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Immunology and Infection

विशाल कोशिका Arteritis में फोलेट रिसेप्टर बीटा मैक्रोफेज और संवहनी प्रतिरक्षा Microenvironment प्रोफाइल करने के लिए एक Immunohistopathologic अध्ययन

Published: February 8, 2019 doi: 10.3791/58713
Automatic Translation
1, 2, 3, 4, 1
1Department of Medicine, Penn State University, 2Department of Pathology, Penn State University, 3Penn State College of Medicine, 4Department of Oncology, Wayne State University School of Medicine

Summary

प्रोटोकॉल histopathologic परीक्षा और प्रोफाइल करने के लिए immunohistochemistry के उपयोग को दर्शाता है फोलेट रिसेप्टर बीटा मैक्रोफेज और कुल प्रतिरक्षा सेल के साथ अपने रिश्ते को विशाल सेल arteritis में लौकिक धमनी बायोप्सी में घुसपैठ ।

Abstract

विशाल कोशिका arteritis (जीसीए) मध्यम-से-बड़े आकार की धमनियों की पुरानी प्रतिरक्षा-मध्यस्थता वाली बीमारी है जो पुराने वयस्कों को प्रभावित करती है । जीसीए गठिया और सिर दर्द, स्ट्रोक या दृष्टि हानि के पूर्णावरोधक लक्षण के साथ प्रकट होता है । मैक्रोफेज और टी सहायक लिम्फोसाइटों संवहनी दीवार घुसपैठ और एक समर्थक भड़काऊ प्रतिक्रिया है कि पोत नुकसान और ischemia करने के लिए नेतृत्व का उत्पादन । तारीख करने के लिए, वहाँ कोई जीसीए है कि रोग गतिविधि की निगरानी और चिकित्सीय प्रतिक्रिया का मार्गदर्शन कर सकते हैं ।

फोलेट रिसेप्टर बीटा (FRB) एक glycosylphosphatidylinositol प्रोटीन है कि कोशिका झिल्ली पर लंगर डाला है और आम तौर पर myelomonocytic वंश में व्यक्त और माइलॉयड ल्यूकेमिया कोशिकाओं के बहुमत में के रूप में अच्छी तरह के रूप में ट्यूमर और रुमेटी श्लेष मैक्रोफेज में है, जहां इसकी अभिव्यक्ति रोग गंभीरता के साथ संबद्ध है । फोलेट यौगिकों, फोलिक एसिड-conjugates और antifolate दवाओं को बांधने के लिए FRB की क्षमता यह कैंसर और भड़काऊ रोग अनुसंधान में एक druggable लक्ष्य बना दिया है । इस रिपोर्ट में histopathologic और immunohistochemical GCAimmunopathology के संबंध में FRB के अभिव्यक्ति और वितरण का आकलन करने के लिए इस्तेमाल किया तरीकों का वर्णन है ।

Formalin-फिक्स्ड और आयल-एंबेडेड लौकिक धमनी बायोप्सी से जीसीए और सामांय नियंत्रण Hematoxylin और Eosin ऊतक प्रोटोकॉल की समीक्षा करने के लिए और pathognomonic सुविधाओं की पहचान के साथ दाग थे । Immunohistochemistry FRB, CD68 और CD3 अभिव्यक्ति का पता लगाने के लिए इस्तेमाल किया गया था । एक सूक्ष्म विश्लेषण के लिए 10 चयनित उच्च शक्ति क्षेत्र वर्गों और धमनी की दीवार में उनके संबंधित स्थानों पर सकारात्मक दाग कोशिकाओं की संख्या यों तो किया गया था ।

Lymphohistiocytic (LH) intimal हाइपरप्लासिया और बाधित लोचदार लेमिना के साथ सूजन जीसीए में नियंत्रण में पाया कोई नहीं के साथ देखा गया था । LH घुसपैठ लगभग ६०% लिम्फोसाइटों और ४०% मैक्रोफेज की रचना की थी । FRB अभिव्यक्ति मैक्रोफेज तक ही सीमित था, कुल CD68 + मैक्रोफेज जनसंख्या का 31% शामिल है और मीडिया और adventitia के लिए स्थानीयकृत । कोई FRB नियंत्रण में देखा गया था ।

इस प्रोटोकॉल जीसीए में संवहनी प्रतिरक्षा microenvironment के सापेक्ष FRB मैक्रोफेज के एक विशिष्ट संख्यात्मक और स्थानिक पैटर्न का प्रदर्शन किया ।

