Summary
이 프로토콜을 식별 하 고 계량 수용 체 ligand 상호 작용 하는 데 사용할 수 있는 기자 시스템을 설정 하는 방법을 설명 합니다.
Abstract
수용 체와 ligands 간의 상호 작용 기본적인 생물 학적 프로세스를 구성합니다. 그러나, 네이티브 수용 체를 표현 하는 세포와 실험을 직접 하 고는 ligand 도전 이후 특정 수용 체의 ligand 수 있습니다 알 수 없는 네이티브 ligand와 실험 절차는 기술적으로 복잡 한 될 수 있습니다. 이러한 장애를 해결 하기 위해 우리는 기자 감지 하는 시스템 바인딩 및 특정 수용 체의 활성화의 리간드에 의해 설명 합니다. 이 기자 시스템에서 특정 수용 체의 세포 외 도메인 CD3ζ 활용 하 고이 공상 단백질 다음 마우스 BW 셀에 표시 됩니다. 이러한 transfected BW 셀 다른 대상 (예를 들어, 셀 또는 항 체) 하 고 다음 알을 품 수 있습니다. Transfected 수용 체의 활성화 효소 연결 된 immunosorbent 분석 결과 (ELISA)에 의해 검출 될 수 있다 마우스 interleukin-2 (밀-2)의 분 비에 지도 한다. 이 기자 시스템 과민 하 고 특정 한 수용 체의 이점이 있다. 또한, 특정 수용 체의 활성화 수준을 쉽게 측정할 수 있다 그리고 수용 체의 리간드가 알려진 없는 경우에도 사용할 수 있습니다. 이 시스템은 우리의 연구 특성 수용 체 ligand 상호 작용의 대부분에 성공적으로 구현 되었습니다. 우리는 최근 임상 사용에서 다른 단일 클로 널 항-CD20 항 체에 의해 인간 Fcγ 수용 체 (FcγRs)의 활성화를 공부 하는이 시스템을 채용 했습니다.
Introduction
BW 기자 시스템 수용 체 ligand 상호 작용1을 공부 하는 기술 이다. 이 시스템은 특정 수용 체의 ligand 알려진 또는 내 인 성 ligand와 실험은 기술적으로 어려운 때 특히 유리 하다. 그것은 또한 공부 인간의 FcγRs 단일 클론 항 체의 바인딩을 사용할 수 있습니다. 메서드를 사용 하면 마우스 BW 셀에 공상 단백질 표현 기반으로 합니다. 이 공상 단백질 마우스 ζ 체인의 막 횡단 및 세포내 도메인 융합의 수용 체의 세포 외 도메인 구성 됩니다. 수용 체의 적절 한 ligands의 바인딩은 감지할 수 있습니다 쉽게 ELISA, 그림 1에서 볼 수 있듯이 마우스 일리노이-2의 분 비를 리드. 이 메서드는와 관련 된 개별 수용 체, 간편한 작동, 민감하고 높은 재현성. 그것은 따라서 수용 체 ligand 상호 작용을 공부에 대 한 추가 도구를 보완 하는 수 있습니다. 예를 들어 사용할 수 있습니다 (경우에 자체 ligand 식별 되지 않은) 특정 수용 체에 ligand의 존재에 대 한 여러 세포 라인 화면 또는 단일 클론 항 체 또는 인간 혈 청 항 바이러스를 포함 하 여 인간 FcγRs의 활성화를 감지 항 체입니다. 기본 면역 세포 생 FcγRs 익스프레스, 하지만 그들은 일반적으로 처리 하 고 일반적으로 여러 Fc 수용 체를 표현 하기 어려운입니다.
우리는 사용이 시스템 성공적으로 우리의 연구의 많은 수용 체 ligand 상호 작용의 특성. 이 NK 세포 수용 체 NKp462, 인간 ligands 및 마우스 TIGIT3,4, nectin-2 PVR을 식별의 ligand haemagglutinin 식별을 포함 하 고 fusobacterium nucleatum 보여주는 박테리아 바인딩합니다 및 인간의 TIGIT5를 활성화합니다. 또한, Fc 수용 체를 표현 하는 BW 셀 환자 세라6,,78안티 바이러스 항 체를 검출 하기 위하여 성공적으로 사용 되었습니다. 특히, 우리는 최근에 만성 림프모구 백혈병 (CLL)9의 처리에 사용 하는 안티-CD20 항 체의 차동 FcR 활성화를 감지 하는 인간의 FcγRs를 표현 하는 BW 셀 설립. 중요 한 것은, BW 기자 시스템의 결과 보완 실험에 유효성이 검증 되었습니다.
