किलोग्राम (आईएम) (मिंटर, 2011)

तालिका 3: उभयचरों में analgesia के लिए प्रोटोकॉल.

राणा मस्कोसा
साल 2014 2015
नहीं, ♀ 18 18
अंडा विकास 61% 94%
नियंत्रण ♀ 4 6
एम्फीप्लेक्स ♀ 4 7
औसत दिन के बाद oviposit करने के लिए Amphiplex 10.5 10.9
ओविपोजिशन दर (एम्फीप्लेक्स) 22.20% 33.33%
Oviposition दर (नियंत्रण) 22.20% 38.88%

तालिका 4: कैप्टिव महिला को नियंत्रित करने की तुलना में एम्फीप्लेक्स-उपचार के बीच प्रजनन पैरामीटरों की तुलना राणा मस्कोसा 2014 और 2015 में।

नेक्टूरस एस.पी.
साल 1 २ 3 4 5
नहीं, ♀ 6* 7 7* 7* 7*
अंडा विकास 83% 100% 86% 86% 86%
एलएचआरएच ♀ 3 5 3 6 0
नियंत्रण ♀ २ २ 3 0 6
दिन के बाद LHRH Oviposit करने के लिए 5 7 5.5 (रेंज 3 - 8) 13 एन/ए
ओविपोजिशन रेट (LHRH) 60% 20% 67% 17% एन/ए
Oviposition दर (नियंत्रण) 50% 50% 100% एन/ए 67%
* n $ 1 कोई अंडा विकास ♀

तालिका 5: LHRH के बीच प्रजनन मानकों की तुलना (जीएनआर) -उपचार और नियंत्रण (बाँझ पानी) बंदी महिला नेक्टूरस समय की एक 5 साल की अवधि में तीन प्रजातियों से (2012-2017)।

Figure 1
चित्र 1: एक मेंढक धारण करने के तीन तरीके| (ए) प्रक्रिया 1. (बी) प्रक्रिया 2. (सी) प्रक्रिया 3. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्र 2: Morphometric आकलन. (ए, बी) SVL/SUL(सी,डी)। वजन, आर muscosa और डी Necturus में. (ई) कैलिपर्स के साथ आकार माप। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्रा 3: यौन द्विरूपता महिलाओं की तुलना में वयस्क आर muscosa पुरुषों पर वैवाहिक अंगूठे पैड द्वारा प्रतिष्ठित है. (क) स्त्री (बी) पुरुष. निचले पैनल पुरुष बनाम महिला की लंबाई से पता चलता है. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्रा 4: आर muscosa में अंडस्थिति के लिए अग्रणी प्रजनन व्यवहार की विशेषता (एक) अदालत. (बी) एम्प्लेक्ससस। (ग) पुरुष घातले जाते समय अमिश्रक में मादा को निचोड़ते हैं. (डी, ई) एक हाथ खड़े में Amplexed महिला. (एफ , जी) पेट में संकुचन और अंडस्थिति। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 5
चित्र 5: विकासात्मक चरण4के अनुसार प्रजनन स्थिति के साथ आर मस्कोसा ए-बी पर अल्ट्रासाउंड किया गया। (ए, बी) राणा मस्कोसा पर अल्ट्रासाउंड करना। (सी) ग्रेड 0. (डी) ग्रेड 1. (ई) ग्रेड 2. (एफ) ग्रेड 3. (जी) ग्रेड 4 (ओव्यूटेड और retained अंडे) कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 6
चित्र 6: Necturus के अल्ट्रासाउंड छवियों। (ए) ग्रेड 1. (बी) ग्रेड 2. (सी) ग्रेड 3 अंडे. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 7
चित्र 7: आर muscosa में रक्त संग्रह. (ए) कक्षा के मध्य में जबड़े की रेखा के ठीक ऊपर वेना कक्षीय के पीछे चेहरे की नस को दंड देकर रक्त संग्रह। (बी, सी) रक्त त्वचा की सतह पर जारी किया जाता है और एक heparinized केशिका ट्यूब के साथ एकत्र किया जाता है। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 8
चित्र 8: उभयचरों में इंजेक्शन के तरीके। इंजेक्शन के प्रकार की गहराई के आधार पर कोण और सुई की गहराई अलग अलग होंगे. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 9
चित्र 9: आर muscosa में हार्मोनल इंजेक्शन. राणा मस्कोसा महिलाओं में हार्मोनल उपचार द्वारा ओविपोजिशन का प्रेरण जो एम्फीप्लेक्स इंट्रा-पेरिटोनली के साथ इंजेक्ट किया जाता है। Ovaries coelomic गुहा में पाया जा सकता है कृपया यहाँ क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए.

