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Biology

एक BW रिपोर्टर प्रणाली के अध्ययन के लिए रिसेप्टर Ligand बातचीत

Published: January 7, 2019 doi: 10.3791/58685
Automatic Translation
1,2, 2, 2, 2
1Department of Hematology, Hadassah - Hebrew University Medical Center, 2The Lautenberg Center for General and Tumor Immunology, Department of Immunology and Cancer Research, Institute for Medical Research Israel Canada (IMRIC), Hadassah - Hebrew University Medical Center

Summary

इस प्रोटोकॉल का वर्णन कैसे एक रिपोर्टर प्रणाली है कि पहचान करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता स्थापित करने के लिए और रिसेप्टर ligand बातचीत ।

Abstract

रिसेप्टर्स और लाइगैंडों के बीच बातचीत एक मौलिक जैविक प्रक्रिया का गठन. हालांकि, कोशिकाओं है कि देशी रिसेप्टर और ligand व्यक्त के साथ प्रत्यक्ष प्रयोगों के बाद से एक विशिष्ट रिसेप्टर के ligand को चुनौती दे रहे हैं अज्ञात हो सकता है और देशी ligand के साथ प्रयोगात्मक प्रक्रियाओं तकनीकी रूप से जटिल हो सकता है. इन बाधाओं को हल करने के लिए, हम एक रिपोर्टर प्रणाली का वर्णन करने के लिए एक ligand के द्वारा एक विशिष्ट रिसेप्टर के बंधन और सक्रियण का पता लगाने के लिए ब्याज । इस रिपोर्टर प्रणाली में, एक विशिष्ट रिसेप्टर के extracellular डोमेन माउस CD3ζ करने के लिए संयुग्मित है और इस chimeric प्रोटीन तो माउस BW कोशिकाओं में व्यक्त की है. इन transfected BW कोशिकाओं को तो अलग लक्ष्य (जैसे, कोशिकाओं या एंटीबॉडी) के साथ मशीन हो सकता है । एक transfected रिसेप्टर के सक्रियकरण माउस interleukin-2 (मिल-2) जो एंजाइम से जुड़े immunosorbent परख (एलिसा) द्वारा पता लगाया जा सकता है के स्राव की ओर जाता है । इस रिपोर्टर प्रणाली के फायदे के लिए किया जा रहा है संवेदनशील और एक एकल रिसेप्टर के लिए विशिष्ट. इसके अलावा, एक विशिष्ट रिसेप्टर के सक्रियकरण स्तर आसानी से quantified जा सकता है और भी मामलों में इस्तेमाल किया जा सकता है जहां रिसेप्टर के ligand अज्ञात है. इस प्रणाली को हमारे अध्ययन के कई में सफलतापूर्वक लागू किया गया है रिसेप्टर ligand बातचीत की विशेषता है । हम हाल ही में नैदानिक उपयोग में विभिन्न मोनोक्लोनल विरोधी CD20 एंटीबॉडी द्वारा मानव Fcγ रिसेप्टर्स (FcγRs) के सक्रियण का अध्ययन करने के लिए इस प्रणाली को नियोजित किया है.

Introduction

BW रिपोर्टर प्रणाली रिसेप्टर का अध्ययन करने के लिए एक तकनीक है-ligand बातचीत1. यह प्रणाली विशेष रूप से लाभप्रद है जब एक विशिष्ट रिसेप्टर के ligand अज्ञात है या अंतर्जात ligand के साथ प्रयोग तकनीकी रूप से मुश्किल हैं. यह भी मानव FcγRs के लिए मोनोक्लोनल एंटीबॉडी के बंधन का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । विधि माउस BW कोशिकाओं में एक chimeric प्रोटीन व्यक्त करने पर आधारित है । इस chimeric प्रोटीन ब्याज की रिसेप्टर के extracellular डोमेन से बना है transmembrane और माउस ζ श्रृंखला के intracellular डोमेन से जुड़े । उचित लाइगैंडों रिसेप्टर की बाध्यकारी माउस IL-2 के स्राव की ओर जाता है, जो आसानी से एलिसा द्वारा पता लगाया जा सकता है, के रूप में चित्र 1में सचित्र । इस विधि संवेदनशील और एक व्यक्ति रिसेप्टर के लिए विशिष्ट है, संचालित करने के लिए आसान है, और अत्यधिक reproducible. यह इस प्रकार रिसेप्टर-ligand बातचीत का अध्ययन करने के लिए अतिरिक्त उपकरण पूरक कर सकते हैं. उदाहरण के लिए, यह एक विशिष्ट रिसेप्टर के लिए एक ligand की उपस्थिति के लिए कई सेल लाइनों स्क्रीन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है (भले ही ligand खुद को पहचान नहीं किया गया है) या मोनोक्लोनल एंटीबॉडी द्वारा मानव FcγRs के सक्रियण का पता लगाने या एंटी वायरल युक्त मानव सीरम द्वारा एंटीबॉडी. हालांकि प्राथमिक प्रतिरक्षा कोशिकाओं अंतर्जात FcγRs एक्सप्रेस, वे आम तौर पर संभालना मुश्किल है और आमतौर पर कई एफसी रिसेप्टर्स व्यक्त करते हैं ।

हम अपने अध्ययन के कई में सफलतापूर्वक इस प्रणाली का इस्तेमाल किया है रिसेप्टर ligand बातचीत की विशेषता । ये NK सेल रिसेप्टर NKp462के ligand के रूप में haemagglutinin की पहचान, पीवीआर और nectin-2 मानव और माउस लाइगैंडों3,4के लिए TIGIT के रूप में, और दिखा रहा है कि fusobacterium nucleatum जीवाणु बांधों की पहचान शामिल है और सक्रिय करता है मानव TIGIT5. इसके अलावा, BW कोशिकाओं है कि एक्सप्रेस एफसी रिसेप्टर्स सफलतापूर्वक रोगियों के सीरा6,7,8में विरोधी वायरल एंटीबॉडी का पता लगाने के लिए इस्तेमाल किया गया है । विशेष रूप से, हम हाल ही में BW कोशिकाओं है कि मानव FcγRs विरोधी CD20 एंटीबॉडी क्रोनिक लिम्फोसाईटिक ल्यूकेमिया (CLL)9के उपचार के लिए इस्तेमाल किया के अंतर FcR सक्रियण का पता लगाने एक्सप्रेस की स्थापना की । महत्वपूर्ण बात यह है कि BW रिपोर्टर प्रणाली के परिणामों को पूरक प्रयोगों में मान्य किया गया है.

