Summary
该协议说明了使用组织病理学检查和免疫组织化学来描述叶酸受体β巨噬细胞及其与全免疫细胞浸润的关系, 在颞动脉活检在巨细胞动脉炎。
Abstract
巨细胞动脉炎 (gca) 是一种影响老年人的中大型动脉慢性免疫介导的疾病。gca 表现为关节炎和头痛、中风或视力下降的闭塞症状。巨噬细胞和 t 辅助淋巴细胞浸润血管壁, 产生促炎症反应, 导致血管损伤和缺血。到目前为止, 还没有 gca 生物标志物可以监测疾病活动和指导治疗反应。
叶酸受体β (frb) 是一种糖基磷脂甾醇蛋白, 锚定在细胞膜上, 通常表达在骨髓细胞系和大多数骨髓性白血病细胞, 以及在肿瘤和类风湿滑膜巨噬细胞,它的表达与疾病的严重程度有关。frb 结合叶酸化合物、叶酸结合剂和抗叶酸药物的能力使其成为癌症和炎症性疾病研究中的一个可吸毒靶点。本报告描述了组织病理学和免疫组化方法, 用于评估 frb 的表达和分布与 gca麻醉正理学。
用血红素和 eosin 对 gca 和正常对照组的福尔马林固定和石蜡包埋的颞动脉活检进行染色, 以回顾组织组织学特征并确定其病理学特征。免疫组织化学用于检测 frb、cd68 和 cd3 的表达。进行了微观分析, 以量化10个选定的高功率场部分的阳性染色细胞的数量及其各自在动脉壁的位置。
淋巴缺血细胞 (lh) 炎症伴内膜增生和弹性片受干扰在 gca 中被发现, 对照组没有发现。lh 浸润由大约60% 的淋巴细胞和40% 的巨噬细胞组成。frb 表达仅限于巨噬细胞, 占 cd688+ 巨噬细胞总数的 31%, 并局部到媒体和外膜。在控件中没有看到 frb。
该方案证明了 frb 巨噬细胞相对于 gca 血管免疫微环境的独特的数值和空间模式。
Introduction
巨细胞动脉炎 (gca) 是一种针对主动脉及其分支并影响老年人的中大动脉炎症性疾病。它表现为轻度至重度缺血性并发症, 如头痛、下巴疼痛、视力下降、中风和组织坏疽。诊断是由高炎症标志物, 如红细胞沉降率 (esr) 和一个独特的组织病理学模式的颞动脉活检 (tab)1证实。gca 是最常见的成人血管炎, 获得诊断的颞动脉的可及性比其他血管病变具有优势, 从而使人们能够更容易地研究其发病机制。tab 上的典型发现包括巨噬细胞 (巨噬细胞) 和 t 淋巴细胞浸润, 这些血管层在内膜、培养基和肌细胞的所有维度层中都有浸润, 同时破坏了通常将这些血管层分开的弹性层隔间2。目前的证据表明, gca 涉及一种未知的抗原, 它激活血管外膜中的树突状细胞, 然后招募辅助 t (th) 细胞, 特别是分泌白细胞介素-17 和干扰素伽玛 (ifg)。ifg 然后招募和激活巨噬细胞产生细胞因子和蛋白酶。这些包括促炎细胞因子;包括 il-12, 它相互激活 th1 细胞, 从而提供一个正反馈回路;肿瘤坏死因子和白细胞介素-6, 引起关节炎和发烧和金属蛋白酶, 损害弹性层。糖皮质激素 (gc) 构成标准的慢性治疗, 通过衰减 th17 il-17 而不是免疫反应的 thiifg 臂 3, 4,部分控制细胞因子通路.不幸的是, 停止 gc 导致疾病复发。作为一种替代方法, 甲氨蝶呤已被重新用于 gca 治疗, 但尽管更敏感的生物标志物尚未用于治疗监测5,6, 但所需的临床终点并没有一致实现。.2017年, 白细胞介素6阻滞剂 tocilizumab 被批准用于治疗 gca, 因为它有效地显示了疾病控制和类固醇的保护效果7,8。
到目前为止, gca 还没有很好的生物标志物。因此, 很难监测疾病活动和对现有药物的滴定剂量, 以避免不利影响, 减轻社会成本负担。因此, 必须寻找与疾病活动相关的候选生物标志物, 提供新的关于发病机制的见解, 并在治疗决策中提供帮助。