Protocol
1. 공상 건설을 표현 하는 플라스 미드의 생성
참고: 목표 마우스 CD3ζ 체인 (그림 2A)의 막 횡단 및 세포내 도메인 융합의 수용 체의 세포 외 도메인을 표현 하는 플라스 미드를 생성 하는.
- 신호 펩 티 드를 포함 하 여 관심의 수용 체의 세포 외 도메인의 시퀀스를 검색 합니다. (예를 들어, cDNA 또는 한 플라스 미드)이 수용이 체를 표현 하기 위해 예상 되는 DNA 자료를 얻을.
- DNA 자료를 표현 하는 막 횡단 및 마우스 CD3ζ 체인의 세포내 도메인 (예., cDNA 또는 한 플라스 미드).
- 그림 2A에 표시 된 일반적인 구조에 따라 융해 단백질의 시퀀스를 디자인 합니다. 전체 시퀀스 프레임 내에 동일한 codon 읽는 다는 것을 확인 하십시오. 이 순서는 적절 한 뇌관을 디자인 하 고 최종 제품을 확인 하는 데 사용 됩니다.
- 융해 단백질의 파편의 각각을 별도로 증폭 하는 두 개의 PCR 반응 디자인 (그림 2B, 2c)10.
참고: PCR 반응에 대 한 특정 조건 (예., 신장 시간 및 어 닐 링 온도)는 특정 수용 체를 위한 뇌관의 성격에 따라 달라 집니다.- 수용 체의 extracellular 세그먼트를 증폭.
- 수용 체, Kozak 합의 시퀀스, 그리고 적절 한 제한 사이트 (그림 2B)의 신호 펩 티 드의 부분을 포함 5 개의 ' 뇌관 디자인.
- Flanks 융합 단백질 (그림 2B)의 두 부분 3' 뇌관 디자인. 예를 들어 초기 디자인에 대 한이 3' 뇌관 수용 체의 extracellular 세그먼트와 CD3ζ 세그먼트의 처음 9 기본적인 쌍의 마지막 20의 기본적인 쌍을 포함할 수 있습니다.
참고: 거기 아무 필요도 금지 사이트를 추가 3' 뇌관이이 뇌관 융합된 시퀀스를 생성 하는 데 사용 됩니다 및 결 찰에 대 한 사용 되지 않습니다.
- CD3ζ 세그먼트를 증폭.
- 5' 뇌관 flanks 융합 단백질 (그림 2C)의 두 부분을 디자인 합니다. 예를 들어 초기 디자인에 대 한 5 개의 ' 뇌관 수용 체의 extracellular 세그먼트와 CD3ζ 세그먼트의 처음 20 기본적인 쌍의 마지막 9 기본적인 쌍을 포함할 수 있습니다.
참고:이 입문서 융합된 시퀀스를 생성 하는 데 사용 됩니다 고 결 찰을 사용 하지 않는 5 개의 ' 뇌관 제한 사이트를 추가할 필요가 없습니다 있다. - CD3ζ 시퀀스를 적절 한 제한 사이트 (그림 2C)의 끝을 포함 하는 3' 뇌관 디자인.
- 5' 뇌관 flanks 융합 단백질 (그림 2C)의 두 부분을 디자인 합니다. 예를 들어 초기 디자인에 대 한 5 개의 ' 뇌관 수용 체의 extracellular 세그먼트와 CD3ζ 세그먼트의 처음 20 기본적인 쌍의 마지막 9 기본적인 쌍을 포함할 수 있습니다.
- 어 닐 링 온도 각 쌍 (두 부분 융해 단백질의 시퀀스를 포함, 뇌관만 각 반응에서 시퀀스의 부분 anneals 참고)에 비슷한이 두 반응의 각 뇌관 시퀀스를 수정 합니다.
- 수용 체의 extracellular 세그먼트를 증폭.
- 처음 두 반응의 PCR 제품의 혼합물과 세포 외 수용 체 세그먼트 (단계 1.4.1.1)의 5 개의 ' 뇌관은 3' CD3ζ 세그먼트 (단계 1.4.2.2)의 (그림 2D)10 DNA 템플렛으로 사용 되는 추가 PCR을 수행 . 이 반응 최종 융합된 시퀀스를 생성 해야 합니다.
- 복제에 대 한 평소와 같이 진행 합니다.
- 벡터 (대상 벡터는 일반적으로 G418 및 암 피 실린 저항을 표현 하는 pcDNA3)을 삭감 대상에 최종 PCR 제품 선
- 유능한 박테리아11에 합자 벡터 변환.