Protocol

1. एक प्लाज्मिड है कि Chimeric का निर्माण व्यक्त की पीढ़ी

नोट: उद्देश्य के लिए एक प्लाज्मिड है कि ब्याज की रिसेप्टर के extracellular डोमेन व्यक्त करने के लिए transmembrane और माउस CD3ζ श्रृंखला (चित्रा 2a) के intracellular डोमेन से जुड़े उत्पंन करने के लिए है ।

  1. संकेत पेप्टाइड सहित ब्याज की रिसेप्टर के extracellular डोमेन के अनुक्रम को पुनः प्राप्त. डीएनए सामग्री जो इस रिसेप्टर (जैसे, सीडीएनए या एक प्लाज्मिड) व्यक्त करने की उम्मीद है प्राप्त करें ।
  2. डीएनए सामग्री है कि transmembrane और माउस CD3ζ श्रृंखला (जैसे, सीडीएनए या एक प्लाज्मिड) के intracellular डोमेन व्यक्त प्राप्त करें ।
  3. चित्रा 2aमें दिखाया सामान्य संरचना के आधार पर फ्यूजन प्रोटीन के अनुक्रम डिजाइन । सुनिश्चित करें कि पूरे अनुक्रम एक ही codon पठन फ़्रेम के भीतर है । इस अनुक्रम उपयुक्त प्राइमरों डिजाइन और अंतिम उत्पाद को सत्यापित करने के लिए प्रयोग किया जाता है ।
  4. दो पीसीआर प्रतिक्रियाओं डिजाइन फ्यूजन प्रोटीन के टुकड़े के प्रत्येक अलग बढ़ाना (चित्रा 2 बी, 2c)10।
    नोट: पीसीआर प्रतिक्रियाओं (जैसे, बढ़ाव समय और एनीलिंग तापमान) के लिए विशिष्ट शर्तों प्राइमरों, जो एक विशिष्ट रिसेप्टर के लिए तैयार कर रहे हैं की प्रकृति पर निर्भर हैं ।
    1. रिसेप्टर के extracellular खंड बढ़ाना.
      1. डिजाइन एक ' 5 प्राइमर कि रिसेप्टर के संकेत पेप्टाइड का हिस्सा शामिल है, एक श्मिट आम सहमति अनुक्रम, और एक उपयुक्त प्रतिबंध साइट (चित्रा 2 बी) ।
      2. डिजाइन एक ' 3 प्राइमर है कि संलयन प्रोटीन के दोनों भागों (चित्रा 2 बी) पार्श्व । उदाहरण के लिए, प्रारंभिक डिजाइन के लिए इस ' 3 प्राइमर रिसेप्टर के extracellular खंड और CD3ζ खंड के पहले 9 आधार जोड़े के पिछले 20 आधार जोड़े शामिल कर सकते हैं ।
        नोट: इस किताब से जुड़े अनुक्रम उत्पन्न करने के लिए इस्तेमाल किया जाएगा के बाद से 3 ' प्राइमरी के लिए एक प्रतिबंध साइट जोड़ने के लिए कोई जरूरत नहीं है, और बंधाव के लिए इस्तेमाल नहीं किया जाता है.
    2. CD3ζ सेगमेंट को बढ़ाना.
      1. डिजाइन एक ' 5 प्राइमर जो संलयन प्रोटीन के दोनों भागों में पार्श्वों (चित्रा 2c) । उदाहरण के लिए, प्रारंभिक डिजाइन के लिए 5 ' प्राइमर रिसेप्टर के extracellular खंड के अंतिम 9 आधार जोड़े और CD3ζ खंड के पहले 20 आधार जोड़े को शामिल कर सकते हैं ।
        नोट: इस किताब से जुड़े अनुक्रम उत्पन्न करने के लिए इस्तेमाल किया जाएगा के बाद से 5 ' प्राइमर के लिए एक प्रतिबंध साइट जोड़ने के लिए कोई जरूरत नहीं है, और बंधाव के लिए इस्तेमाल नहीं किया जाता है.
      2. डिजाइन एक ' 3 प्राइमर जो CD3ζ अनुक्रम के अंत के रूप में के रूप में अच्छी तरह से एक उपयुक्त प्रतिबंध साइट (चित्रा 2c) शामिल है ।
    3. इन दो प्रतिक्रियाओं में से प्रत्येक में प्राइमर अनुक्रम सही है कि एनीलिंग तापमान प्रत्येक जोड़ी में समान है (ध्यान दें कि प्राइमर, जो फ्यूजन प्रोटीन के दो भागों के अनुक्रम भी शामिल है, प्रत्येक प्रतिक्रिया में अनुक्रम के भाग के साथ केवल anneals).
  5. एक अतिरिक्त पीसीआर निष्पादित करें जिसमें पहली दो प्रतिक्रियाओं के पीसीआर उत्पादों का मिश्रण डीएनए टेम्पलेट के रूप में प्रयोग किया जाता है 5 ' प्राइमरी के extracellular रिसेप्टर सेगमेंट (step 1.4.1.1) और CD3ζ सेगमेंट की 3 ' (step 1.4.2.2) (figure 2d)10 . यह प्रतिक्रिया अंतिम जुड़े अनुक्रम उत्पन्न करना चाहिए.
  6. क्लोनिंग के लिए हमेशा की तरह आगे बढ़ें ।
    1. अंतिम पीसीआर उत्पाद Ligate लक्ष्य में कटौती सदिश (लक्ष्य वेक्टर आमतौर पर pcDNA3 जो G418 और एम्पीसिलीन प्रतिरोध व्यक्त करता है) ।
    2. सक्षम जीवाणु11में ligated वेक्टर रूपांतरण ।
      1. गल बर्फ पर सक्षम जीवाणुओं के ५० µ एल.
      2. बैक्टीरिया को ligated वेक्टर जोड़ें और बर्फ पर 20 मिनट के लिए मशीन ।
      3. ४५ एस के लिए ४२ ° c पर मशीन ।
      4. जोड़ें २०० एंटीबायोटिक दवाओं के बिना पौंड के µ एल ।
      5. सतत मिलाते के साथ ३७ डिग्री सेल्सियस पर 1 एच के लिए मशीन ।
      6. उचित एंटीबायोटिक दवाओं के साथ एक पौंड प्लेट पर बीज (जैसे, ०.१ मिलीग्राम/एमएल) के अंतिम एकाग्रता के साथ एम्पीसिलीन समाधान ।
    3. लीजिए और पौंड के 5 मिलीलीटर (15 मिलीलीटर ट्यूबों में) में कई बैक्टीरियल कालोनियों बढ़ने ।
    4. अगले दिन, एक मिनी तैयारी किट के साथ plasmids निकालें ।
    5. प्रतिबंध एंजाइमों के साथ जीन डालने का विश्लेषण ।
    6. संबंधित कालोनियों अनुक्रम और सत्यापित करें कि अनुक्रम और पठन फ़्रेम सही है (के रूप में चरण १.३ में इंगित) ।
  7. सक्षम बैक्टीरिया11में सत्यापित प्लाज्मिड रूपांतरण ।
    1. बर्फ पर सक्षम जीवाणुओं के गल 20 µ l.
    2. बैक्टीरिया को प्लाज्मिड के 1 µ एल जोड़ें और 20 मिनट के लिए बर्फ पर मशीन ।
    3. ४५ एस के लिए ४२ ° c पर मशीन ।
    4. जोड़ें २०० एंटीबायोटिक दवाओं के बिना पौंड के µ एल ।
    5. सतत मिलाते के साथ ३७ डिग्री सेल्सियस पर 1 एच के लिए मशीन ।
    6. उचित एंटीबायोटिक दवाओं के साथ एक जीवाणु विकास की थाली पर बीज (जैसे, ०.१ मिलीग्राम/एमएल) के अंतिम एकाग्रता के साथ एम्पीसिलीन समाधान ।
  8. अगले दिन, एक बड़े पौंड कंटेनर में एक बैक्टीरियल कॉलोनी बढ़ने के साथ ०.१ मिलीग्राम/एमएल एम्पीसिलीन (~ २५० एमएल) ।
  9. अगले दिन, किट द्वारा प्रदान की विशिष्ट निर्देशों के अनुसार मैक्सी प्रस्तुत करने का प्रदर्शन ।
    नोट: electroporation कार्यविधि के लिए, प्लाज्मिड की एक बड़ी मात्रा के रूप में नीचे विस्तृत आवश्यक है ।