Introduction

विशालकाय कोशिका arteritis (जीसीए) मध्यम से बड़ी धमनियों की एक भड़काऊ बीमारी है, महाधमनी और इसकी शाखाओं को लक्षित और पुराने वयस्कों को प्रभावित । यह सिर दर्द, जबड़े में दर्द, दृष्टि हानि, स्ट्रोक और ऊतक अवसाद के रूप में गंभीर कोरोनरी जटिलताओं के लिए हल्के के साथ प्रस्तुत करता है । निदान एरिथ्रोसाइट अवसादन दर (ESR) और लौकिक धमनी बायोप्सी (टैब)1पर एक अलग histopathologic पैटर्न की तरह उच्च भड़काऊ मार्करों द्वारा की पुष्टि की है । जीसीए सबसे आम वयस्क वाहिकाशोथ है, और लौकिक धमनी की पहुंच निदान के लिए प्राप्त अंय vasculopathies पर एक लाभ प्रस्तुत करता है, इस प्रकार एक को सक्षम करने के लिए अपनी रोगजनन और अधिक आसानी से अध्ययन । टैब पर ठेठ निष्कर्षों मैक्रोफेज की घुसपैठ/histiocytes और टी लिम्फोसाइटों tunica intima, मीडिया के सभी संवहनी परतों में पाया, और लोचदार adventitia है कि आम तौर पर इन अलग है के समवर्ती विनाश के साथ लेमिना शामिल कंपार्टमेंट2. वर्तमान साक्ष्य दर्शाता है कि जीसीए एक अज्ञात प्रतिजन है कि संवहनी adventitia में वृक्ष कोशिकाओं को सक्रिय करता है, सहायक टी (गु) कोशिकाओं की भर्ती के बाद, विशेष रूप से Th1 और Th17 उपप्रकार जो interleukin-17 स्रावित और इंटरफेरॉन-गामा (IFG) क्रमशः. IFG तो रंगरूटों और साइटोकिंस और मैक्रोफेज उत्पादन करने के लिए सक्रिय करता है । ये समर्थक भड़काऊ साइटोकिंस शामिल हैं; IL-12 सहित, जो पारस्परिक रूप से Th1 कोशिकाओं को सक्रिय करता है इस प्रकार एक सकारात्मक प्रतिक्रिया पाश प्रदान; ट्यूमर परिगलन कारक और interleukin-6, जो कारण गठिया और बुखार और metalloproteases कि लोचदार लेमिना नुकसान । ग्लुकोकोर्तिकोइद (GC), जो मानक जीर्ण चिकित्सा का गठन, आंशिक रूप से Th17/IL-17 लेकिन Th1/IFG हाथ की प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया3,4के तनु द्वारा cytokine रास्ते को नियंत्रित । दुर्भाग्य से, रोग पतन में जीसी परिणामों के विच्छेदन । एक वैकल्पिक रूपरेखा के रूप में, methotrexate जीसीए उपचार के लिए repurpose किया गया है, लेकिन वांछित नैदानिक अंतिमबिंदु लगातार प्राप्त नहीं किया गया है, हालांकि अधिक संवेदनशील उपचिह्न चिकित्सकीय निगरानी के लिए उपयोग नहीं किया गया है5,6 . २०१७ में, interleukin 6 अवरोधक, tocilizumab, जीसीए के उपचार के लिए अनुमोदित किया गया था के रूप में यह प्रभावी ढंग से प्रदर्शन रोग नियंत्रण और स्टेरॉयड7,8बख्शते.

तारीख करने के लिए, वहां जीसीए के लिए कोई अच्छा नहीं कर रहे है मार्क्स । नतीजतन, प्रतिकूल प्रभावों से बचने और समाज को लागत के बोझ को कम करने के लिए रोग गतिविधि और उपलब्ध दवाओं की अनुमापन खुराकों पर नजर रखना मुश्किल होता है । इस प्रकार, यह एक उंमीदवार है कि रोग गतिविधि के साथ संबद्ध है, रोगजनन पर उपंयास अंतर्दृष्टि प्रदान करने और चिकित्सीय निर्णयों में सहायता के लिए देखने के लिए आवश्यक है ।

मैक्रोफेज सक्रियण के dysregulation जीसीए रोगजनन में एक महत्वपूर्ण कारक है । इस प्रकार, जीसीए के इलाज का एक प्रभावी साधन सक्रिय मैक्रोफेज के चयनात्मक लक्ष्यीकरण हो सकता है । फोलेट रिसेप्टर बीटा (FRB) एक glycosyl-phosphatidylinositol ग्लाइकोप्रोटीन कि कोशिका झिल्ली पर लंगर डाला है सामांय myelomonocytic कोशिकाओं, माइलॉयड ल्यूकेमिया कोशिकाओं और सक्रिय मैक्रोफेज में व्यक्त की है । इसके ligand, फोलिक एसिड, अपने कम रूप में एक आवश्यक विटामिन है, जो सेलुलर डीएनए संश्लेषण, मिथाइल और मरंमत9सक्षम बनाता है । FRB अभिव्यक्ति स्व-प्रतिरक्षित रोग में प्रेरित है और कैंसरजनन के दौरान । इसकी अभिव्यक्ति रुमेटी गठिया में monocytes या समर्थक भड़काऊ M1 मैक्रोफेज की सतह के लिए प्रतिबंधित है, या ठोस अंग और माइलॉयड द्रोह में विरोधी भड़काऊ M2 मैक्रोफेज करने के लिए10,11,12 , 13. सक्रिय मैक्रोफेज के एक के रूप में अपनी क्षमता की भूमिका के अलावा, FRB एक बहु कदम प्रक्रिया है कि फोलिक एसिड, antifolates या फोलेट-संयुग्मित दवाओं के लिए सेल में रिसेप्टर बाध्यकारी के साथ शुरू होता है के माध्यम से चयनात्मक दवा परिवहन सक्षम कर सकते है सतह, आंतरिक सेल मशीनरी12,14,15,16के लिए internalization, रिहाई और वांछित दवा के अंतिम प्रसव के बाद । frb के विपरीत में कैंसर की कोशिकाओं और सक्रिय मैक्रोफेज में व्यक्त की है, frb सामांय टेम कोशिकाओं में व्यक्त करने के लिए इस प्रकार यह सुनिश्चित करना है कि frb/फोलेट की मध्यस्थता दवा वितरण के लिए सीमित है के लिए नहीं कर रहे है-सकारात्मक भड़काऊ या कैंसर की कोशिकाओं frb ।