Figure 10
चित्र 10: सर्जरी से पहले तैयारी. (क) तनु पोविडोन-आयोडीन घोल (1/10), ट्रेकीसिफैलस रेजिनिफिकट्रिक्स का उपयोग करते हुए शल्य क्षेत्र की एसेप्टिक तैयारी। (ख) एक Xenopus लेविस या , (सी) लेजर-डिओड त्वचा चीरा में स्वच्छ स्केलपेल चीरा , Lithobates catesbeianus. (घ) मध्य शिरा, ट्रेचिसेफैलस रेजिनिट्रिक्सको नुकसान पहुंचाने से बचें . कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 11
चित्र 11: Xenopus laevis में ओवारीउच्छेदन. (ए) अंडे के द्रव्यमान को उजागर करने के लिए बड़े वसा निकायों को उजागर और स्थानांतरित करें। (ख) किसी भी रक्त वाहिकाओं को लिगाइन किए बिना अंडे के द्रव्यमान का एक भाग तैयार करें। (सी) पूर्ण अंडाशय के लिए इलेक्ट्रोकेटरी द्वारा रक्त वाहिकाओं के आस-पास का काउटेराइज़ करें। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 12
चित्र 12: पूर्व शल्य चिकित्सा तैयारी और A. mexicanum में ovariectomy. (क) स्टराइल जाली में भिगोया हुआ , 0.75% क्लोरहेक्सीडीन विलयन शल्य स्थल (बी) पर लागू होता है . कंधे और पिछले अंगों के बीच एक रेखा जानवर को तीन बराबर भागों में विभाजित करती है और नीले रंग का धब्बा चीरा पर साइट को चिह्नित करता है। (ग) पलक रिट्रैक्टर के साथ गुपलिया चीरों को वापस ले लें। (घ) पूर्ण अंडाशय के लिए आस-पास के रक्त वाहिकाओं को इलेक्ट्रोकेटरी द्वारा काटर करें। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 13
चित्र 13: प्रजनन चरणों का दृश्य मूल्यांकन। (ए, बी) अर्द्ध-ट्रांसलुसेंट त्वचा, Necturus के माध्यम से प्रजनन चरण के दृश्य आकलन. (ग) पारदर्शक त्वचा, हायलिनोबैट्राशियम (ग्लास मेंढक)। (घ) आर मस्कोसा का दृश्य मूल्यांकन (दाएं, नीली रेखा) और अंडस्थिति (बाएं - पीले रंग की रेखा) के बाद। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 14
चित्र 14: अंडा प्रतिधारण. (ए, बी) अंडे प्रतिधारण के गंभीर मामले के साथ महिला राणा muscosa. (सी) अल्ट्रासाउंड पुराने degenerating से पता चलता है, अंडे (ऊपर) और बड़े अंडे (मध्य और नीचे पैनल) ovulated और सीलोम में फंस. (डी) मैनुअल अलग करना द्वारा प्राप्त बनाए गए अंडे। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 15
चित्र 15: Necturus में बनाए रखा अंडे के अल्ट्रासाउंड छवियों कि (ए) उपस्थिति में प्रतिध्वनिजन बन गया (वृत्त) और के साथ जुड़े थे (बी) शरीर गुहा में द्रव प्रतिधारण (तीर). कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 16
चित्र 16: कैप्टिव मादा Necturus का प्रतिशत है कि oviposited पूर्ण या आंशिक क्लच (2013-2017) उन है कि oviposit नहीं था की तुलना में. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Discussion