巨噬细胞活化失调是 gca 发病机制的关键因素。因此, 治疗 gca 的有效方法可能是选择性靶向活化巨噬细胞。叶酸受体β (frb) 是一种糖基磷脂酰肌醇糖蛋白, 锚定在正常粒细胞细胞、髓样白血病细胞和活化巨噬细胞中表达的细胞膜上。它的配体, 叶酸, 是一种必需的维生素, 在其减少的形式, 这使得细胞 dna 合成, 甲基化和修复9。frb 在自身免疫性疾病和癌变过程中被诱导表达。其表达仅限于类风湿关节炎单核细胞或促炎性 m1 巨噬细胞的表面, 或在固体器官和骨髓恶性肿瘤中的抗炎 m2 巨噬细胞 10, 11,12,13. 除了其作为活化巨噬细胞的生物标志物的潜在作用外, frb 还可以通过一个多步骤的过程, 从细胞内的受体与叶酸、抗叶酸或叶酸结合药物开始, 从而实现选择性药物运输表面, 然后将所需药物内化、释放并最终输送到内部细胞机械 12、14、15、16.与 frb 在癌细胞和活化巨噬细胞中表达相比, 在正常造血细胞中表达的 frb 无法结合叶酸, 从而确保 frb/folt 介导的药物传递仅限于 frb 阳性炎症或癌细胞。
在我们之前的研究中, 我们首次证明了 frb 在 gca 巨噬细胞中的表达, 其表达与 cd688+ 和内皮素受体β巨噬细胞相关, 这对 gca 的发病机制17有一定的贡献。在本报告中, 我们描述了用于评估 frb 巨噬细胞的组织病理学和免疫组织化学方法, 并分析了总淋巴细胞和巨噬细胞计数, 以深入了解 frb 在 gca 血管景观中的位置。
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Protocol
所述所有方法都得到了宾州机构审查委员会的批准。
1. 获得时间动脉活检后的组织病理学准备及处理
请注意:颞动脉活检 (tab) 是在局部麻醉和无菌条件下由认证的外科医生进行的。手术后, 获得3厘米动脉部分在受影响较大的一侧, 标本被固定在福尔马林立即 24小时, 分为3至4毫米的部分, 并嵌入石蜡, 注意适当的对齐组织在块然后在室温下储存。样本选择是在验证病历后进行的。诊断是基于1990年美国风湿病学院的标准, 要求研究对象满足5个领域中的3个领域: 年龄和 gt;50 年、新头痛、颞动脉压痛、红细胞沉降率 & gt;50 mmm/gn 方法和一个不正常的 tab。为了安全起见, 在处理标本、化学品和抗体时, 必须始终佩戴防护手套。
- 从嵌入块中, 使用微孔切割4-5 微米厚的部分。和染色与血红素和 eosin (h & e)。使用选定正常组织的控制部分进行质量保证。
- 在加热至40°c 的温水浴上漂浮切割部分, 以消除皱纹, 并拿起涂层玻璃微观幻灯片。 将玻璃滑块放在60°c 烤箱中的热板上 60分钟, 以便干燥和将部分粘附在滑块上。
- 将玻璃滑块放在60°c 烤箱中的热板上 60分钟, 以便干燥和将部分粘附在滑块上。
- 在显微镜幻灯片上安装3个部分。
- 将滑梯放置在垂直机架中, 并在37°c 下过夜24小时。
- 将幻灯片放入容器中, 并存放在4°c。
2. 免疫组织化学制剂、脱蜡、抗原回收和染色15、18、19、20
- 将幻灯片加载到幻灯片机架中。运行机架通过菜式如下: 两次在100% 二甲苯 5分钟, 每30秒的温和搅拌 10秒, 一次在100% 乙醇与10秒的搅拌, 一次在90% 乙醇与10秒搅拌, 一次在70% 乙醇与10秒搅拌, 并在双蒸馏 h2o 与10秒的搅拌。
注: 处理二甲苯和丙酮应在通风罩中进行, 以避免吸入和呼吸毒性。 - 将机架转移到一个玻璃容器中, 该容器的温度为 200 ml, 为 10mmol, ph 6.0 柠檬酸缓冲液预热至95°c。在水浴中设置计时器 30分钟, 然后在室温下冷却 20分钟, 然后用自来水冲洗5分钟。
- 在3% 过氧化氢的200毫升中孵育 10分钟, 去除内源性过氧化物酶活性。在200μl 的三缓冲盐溶液 (tbss) 中清洗滑块3次。
- 从机架上取下幻灯片, 轻轻轻拍每张幻灯片, 擦拭多余的缓冲液。对于染色, 添加以下主要抗体 200μl, 在幻灯片上添加盖板, 并在潮湿的室内孵育 1小时, 在室温下:
抗 frb 抗体稀释1:800
单克隆小鼠反人类 cd68, 1: 200 稀释
多克隆兔抗 cd3 1:100 稀释