हमारे पिछले अध्ययन में, हम पहली बार है कि FRB जीसीए मैक्रोफेज में व्यक्त की है और अपनी अभिव्यक्ति CD68 + और endothelin रिसेप्टर बीटा मैक्रोफेज, जो जीसीए रोगजनन17में योगदान के साथ संबंधित है के लिए प्रदर्शन किया । इस रिपोर्ट में, हम histopathological और immunohistochemical के लिए frb मैक्रोफेज का आकलन करते थे तरीकों का वर्णन है, और कुल लिम्फोसाइट और मैक्रोफेज मायने रखता विश्लेषण के लिए जीसीए संवहनी परिदृश्य में है FRB स्थिति में अंतर्दृष्टि लाभ ।

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Protocol

बताए गए सभी तरीकों को पेन स्टेट इंस्टीट्यूशनल रिव्यू बोर्ड ने मंजूरी दी थी ।

1. Histopathological तैयारी, और प्रसंस्करण लौकिक धमनी बायोप्सी प्राप्त करने के बाद

नोट: लौकिक धमनी बायोप्सी (टैब) एक प्रमाणित सर्जन द्वारा स्थानीय संज्ञाहरण और बाँझ शर्तों के तहत किया जाता है । शल्य चिकित्सा के बाद अधिक प्रभावित पक्ष पर एक 3 सेमी धमनी अनुभाग प्राप्त करने के बाद, नमूना formalin में तुरंत 24 घंटे के लिए तय हो गया है, 3 से 4 मिमी वर्गों में विभाजित है, और आयल में एंबेडेड, ब्लॉक में ऊतक के उचित संरेखण के लिए सावधान ध्यान दे जो फिर कमरे के तापमान पर संग्रहित किया जाता है । नमूना चयन चिकित्सा अभिलेखों की पुष्टि करने के बाद किया जाता है । निदान संधिवातीयशास्त्र १९९० मानदंड है जो की आवश्यकता है कि विषयों 5 डोमेन के 3 पूरा करने के अमेरिकी कॉलेज पर आधारित है: आयु > 50 साल, नई सिरदर्द, लौकिक धमनी कोमलता, एक एरिथ्रोसाइट अवसादन दर > 50 मिमी/Westergren विधि द्वारा घंटे/ एक असामान्य टैब. सुरक्षा के लिए, सुरक्षात्मक दस्ताने हर समय पहना जाना चाहिए जब नमूनों, रसायनों और एंटीबॉडी से निपटने ।

  1. एंबेडेड ब्लॉकों से, कट 4-5 µm मोटी एक microtome का उपयोग कर वर्गों । और Hematoxylin और Eosin (एच & ई) के साथ दाग । गुणवत्ता आश्वासन के लिए चयनित सामांय ऊतक के नियंत्रण अनुभाग का उपयोग करें ।
  2. एक गर्म पानी से गर्म स्नान पर फ्लोट कट वर्गों ४० ° c झुर्रियों को दूर करने के लिए और एक लेपित ग्लास माइक्रोस्कोपी स्लाइड के साथ उठाओ ।  ६० ° c ओवन में एक गर्म थाली पर ग्लास स्लाइड प्लेस ६० मिनट के लिए सुखाने और स्लाइड करने के लिए अनुभाग के पालन की सुविधा के लिए ।
  3. ६० ° c ओवन में एक गर्म थाली पर ग्लास स्लाइड प्लेस ६० मिनट के लिए सुखाने और स्लाइड करने के लिए अनुभाग के पालन की सुविधा के लिए ।
  4. माइक्रोस्कोप स्लाइड पर 3 वर्गों माउंट ।
  5. स्लाइड्स को अनुलंब रैक में रखें और 24 घंटे के लिए ३७ ° c पर रातोंरात सुखाएं ।
  6. स्लाइड्स को 4 ° c में एक कंटेनर और स्टोर में रखें ।