प्रत्यक्ष हैंडलिंग, दृश्य अवलोकन और morphometric उपायों गैर इनवेसिव तकनीक प्रदान करते हैं और महिला प्रजनन चरण का निर्धारण करने के लिए पहला मूल्यांकन मानदंड हैं. हालांकि, इस अध्ययन से पता चलता है कि gravid अंडाशय हमेशा मज़बूती से palpation द्वारा पहचाना नहीं जा सकता है. प्रजातियों के आधार पर, ग्रैविड अंडाशय कभी-कभी अर्ध-पारांत के माध्यम से नेत्रहीन पाया जा सकता है (चित्र 13क, बी) या जानवर के अधर पक्ष पर पूरी तरह से पारदर्शी त्वचा ( चित्र13 ब्) । महिलाओं है कि oviposition पूरा कर लिया है gravid महिलाओं की तुलना में उनकी उपस्थिति के लिए स्पष्ट परिवर्तन दिखा सकते हैं (उदाहरण के लिए, ढीली त्वचा और उनके शरीर द्रव्यमान के 30% तक की हानि, चित्र 13D). प्रजनन के दौरान, पुरुषों और महिलाओं के कुछ व्यवहार है कि ओव्यूलेशन और oviposition के लिए निकटता के बारे में जानकारी प्रदान प्रदर्शित करेगा. आर muscosa संकेत के मामले में है कि एक महिला oviposition के करीब है हाथ में प्रवेश करने वाली महिला के साथ शुरू करते हैं.

Anurans और Caudates के लिए अल्ट्रासाउंड प्रौद्योगिकी के आवेदन उपस्थिति या अंडे की अनुपस्थिति के निदान की अनुमति देता है और क्या oviposition विकसित अंडे की पूरी या आंशिक रिहाई के साथ जुड़ा हुआ था। इस प्रकार, इस विधि एक दृश्य तकनीक है कि पेट की त्वचा पारदर्शिता, या epidermal स्थिरता के बीच से भिन्न होता है के माध्यम से gravid/गैर-ग्रेविड स्थिति का निर्धारण करने के लिए सीमित किया जा रहा बिना प्रजनन स्थिति का एक अधिक पूर्ण और सटीक मूल्यांकन प्रदान करता है विभिन्न उभयचर प्रजातियों. अल्ट्रासाउंड अपेक्षाकृत आसानी से और जानवरों के लिए थोड़ा तनाव के साथ किया जा सकता है (चित्र 5 और चित्र 13) और प्रजनन चक्र की विशेषता और प्रजनन स्थिति4का निर्धारण करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है . यह प्रजातियों के साथ परिचित बनने के लिए महत्वपूर्ण है; तथापि, इस अध्ययन से पता चला है कि नेकटूरस और आर मस्कोसा अपने प्रजनन पैटर्न में सामान्य विकासात्मक संकेतों को साझा करते हैं जिससे प्रजनन अवस्था के समान वर्गीकरण की अनुमति मिल जाती है (चित्र 5)। इस तकनीक के माध्यम से अब सबूत है कि अंडे के विकास बंदी Necturus और आर muscosa में उच्च है और यह कि इन दोनों प्रजातियों एक मौसमी पैटर्न का पालन करें. हालांकि इन घटनाओं के कारण अज्ञात हैं और आगे की जांच की आवश्यकता होती है, अल्ट्रासाउंड के उपयोग के बिना, डिम्बग्रंथि रोग के कई क्षेत्रों, जैसे अंडा प्रतिधारण और आंशिक अंडाणु, का पता नहीं चला होगा। इस तकनीक के लिए भविष्य अनुप्रयोगों कि क्या महिलाओं को किसी भी वर्ष में प्रजनन के लिए चुना जाना चाहिए और क्या oviposition पूरा हो गया है यह निर्धारित करने के लिए इस्तेमाल किया जाएगा.