- 얼음에 유능한 박테리아의 50 µ L 해빙
- 박테리아에 합자 벡터를 추가 하 고 20 분 동안 얼음에 품 어.
- 42 ° C 45에서 품 어 s.
- 항생제 없이 파운드의 200 µ L를 추가 합니다.
- 연속 떨고와 37 ° C에서 1 시간에 품 어.
- 적절 한 항생제 (예, 0.1 mg/mL의 최종 농도와 암 피 실린 솔루션)와 파운드 플레이트에 씨.
- 수집 하 고 (15 mL 튜브)에 파운드의 5 mL에 여러 가지 세균성 식민지 성장.
- 다음 날, 미니 준비 키트와 플라스 미드 추출 합니다.
- 제한 효소와 유전자 삽입을 분석 합니다.
- 시퀀싱 관련 식민지 하 고 시퀀스와 독서 프레임 올바른지 확인 (같이 1.3 단계에서에서).
- 유능한 박테리아11로 확인 된 플라스 미드를 변환.
- 20 µ L 얼음에 유능한 박테리아의 해빙
- 박테리아에 플라스 미드의 1 µ L을 추가 하 고 20 분 동안 얼음에 품 어.
- 42 ° C 45에서 품 어 s.
- 항생제 없이 파운드의 200 µ L를 추가 합니다.
- 연속 떨고와 37 ° C에서 1 시간에 품 어.
- (예, 0.1 mg/mL의 최종 농도와 암 피 실린 솔루션) 적절 한 항생제로 세균성 성장 플레이트에 씨.
- 다음 날, 0.1 mg/mL 암 피 실린 (~ 250 mL)와 큰 파운드 컨테이너에 세균성 식민지 성장.
- 다음 날, 맥시 준비 키트에서 제공 하는 특정 지침에 따라 수행 합니다.
참고: electroporation 절차에 대 한 대량 플라스 미드가 아래로 필요 합니다.
2. transfection BW 셀에 공상 단백질을 표현 하는 플라스 미드의
참고: 다른 방법 transfection를 위해 채택 될 수 있다 또한 (예를들면., lentiviral 감염). Electroporation, 전에 아래와 같이 DNA의 에탄올 강수량을 수행 합니다. 다음 단계는 무 균 조건 필요합니다.
- 하루 전에, electroporation는 BW5147 셀 ("BW") 준비. 접시 10 접시 (10 cm) 100000 BW5147 셀/mL의 (즉, 10 x 106 세포의 총) 10 mL와 RPMI 10% 태아 종 아리 혈 청 (FCS), 1% 나트륨 pyruvate, 1 %L-글루타민, 1% 비 본질적인 아미노산, 1%와 보충 페니실린-스 ("완전 한 매체").
- 1.5-2 mL 튜브에 융해 단백질을 표현 하는 pcDNA3 플라스 미드의 100 µ g 놓고 그것에 pH 5.3-5.5에서 3m 나트륨 아세테이트를 추가 합니다. 나트륨 아세테이트의 볼륨 100 µ g 플라스 미드의 볼륨의 0.1 (10%)에 해당 한다; NaOH 또는 HCl를 추가 하 여 pH 미터를 가진 나트륨 아세테이트의 pH를 적정 하십시오.
- 2.2 단계 (2.5 엑스 플라스 미드 및 나트륨 아세테이트의 총 거래량)에 설명 된 대로 플라스 미드 및 나트륨 아세테이트의 혼합물에 100% 에탄올의 2.5 볼륨을 추가 합니다. 70 ° c.에서 2 h 또는-20 ° C에서 밤새 품 어
- 2.4. 24 h 후 BW 셀 도금 되었습니다, 모든 BW 셀 (~ 100 mL) 2 50 mL 튜브에 수집 합니다. 515 x g 에 5 분에 대 한 셀을 원심 및 삭제는 상쾌한.
- 다시 25 mL RPMI-단일 50 mL 튜브에서에 두 튜브에서 펠 릿을 일시 중단 합니다. 예를 들어 다시 25 mL RPMI-와 1 개의 관의 펠 릿을 일시 중지 하 고이 액체를 사용 하 여 다시 뷔 셀에서 총 펠 릿 다시 단일 튜브에 매체의 25 mL에 일시 중지 되도록 다른 50 mL 튜브에 액체를 일시 중단.
참고: 매체 이어야 한다 추가 없이 혈 청 electroporation 방해할 수도 있기 때문. - 515 x g에 5 분 동안 다시 셀 원심 다시 RPMI의 1 mL에 펠 릿을 일시 중단 하 고 얼음에 0.4 cm 베트 내용을 전송.
