Summary
齧歯動物の骨格筋収縮機能の測定は、治療的介入の有効性と同様、病気の進行を追跡するために使用できる便利なツールです。私たちはここで同じマウスで時間をかけて繰り返すことができる内がえし筋の非侵襲的体内評価について説明します。
Abstract
骨格筋収縮機能の評価は、臨床の両方のための重要な測定および研究目的。多数の条件には、骨格筋が悪影響します。これ筋肉量 (萎縮) の損失や筋肉の質の損失で起因できる (筋の単位当たりの力が小さく質量)、どちらも慢性疾患、筋固有の疾患、固定、および高齢化 (サルコペニア) で普及しています。動物の骨格筋機能は、さまざまなテストの範囲で評価できます。すべてのテストがある生理学的なテスト環境に関連する制限と特定のテストの選択は、多くの場合、実験の性質によって異なります。ここでは、時間の経過とともに同じ動物に対して実行できるマウス力周波数曲線 (FFC) の有用な評価を含む生体内で,非侵襲的手法について述べる。これは、病気の進行や潜在的な治療上の処置の有効性の監視を許可します。
Introduction
骨格筋は全体重の約 40% を構成する重要な代謝組織です。エネルギー代謝、恒常性1の制御に重要な役割を果たします。骨格筋質量はタンパク質の合成と分解1の率の間の微妙なバランスによって維持されます。多数の病状は、骨格筋、筋肉量 (萎縮) の純損失につながるこれらのプロセスを影響します。これらはなどが、がん、エイズ、老化、断食に限定されない、四肢の固定2,3。人口の高齢化で強度の低下は筋肉の損失に関連付けられている質量し、全例死亡率4の予測因子であります。このコンテキストで筋機能の評価は戦闘および/または骨格筋萎縮と機能の損失を防ぐために治療法の有効性を決定する際に重要な測定を提供します。
研究者は、筋肉萎縮5,6の分子経路と筋収縮機能2,3 にこれらのメカニズムの影響を理解するのに多くの異なるアプローチや動物モデルを使用しています。 ,7。分子レベルの変化は筋肉の機能に影響を与える方法したがって、筋肉の機能の違いを分子レベルでの変更を関連付けることの理解が不可欠です。
骨格筋機能、特に小さい齧歯動物は通常力生産の障害検出および/または病気の進行を監視する 3 つ手順よく8,9を使用して実行されます。(1) 前のヴィヴォ;どこ筋動物から削除され、風呂リンゲル液中フィールド刺激10を使用して筋機能を評価するために培養しました。(2) そのままで;ここで筋の近位付着は歯動物の遠位腱力探触子は、直接神経刺激11によって実行される筋肉の機能をできるようにしています。(3) 生体内で。神経誘発筋活動力の生産9,12電極の配置場所皮下を取得します。これらの 3 つの手順がさまざまな目的で使用されますが、彼らそれぞれ持っている長所と短所。したがって、研究の目的に応じて適切な方法を選択することが重要です。Ex vivo 実験の主な制限は、通常環境から筋肉の取り外しそして刺激の使用です。In situ 法正常な血液供給を維持し、神経を刺激を使用してしかし、正常解剖学は変更、実験の性質はターミナル;したがって、これはフォロー アップの筋機能測定ができなくなります。最も密接にここで説明した in vivo 法で生理解剖学は邪魔、筋束がそのまま残る、実験時間8上同じ動物内でフォロー アップ対策をできるように、ターミナルではない通常模倣します。
ここでは、時間をかけて同じ動物の筋機能の複数の計測を可能にする生体内で手順をについて説明します。このプロシージャを含む前部下腿コンパートメントの筋肉の評価-anterior(TA) 前脛骨筋、長趾伸筋 (EDL) 伸展母指筋 (EHL) 筋肉、背屈の責任など、非侵襲的な手順で腓骨 (として知られている腓骨) 神経の刺激。TA は、足首背屈で13EDL、EHL のつま先の制御の動きによってのみ最小限貢献の力のほとんどを提供します。この非終端プロトコルは、神経や血液の供給の保全を保証します。動物モデルで現在利用可能な最も生理学的環境で時間をかけて病気の進化と治療の有効性の検討が可能になります。
Protocol
すべての実験手順は、ディーキン大学動物倫理委員会 (プロジェクト #G19/2014) によって承認されました。
1. 機器のセットアップ
- すべてのマシンが正しく接続されていることを確認します。
- コンピューター、高出力の 2 相刺激とデュアル モード レバー システムを入れます。
- プラットフォーム上マウス膝クランプとして、組み立てのマウス フット プレートを設定します。
- 37 ° C に加熱プラットフォームを有効に
- デスクトップ上の動的筋制御ソフトウェアを開きます。
注:これは、機能のテストを実行するために必要なソフトウェアです。
2. ソフトウェアおよびモデルのセットアップ