2. प्लाज्मिड की अभिकर्मक जो Chimeric प्रोटीन को BW कोशिकाओं में अभिव्यक्त करती है

नोट: विभिन्न तरीकों को भी अभिकर्मक के लिए नियोजित किया जा सकता है (जैसे, lentiviral संक्रमण द्वारा). electroporation करने से पहले, नीचे वर्णित के रूप में डीएनए के इथेनॉल वर्षण प्रदर्शन । अगले कदम बाँझ शर्तों की आवश्यकता होती है ।

  1. इससे पहले दिन, BW5147 कोशिकाओं ("BW कोशिकाओं") electroporation के लिए तैयार करते हैं । प्लेट 10 प्लेट (10 सेमी की) 10 मिलीलीटर के साथ १००,००० BW5147 कोशिकाओं/एमएल (यानी, RPMI 10% भ्रूण बछड़ा सीरम (FCS), 1% सोडियम पाइरूवेट, 1% L-glutamine, 1% गैर आवश्यक अमीनो एसिड और 1% के साथ पूरक के साथ 10 x 106 कोशिकाओं की कुल) पेनिसिलिन-streptomycin ("पूर्ण मध्यम").
  2. प्लेस १०० pcDNA3 प्लाज्मिड के µ जी कि एक 1.5-2 एमएल ट्यूब में फ्यूजन प्रोटीन व्यक्त करता है और यह करने के लिए पीएच 5.3-5.5 में 3 एम सोडियम एसीटेट जोड़ें । सोडियम एसीटेट की मात्रा ०.१ के अनुरूप होनी चाहिए (१०० µ g प्लाज्मिड की मात्रा का 10%); अनुमापन एसीटेट या एचसीएल को जोड़कर पीएच मीटर के साथ सोडियम NaOH का पीएच ।
  3. प्लाज्मिड और सोडियम एसीटेट के मिश्रण के लिए १००% इथेनॉल के २.५ संस्करणों जोड़ें चरण २.२ में वर्णित के रूप में (2.5 x प्लाज्मिड और सोडियम एसीटेट की कुल मात्रा) । -20 ° c या ७० ° c पर 2 घंटे के लिए रात भर में मशीन ।
  4. २.४. 24 ज के बाद BW कोशिकाओं चढ़ाया गया है, सभी BW कोशिकाओं को इकट्ठा (~ १०० एमएल) २ ५० मिलीलीटर ट्यूबों में । ५१५ x g पर 5 मिनट के लिए कोशिकाओं के केंद्रापसारक और supernatant त्यागें ।
  5. Re-RPMI के 25 मिलीलीटर में दोनों ट्यूबों से गोली निलंबित-एक एकल ५० मिलीलीटर ट्यूब में । उदाहरण के लिए, RPMI के 25 मिलीलीटर के साथ एक ट्यूब की गोली फिर से निलंबित-और फिर BW कोशिकाओं से कुल गोली एक एकल ट्यूब में मध्यम के 25 मिलीलीटर में निलंबित कर दिया है ताकि फिर से अन्य ५० मिलीलीटर ट्यूब में तरल पदार्थ को निलंबित करने के लिए इस द्रव का उपयोग करें ।
    नोट: मध्यम संस्करण के बिना होना चाहिए, के बाद से सीरम electroporation के साथ हस्तक्षेप हो सकता है.
  6. ५१५ x gपर 5 मिनट के लिए फिर से कोशिकाओं को केंद्रापसारक पुनः RPMI के 1 मिलीलीटर में गोली निलंबित, और बर्फ पर एक ०.४ सेमी cuvette के लिए सामग्री हस्तांतरण ।
  7. प्लाज्मिड कि इथेनॉल वर्षण (चरण २.३) 30 मिनट के लिए १६,००० x g पर और 4 डिग्री सेल्सियस से गुजरना केंद्रापसारक ।
  8. ७०% इथेनॉल के 1 मिलीलीटर के साथ एक बार धो और १६,००० x g और 4 डिग्री सेल्सियस पर एक और 20 मिनट के लिए केंद्रापसारक (बाहर नमक धोने के लिए) ।
  9. सभी इथेनॉल निकालें और दो गोली थोड़ा सूखी (यानी, ऊतक संस्कृति हूड में एक खुली ट्यूब में) । पुन: RPMI के १०० µ एल के साथ गोली निलंबित-पहले ६० डिग्री सेल्सियस के लिए गरम ।
  10. cuvette में कोशिकाओं को पुनः निलंबित प्लाज्मिड (चरण २.८) जोड़ें और बर्फ पर 5 मिनट के लिए मशीन ।
  11. ०.२३ केवी, २५० समाई पर कोशिकाओं Electroporate । यह ले जाना चाहिए ~ 4 ms ।