注: 胎盘福尔马林固定石蜡嵌入部分也按照步骤2.1 至2.9 中的规定进行处理, 并用抗 frb18 孵育, 并用作阳性对照。染色结果是通过寻找最佳抗体浓度获得的, 是通过用双稀释法滴定抗体来实现的 (例如, 1:50、1:50、1:50、1:50、1:50、11600)。 - 孵育后取下盖板滑移并丢弃。用 tbss 冲洗滑块 3次, 每次 2分钟, 排出多余的缓冲液。
- 加入含有生物素化抗兔子类二级抗体的200μl 二级抗体溶液, 与与组织抗原结合的非共轭原代抗体发生反应。将盖板放在滑梯上, 在潮湿的室内孵育45分钟。
- 孵育后取下盖板滑移并丢弃。用 tbs 冲洗滑块 3次, 每次 2分钟, 排出多余的缓冲液。
- 加入200μl 的二胺苯胺 (dab) + 底物缓冲液 (咪唑 hcl)-铬原系统, 孵育 10分钟, 以显示染色模式。用 tbss 清洗, 然后在自来水中清洗10分钟。
- 用血红素进行3分钟的反染色。
- 通过将70μl 的安装介质应用到滑块表面来安装幻灯片。慢慢地将盖板倾斜到安装介质上, 并避免在降低其位置时产生气泡。等待24小时才能干燥。
3. 病理组织学和免疫组织化学 (ihc) 分析
用光学显微镜检查 gca 阳性和正常受试者的 h & e 和 ihc 染色切片。
-
对于 h & e 染色部分:
- 评估血管结构, 识别内皮细胞内膜, 平滑肌细胞中的 tunica 培养基, 以及外膜炎 21,22的成纤维细胞和血管。
- 识别 gca 特征, 包括淋巴细胞和巨噬细胞浸润、细胞增生和内部弹性层的降解。
- 通过识别和定量分析与淋巴细胞相关的巨噬细胞数量, 分析淋巴血细胞浸润。评估内弹性层块破坏和常驻细胞增生变化的程度, 并与对照进行比较。
-
对于 ihc 染色部分:
- 检查 frb 的染色模式, 注意其按特定类型或类型的细胞的表达, 其在血管层中的分布, 以及它与总免疫浸润、总巨噬细胞标记、抗 cd68 和平底锅的关系淋巴细胞标志物抗 cd3。
- 通过计算10个随机选择的高功率场 (hpf) 上的阳性染色细胞, 量化 frb、cd68 和 cd3 细胞的表达, 并记录其表达方式。
请注意:这些正常和病理细胞和结构的鉴定是由一个认证的心血管病理学家 (j. m.) 和风湿病学家 (s. a. a.) 进行的, 结果记录在所有病例。 - 使用数码相机捕获代表性图像。
请注意:完成这些步骤后, 剩余的等价物可存储在-80°c。
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Representative Results
病理组织学发现
正常标本中的 h & e 染色显示正常动脉解剖, 内膜内皮细胞, tunica 培养基中的平滑肌细胞, 以及包括成纤维细胞和供体血管的异质胶原蛋白基质, 称为 vasa vasorum在 tunica 外膜。没有发现炎症浸润。gca 正颞动脉表现为中度至重度炎症, 具有巨噬细胞、淋巴细胞、偶尔的浆细胞和多核巨细胞聚集。注意到椎动脉狭窄, 并伴有内膜增厚和90% 的内部弹性层部断裂 (图 1)。
免疫组化发现
所有 gca + 标本中都存在 cd3 + 淋巴细胞和 cd688+ 巨噬细胞, 并在所有活检中显示出相似的染色模式。淋巴细胞主要在巨噬细胞上, cdh/cd68 比为1.6。frb 的染色仅限于巨噬细胞和多核巨细胞, 它们优先定位到外膜和介质 (表 1和图 2)。对照标本显示白细胞 (和 lt;5 细胞/高功率场), 没有 frb 表达。
图 1:h & e 图像的颞动脉.(a) 代表 h & e 图像的正常颞动脉具有不同的层的 tunica (t) 外膜, 媒体, 和内膜从最外层到内部。注意外膜 (粗箭) 中的胶原蛋白和血管的网络, 培养基中的平滑肌细胞 (细箭), 以及内膜内皮细胞 (10倍放大)。(b) 内印界面的放大微图由 a 中的矩形插入突出显示, 并由内部弹性层 (箭头) (20x 放大倍率) 分隔。(c) h& e 代表图像的 ta 与巨细胞动脉炎的标志是经膜淋巴淋巴监督细胞浸润 (厚箭头), 内膜增生和破坏内部弹性板 (箭头) (10倍放大)。请点击这里查看此图的较大版本.