- 16000 x g 와 4 ° C에서 30 분 동안 에탄올 강수량 (2.3 단계)를 받았다 플라스 미드를 원심
- 70% 에탄올과 다른 20 분 16000 x g 와 (를 소금) 4 ° C에서 원심 분리기의 1 mL로 한 번 씻어.
- 모든 에탄올을 제거 하 고 약간 건조 한 펠 릿 (즉, 조직 문화 후드에서 오픈 관에서). 다시 100 µ L의 RPMI-이전 60 ° c가 열 된 펠 릿을 일시 중단
- 다시 일시 중단 된 플라스 미드 (단계 2.8)는 베트에 셀을 추가 하 고 얼음에 5 분 동안 품 어.
- Electroporate 0.23에서 셀 kV, 250 capacitation. 이 ~ 4 ms를 취해야 한다.
- 50 mL 튜브에 electroporated 세포를 전송, 515 x g. 에서 완전 한 매체 및 5 분 동안 원심 분리기의 50 mL를 추가
- 상쾌한 삭제 하 고 다시 완전 한 매체의 50 mL와 함께 셀을 일시 중단.
- 24 잘 문화 요리 (1 mL 당 50 ~ 웰 스의 총 잘) electroporated 셀 접시 하 고 37 ° C, 5% CO2 48 h에 품 어.
- 항생제로 transfected 셀을 선택 합니다. 48 h 추가 10 mg/mL G418 각 잘 보완 하는 완전 한 매체의 1 mL (이 단계에서 각 마지막 볼륨 잘 2 mL 이며 각 G418의 최종 농도 잘 5 mg/mL).
참고: 다른 항생제 내성 플라스 미드 있으면이 단계 전에 untransfected BW 세포를 죽 일 하는 데 필요한 항생제 농도 결정 합니다. - 모든 48 h 신중 하 게 우물에서 매체를 교 반 하지 않고 각의 위쪽 볼륨의 1 mL를 삭제 (BW 세포는 우물의 바닥에 있을 하는 경향이 있다). 각 잘에서 최종 볼륨은 다시 2 mL 5 mg/mL G418 각 음을 보충 하는 완전 한 매체를 추가 합니다.
- 모든 우물에서 세포 성장 위한 문화 접시를 정기적으로 검사 합니다.
참고: 노란색 매체의 색상에서 변경 수 있습니다 식별할 성장 세포; 그러나, 처음에 매체 됩니다 노란색에 G418 때문에 자체. 양수 우물 (웰 스 성장 하는 세포)를 식별 합니다. 이 우물 G418 방지 되며 따라서 융해 단백질을 표현할 것으로 예상 된다. 이 프로세스는 일반적으로 3 주 걸립니다.
3. 긍정적인 우물에서 셀에 Transfected 수용 체의 식의 확인.
- 하 페는 수용 체에 대 한 특정 항 체로 transfected BW 셀 얼룩.
- Cytometry는 제어 셀 (untransfected BW)의 표현에 의해 수용 체의 식 수준 비교.
- 확인 후 하나 이상의 우물의, 실험적인 목적을 위한 세포를 즉시 사용 하는 방법, 문화, 성장 또는 미래의 응용 프로그램에 대 한 동결.
- 새로운 실험을 수행 하기 전에 transfected 수용 체의 식을 확인 합니다. 성장, 안정 되어 있는 수용 체 식 G418 셀의 몇 주 후 G418 문화 매체에서 생략할 수 있습니다.
4. 보육 대상 Transfected BW 셀의
참고: transfected BW 셀을 사용 하 여 처음으로, 그것은 관심의 수용 체의 알려진된 리간드를 표현 하는 대상 또는 플레이트-바인딩 항 체 특히 관심 (cross-linking의 수용 체에 대 한 감독 들을 테스트 하는 것이 좋습니다. 실험; 아래 참조, 4.2.1.3 섹션).
- 가급적 이면, (예를 들어 새로운 10 cm 배양 접시에 문화에 있는 세포의 2 개 mL를 완전 한 매체의 10 mL을 추가) 하 여 BW 세포 실험 하기 전에 24 시간을 분할.
- 그들의 목표를 가진 transfected BW 세포를 품 어. 빈 벡터 (또는 부모의 BW 셀) 표현 하는 제어 BW 셀에 실험을 동시에 수행 합니다. 96F 격판덮개는 바람직 (하지만 96U 접시를 사용할 수 있습니다). 3 중에서 실험을 수행 합니다. 완전 한 매체에 있는 모든 셀을 일시 중단 합니다.
- 목표를 준비 합니다. 대상의 유형, 목표의 기능으로 변화 한다 그리고 사전에 항 체 또는 항 체 혼자 incubated 셀 수 있습니다. 이 시스템은 또한 대상5박테리아와 함께 사용 되었습니다.