  12. एक ५० मिलीलीटर ट्यूब करने के लिए electroporated कोशिकाओं स्थानांतरण, पूर्ण मध्यम की ५० मिलीलीटर जोड़ने और 5 मिनट के लिए केंद्रापसारक पर ५१५ x जी ।
  13. supernatant को छोड़ें और पूर्ण माध्यम की ५० मिलीलीटर के साथ कक्षों को पुन: निलंबित करें ।
  14. थाली 24 में electroporated कोशिकाओं को अच्छी तरह से संस्कृति व्यंजन (प्रति अच्छी तरह से 1 मिलीलीटर, ~ ५० कुओं की कुल के लिए) और ३७ डिग्री सेल्सियस और 5% सह2 पर मशीन ४८ एच के लिए ।
  15. एंटीबायोटिक दवाओं के साथ transfected कोशिकाओं का चयन करें । के बाद ४८ एच पूरा मध्यम के 1 मिलीलीटर जोड़ने के लिए 10 मिलीग्राम/एमएल G418 के साथ एक अच्छी तरह से (इस स्तर पर एक अच्छी तरह से प्रत्येक में अंतिम मात्रा 2 मिलीलीटर है और प्रत्येक में G418 के अंतिम एकाग्रता है 5 मिलीग्राम/एमएल) ।
    नोट: प्लाज्मिड एक अलग एंटीबायोटिक प्रतिरोध शामिल हैं, तो इस कदम से पहले untransfected BW कोशिकाओं को मारने के लिए आवश्यक एंटीबायोटिक एकाग्रता निर्धारित करते हैं ।
  16. हर ४८ एच, ध्यान से एक अच्छी तरह से मध्यम सरगर्मी (BW कोशिकाओं को अच्छी तरह से के तल पर हो जाते हैं) के बिना ऊपरी मात्रा के 1 मिलीलीटर त्यागें । एक अच्छी तरह से 5 मिलीग्राम/एमएल G418 के साथ पूरक पूर्ण माध्यम जोड़ें, ताकि प्रत्येक कुआं में अंतिम मात्रा फिर से 2 मिलीलीटर है ।
  17. सभी कुओं में कोशिका वृद्धि के लिए कल्चरल प्लेटों की जांच नियमित रूप से करें ।
    नोट: मध्यम से पीले रंग में बदलाव से बढ़ती कोशिकाओं की पहचान में मदद मिल सकती है; हालांकि, शुरुआत में मध्यम ही G418 की वजह से पीला हो जाएगा । पॉजिटिव वेल्स (बढ़ती कोशिकाओं के साथ कुओं) की पहचान करें । इन कुओं G418 प्रतिरोधी रहे है और इसलिए फ्यूजन प्रोटीन व्यक्त की उंमीद कर रहे हैं । इस प्रक्रिया को आमतौर पर लेता है ~ 3 सप्ताह ।

3. सकारात्मक कुओं में कोशिकाओं में Transfected रिसेप्टर की अभिव्यक्ति का सत्यापन.

  1. transfected था जो रिसेप्टर के खिलाफ एक विशिष्ट एंटीबॉडी के साथ transfected BW कोशिकाओं दाग.
  2. नियंत्रण कक्षों (untransfected BW कक्षों) की अभिव्यक्ति के लिए प्रवाह cytometry द्वारा रिसेप्टर की अभिव्यक्ति स्तर की तुलना करें ।
  3. एक या एक से अधिक कुओं के सत्यापन के बाद, प्रयोगात्मक प्रयोजनों के लिए तुरंत कोशिकाओं का उपयोग, संस्कृति में वृद्धि, या भविष्य अनुप्रयोगों के लिए फ्रीज ।
  4. एक नया प्रयोग करने से पहले transfected रिसेप्टर की अभिव्यक्ति की जाँच करें. विकास के कुछ हफ्तों के बाद, एक स्थिर रिसेप्टर अभिव्यक्ति के साथ G418 के साथ कोशिकाओं, G418 संस्कृति माध्यम से लोप किया जा सकता है.

4. लक्ष्य के साथ Transfected BW कोशिकाओं की मशीन

नोट: पहली बार के लिए transfected BW कोशिकाओं का उपयोग करते समय, यह उन्हें लक्ष्य पर परीक्षण करने के लिए बेहतर है कि ब्याज की रिसेप्टर या प्लेट पर एक ज्ञात ligand व्यक्त एंटीबॉडी विशेष रूप से ब्याज की रिसेप्टर के खिलाफ निर्देशित (पार से जोड़ने प्रयोगों नीचे देखें, धारा 4.2.1.3) ।