एक रक्त संग्रह प्रोटोकॉल, जैसे कि आर muscosaमें प्रस्तुत किया है, जो दोनों प्रभावी है और पशु के लिए कम से कम संकट का कारण बनता है, बंदी और जंगली पकड़ा Anurans में हार्मोन प्रोफाइल का अध्ययन करने के लिए इष्टतम है (Calatayud, अप्रकाशित). तारीख करने के लिए, कोई जानकारी बंदी आर muscosa के वार्षिक हार्मोन प्रोफाइल के बारे में मौजूद है और, इसलिए, कैसे हार्मोन उनके स्वास्थ्य और प्रजनन को प्रभावित कर रहे हैं पर कोई ज्ञान नहीं. इसके अलावा, सबूत के साथ कि इस प्रजाति की महिलाओं वार्षिक प्रजनक नहीं हो सकता है, हार्मोनल रूपरेखा डिम्बग्रंथि चक्र पर नज़र रखने के लिए एक और तरीका होगा. अल्ट्रासाउंड के साथ साथ, हार्मोन विश्लेषण क्या महिलाओं oviposition के लिए तैयार हो जाएगा की बेहतर भविष्यवाणी करने के लिए नेतृत्व कर सकते हैं. इसके अलावा, पिछले एक साल में, बंदी आर muscosa आबादी में मध्यलिंगी के दो मामलों का दस्तावेजीकरण किया गया है. इसके अलावा, अंगूठे पैड के विकास पुराने संस्थापक महिलाओं में से कुछ पर उल्लेख किया गया है. इस के लिए कारण वर्तमान में जांच के तहत कर रहे हैं, लेकिन प्रारंभिक परिणाम सुझाव है कि यह टेस्टोस्टेरोन के स्तर में परिवर्तन से संबंधित हो सकता है (Calatayud, अप्रकाशित). विभिन्न उम्र की महिलाओं में हार्मोनल चक्र समझदार हमें समझने में मदद मिलेगी क्यों महिलाओं पुरुष संबद्ध माध्यमिक यौन विशेषताओं का विकास हो सकता है और क्या यह एक उम्र बढ़ने की आबादी में उम्मीद की जा रही है.

Exogenous हार्मोन थेरेपी अक्सर कैप्टिव उभयचरों में सामना करना पड़ा प्रजनन रोग को दूर करने के लिए इस्तेमाल किया गया है. हालांकि, इस अध्ययन में आर muscosa और Necturus आबादी दोनों के लिए, हार्मोन का इलाज और नियंत्रण महिलाओं के बीच oviposition में कोई महत्वपूर्ण अंतर समय की एक 2 और 5 साल की अवधि में पाया गया, क्रमशः. यह संकेत हो सकता है कि हार्मोन प्रशासन प्रोटोकॉल, खुराक, प्राइमिंग और हार्मोन संयोजन का इस्तेमाल प्रजातियों के लिए पर्याप्त नहीं था. व्यक्तिगत महिला प्रजनन इतिहास के करीब विश्लेषण से पता चलता है आर muscosa वार्षिक प्रजनन का अनुभव नहीं हो सकता है, जो भी इलाज महिलाओं में मनाया हार्मोनल प्रभाव की कमी के लिए खाते में हो सकता है. क्योंकि महिलाओं का एक निश्चित प्रतिशत लगातार हर साल प्रजनन छोड़ दिया, प्रजातियों के प्राकृतिक इतिहास को समझने में मदद कर सकते हैं निर्धारित है कि क्या exogenous हार्मोन के लिए एक की जरूरत है और जब वे सबसे प्रभावी हो सकता है. इस आलेख में उल्लिखित प्रक्रियाओं को कई प्रजातियों पर लागू किया जा सकता है , (तालिका 1) और 5 ग्राम से 150 ग्राम तक के anurans के लिए हैं; बड़े जानवरों को अलग-अलग सीरिंज और सुई गेज की आवश्यकता हो सकती है। इंजेक्शन का स्थान कुछ हार्मोन के साथ भिन्न होता है जिसमें इंट्रा-मस्क्युलर, इंट्रा-पेरिटोनियल, उप-त्वचा या इंट्राडर्मल इंजेक्शन (चित्र 7) की आवश्यकता होती है।