2. Immunohistochemical तैयारी, एपिलेशन, प्रतिजन पुनः प्राप्ति और धुंधला15,18,19,20

  1. स्लाइड रैक में स्लाइड लोड करना । चलाने के व्यंजन के माध्यम से रैक के रूप में इस प्रकार है: १००% xylene में दो बार कोमल आंदोलन के 10 सेकंड हर 30 सेकंड के साथ 5 मिनट के लिए, एक बार 10 सेकंड आंदोलन के साथ १००% इथेनॉल में, एक बार 10 सेकंड आंदोलन के साथ ९०% इथेनॉल में, एक बार 10 सेकंड आंदोलन के साथ ७०% इथेनॉल , और 10 सेकंड के आंदोलन के साथ डबल आसुत H2O में दो बार ।
    नोट: xylene और एसीटोन की हैंडलिंग हवादार डाकू में किया जाना चाहिए सांस लेना और सांस विषाक्तता से बचने के लिए ।
  2. एक गिलास कंटेनर में 10 mmol/L के २०० मिलीलीटर के साथ रैक स्थानांतरित करके प्रतिजन पुनः प्राप्त, पीएच ६.० साइट्रेट ९५ ° c के लिए गर्म बफर । पानी स्नान में 30 मिनट के लिए टाइमर सेट, तो 20 मिनट के लिए कमरे के तापमान में शांत तो 5 मिनट के लिए चल रहे पानी से कुल्ला ।
  3. 10 मिनट के लिए 3% हाइड्रोजन पेरोक्साइड के २०० मिलीलीटर में मशीनिंग द्वारा अंतर्जात peroxidase गतिविधि निकालें । Tris-बफ़र्ड खारा समाधान (TBSS) के २०० µ l में 3 बार स्लाइड धो लें ।
  4. रैक से स्लाइड निकालें और एक धीरे से अतिरिक्त बफर पोंछ करने के लिए हर एक ढाब । धुंधला के लिए, निंनलिखित प्राथमिक एंटीबॉडी के २०० µ एल जोड़ें, स्लाइड पर कवर फिसल जाता है और कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए एक आर्द्र कक्ष में मशीन जोड़ें:
    विरोधी FRB एंटीबॉडी 1:800 पतला
    मोनोक्लोनल चूहा विरोधी मानव CD68, 1:200 कमजोर पड़ने
    Polyclonal खरगोश विरोधी CD3 1:100 कमजोर पड़ने
    नोट: Formalin-तय तेल-अपरा के वर्गों में एंबेडेड भी कार्रवाई की गई के रूप में २.१ चरणों में उल्लिखित २.९ और विरोधी FRB18 के साथ मशीन और सकारात्मक नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल किया । धुंधला परिणाम इष्टतम एंटीबॉडी एकाग्रता खोजने के द्वारा प्राप्त किया गया था और डबल titrating (जैसे 1:50, 1:100, 1:200, 1:400, 1:800, 1:1600) में एंटीबॉडी के द्वारा की गई थी ।
  5. गर्मी और त्याग के बाद कवर स्लिप निकालें । TBSS, नाली और पोंछ अतिरिक्त बफर के साथ प्रत्येक 2 मिनट के लिए 3 बार स्लाइड कुल्ला ।
  6. biotinylated विरोधी खरगोश युक्त माध्यमिक एंटीबॉडी समाधान के २०० µ एल जोड़ें/ऊतक प्रतिजन के लिए बाध्य unconjugated प्राथमिक एंटीबॉडी के साथ प्रतिक्रिया करने के लिए एंटीबॉडी/ स्लाइड पर coverslips प्लेस और कमरे के तापमान पर ४५ मिनट के लिए एक आर्द्र कक्ष में मशीन ।
  7. गर्मी और त्याग के बाद कवर स्लिप निकालें । टीबीएस, नाली और पोंछ अतिरिक्त बफर के साथ प्रत्येक 2 मिनट के लिए 3 बार स्लाइड कुल्ला ।
  8. जोड़ें २०० µ एल के diaminobenzidine (ढाब) + सब्सट्रेट बफर (Imidazole एचसीएल)-chromogen प्रणाली और 10 मिनट के लिए मशीन धुंधला पैटर्न कल्पना करने के लिए । TBSS के साथ धो फिर 10 मिनट के लिए नल का पानी चलाने में ।
  9. 3 मिनट के लिए hematoxylin के साथ Counterstain ।
  10. स्लाइड की सतह के लिए बढ़ते माध्यम के ७० µ एल लागू करने से स्लाइड माउंट । धीरे बढ़ते माध्यम पर coverslip टिप और बुलबुले बनाने से बचने के रूप में आप इसे जगह में कम । शुष्क करने के लिए 24 घंटे रुको ।

3. Histopathologic और Immunohistochemical (आइएचसी) विश्लेषण

एक प्रकाश माइक्रोस्कोप का उपयोग कर जीसीए सकारात्मक और सामान्य विषयों से एच & ई और आइएचसी दाग वर्गों की जांच करें ।