- プログラムが開かれる (図 1)、探触子を校正し、セットアップを選択 |私の楽器 |調整。
- 「セットアップ」ボタンをInstantStimを選択して、"実行時"パラメーター 120 に変更 s (図 1 a)。
注:最適な電圧は、単一のけいれんを実行する、手動での設定、または必要な回数だけ、InstantStim を開始によっても実現できます。 - 自動車の名前を入力する「自動保存ベース」というラベルの付いたタイプができるウィンドウでファイルの場所 (例:, mouse1-日付-timepoint1) を保存します。「自動保存ベース」ウィンドウの左側にあるチェック ボックスをクリックしてし、自動保存を有効にするに変更。
- DMC コントロールの上部には、画面はシーケンサー、新しいポップアップ ウィンドウを開くに移動します。シーケンスを開くを選択し、選択する既成のプロトコル (図 1 b) を使用します。ロード シーケンスをクリックして |ウィンドウを閉じる。
注:この手順を使用して力周波数曲線 (FFC) テストを生成 (1、10、20、30、40、50、60、80、100、150、200、250 Hz)。 - 10 に「範囲」ノブを設定 2 相刺激の mA。
注:「調整」ノブ (隣の右下) はゼロのことを確認します。この微調整により、電極のセットアップです。
3. マウスのセットアップ
注:すべての力の測定は 12 週齢で雄の野生型マウス (C57BI/6) に行った。
- 5% イソフルラン (ノーズ吸入) 経由で 1 L/分の酸素流量で麻酔室に各マウスを置きます、マウスが意識を失うまで。足反射の消失によって適切な麻酔を確認します。
- 電動バリカンでシェービングによるマウスの右脚のすべての髪を削除します。
- 温水のプラットフォームで仰臥位に動物を置き、きれいに右足 70% アルコールとヨウ素 (いずれかの側を使用することができます)。この時点で、2% (1 L/分で酸素の流れ) のイソフルランを調整し、電極が配置される場所の皮膚に導電性ゲルを適用します。
注:直腸温度プローブを使用して、プロシージャの間に体の温度を監視し、目を乾燥や損傷を防ぐために眼軟膏を適用します。 - 板の間の上に足を置き、医療用テープを使用して添付します。安定プロシージャの間に脚を固定し膝をクランプします。
注:安定化を提供するために近位脛骨 (仮筋の後方)12を介して挿入された非常に薄いピンを使用していくつかの研究を説明しました。このプロトコルは、不必要な圧縮/膝を損傷することがなく十分な安定化を提供するよう、クランプ、付き合えない。クランプは、まだ筋肉収縮性の正確な評価を可能にしながら、トランス骨ピンを作成可能性があります潜在的な炎症を回避できます。さらに、マウス膝クランプは正常に使用される14をされています。 - この時点で足首 (図 2) に 90 ° の角度があるので、マウスの後肢の位置のプラットフォームでノブを使用します。
4 電極位置の最適化
- マウスのプラットフォーム上に配置すると、一度 (皮下) 右足の皮膚の下に電極を配置します。
注:これは重要なステップと 4.4 の手順でセットアップ中に目的の位置を取得する必要がありますいくつかの再配置。 - 右脚の外側に電極を配置します。(図 2) の脚の側面のより遠位腓骨とその他の電極の頭部近くに 1 つを配置します。
注:特注電極システムは、この手順を最適化するために設計されています。ただし、このシステムでは、製造元から提供された電極針でこのテストを実行することができます。 - これらの手順は、一度は、ハイパワーの 2 相刺激の結果最大背屈トルク、腓骨神経の刺激を取得する必要に応じて、「調整」というラベルの付いたつまみを調整します。
注:この範囲は、大人の野生型マウス未満 2 mA;ただし、これは、サイズ、年齢、および動物の性別に依存しているかもしれません。力生産 (曲線のピーク) は、最大の力に到達するまでゆっくりと増加する必要があります。 - 刺激の中には、探触子を腓骨神経によって電極刺激を内がえし筋のみを確認することが重要である (図 3)、負の値を生成するため回り。一度このステップを達成すると、プロシージャの間に任意の動きを防止するクランプを使用して電極を安定させます。
注:ピークが現れる、大きくゆっくりと最大アンペア数が 3 つ以上の連続した刺激が同一の収縮性のある結果をレベルとして決定されます。必要に応じてより高いアンペア数を回す抵抗します。最大アンペア数が近隣と刺激潜在的拮抗筋が収縮、正の値のピークを生成することができます共同収縮を引き起こしています。 - ソフトウェアのインスタント スティミュラスを停止します。
- メイン画面 (ステップ 2.4 で説明されている) 以前のセットアップ シーケンスを開始する「シーケンスの開始」ボタンを押してオンにします。