图 2: 巨大细胞动脉炎的颞动脉免疫组化染色.(a) 代表性图像显示广泛的炎症浸润与 cd68 阳性巨噬细胞和巨细胞 (箭头) 发现主要在媒体和外膜 (10倍放大)。(b) 叶酸受体β (frb) 在激活的巨噬细胞 (箭头) 中选择性地表达 (10倍放大)。在较高功率下拍摄的图像显示 frb 阳性巨噬细胞 (c) 和 cd68 阳性巨噬细胞 (d) (100x放大)。请点击这里查看此图的较大版本.
| gca 科目 (n 5) | 平均值 (±sd) |
| cd3 (占免疫浸润的百分比) | 61.7±4。1 |
| cd68 (占免疫浸润的百分比) | 388.3±4。1 |
| cd68 组织巨噬细胞 (cellss/hpf) | 34.8±10。4 |
| frb + 巨噬细胞 (cells1/. hpf) | 10.8±4。4 |
| % frb2 | 31±12。7 |
表 1: frb、cd68 和 cd3 表达的摘要。
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Discussion
gca 是成人中最常见的血管炎, 其病理特征体现了 t 辅助淋巴细胞和活化巨噬细胞的有力组合, 也可以在其他肉芽肿性疾病或血管病, 如结节病和肉芽肿性多血管炎2,3。在 gca 中, 颞动脉提供了一个中到大大动脉的良好表示, ta 活检提供了一个相当大的样本, 可以存储在石蜡块多年, 从而创造了机会, 研究新兴诊断和像 frb 这样的治疗靶点在血管微环境中。我们利用可接触组织和标准免疫病理方法提供的优势, 询问是否可以通过 ihc 可靠地分析 frb。我们的研究结果表明, 组织病理学和 ihc 不仅可以作为确认血管损伤的诊断和程度的宝贵工具, 而且可以作为验证不同巨噬细胞亚型在 gca 中的作用的宝贵工具。
组织病理学和 ihc 方法都是劳动密集型的, 需要组织化学技术人员、病理学家和风湿病学家的技能, 但这些技术已经建立, 可以作为使用其他方法的跳板, 如免疫荧光和流式细胞术。然而, 这种方法的缺点是需要新鲜的冷冻组织, 这需要前瞻性的收集。ihc, 连同组织病理学检查, 是非常宝贵的, 在提出血管免疫微环境的全景透视, 可以反复访问和分析, 特别是随着新的蛋白质的出现, 如 frb。血红素和 eosin (h & e) 染色使人们能够回顾组织组织学。血红素染色细胞核, 突出核细节, 而 eosin 作为一种反染色, 有助于显示核和细胞质特征之间的差异。使用选定正常组织的控制部分对于评估质量保证至关重要。
ihc 通过使用显微镜观察到的多种抗体, 检测冷冻或福尔马林固定和石蜡包埋组织中感兴趣的抗原。该协议改编自范德尔黑杰登等人 15, 谁证明 frb 表达滑膜巨噬细胞在类风湿关节炎。基本的 ihc 步骤包括组织制备、去蜡化、抗原回收和染色23。重要的是要确保从患者身上取出的组织立即固定在福尔马林和组织对齐和方向时, 要精心保存在石蜡中。组织被稀薄地分割与使用微本并且遭受脱蜡步需要在二甲苯、乙醇和水中多次清洗。下一步, 称为抗原回收, 是需要打破在福尔沙林固定过程中形成的亚甲连接, 并需要一个以柠檬酸为基础的缓冲液和湿热。幻灯片用过氧化氢处理, 以阻断内源性过氧化物酶, 这可能会干扰抗原检测。染色程序下一步是通过孵育幻灯片与稀释的初级抗体, 将绑定感兴趣的抗原, 然后应用二级抗体, 将检测初级抗原抗体反应。然后用彩色 dob 基板标记, 该基板形成一种在显微镜下可视化的棕色颜料。最后一步是用永久溶液小心安装组织, 确保在盖滑和表面之间不形成气泡等干扰物质。该协议需要修改, 以适应动脉组织的使用。由于这项研究是首次评估 gca 中 frb 的研究, 因此在1:50、1:50、1:50、1:50、1:50、1:50、1:3200 时, 最佳抗体浓度是未知的, 在最低背景噪声或信号下, 最佳染色质量或信号达到了最佳的1: 800。