  1. अधिमानतः, (उदाहरण के लिए, एक नया 10 सेमी संस्कृति की थाली में संस्कृति में 2 मिलीलीटर के लिए पूर्ण मध्यम के 10 मिलीलीटर जोड़कर) प्रयोग करने से पहले BW कोशिकाओं 24 ज विभाजित करें ।
  2. अपने लक्ष्य के साथ transfected BW कोशिकाओं की मशीन । किसी खाली वेक्टर (या पैतृक BW कक्षों) को अभिव्यक्त करने वाले नियंत्रण BW कक्षों पर एक साथ प्रयोग करें । 96F प्लेट्स (लेकिन 96U प्लेट्स भी इस्तेमाल किया जा सकता है) बेहतर कर रहे हैं । तपसिल में प्रयोग करते हैं । पूर्ण माध्यम में सभी कोशिकाओं को निलंबित ।
    1. लक्ष्य तैयार करें । लक्ष्य के प्रकार के उद्देश्य के एक समारोह के रूप में बदलता है, और कोशिकाओं, कोशिकाओं है कि पूर्व एंटीबॉडी के साथ किया गया है, या एंटीबॉडी अकेले हो सकता है । यह प्रणाली भी5लक्ष्य के रूप में बैक्टीरिया के साथ प्रयोग किया गया है ।
      1. यदि लक्ष्य कोशिकाओं विभाजित कर रहे है (यानी, सेल लाइनों), विकीर्ण उंहें ६,००० रेड पर परख से पहले । एक ९६ प्लेट (१०० µ एल की मात्रा में) के एक एकल कुआं में लक्ष्य कोशिकाओं के ५०,००० प्लेस ।
      2. एंटीबॉडी और BW कोशिकाओं है कि मानव FcγRs एक्सप्रेस के साथ प्रयोग के लिए, एक ९६ अच्छी तरह से थाली में बर्फ पर एक एंटीबॉडी के साथ लक्ष्य कोशिकाओं गर्मी (उदाहरण के लिए, ५० लक्ष्य कोशिकाओं के µ एल और µ के ५० एंटीबॉडी एल; अलग एंटीबॉडी खुराक परीक्षण किया जा सकता है).
      3. यदि लक्ष्य के रूप में अकेले एंटीबॉडी का उपयोग (पार से जोड़ने प्रयोग), वे थाली बाध्य किया जाना चाहिए । इस प्रयोजन के लिए, पहले एक पूर्ण माध्यम में एंटीबॉडी एक 96F प्लेट में 1-2 के लिए ३७ डिग्री सेल्सियस और 5% CO2 (एक ठेठ प्रारंभिक खुराक ५० μL में एक विशिष्ट एंटीबॉडी के ०.५ μg है) । थाली धो असीम एंटीबॉडी को दूर करने के लिए ।
        नोट: इस मामले में, एक 96F प्लेट एंटीबॉडी की थाली है, जो transfected BW कोशिकाओं के अलावा transfected रिसेप्टर के सक्रियण के लिए नेतृत्व करेंगे के लिए बाध्यकारी सक्षम हो जाएगा ।
    2. BW कोशिकाओं (प्रभाव कोशिकाओं) जोड़ें । ५०,००० BW कक्षों को ९६ प्लेट (१०० µ l की मात्रा में) के एकल कुआं में रखें ।
    3. प्रत्येक अच्छी तरह से २०० µ एल में मात्रा यदि आवश्यक हो तो पूरा करें ।
    4. ३७ ° c और 5% सह2 पर प्लेटें ४८ ज के लिए मशीन (इस समय की अवधि नपेed किया जा सकता है) ।
  3. ४८ ज के बाद, पर प्लेटें फ्रीज-20 ° c और गल एलिसा से पहले, या एलिसा के लिए तुरंत उपयोग (अगले कदम देखें) ।

5. एलिसा

  1. कोट एक एंटी-माउस आईएल-2 एंटीबॉडी (विरोधी लाख-2) के साथ एक एलिसा थाली । जगह विरोधी के ०.०५ µ g--2 ५० µ एल की एक मात्रा में 1 1x पंजाबियों के प्रति अच्छी तरह से । विरोधी के साथ लेपित एलिसा थाली-मिल-4 ° c रात भर में 2 एंटीबॉडी या ३७ डिग्री सेल्सियस पर 2 एच के लिए मशीन ।
    नोट: एलिसा सीधे प्रदर्शन के लिए मशीन कदम के बाद, एलिसा प्लेट BW कोशिकाओं की गर्मी की अवधि के अंत से पहले 24 ज लेपित किया जाना चाहिए ।
  2. एलिसा थाली में तरल पदार्थ त्यागें और एक अवरुद्ध समाधान जोड़ने (२०० µ एल प्रति अच्छी तरह से) जो 1x पंजाबियों और 1% गोजातीय सीरम एल्ब्युमिन (BSA) से बना है । कमरे के तापमान पर 2 घंटे के लिए एलिसा प्लेट की मशीन ।
  3. एलिसा थाली धो ०.०५% पंजाबियों के बीच समाधान के साथ तीन बार (यानी, ०.५ के बीच की मिलीलीटर-20 1x पंजाबियों के 1 लीटर में) ।
  4. ९६ प्लेट जो BW कोशिकाओं है कि उनके लक्ष्य (४.३) के साथ मशीन थे ले लो । यदि प्लेट जमी थी, पूरी तरह से गल यह (जैसे, ३७ डिग्री सेल्सियस पर कम गर्मी से) । ९६ प्लेट केंद्रापसारक (5 मिनट, ५१५ एक्स जी) और ध्यान से एक अच्छी तरह से पूर्व में supernatant के १०० µ एल स्थानांतरण-लेपित और अवरुद्ध एलिसा प्लेट ।
    नोट: supernatant कोशिकाओं को लेने से बचने के लिए एक अच्छी तरह से पक्षों से एकत्र किया जाना चाहिए ।
  5. यदि वांछित, लेपित एलिसा प्लेट की खाली पंक्तियों में से एक को परिभाषित सांद्रता के साथ रिकॉमबिनेंट मिल-2 जोड़ने के लिए मिल-2 के एक मानक वक्र उत्पंन करते हैं । उदाहरण के लिए, एक मिल-2 २,५०० स्नातकोत्तर के एकाग्रता से शुरू/एमएल और फिर प्रत्येक बाद में अच्छी तरह से ५०% की कमी; मिल-2 पिछले अच्छी तरह से जोड़ नहीं है ।
  6. 4 ° c रात भर में एलिसा प्लेट या ३७ डिग्री सेल्सियस पर 2 एच के लिए मशीन ।
  7. एलिसा प्लेट पंजाब के बीच चार बार धो लो ।
  8. एलिसा प्लेट के लिए बायोटिन विरोधी माउस आईएल-2 जोड़ें । 1% BSA के साथ 1x पंजाबियों के 1 मिलीलीटर में 1 µ g एंटीबॉडी के एक एकाग्रता का प्रयोग करें और अच्छी तरह से प्रति १०० µ एल में विभाजित ।
  9. 1 एच के लिए कमरे के तापमान पर मशीन ।
  10. एलिसा थाली धो पंजाब के बीच छह बार ।
  11. जोड एचआरपी संयुग्मित streptavidin. 1% BSA के साथ PBSX1 के 1 मिलीलीटर में १ µ l streptavidin की एकाग्रता का प्रयोग करें और इसे अच्छी तरह से प्रति १०० µ l में बांटें ।
  12. 30 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर मशीन ।
  13. एलिसा थाली धो पंजाब के बीच छह बार ।
  14. TMB सब्सट्रेट समाधान के प्रति अच्छी तरह से १०० µ एल जोड़ें । इस चरण को पूरा करने के लिए समय lags के कारण कुओं के बीच मतभेदों को कम करने के लिए जब TMB जोड़ने ।
  15. ६५० एनएम में एक एलिसा प्लेट रीडर के साथ एलिसा थाली पढ़ें (पढ़ने अगर संकेत कमजोर है दोहराया जा सकता है) ।