- 목표 셀 (즉, 셀 라인) 분할 된다, 경우 6000 rad 분석 결과 이전에 그들을 비추는. 96 접시 (100 µ L의 볼륨)에 한 잘에 대상 셀의 장소 50000.
- 항 체 및 인간 FcγRs을 표현 하는 BW 셀 실험 품 어 96 잘 접시에 얼음에 항 체와 대상 셀에 대 한 (예를 들어, 대상 셀의 50 µ L와 항 체;의 50 µ L에 대 한 서로 다른 항 체 투여 시험 될 수 있다).
- 혼자 항 체를 사용 하 여 (실험 cross-linking) 대상으로, 그들은 플레이트-바인딩을 해야한다. 이 위해 먼저 96F 접시 1-2 h 37 ° C, 5% CO2 (전형적인 시작 복용량은 50 μ에 특정 항 체의 0.5 μ g)에 대 한 완전 한 매체에 있는 항 체에 품 어. 언바운드 항 체를 제거 하는 접시를 씻는 다.
참고:이 경우에, 96F 접시 하면 transfected 수용 체의 활성화로 이어질 것입니다 격판덮개 transfected BW 셀의 추가 후에 항 체의 바인딩이 있습니다.
- BW 세포 (effector 세포)를 추가 합니다. 96 접시 (100 µ L의 볼륨)에 한 잘에 50000 BW 셀을 배치 합니다.
- 볼륨에 필요한 경우 200 µ L 각 잘 완료.
- 37 ° C, 5% CO2 48 h (이 기간 측정 될 수 있다)에 번호판을 품 어.
- 목표를 준비 합니다. 대상의 유형, 목표의 기능으로 변화 한다 그리고 사전에 항 체 또는 항 체 혼자 incubated 셀 수 있습니다. 이 시스템은 또한 대상5박테리아와 함께 사용 되었습니다.
- 48 h 후-20 ° C와 ELISA, 전에 해 동 플레이트 고정 또는 ELISA 즉시 사용 (다음 단계 참조).
5입니다. 엘리 사
- 반대로 마우스 일리노이-2 항 체 (항 mIL-2)와 ELISA 격판덮개 코트. 잘 당 1 x PBS의 50 µ L의 볼륨에 반대로 mIL-2의 0.05 µ g를 배치 합니다. 또는 2 h 37 ° C에서 4 ° C 하룻밤에 반대로 mIL-2 항 체로 코팅된 ELISA 격판덮개를 품 어.
참고: ELISA 인큐베이션 단계 후 직접 수행, ELISA 격판덮개 한다 코팅 24 h BW 셀의 잠복기의 끝 전에. - ELISA 격판덮개에 액체를 폐기 하 고 1 x PBS와 1% 소 혈 청 알 부 민 (BSA)의 구성 되는 차단 솔루션 (잘 당 200 µ L)를 추가 합니다. 실 온에서 2 h의 ELISA 격판덮개를 품 어.
- 세 번 0.05 %PBS 트윈 솔루션 (즉, 1 x PBS의 1 리터에서 트윈-20의 0.5 mL)와 ELISA 격판덮개를 세척 하십시오.
- 그들의 목표 (4.3)와 인 큐베이 팅 된 BW 셀 96 접시를 가져가 라. 접시, 냉동 하는 경우 완전히 녹여 (예., 여 37 ° C에 외피를 짧은). 원심 96 접시 (5 분, 515 x g) 고 신중 하 게 미리 코팅 및 차단 ELISA 격판덮개에 각 잘 상쾌한의 100 µ L를 전송.
참고:는 상쾌한 셀을 복용 하지 않도록 각의 측면에서 수집 한다. - 원하는 경우, 밀-2의 표준 곡선을 생성 하기 위해 코팅된 ELISA 격판덮개의 빈 행 중 하나에 정의 된 농도와 재조합 밀-2를 추가 합니다. 예를 들어 밀-2 2500 pg/mL의 농도에서 시작 하 고에 각 후속 잘; 50% 감소 추가 하지 마십시오 밀 2 마지막 잘.
- ELISA 격판덮개 또는 2 h 37 ° C에서 4 ° C 하룻밤에 품 어.
- 4 시간 PBS 트윈와 ELISA 격판덮개를 세척 하십시오.
- ELISA 격판덮개에 biotin 반대로 마우스 일리노이-2를 추가 합니다. 1 x 1 %BSA PBS의 1 mL에 1 µ g 항 체의 농도 사용 하 고 잘 당 100 µ L를 나눕니다.