  1. एच & ई सना वर्गों के लिए:
    1. संवहनी वास्तुकला का आकलन करें और tunica intima, tunica मीडिया में चिकनी मांसपेशी कोशिकाओं में endothelial कोशिकाओं की पहचान, और fibroblasts और vasorum tunica में वासा adventitia21,22।
    2. जीसीए सुविधाओं, जो लिम्फोसाइट और मैक्रोफेज/histiocyte घुसपैठ, सेलुलर हाइपरप्लासिया, और आंतरिक लोचदार लेमिना क्षरण शामिल पहचानें ।
    3. lymphohistiocytic की पहचान और लिम्फोसाइटों के सापेक्ष मैक्रोफेज की संख्या को बढ़ाता द्वारा घुसपैठ का विश्लेषण । आंतरिक लोचदार लेमिना व्यवधान और निवासी कोशिकाओं में hyperplastic परिवर्तन की हद का आकलन और नियंत्रण के साथ तुलना करें ।
  2. आइएचसी दाग वर्गों के लिए:
    1. FRB के धुंधला पैटर्न की जांच करें, एक विशेष प्रकार या कोशिकाओं और संवहनी परतों और कुल प्रतिरक्षा घुसपैठ के लिए अपने रिश्ते के भीतर अपने वितरण के प्रकार के द्वारा अपनी अभिव्यक्ति के नोट लेने, कुल मैक्रोफेज मार्कर, विरोधी CD68, और पान लिम्फोसाइट मार्कर विरोधी CD3.
    2. 10 एकाधिक बेतरतीब ढंग से चयनित उच्च शक्ति क्षेत्रों (hpf) और रिकॉर्ड का मतलब है पर सकारात्मक सना हुआ कोशिकाओं की गिनती से FRB, CD68 और CD3 कोशिकाओं की अभिव्यक्ति यों तो ।
      नोट: इन सामान्य और रोग कोशिकाओं और संरचनाओं की पहचान एक प्रमाणित हृदय पैथोलॉजिस्ट (जेएम) और rheumatologist (S.A.A.) द्वारा प्रदर्शन किया गया और सभी मामलों के लिए परिणाम दर्ज किए गए थे.
    3. एक डिजिटल कैमरे का उपयोग कर प्रतिनिधि छवियों पर कब्जा ।
      नोट: इन चरणों के बाद, शेष aliquots-८० ° c पर संग्रहित किया जा सकता है ।

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Representative Results

Histopathologic निष्कर्षों

सामांय नमूनों में एच & ई दाग tunica intima, tunica मीडिया में चिकनी मांसपेशी कोशिकाओं में endothelial कोशिकाओं के साथ सामांय धमनी एनाटॉमी का प्रदर्शन किया, और एक heterogenous कोलेजन मैट्रिक्स जो fibroblasts और फीडर जहाजों शामिल वासा vasorum बुलाया में tunica adventitia । कोई भड़काऊ घुसपैठ की पहचान नहीं है । जीसीए सकारात्मक लौकिक धमनियों मैक्रोफेज/histiocytes, लिम्फोसाइटों, सामयिक प्लाज्मा कोशिकाओं, और multinucleated विशाल कोशिकाओं के समुच्चय के साथ गंभीर सूजन के लिए उदार प्रदर्शन किया । चमकदार संकुचन नोट किया गया था और intimal और अधिक मोटा होना और ९०% विघटन आंतरिक लोचदार लेमिना (चित्रा 1) के साथ ।

Immunohistochemical निष्कर्षों

CD3 + लिम्फोसाइटों और CD68 + मैक्रोफेज सभी जीसीए + नमूनों में मौजूद थे और सभी बायोप्सी में इसी तरह के धुंधला पैटर्न का प्रदर्शन किया । लिम्फोसाइटों १.६ के एक CD3/CD68 अनुपात के साथ मैक्रोफेज पर हावी है । FRB के लिए धुंधला मैक्रोफेज और multinucleated विशाल कोशिकाओं को जो तरजीह adventitia और मीडिया (तालिका 1 और चित्रा 2) के लिए स्थानीयकृत करने के लिए प्रतिबंधित किया गया था । नियंत्रण नमूनों न्यूनतम ल्यूकोसाइट्स दिखाया (< 5 कोशिकाओं/उच्च शक्ति क्षेत्र) और कोई FRB अभिव्यक्ति ।

Figure 1
चित्रा 1: एच & लौकिक धमनियों के ई छवियों । (क) प्रतिनिधि एच & tunica (टी) adventitia, मीडिया की विशिष्ट परतों के साथ एक सामान्य लौकिक धमनी की छवि, और intima से सबसे बाहरी से क्रमशः अंतस/ adventitia (मोटे तीरों) में कोलेजन और वासा vasorum के नेटवर्क को ध्यान में रखें, मीडिया में चिकनी मांसपेशी कोशिकाओं (पतले तीरों), और intima में endothelial कोशिकाओं (10x इज़ाफ़ा) । (ख) intima-मीडिया इंटरफेस का एक बढ़े हुए micrograph एक में आयताकार इनसेट द्वारा डाला जाता है और आंतरिक लोचदार लेमिना (ऐरोहेड) (20x आवर्धन) द्वारा अलग किया जाता है । (ग) प्रतिनिधि एच & एक विशाल कोशिका arteritis के साथ एक टा की छवि एक transmural lymphohistiocytic घुसपैठ (घने तीर), intimal हाइपरप्लासिया और आंतरिक लोचदार लेमिना (ऐरोहेड) (10x इज़ाफ़ा) के विनाश के द्वारा चिह्नित । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्रा 2: विशाल सेल arteritis के साथ लौकिक धमनियों के Immunohistochemical धुंधला । (क) प्रतिनिधि छवियों CD68 सकारात्मक मैक्रोफेज और विशाल कोशिकाओं (तीर) ज्यादातर मीडिया और adventitia (10x इज़ाफ़ा) में पाया के साथ एक व्यापक भड़काऊ घुसपैठ का प्रदर्शन । (ख) फोलेट रिसेप्टर बीटा (FRB) चुनिंदा सक्रिय मैक्रोफेज (तीर) (10x बढ़ाई) में व्यक्त किया गया था । उच्च शक्ति में लिया छवि (ग) में FRB सकारात्मक मैक्रोफेज और CD68 सकारात्मक मैक्रोफेज में (डी) (100x इज़ाफ़ा) का प्रदर्शन किया । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