Representative Results

चित्रा 3 एक BW रिपोर्टर प्रणाली के साथ एक प्रयोग के परिणाम दिखाता है । इस प्रयोग में, CLL कोशिकाओं को पूर्व अलग विरोधी CD20 एंटीबॉडी (rituximab और obinutuzumab) और फिर सह transfected BW कोशिकाओं जो CD16a-CD3ζ एक्सप्रेस के साथ-मशीन थे । हमारे अध्ययन9में इसी तरह के प्रयोगों का आयोजन किया गया । 3 ए एक कच्ची एलिसा थाली की एक छवि प्रस्तुत करता है जहां रंग की तीव्रता मिल के एक एकाग्रता-2 से मेल खाती है । प्रयोग तपसिल में किया गया । इस प्रयोग में कई नियंत्रण शामिल हैं: CLL कोशिकाओं माता पिता untransfected BW कोशिकाओं (ऊपरी पंक्ति) और CLL कोशिकाओं BW कोशिकाओं जो CD16a एक्सप्रेस-CD3ζ लेकिन एक एंटीबॉडी के साथ या एक नियंत्रण एंटीबॉडी (बाईं तरफ दूसरी पंक्ति में छह कुओं के साथ) के साथ मशीन के साथ मशीन . BW कोशिकाओं है कि CLL कोशिकाओं है कि पूर्व विरोधी CD20 एंटीबॉडी के साथ थे CD16 व्यक्त की मशीन की एक महत्वपूर्ण स्राव मिल-2 के नियंत्रण कुओं के मिल-2 स्तर की तुलना में प्रेरित किया । महत्वपूर्ण बात, विरोधी CD20 obinutuzumab के साथ CLL कोशिकाओं की पूर्व मशीन सक्रिय CD16 अधिक दृढ़ता से rituximab, एक ज्ञात खोज जो हमारी प्रणाली द्वारा recapitulated था । अंतिम पंक्ति रिकॉमबिनेंट मिल-2 के पूर्व परिभाषित सांद्रता (कोशिकाओं के अलावा बिना) उतरते दिखाता है । सही अच्छी तरह से अंतिम पंक्ति में मिल-2 नहीं है और पृष्ठभूमि पढ़ने, जो नियंत्रण कुओं के समान प्रतीत होता है का प्रतिनिधित्व करता है । चित्र 3 बी एलिसा थाली के परिणामों के ठहराव प्रस्तुत चित्रएक में दिखाया गया है । ऑप्टिकल घनत्व (आयुध डिपो) के स्तर को मिल-2 रिकॉमबिनेंट मिल-2 के साथ मानक वक्र के आधार पर सांद्रता में परिवर्तित किया गया । चित्रा 3 सी एक खुराक प्रतिक्रिया प्रयोग जहां एंटीबॉडी की अलग खुराक पूर्व CLL कोशिकाओं के साथ मशीन और फिर CD16 व्यक्त BW कोशिकाओं के साथ मशीन थे प्रस्तुत करता है ।

Figure 1
चित्रा 1: BW रिपोर्टर प्रणाली के योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व । BW5147 कोशिकाओं छुरा transfected माउस cytoplasmic श्रृंखला (CD3ζ chimeric-recptor) के transmembrane और CD3ζ डोमेन से जुड़े रिसेप्टर्स के extracellular हिस्से के साथ कर रहे हैं । एक विशिष्ट रिसेप्टर के सक्रियकरण-CD3ζ-2 के एक स्राव में एक ligand परिणामों से एलिसा द्वारा पता लगाया जा सकता है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्रा 2: chimeric रिसेप्टर की संरचना-CD3ζ और पीसीआर प्राइमरों के डिजाइन । (क) एक extracellular रिसेप्टर के सामांय संरचना transmembrane और माउस CD3ζ के intracellular डोमेन से जुड़े । (ख) रिसेप्टर के extracellular डोमेन एक ' 3 प्राइमर जो भी CD3ζ के न्यूक्लियोटाइड शामिल के साथ परिलक्षित किया गया । (ग) CD3ζ के intracellular और transmembrane डोमेन एक 5 ' प्राइमर है कि भी रिसेप्टर न्यूक्लियोटाइड शामिल के साथ परिलक्षित किया गया । (घ) अंतिम पीसीआर प्रतिक्रिया में, दोनों खंडों, जिसमें अतिव्यापी दृश्यों है, डीएनए टेंपलेट के रूप में इस्तेमाल किया गया । सभी आंकड़ा पैनलों में, विभिंन प्रोटीन डोमेन रंग कोडित रहे है और नीले आयतों (CD3ζ अनुक्रम) और लाल आयतों (रिसेप्टर अनुक्रम) में बॉक्स्ड । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्रा 3: BW रिपोर्टर प्रणाली के अंतिम उत्पाद का चित्रण । (A, B, C) CLL कोशिकाओं के साथ या दो विरोधी CD20 एंटीबॉडी (rituximab और obinutuzumab) या एक नियंत्रण एंटीबॉडी के बिना पूर्व-मशीन थे । बाद में, एंटीबॉडी-बाउंड कोशिकाओं पैतृक BW कोशिकाओं या BW कोशिकाओं जो CD16a-CD3ζ एक्सप्रेस के साथ मशीन थे । supernatant में मिल-2 का स्तर एलिसा द्वारा निर्धारित किया गया था । (क) एक कच्ची एलिसा प्लेट की एक छवि । रंग तीव्रता supernatant में मिल-2 की एकाग्रता को इंगित करता है । प्रयोग तपसिल में किया गया । निचली पंक्ति रिकॉमबिनेंट मिल-2 जो एक ही थाली में विश्लेषण किया गया की सांद्रता कम करने में एलिसा readout से पता चलता है । (ख) (क) में दिखाई गई एलिसा पाठन की ठहराव. मिल-2 के स्तर मिल-2 के एक मानक वक्र का उपयोग कर गणना की गई । (ग) एक खुराक प्रतिक्रिया प्रयोग जहां एंटीबॉडी के विभिंन खुराकों थे पूर्व CLL कोशिकाओं के साथ मशीन और फिर CD16a-CD3ζ व्यक्त BW कोशिकाओं के साथ मशीन । , पृ < ०.००१; छात्र का t टेस् ट (B) या मल्टीपल तुलना (C) के साथ ANOVA । (ग) जो काफी अलग नहीं था में केवल तुलना rituximab और नियंत्रण के लिए था पहले एकाग्रता में अटल बिहारी (०.०१ µ g/एमएल) । त्रुटि पट्टियां triplicates के मानक विचलन का प्रतिनिधित्व करती हैं । इसी तरह के प्रयोग हमारे हाल के9अध्ययन में से एक के भाग के रूप में आयोजित किए गए । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Discussion