अंडाशय के उच्छेदन के उद्देश्य के लिए सर्जरी एक आम विधि है जिसका उपयोग भ्रूण अध्ययन के लिए अंडाणु प्राप्त करने के लिए विभिन्न उभयचर प्रजातियों में किया जाता है। Ovariectomy भी इस तरह के अंडे प्रतिधारण के रूप में जनसंख्या नियंत्रण और चिकित्सा मुद्दों के लिए संकेत दिया जा सकता है. आंशिक ओवेरीक्टॉमी के मामले में, जिसमें, अंडाणु कटाई अनुसंधान प्रयोजनों के लिए किया जाता है, सर्जरी को यह सुनिश्चित करना चाहिए कि जानवर प्रजनन रहता है। पीजीएफ2 के प्रशासन ने मादा आर मस्कोसामें अंडे की अवधारण को हल करने में कुछ वादा किया है . कई व्यक्तियों में, PGF2 ] पहले बनाए रखा अंडे का पूरा बयान प्राप्त है, लेकिन दूसरों में केवल आंशिक जमा हुआ मैनुअल अलग करना सभी अंडे को दूर करने की आवश्यकता होती है. जबकि PGF2 ] आर muscosaमें अंडे प्रतिधारण के लिए सर्जरी के लिए एक विकल्प के रूप में सेवा कर सकते हैं, अन्य उभयचरों में इसी तरह की रोगग्रस्त स्थितियों के उपचार की क्षमता प्रजातियों विशेष सत्यापन की आवश्यकता होगी. जब शल्य चिकित्सा हस्तक्षेप Anuran या Caudate रोगी के लिए अनिवार्य है, यह संज्ञाहरण की एक पर्याप्त विमान सुनिश्चित करने से पहले चीरों बना रहे हैं आवश्यक है. चतुर अवलोकन कौशल का आकलन करने और कर के प्रत्येक के लिए इस अध्ययन में उल्लिखित के रूप में मानक प्रेरण और वसूली प्रतिक्रियाओं की निगरानी की जरूरत है. एक बार एक विशिष्ट शरीर रचना विज्ञान, एक उचित शल्य चिकित्सा दृष्टिकोण, hemostasis, कोमल ऊतक हेरफेर और पर्याप्त पश्चात प्रबंधन के साथ परिचित है, प्रजनन सर्जरी कोई भारी बाधाएं पैदा.

Disclosures

लेखकों को खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है.