जीसीए विषय (n = 5) मतलब (± एसडी)
CD3 (प्रतिरक्षा घुसपैठ का%) ६१.७ ± ४.१
CD68 (प्रतिरक्षा घुसपैठ का%) ३८.३ ± ४.१
CD68 histiocytes/मैक्रोफेज (cells/hpf) ३४.८ ± १०.४
FRB + मैक्रोफेज (कक्ष/hpf) १०.८ ± ४.४
% FRB/% CD68 31 ± १२.७

तालिका 1: FRB, CD68 का सारांश, और CD3 अभिव्यक्ति ।

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Discussion

जीसीए वयस्कों में सबसे आम वाहिकाशोथ है, और इसके रोग बानगी मिसाल टी हेल्पर लिम्फोसाइटों और सक्रिय मैक्रोफेज के एक शक्तिशाली संयोजन है कि अन्य granulomatous रोगों में भी पाया जा सकता है या vasculopathies की तरह सारकॉइडोसिस और granulomatous polyangiitis2,3. जीसीए में, लौकिक धमनी के एक अच्छे प्रतिनिधित्व प्रदान करता है एक मध्यम से बड़े धमनी आकार और टा बायोप्सी एक बड़ा नमूना है कि वर्ष के लिए आयल ब्लॉक में संग्रहित किया जा सकता है, इस प्रकार के अवसरों के निर्माण के लिए उभरते नैदानिक और की भूमिकाओं का अध्ययन देता है vasculitic microenvironment में FRB की तरह चिकित्सकीय लक्ष्य । हम सुलभ ऊतक और मानक immunopathologic तरीके से प्रस्तुत लाभ के लिए पूछना है कि क्या FRB मज़बूती से आइएचसी के माध्यम से विश्लेषण किया जा सकता है लिया । हमारे निष्कर्षों का प्रदर्शन है कि histopathology और आइएचसी न केवल निदान और संवहनी क्षति की हद तक की पुष्टि करने में मूल्यवान उपकरण के रूप में सेवा कर सकते हैं, लेकिन यह भी जीसीए में अलग मैक्रोफेज उपप्रकार की भूमिका मान्य.

histopathology और आइएचसी तरीकों दोनों श्रम गहन रहे है और histochemical तकनीशियन, पैथोलॉजिस्ट और rheumatologist के कौशल की आवश्यकता है, लेकिन तकनीक अच्छी तरह से स्थापित किया गया है और अंय तरीकों का उपयोग कर के लिए एक लॉंच पैड के रूप में सेवा कर सकते है जैसे इम्यूनोफ्लोरेसेंस आणि प्रवाह cytometry. इस तरह के तरीकों का नुकसान, तथापि, ताजा जमे हुए ऊतक जो संभावित संग्रह की आवश्यकता के लिए की जरूरत है । आइएचसी, histopathologic परीक्षा के साथ साथ, संवहनी प्रतिरक्षा microenvironment के एक मनोरम परिप्रेक्ष्य को पेश करने में अमूल्य है कि बार में पहुंचा जा सकता है और विशेष रूप से FRB की तरह उपंयास प्रोटीन के उद्भव के साथ विश्लेषण किया । Hematoxylin और Eosin (एच & ई) धुंधला एक ऊतक प्रोटोकॉल की समीक्षा करने के लिए सक्षम बनाता है । Hematoxylin नाभिक दाग और परमाणु विवरण पर प्रकाश डाला गया जबकि eosin एक counterstain जो परमाणु और cytoplasmic सुविधाओं के बीच मतभेदों के प्रदर्शन में एड्स के रूप में कार्य करता है । चयनित सामांय ऊतक के एक नियंत्रण अनुभाग के उपयोग के लिए गुणवत्ता आश्वासन के मूल्यांकन के लिए आवश्यक है ।