- 1 시간에 대 한 실 온에서 품 어.
- 6 번 PBS 트윈와 ELISA 격판덮개를 세척 하십시오.
- 활용 하는 HRP streptavidin을 추가 합니다. 1 %BSA PBSX1의 1 mL에 1 µ L streptavidin의 농도 사용 하 고 잘 당 100 µ L로 나눕니다.
- 30 분 동안 실 온에서 품 어.
- 6 번 PBS 트윈와 ELISA 격판덮개를 세척 하십시오.
- TMB 기판 솔루션의 당 100 µ L를 추가 합니다. 때문에 시간을 뒤져는 TMB 추가할 때 우물 사이의 차이 최소화 하기 위해 신속 하 게이 단계를 완료 합니다.
- 650에서 ELISA 플레이트 리더 ELISA 격판덮개를 읽고 nm (읽기 수 신호가 약한 경우 반복).
Representative Results
그림 3 에서는 BW 기자 시스템 실험의 결과를 보여 줍니다. 이 실험에서 CLL 세포는 미리 다른 안티-CD20 항 체 (rituximab, obinutuzumab)와 함께 알을 품 이었고 공동 인 큐베이 팅 transfected BW 셀 CD16a CD3ζ을 표현 하는. 비슷한 실험은 우리의 연구9에서 실시 되었다. 그림 3A 원시 ELISA 격판덮개 명도 밀 2의 농도에 해당 하는 곳의 이미지를 제공 합니다. 실험 3 중에서 수행 되었다. 이 실험 포함 여러 컨트롤: 보호자 untransfected BW 셀 (위쪽 행)와 CLL 세포 incubated CLL 세포 incubated BW 셀 CD16a CD3ζ을 표현 하는 하지만 항 체 없이 또는 제어 항 체 (왼쪽에서 두 번째 행에서 6 웰 스) . CD16 안티-CD20 항 체와 인 큐베이 팅 했다 미리 CLL 세포 표현 BW 세포의 외피 밀-2 제어 우물의 밀 2 레벨에 비해의 중요 한 분 비를 유도 한다. 중요 한 것은, 안티-CD20 obinutuzumab 가진 CLL 세포의 사전 보육 활성화 CD16 rituximab, 알려진 찾는 우리의 시스템에 의해 지는 보다는 더 강하게. 마지막 행 (셀의 추가) 없이 재조합 밀 2의 미리 정의 된 농도 내림차순으로 표시 됩니다. 마지막 행에서 오른쪽 잘 밀-2는 고 나타나는 컨트롤 웰 스와 비슷한 배경 독서를 나타냅니다. 그림 3B 그림 3A에서 ELISA 격판덮개의 결과의 정량화를 선물 한다. 광학 밀도 (OD) 레벨 밀 2 농도 재조합 밀-2 표준 곡선을 기반으로 변환 했다. 그림 3C 복용량 응답 실험을 항 체의 다른 복용량 했다 미리 CLL 세포와 인 큐베이 팅 하 고 다음 BW 셀 CD16 표현으로 알을 품을 선물 한다.
그림 1: BW 기자 시스템의 도식 대표. BW5147 세포는 안정적으로 마우스 CD3ζ 체인 (공상 recptor-CD3ζ)의 막 횡단 및 세포질 영역을 융합 하는 서로 다른 수용 체의 extracellular 부분을 가진 페. Ligand 결과 ELISA에 의해 검출 될 수 있다-2 밀의 분 비에 의해 특정 수용 체 CD3ζ의 활성화. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2: PCR 뇌관의 디자인과 공상 수용 체 CD3ζ의 구조. (A)는 세포 외 수용 체의 구조는 마우스 CD3ζ의 막 횡단 및 세포내 도메인 융합. (B) 수용 체의 세포 외 도메인은 또한 CD3ζ의 뉴클레오티드를 포함 하는 3' 뇌관 증폭 되었다. (CD3ζ의 도메인 C)는 세포내 및 막 횡단 수용 체 뉴클레오티드 포함 5' 뇌관 증폭 했다. (D) 최종 PCR 반응에에서 있는 시퀀스를 중첩, 두 세그먼트 DNA 템플렛으로 사용 되었다. 모든 그림 패널에서 다른 단백질 도메인 색상으로 구분 하 고 파란색 사각형 (CD3ζ 시퀀스) 및 빨간색 사각형 (수용 체 시퀀스) 박스. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3: BW 기자 시스템의 최종 제품의 그림. (A, B, C) CLL 세포 미리 incubated 두 안티-CD20 항 체 (rituximab 및 obinutuzumab) 또는 제어 항 체 없이 했다. 이후에, 항 체 바인딩된 셀 부모의 BW 셀 또는 BW 셀 CD16a CD3ζ을 표현 하는 인 큐베이 팅 했다. 