यहां हम एक रिपोर्टर प्रणाली के लिए रिसेप्टर ligand बातचीत की जांच पैदा करने के लिए एक प्रोटोकॉल मौजूद (1में इस प्रोटोकॉल के एक संक्षिप्त रूप देखें) । प्रोटोकॉल तीन मुख्य भागों से बना है: एक chimeric प्रोटीन की क्लोनिंग, जो CD3ζ के intracellular डोमेन से जुड़े एक विशिष्ट रिसेप्टर के extracellular डोमेन भी शामिल है, एक अभिकर्मक के प्लाज्मिड कि BW कोशिकाओं को फ्यूजन प्रोटीन व्यक्त (उदा , electroporation द्वारा), और एलिसा द्वारा माउस इल-2 का मात्रात्मक पता लगाना । इन भागों में से प्रत्येक के अंतिम उत्पाद स्वतंत्र रूप से सत्यापित किया जाना चाहिए: क्लोनिंग की प्रक्रिया के लक्ष्य प्लाज्मिड में फ्यूजन प्रोटीन का पूरा अनुक्रमण द्वारा सत्यापित किया जाना चाहिए, BW कोशिकाओं के अभिकर्मक की अभिव्यक्ति की जांच करके सत्यापित किया जाना चाहिए BW कोशिकाओं में रुचि के रिसेप्टर (जैसे, प्रवाह cytometry द्वारा), और एलिसा प्रक्रिया सामांय सकारात्मक नियंत्रण द्वारा सत्यापित किया जाना चाहिए (जैसे, रिकॉमबिनेंट मिल-2) के रूप में अच्छी तरह के रूप में transfected BW कोशिकाओं के लिए विशिष्ट नियंत्रण के साथ; यानी, लक्ष्य है कि ब्याज की रिसेप्टर की एक ज्ञात ligand व्यक्त (जैसे, कोशिकाओं है कि एक्सप्रेस CD48 BW कोशिकाओं है कि एक्सप्रेस NK सेल रिसेप्टर 2B4 के लिए एक सकारात्मक नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है) । उदाहरण के लिए, क्लोनिंग प्रक्रिया सफल हो सकती है, लेकिन फ्यूजन प्रोटीन BW कोशिकाओं द्वारा व्यक्त नहीं किया जाता है । इस मामले में, electroporation दोहराया जाना चाहिए । वैकल्पिक रूप से, यदि एलिसा प्लेट की पृष्ठभूमि के स्तर के ऊपर कोई संकेत नहीं है (विशेष रूप से सकारात्मक नियंत्रण के लिए) transfected BW कोशिकाओं रिसेप्टर को व्यक्त करने में विफल हो सकता है (या अभिव्यक्ति खो गया है) या एक तकनीकी समस्या के दौरान हुई हो सकती है एलिसा प्रक्रिया ।

इस प्रक्रिया के सामांय सिद्धांतों के संरक्षण, जबकि कई संशोधनों को इस प्रोटोकॉल के लिए किया जा सकता है । इन संशोधनों में शामिल है वेक्टर फ्यूजन प्रोटीन व्यक्त करने के लिए, transfecting के लिए विधि BW कोशिकाओं और विशिष्ट इस तरह के लक्ष्य के प्रकार के रूप में और एलिसा मशीन से संबंधित मानकों के लिए प्लाज्मिड (जैसे, कोशिकाओं, एंटीबॉडी, आदि) , लक्ष्य कोशिकाओं की संख्या या एंटीबॉडी एकाग्रता अगर प्रासंगिक (हम अच्छी तरह से प्रति ५०,००० कोशिकाओं का उपयोग करें और ०.५ µ जी की एक एंटीबॉडी शुरू खुराक/अच्छी तरह से), मशीन समय (हम ४८ एच की एक मशीन समय का उपयोग करें) और supernatant मात्रा जो एलिसा थाली को हस्तांतरित कर रहा है ।

यह विधि संवेदनशील है, विशिष्ट है और आसानी से quantified जा सकता है । यह विशिष्ट रिसेप्टर्स के लिए लाइगैंडों की उपस्थिति के लिए स्क्रीनिंग के लिए आदर्श है (खासकर अगर ligand ही मांयता प्राप्त नहीं किया गया है) । transfected BW कोशिकाओं है कि एक विशिष्ट रिसेप्टर एक्सप्रेस तैयार करने के बाद, इन कोशिकाओं को जमे हुए और उपयोग किया जा सकता है जब अतिरिक्त प्रयोगों के लिए की जरूरत. हम और दूसरों को इस प्रणाली का इस्तेमाल किया है सफलतापूर्वक पिछले अध्ययनों में रिसेप्टर ligand बातचीत का पता लगाने के लिए (उदाहरण के लिए2,3,5,12,13,14 ,15,16) और इस प्रणाली द्वारा प्राप्त परिणामों के अंय तकनीकों द्वारा सत्यापित किया गया है । इस विधि भी एंटीबॉडी द्वारा विभिन्न मानव FcγR रिसेप्टर्स के सक्रियकरण का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, के रूप में विरोधी वायरल एंटीबॉडी के लिए किया गया है सीरम6,7,8 या CD20 के खिलाफ मोनोक्लोनल एंटीबॉडी के साथ 9.