आइएचसी कई एंटीबॉडी जो माइक्रोस्कोपी द्वारा visualized कर रहे हैं के उपयोग के माध्यम से जमे हुए या formalin-फिक्स्ड और आयल-एंबेडेड ऊतकों में ब्याज की प्रतिजन का पता लगाता है । वर्णित प्रोटोकॉल वान डेर Heijden एट अल.15, जो श्लेष मैक्रोफेज में रुमेटी गठिया में FRB अभिव्यक्ति का प्रदर्शन से अनुकूलित किया गया । आवश्यक आइएचसी कदम ऊतक तैयारी, एपिलेशन/deparaffinization, प्रतिजन पुनः प्राप्ति और धुंधला23शामिल हैं । यह सुनिश्चित करने के लिए आवश्यक है कि रोगी से निकाले गए ऊतक तुरंत formalin और ऊतक संरेखण और अभिविंयास में तय किया जाता है सावधानी से संरक्षित जब आयल में फिक्स्ड । ऊतक पतले एक microtome के उपयोग के साथ खोदी गई है और एक एपिलेशन कदम है कि xylene, इथेनॉल और पानी में कई धोने की आवश्यकता है बहोत । अगले कदम, प्रतिजन है़ कहा जाता है, formalin निर्धारण के दौरान गठित methylene लिंकेज को तोड़ने की जरूरत है और एक साइट्रेट आधारित बफर और नम गर्मी की आवश्यकता है । स्लाइड अंतर्जात peroxidase एंजाइमों कि प्रतिजन का पता लगाने के साथ हस्तक्षेप कर सकते हैं ब्लॉक करने के लिए हाइड्रोजन पेरोक्साइड के साथ इलाज कर रहे हैं । धुंधला प्रक्रिया अगले पतला प्राथमिक एंटीबॉडी कि एक माध्यमिक एंटीबॉडी कि प्राथमिक प्रतिजन-एंटीबॉडी प्रतिक्रिया का पता लगाने जाएगा लागू करने के बाद ब्याज की प्रतिजन बांध देगा के साथ स्लाइड मशीन द्वारा प्रदर्शन किया है । यह एक chromogen ढाब-सब्सट्रेट जो एक भूरे रंग का है कि माइक्रोस्कोप के तहत कल्पना की है रूपों के साथ लेबलिंग के बाद है । अंतिम कदम एक स्थाई यकीन है कि बुलबुले की तरह कोई हस्तक्षेप पदार्थ कवर पर्ची और सतह के बीच गठन कर रहे है बनाने के समाधान के साथ ऊतक के बढ़ते सावधान है । प्रोटोकॉल के लिए धमनी ऊतक के उपयोग को समायोजित संशोधनों की आवश्यकता है । अध्ययन के बाद से जीसीए में FRB का मूल्यांकन करने के लिए पहली बार था, इष्टतम एंटीबॉडी एकाग्रता अज्ञात और 1:50, 1:100, 1:200, 1:400, 1:800, 1:1600, सबसे कम पृष्ठभूमि शोर या पर प्राप्त संकेत में सर्वश्रेष्ठ धुंधला गुणवत्ता के साथ 1:3200 पर कई कमजोर पड़ने की जरूरत थी 1:800.

झिल्ली से जुड़े FRB पहले रॉस एट अल.18,24 द्वारा मांय था और सामांय अपरा कोशिकाओं, न्यूट्रोफिल, क्रोनिक माईलोजेनस रक्त ल्यूकेमिया, promyelocytic ल्यूकेमिया में ल्यूकेमिया से प्रभावित विस्फोटों में व्यक्त किया जा पाया गया था, myelomonocytic की myeloblast आबादी, और erythroleukemias और एम1/M2 एक्यूट माईलोजेनस रक्त ल्यूकेमिया में बदलती है । संबध-शुद्ध खरगोश polyclonal एंटीबॉडी के लिए विशिष्ट FRB इन पहले काम करता था के बाद से रुमेटी गठिया सकारात्मक श्लेष मैक्रोफेज और ठोस अंग ट्यूमर के अध्ययन के लिए लागू किया गया है । FRB एंटीबॉडी इस प्रोटोकॉल में इस्तेमाल व्यावसायिक रूप से उपलब्ध नहीं है और व्यापक आवेदन बाधित हो सकता है । गर्भ धारण, पद्धति यहां वर्णित अंय FRB एंटीबॉडी के लिए भी काम कर सकते हैं, लेकिन बड़ी संख्या में इसके उपयोग से पहले व्यक्तिगत अनुकूलन की आवश्यकता होगी । के बाद से FRB काफी अपरा में व्यक्त की है, इस ऊतक बार किया गया है एक सकारात्मक नियंत्रण के रूप में उपयोग ।

अध्ययन डिजाइन एक छोटे से नमूना आकार तक सीमित है और आदर्श जीसीए के जल्दी और देर चरणों में प्राप्त टैब्स की बड़ी संख्या में सत्यापन की आवश्यकता थी । इसके अलावा, के बाद से FRB मैक्रोफेज फोलिक संयुग्मित एजेंटों और antifolates के साथ एक संभावित नैदानिक और चिकित्सीय लक्ष्य के रूप में सेवा कर सकते हैं, यहां प्राप्त डेटा को आगे के संदर्भ में FRB phenotype की जांच की जरूरत का समर्थन करता है एम 1 और M2 मैक्रोफेज ध्रुवीकरण. अंय निदान के संबंध में, इन परिणामों के साथ गैर इनवेसिव इमेजिंग दृष्टिकोण के लिए खुला अवसर FRB लक्षित फोलिक एसिड पीईटी इमेजिंग एजेंटों के संयुग्मित SPECT । इसके अतिरिक्त, यह देखते हुए कि मैक्रोफेज घुसपैठ रोग प्रगति और atherosclerosis, त्वग्काठिन्य, सारकॉइडोसिस, और रुमेटी गठिया में गतिविधि की एक बानगी है, इस प्रोटोकॉल का उपयोग इन स्थितियों में आवेदन पा सकते हैं ।