밀-2는 상쾌한의 수준 ELISA에 의해 결정 되었다. (A)는 원시 ELISA 격판덮개의 이미지. 명도 상쾌한에 밀 2의 농도 나타냅니다. 실험 3 중에서 수행 되었다. 아래쪽 행 같은 접시에 분석 된 재조합 밀-2의 농도 감소에 ELISA 판독을 보여줍니다. (B) (A)에 표시 된 읽기 ELISA의 정량화. 밀 2 레벨 밀-2의 표준 곡선을 사용 하 여 계산 했다. (C) A 복용량 응답 실험 항 체의 다른 복용량 미리 CLL 세포와 알을 품 하 고 다음 인 큐베이 팅 BW 셀 CD16a CD3ζ을 표현 했다. P < 0.001; 학생의 t 시험 (B) 또는 여러 비교 (C) ANOVA. (C)에 크게 다른 유일한 비교 rituximab 및 첫 번째 농도 (0.01 µ g/mL)에서 제어 Ab에 대 한 했다. 오차 막대는 triplicates의 표준 편차를 나타냅니다. 비슷한 실험은 우리의 최근 연구9중의 일환으로 실시 되었다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
Discussion
여기 선물이 기자 시스템 조사 (참조1에서이 프로토콜의 축약 된 형태) 수용 체 ligand 상호 작용을 생성 하기 위한 프로토콜. 프로토콜은 세 가지 주요 부분으로 구성: CD3ζ, BW 셀에 융해 단백질을 표현 하는 플라스 미드의 transfection의 세포내 도메인 융합 특정 수용 체의 세포 외 도메인을 포함 하는 공상 단백질의 복제 (예: , electroporation에 의해), 그리고 마우스 ELISA에 의해 일리노이-2의 정량적 검출. 이 부속의 각각의 최종 제품 독립적으로 확인 해야 합니다: 대상 플라스 미드에 융해 단백질의 완전 한 연속 복제 프로세스를 확인 해야 합니다, BW 세포의 transfection에의 식을 검사 하 여 확인 되어야 한다는 BW 셀 (예를 들어, cytometry에 의해), 그리고 엘리 사 과정에 대 한 관심의 수용 체 transfected BW 셀;에 대 한 특정 컨트롤 뿐만 아니라 일반적인 긍정적인 컨트롤 (예:, 재조합 밀-2)에 의해 확인 되어야 한다 즉, (예를 들어, 셀에 BW 셀을 표현 하는 NK 세포 수용 체 2B4 익스프레스 CD48 긍정적인 제어로 사용할 수 있습니다)의 수용 체의 알려진된 리간드를 표현 하는 대상. 예를 들어, 복제 프로세스 수 있습니다, 하지만 융해 단백질은 BW 세포에 의해 표현 하지. 이 경우에 electroporation 반복 한다. 또는, ELISA 격판덮개의 배경 수준 이상의 신호 transfected BW 세포 수용 체를 표현 하기 위해 실패 수 있습니다 (특히 컨트롤에 대 한 긍정적인) (또는 식 손실 되었습니다) 동안 기술적인 문제가 발생 한 또는 ELISA 과정입니다.
몇 가지 수정 절차의 일반 원칙을 유지 하면서이 프로토콜을 만들 수 있습니다. 이러한 수정 융해 단백질, transfecting BW 전지와 외피와 ELISA 대상 (예를 들어, 셀, 항 체, 등)의 종류 등에 관련 된 특정 매개 변수를 플라스 미드에 대 한 방법을 표현 하는 데 사용 하는 벡터를 포함 대상 셀 또는 항 체 농도 관련 (우리 잘 하 고 시작 하는 복용량의 0.5 µ g/항 체 당 50000 셀)를 사용 하는 경우의 수 (우리를 사용 하 여 48 h의 외피 시간) 부 화 시간과 ELISA 격판덮개 전송 되는 표면에 뜨는 볼륨.
이 방법은 중요 한, 특정 고 쉽게 양이 정해질 수 있다. (특히 경우 자체 ligand 인정 하지) 특정 한 수용 체에 ligands의 존재에 대 한 심사에 이상적입니다. 특정 수용 체를 표현 하는 transfected BW 셀 준비 후이 세포 냉동 고 추가 실험을 위해 필요할 때 사용 될 수 있습니다. 우리와 다른 사용이 시스템 성공적으로 이전 연구에서 수용 체 ligand 상호 작용 (예2,3,5,12,,1314 탐험 ,1516) 하 고이 시스템에서 얻은 결과 다른 기술에 의해 확인 되었습니다. 이 방법을 사용할 수 있습니다 또한 다른 인간 FcγR 수용 체의 활성화를 공부 하 항 체, 혈 청6,,78 또는 CD20에 대하여 단일 클론 항 체와 항 바이러스 항 체를 일에 의해 9.