Acknowledgments

नताली Calatayud अल्ट्रासाउंड के साथ प्रशिक्षण और सहायता के लिए और Exploradora डे Immuebles, एस.ए. (EISA) एसडीजेडजी में मेरे अनुसंधान सहयोगी की स्थिति के लिए वित्तीय सहायता प्रदान करने के लिए डॉ बारबरा Durrant धन्यवाद करना चाहते हैं। पांडुलिपि पर टिप्पणी के लिए डॉ Kylie केन के लिए धन्यवाद के रूप में के रूप में अच्छी तरह से सरकारी समीक्षकों के लिए (जो भी वे हो सकता है). जोनाथन Dain हमारे 2018 ग्रीष्मकालीन साथी के लिए धन्यवाद, सैन डिएगो चिड़ियाघर संरक्षण अनुसंधान के लिए संस्थान तस्वीरें प्रदान करने के लिए (चित्र 1A,बी). मोनिका स्टोप्स ने कैप्टिव Necturus आबादी स्थापित करने के लिए वित्तीय सहायता प्रदान करने के लिए चिड़ियाघरों और एक्वैरियम संरक्षण एंडोमेंट फंड और डिज्नी वर्ल्डवाइड कंजर्वेशन फंड के एसोसिएशन के लिए प्रशंसा प्रदान की है। इसके अतिरिक्त, समर्थन भी उभयचर वकील सुश्री आइरिस डे ला Motte से निजी दान के माध्यम से प्राप्त किया गया था. धन्यवाद, श्री क्रिस्टोफर DeChant और डॉ मार्क कैम्पबेल को अनुसंधान के लिए उनके महत्वपूर्ण योगदान के लिए दिया जाता है.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
GE logiq Book XP and 8C-RS probe 4e10 MHz GE Medical Systems GE medical systems GE logiq Book XP Ultrasound
Aloka 500 7.5mHz linear or IBEX multi-frequency (10-6mHz) micro-convex GE medical systems 8C-RS (10 MHz) Ultrasound probe
BD disposable U-100 insulin syringe (28-29 G needle) Mettler Electronics Corp CA Sonigel Ultrasound gel (water soluble, salt-free)
Hormone
Gonadotropin releasing hormone BACHEM 4012028 synonym: [Des-Gly10, D-Ala6, Pro-NHEt9]-GnRH acetate
abbreviation: GnRH
Lutenizing hormone releasing hormone BACHEM, Sigma-Aldrich 4033013;     L1898 synonym: Pyr-His-Trp-Ser-Tyr-Gly-Leu-Arg-Pro-Gly-NH2 acetate salt;
[D-Ala6}-LHRH acetate salt hydrate
abbreviation: LHRH
Human chorionic gonadotropin BACHEM, Sigma-Aldrich 4030270, 4018894; C1063, CG5, CG10 synonym: Chorionic gonadotropin-β (109-145)(109-119); Choriogonin, HCG (2,500IU, 5,000IU, 10,000IU)
abbreviation: hCG
Prostaglandin 2α Sigma-Aldrich P40424; synonym: (5Z,9α,11α,13E,15S)-9,11,15-Trihydroxyprosta-5,13-dienoic acid tris salt, PGF2α−Tris;
abbreviation: PGF2α
Follicle-stimulating hormone Sigma-Aldrich F4021, F8174 synonym: porcine, sheep
abbreviation: FSH
Progesterone Sigma-Aldrich 46665;      P7556 synonym: Vetranal; P4 water soluble
abbreviation: P4
Pituitary extract na synonym: Check papers for amphibian species derivation
abbreviation: PE
Pregnant Mare Serum Gonadotropin Prospec;       Lee Biosolutions; Sigma-Aldrich HOR-272;    493-10; 9002-70-4 synonym: Pregnant Mare Serum Gonadotropin
abbreviation: PMSG
Metaclopromide Sigma-Aldrich M0763 synonym: 4-Amino-5-chloro-N-[2-(diethylamino)ethyl]-2-methoxybenzamide, Methoxychloroprocainamide
abbreviation: MET
Lucrin BACHEM; Sigma-Aldrich 4033014;   L0399 synonym: Leuprorelin acetate
abbreviation: Lucrin
Lutalyse Pfizer synonym: PGF2α - Dinoprost tromethamine
abbreviation: Lut
Pimozide Sigma-Aldrich P1793 synonym: 1-[1-[4,4-bis(4-Fluorophenyl)butyl]-4-piperidinyl]-1,3-dihydro-2H-benzimidazol-2-one
abbreviation: PZ
Amphiplex see above synonym: Gonadotropin releasing hormone + metoclopramide
abbreviation: GnRH + MET
Ovopel Ovopel na synonym: GnRHa + dopamine receptor antagonist (administered 1 pellet/ kg)
abbreviation: Ovo
Ovaprim Pentair aquatic eco-systems Ova10 synonym: Salmon gonadotropin + domperidone
abbreviation: Ova
Domperidone Sigma-Aldrich D122 synonym: 4-(5-Chloro-2-oxo-1-benzimidazolinyl)-1-[3-(2-oxobenzimidazolinyl)propyl]piperidine
abbreviation: DOM

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References

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Calatayud, N. E., Chai, N., Gardner, N. R., Curtis, M. J., Stoops, M. A. Reproductive Techniques for Ovarian Monitoring and Control in Amphibians. J. Vis. Exp. (147), e58675, doi:10.3791/58675 (2019).

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