चूंकि यह एक रिपोर्टर प्रणाली है जिसमें केवल रिसेप्टर के extracellular खंड व्यक्त किया जाता है, इस प्रणाली द्वारा प्राप्त निष्कर्षों प्राकृतिक साथ cytotoxicity परख के रूप में अंतर्जात रिसेप्टर, के साथ अतिरिक्त प्रयोगों द्वारा पूरित किया जाना चाहिए खूनी (NK) कोशिकाओं NK सेल रिसेप्टर्स के साथ बातचीत का अध्ययन करने के लिए. इसके अलावा, कुछ ligand/रिसेप्टर बातचीत एक लाख-2 रिपोर्टर प्रणाली द्वारा स्राव में परिणाम नहीं हो सकता है, और इसलिए अनदेखी की जा सकती है । इसके अलावा, के रूप में किसी भी प्रयोगात्मक सेटअप में, परिणाम के रूप में ऊपर वर्णित विभिंन मापदंडों के लिए सत्यापित किया जाना चाहिए । यह मामलों में विशेष रूप से महत्वपूर्ण है जहां दो शर्तों की तुलना की आवश्यकता है (जैसे, अलग एंटीबॉडी द्वारा ही एफसी रिसेप्टर के सक्रियकरण). यह भी सत्यापित करने के लिए महत्वपूर्ण है कि एक विशिष्ट ligand-रिसेप्टर बातचीत की संवेदनशीलता प्रणाली के रेखीय रेंज के भीतर है । अंयथा यह संतृप्ति मूल्यों के लिए नेतृत्व कर सकते है जो शर्तों के पार एक वैध तुलना बाधा सकता है । यह एक लाख का उपयोग करके प्राप्त किया जा सकता है-2 मानक वक्र के रूप में अच्छी तरह के रूप में एक खुराक उत्पादन द्वारा परीक्षण ligand के साथ प्रतिक्रिया वक्र (मूल्यों संतृप्ति के मामले में, प्रयोगात्मक मापदंडों संशोधित किया जाना चाहिए; उदाहरणके लिए, supernatant की एक छोटी मात्रा एलिसा द्वारा विश्लेषण किया जाना चाहिए) । इस प्रणाली की एक और संभव सीमा मिल-2 के अंतर्जात स्राव के साथ लक्ष्य कोशिकाओं का उपयोग है (जैसे, माउस टी कोशिकाओं) जो BW कोशिकाओं के आईएल-2 स्राव मुखौटा होगा । इन अत्यधिक असामांय घटनाओं जो माउस कोशिकाओं तक सीमित है पर काबू पाने के लिए, इस रिपोर्टर प्रणाली एक अलग रिपोर्टर (जैसे, GFP) जो लक्षित कोशिकाओं द्वारा व्यक्त नहीं है का उपयोग करके सुधारा जा सकता है ।

Disclosures

लेखक कोई प्रतिस्पर्धी वित्तीय हितों की घोषणा ।

Acknowledgments

लेखक भाषा संपादन के लिए एस्तेर गायक धंयवाद । यूरोपीय संघ के सातवें फ्रेमवर्क कार्यक्रम (FP/2007-2013)/ईआरसी अनुदान समझौते संख्या ३२०४७३-BacNK के तहत यूरोपीय अनुसंधान परिषद् द्वारा इस अध्ययन का समर्थन किया गया । इसके अलावा समर्थन योजना और बजट समिति और इसराइल विज्ञान फाउंडेशन के i-कोर कार्यक्रम द्वारा प्रदान की गई थी और जीन विनियमन में क्रोमेटिन और आरएनए पर मैं कोर द्वारा, GIF फाउंडेशन, लुईस परिवार फाउंडेशन, ICRF प्रोफेसरों अनुदान, Helmholtz इज़राइल अनुदान और Rosetrees ट्रस्ट (सभी ओएम के लिए) । यह अध्ययन भी इसराइल विज्ञान फाउंडेशन (अनुदान 502/15), Kass चिकित्सा अनुसंधान पुरस्कार और रुधिर और चढ़ाए चिकित्सा के इसराइल सोसायटी से एक अनुसंधान अनुदान (एस. ई.) द्वारा समर्थित किया गया था । ओ. एम आणविक इम्यूनोलॉजी के एक क्राउन प्रोफेसर है ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
AccuPrep, Plasmid Mini Extraction Kit Bioneer K-3030
Anti-mouse IL-2 BioLegend 503702
Biotin anti-mouse IL-2 BioLegend 503804
ELISA plates De-groot 60-655061
Fetal Bovine Serum Sigma F7524-500ml
G418 Mercury MBS3458105GM
Gene Pulser II Bio-Rad 165-2105, 165-2106, 165-2107, 165-2108, 165-2109, 165-2110
L-Glutamine Biological industry 03-020-1B
MEM Non-Essential Amino Acids Solution Biological industry 01-340-1B
Penicillin-Streptomycin Solution Biological industry 03-031-1B
peroxidase streptavidin Jackson ImmunoResearch 016-030-084
PureLink HiPure Plasmid Filter Maxiprep Kit ThermoFisher Scientific K210016
RPMI-1640 Medium Biological industry 30-2001
Sodium Pyruvate Biological industry 03-042-1B
TMB SouthernBiothech 0410-01

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References

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जीवविज्ञान १४३ अंक BW कोशिकाओं रिसेप्टर ligand रिपोर्टर आईएल-2 एफसी रिसेप्टर्स NK कोशिकाओं
एक BW रिपोर्टर प्रणाली के अध्ययन के लिए रिसेप्टर Ligand बातचीत
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Elias, S., Kahlon, S., Duev-Cohen, A., Mandelboim, O. A BW Reporter System for Studying Receptor-Ligand Interactions. J. Vis. Exp. (143), e58685, doi:10.3791/58685 (2019).

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