이 수용 체의 extracellular 세그먼트만 표시 됩니다 기자 시스템 이므로,이 시스템에서 얻은 결과 자연 세포 독성 분석 실험 등 내 인 성 수용 체와 추가 실험에 의해 보완 해야 킬러 (NK) 세포 NK와의 상호 작용을 공부 하는 수용 체 세포. 또한, 특정 수용 체의 ligand 상호 작용 하지 밀 2 분 비 기자 시스템에 의해 발생할 수 있습니다 그리고 그러므로 간과 될 수 있습니다. 또한, 어떤 실험 설정에서 결과 확인 되어야 한다 다양 한 매개 변수에 대 한 위에 설명 된 대로. 이 경우 두 개의 조건의 비교 필요 (예를 들어, 다른 항 체에 의해 같은 Fc 수용 체의 활성화) 특히 중요 하다. 그것은 또한 특정 리간드-수용 체 상호 작용의 감도 시스템의 선형 범위 내 임을 확인 하는 것이 중요. 그렇지 않으면이 조건에 걸쳐 유효한 비교를 배제 수 있습니다 채도 값 발생할 수 있습니다. 이 테스트 ligand와 복용량 응답 곡선을 생성 하 여 뿐만 아니라 밀 2 표준 곡선을 사용 하 여 달성 될 수 있다 (포화 값, 경우 실험적인 매개 변수 수정 해야; 예를 들어를 상쾌한의 작은 볼륨 분석 되어야 합니다 ELISA에 의해). 이 시스템의 또 다른 가능한 한계 밀-2의 (예를 들어, 마우스 T 세포)는 뷔 셀의 일리노이-2 분 비 마스크 것 내 인 성 분 비 물과 대상 셀의 사용 이다. 극복 하기 위해 마우스 세포에 수감 되는이 매우 드문 발생,이 기자 시스템 대상 세포에 의해 표현 되는 다른 기자를 (예를 들어, GFP)를 사용 하 여 향상 시킬 수 있습니다.
Disclosures
저자 아무 경쟁 금융 관심사를 선언합니다.
Acknowledgments
저자는 언어 편집에 대 한에 스 더가 수 감사합니다. 이 연구는 유럽 연합의 7 차 프레임 워크 프로그램 (FP/2007-2013) 아래 유럽 연구 위원회에 의해 지원 되었다 / ERC 부여 계약 번호 320473-BacNK. 난-코어는 계획 예산 위원회 및 이스라엘 과학 재단의 프로그램에 의해 및 I-핵심 Chromatin와 RNA 유전자 규칙, GIF 재단, 루이스 가족 재단 ICRF 교수 그랜트에 의해 추가 지원을 제공 했다는 헬름홀츠 이스라엘 그랜트 그리고 Rosetrees 신뢰 (모든 O.M.). 이 연구는 이스라엘 과학 재단 (그랜트 502/15), 카스 의료 연구 상 (S.E)를 이스라엘 사회 혈액학 및 수혈 의학에서 연구 그랜트에 의해 또한 지원 되었다. O.M 분자 면역학의 왕관 교수 이다입니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| AccuPrep, Plasmid Mini Extraction Kit | Bioneer | K-3030 | |
| Anti-mouse IL-2 | BioLegend | 503702 | |
| Biotin anti-mouse IL-2 | BioLegend | 503804 | |
| ELISA plates | De-groot | 60-655061 | |
| Fetal Bovine Serum | Sigma | F7524-500ml | |
| G418 | Mercury | MBS3458105GM | |
| Gene Pulser II | Bio-Rad | 165-2105, 165-2106, 165-2107, 165-2108, 165-2109, 165-2110 | |
| L-Glutamine | Biological industry | 03-020-1B | |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution | Biological industry | 01-340-1B | |
| Penicillin-Streptomycin Solution | Biological industry | 03-031-1B | |
| peroxidase streptavidin | Jackson ImmunoResearch | 016-030-084 | |
| PureLink HiPure Plasmid Filter Maxiprep Kit | ThermoFisher Scientific | K210016 | |
| RPMI-1640 Medium | Biological industry | 30-2001 | |
| Sodium Pyruvate | Biological industry | 03-042-1B | |
| TMB | SouthernBiothech | 0410-01 |
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