5. 手順を終了
- 力の測定が完了すると、電極を削除、膝クランプを外し、足テープを取り外します。
- イソフルランを切り、動物の回復を助ける、数分間酸素供給を維持します。マウス移動を開始および/または意識を取り戻すし、自己の権利が、そのケージに戻します。
注:非ステロイド性抗炎症薬 (NSAID) を皮下に注射することができます (1 mg/kg メロキシカム) プロシージャの後の不快感や痛みを防ぐために。
6. データの分析
- データ分析ソフトウェアを開きます。
- 高スループット(画面左) に移動します。上記分析に選択力周波数は、セットアップ シーケンスを説明します。
- マニュアルを選択し、「エンド カーソル」の値を 3 に変更します。また削除の基準を選択します。
- 以前に実行されたプロシージャにアクセスし、[分析] をクリックしてファイルの選択をクリックします。この時点で、結果を画面上でアクセスまたはさらに分析や計算のスプレッドシートにエクスポートできます。
注:データ測定した mN;しかし、トルクは (絶対的な力) のレバー腕の長さで力の値を乗算することによって計算できます。正規化が必要 (特定力) の場合は、体重、トルクを正規化することができます。 またはターミナル実験は同年齢の筋肉量を収集するために実行できます。
Representative Results
力周波数曲線は最適と最適な力応答15を区別するために低い周波数で、筋肉を刺激できる有用な検査です。低い周波数で力が少ないと小さいモーター ユニットを活性化、単収縮を刺激することより高い周波数で安定的なピークに達すると、分離のけいれんの融合 (破傷風)、どこに達するすべてのモーター ユニット16 を活性化を介して最大の力.高原に達すると完了した融合曲線9、テスト シナリオ、テタヌス曲線開始 〜 60 hz、増強を視覚化することができます (図 4 a) で最大の力 ~ 150 Hz (図 4 b) に決定されます。 16。
これらの結果の変化形も筋肉がないは電極によっても正しく刺激されて可能性があります。電極配置の重要なステップは、この手順の準備のために電気刺激は腓骨神経を刺激して、したがって、背の筋肉を完全に活性化するのに正しく配置されている必要がありますそれ供給 (TA、EDL、EHL)。正しい電極またはより高いアンペア数のずれが周囲の筋の共収縮を引き起こす刺激につながるに対し、この過程で負のピーク (図 3) の世代で結果電極位置、隣接する筋肉と拮抗薬の筋肉は、正の値のピークを生成します。
図 5 aは、プロシージャが 5 の縦長が完了するまでは週 1 回を繰り返していた時間をまたいでマウスから代表的な力周波数曲線データを示します。これらの観察は縦長および/または測定の観察を通して生産値の一貫性のある力を示されています。この手順は、FFC の曲線下面積刺激以上 5 週に一度のテスト 6 マウス観察代表を示す図 5Bマウス測定間の一貫性にも示しています。
図 1: ソフトウェア システム。(A) 制御ソフトウェア「インスタント スティミュラス」パラメーターを設定するため手順の図。背景写真をクリックしてセットアップ |インスタント スティミュラス。小さなポップアップ ウィンドウ (フロント写真)、パラメーターを設定します。「シーケンサー」セットアップ ビューの (B) のイラスト。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 2: マウスのセットアップ。麻酔下の動物の位置の概要です。足と足首が 90 ° 角度 (白色の点線) になるようにし、膝が 90 °、右膝クランプが配置されます。仮の筋肉の収縮はちょうど下にある腓骨神経の刺激によって達成される (遠位) 腓骨頭。我々 はカスタム設計された電極 (インセット); を使用します。ただし、針電極ユニットは、付属または別売でも十分です。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 3: 電極の配置から出力します。電極が皮膚の下に、電圧が開始されると、負の値のピークが観測されています。この時点で、内がえし筋のみ (TA、EDL、EHL) 刺激が達成されることを確認の重要なステップは、負の値 (緑線) に到達します。リアルタイムの測定は、2 つの赤い線の間示されます。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 4: 代表的な曲線です。(A) 60 hz (マウス #06) 力曲線のサンプルです。(B) 150 Hz (マウス #03) で筋の曲線のサンプルです。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 5:代表力周波数曲線 (FFC) と曲線のデータの下の領域。(A) FFC (x 軸) 5 以上の異なる縦長 (週 1、2、3、4、および 5) サンプル マウス (05)。(B)「5 異なる縦長に ffc (AU、y 軸) の曲線下面積 (マウス #01、02、03、04、05、06、それぞれ x 軸).結果 6 マウス 5 縦長 (テスト) の測定 (SEM) の平均 ± 標準誤差として表現し、一方向の分散分析によって分析されたテスト (p < 0.05)。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