इस पहली प्रोटोकॉल अभिव्यक्ति और जीसीए में FRB के वितरण का पता लगाने के लिए है । आइएचसी एक मनोरम पार अनुभागीय और टा के कई विचारों की अनुमति दी और प्रतिरक्षा घुसपैठ और धमनी microenvironment के बीच संख्यात्मक संबंधों का विश्लेषण की अनुमति देता है । frb कुल मैक्रोफेज कि संवहनी दीवार के सभी परतों घुसपैठ की 30% शामिल है, लेकिन दिलचस्प है, FRB intima में नहीं मिला और केवल adventitia और मीडिया के लिए स्थानीयकृत । वितरण के इस पद्धति का अंतर कोलेजन रचना मीडिया और adventitial25परतों में पाया के लिए FRB मैक्रोफेज tropism पर उपंयास अंतर्दृष्टि प्रकट हो सकता है । प्रतिरक्षा घुसपैठ के बारे में ६०% लिम्फोसाइटों शामिल (के रूप में पैन-लिम्फोसाइट मार्कर विरोधी CD3 द्वारा मापा) और ४०% मैक्रोफेज (पान-मैक्रोफेज मार्कर विरोधी CD68 द्वारा चिह्नित) । एक ताजा अध्ययन जीसीए निदान के लिए एक उच्च संवेदनशीलता के साथ CD3 संबंधित जबकि एक अंय लिंक CD68 अभिव्यक्ति उच्च रोग गतिविधि । इस प्रकार, हम प्रस्ताव है कि जल्दी जीसीए संवहनी प्रतिरक्षा वातावरण लिम्फोसाइटों के 60:40 अनुपात के साथ शुरू होता है: मैक्रोफेज के 30% के साथ मैक्रोफेज जा रहा है FRB सकारात्मक । क्या इस के लिए सच रखती है और लगातार जल्दी रोग के साथ रोगियों में प्रदर्शन किया आगे भविष्य और भावी प्रयोगों में मांय होना चाहिए । यदि यह सेलुलर घुसपैठ वितरण लगातार रखती है, यह तो जीसीए रोग गतिविधि के लिए के रूप में अगोचर कंपोजिट सेवा कर सकते हैं ।

अंत में, इस प्रोटोकॉल पहली बार मीडिया और जीसीए में लौकिक धमनियों के adventitia में FRB घुसपैठ की उपस्थिति के लिए प्रदर्शन किया । FRB मैक्रोफेज एक प्रारंभिक और सक्रिय जीसीए microenvironment ६०% लिम्फोसाइटों और ४०% मैक्रोफेज से बना में कुल मैक्रोफेज जनसंख्या के एक तिहाई के बारे में प्रतिनिधित्व किया ।

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Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

यह काम डॉ डगलस सीढ़ियों, Marianne Klinger, एन Benko, संधिवातीयशास्त्र के प्रभाग/चिकित्सा और आणविक और Histopathologic कोर प्रयोगशाला, पेन स्टेट यूनिवर्सिटी कॉलेज ऑफ मेडिसिन, Hershey पीए के सहयोग से संभव बनाया गया था ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Microtome Reichert-Jung
plain and frosted microscope slides and cover slips Fisher Scientific 
Vertical rack Fisher Scientific 
Light microscope Olympus BX60  microscope
Xylene
Acetone in distilled water concentrations 100%, 90%, 70%
Tris-buffered saline solution (TBS)  Dako Wash BufferS3006
3% hydrogen peroxide in TBS
Diaminobenzidine (DAB) Sigma Fast Tablet set
Chemical Permount  Mounting Medium Fisher Scientific  SP-15-100
Harleco Gill's III Hematoxylin Fiisher Scientific 23-750-019
Harleco Eosin Y 1% Alcoholic Stock Solution Fisher Scientific  23-749-977
10 mM citric acid monohydrate (pH 6.0)
Polyclonal rabbit anti-folate receptor beta  Manohar Ratnam optimized at 1:800
Monoclonal mouse anti-human CD68 Dako  M071801 optimized at 1:200
Polyclonal rabbit anti-CD3 Agilent Dako A0452 optimized at 1:100
Polymer goat anti- rabbit/mouse secondary antibody Dako
Placental tissue  for FRB positive control

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विशाल कोशिका Arteritis में फोलेट रिसेप्टर बीटा मैक्रोफेज और संवहनी प्रतिरक्षा Microenvironment प्रोफाइल करने के लिए एक Immunohistopathologic अध्ययन
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Albano-Aluquin, S., Malysz, J., Kidacki, M., Ratnam, M., Olsen, N. J. An Immunohistopathologic Study to Profile the Folate Receptor Beta Macrophage and Vascular Immune Microenvironment in Giant Cell Arteritis. J. Vis. Exp. (144), e58713, doi:10.3791/58713 (2019).

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