Discussion
遺伝、代謝、進歩的な評価と筋条件17正確かつ再現性のある方法で最大筋収縮機能の測定が欠かせません。同様に、体内筋収縮機能は新しい治療法と治療筋肉条件を衰弱させるための評価のためことができます。マウス体内手順下後肢内がえし筋の力生産の測定を示す本。
効率的な商業装置は、この非侵襲的な手順を実行するのに役立ちます。このテストは、血液供給と神経支配がそのまま残るネイティブの生理学的な環境を維持しながら筋収縮機能の評価に関連するの重要な利点を提供します。その一方で、不利な点実験の後収穫された、孤立した筋でのみ確認することができます (特定力)、筋肉の断面積の単位力の正常化に関連しています。ただし、非侵襲的なテスト測定が可能複数屈筋筋収縮機能の同じ動物で時間をかけて、目標は、相対的な変更 (を評価する場合は特に、必要な実験動物の数が減少の結果時間をかけて絶対力に変更)。
この手順の間、縦長で一貫性のあるデータを達成するために考慮しなければならない重要なステップがあります。まず、1 つは動物位置決め可能な限り標準化しようとしてください。第二に、それを設定中に、電極の配置を最適な刺激は腓骨神経の刺激を介してアクセスできますので、一致する重要です。電極の場所は (図 2) の脚の側面をさらに (この場合) 右足腓骨頭や他の近くの側面にあります。これに基づき、オーダーメイドの電極設計されていますよう、両方置ける同じ位置で毎回。しかし、十分な刺激も実現できます商業装置付属電極針を使用しています。第三に、キャブに接続されている探触子を時計回りに回して電圧セットアップ中に負のピークを達成するために重要です。正しい最大電圧設定でマウスの脚電極の位置を時間をかけて同じマウスで実行できるテクニックである示しています。
評価し、同じ動物の異なる縦長で筋肉の機能を追跡する能力は、別の筋疾患だけでなく、彼らの進行を特徴付ける重要な評価です。さらに、マウスの筋背屈のこの測定は、最小の代謝ストレス12のネイティブの生理学的環境で潜在的な治療法の有効性を評価するためのツールをすることができます。したがって、筋疾患、進行および潜在的な治療を評価する手法を提供します。
Disclosures
著者が明らかに何もありません。
Acknowledgments
このプロジェクトからの資金は学校の運動と栄養科学、ディーキン大学から。著者らは、電極デバイスを最適化するに彼の広汎な仕事のため氏アンドリュー ・ ハワースを感謝したいです。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1300A: 3-in-1 Whole Animal System – Mouse | Aurora Scientific Inc. | 305C-LR: Dual-Mode Footplate; 605A: Dynamic Muscle Data Acquisition And Analysis System; 701C: Electrical Stimulator and 809C: in-situ Mouse Apparatus | Complete muscle function system |
| Conductive gel | Livingstone | ECGEL250 | conductive gel used in the mice |
| Eye ointment | Alcon | Poly Visc | pharmaceutic product (ophthalmic use) |
| nonsteroidal anti-inflammatory drug (NSAID) | Ilium | Metacam | veterinary medicine (injectable 5mg/ml) |
| Isoflurane | Zoetis | Isoflo | veterinary inhalation Anaesthetic |
References
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