膜相关的 frb 早在 ross 等人18, 24 中得到了证实, 并被发现在正常的胎盘细胞、中性粒细胞、慢性骨髓性白血病、早幼粒细胞白血病中表达,骨髓细胞增多症和白血病的成髓细胞群, 不同程度的是 m半 m2 急性粒细胞白血病。早期作品中使用的抗亲和力兔 frb 特异性多克隆抗体已被应用于类风湿性关节炎阳性滑膜巨噬细胞和实体器官肿瘤的研究。本协议中使用的 frb 抗体在商业上不可用, 可能会妨碍广泛的应用。可以想象, 这里描述的方法也可能适用于其他 frb 抗体, 但在使用更多之前需要进行单独的优化。由于 frb 在胎盘中有显著表达, 这种组织被反复用作阳性对照。
研究设计受到小样本量的限制, 需要对更多的 tab 进行验证, 理想情况下是在 gca 的早期和后期获得的。此外, 由于 frb 巨噬细胞可以作为一个潜在的诊断和治疗目标与叶酸共轭剂和抗叶酸, 这里获得的数据支持需要进一步审查 frb 芬型的背景下, m1 和 m2 巨噬细胞极化。在其他诊断方面, 这些结果为 pet 成像剂的 frb 靶向叶酸共轭 spect 非侵入性成像方法提供了机会。此外, 鉴于巨噬细胞浸润是动脉粥样硬化、硬皮病、结节病和类风湿关节炎的疾病进展和活性的标志, 使用该协议可以在这些条件下找到应用。
这是第一个探索 frb 在 gca 中的表达和分布的协议。ihc 允许了 ta 的全景横截面和多种视图, 并允许分析免疫浸润和动脉微环境之间的数值关系。frb 占浸润血管壁所有层的巨噬细胞总数的 30%, 但有趣的是, frb 并没有在内膜中发现, 只定位到外膜和培养基。这种分布模式可以揭示 frb 巨噬细胞取向的不同的胶原蛋白成分在介质和外周层 25发现的新的见解。免疫浸润包括约60% 的淋巴细胞 (由泛淋巴细胞标记抗 cd3 测量) 和40% 的巨噬细胞 (标记为泛巨噬细胞标记抗 cd68)。最近的一项研究将 cd3 与 gca 诊断的敏感性相关, 而另一项研究将 cd68 表达的较高的疾病活性联系起来。因此, 我们建议早期的 gca 血管免疫环境开始与60:40 比例的淋巴细胞: 巨噬细胞与30% 的巨噬细胞是 frb 阳性。这是否适用于早期疾病患者, 并在早期疾病患者中得到一致证明, 应该在未来和未来的实验中得到进一步验证。如果这种细胞浸润分布持续存在, 它可能会成为 gca 疾病活动的生物标志物复合材料。
总之, 该协议首次显示了在 gca 的媒体和颞动脉外膜的 frb 浸润的存在。frb 巨噬细胞约占巨噬细胞总数的三分之一, 在早期活跃的 gca 微环境中, 由60% 的淋巴细胞和40% 的巨噬细胞组成。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
这项工作是在道格拉斯·斯泰尔博士、玛丽安·克林格、安·本科、风湿病系/医学司以及宾州立大学医学院分子和组织病理学核心实验室的支持下得以完成的。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Microtome | Reichert-Jung | ||
| plain and frosted microscope slides and cover slips | Fisher Scientific | ||
| Vertical rack | Fisher Scientific | ||
| Light microscope | Olympus BX60 microscope | ||
| Xylene | |||
| Acetone in distilled water | concentrations 100%, 90%, 70% | ||
| Tris-buffered saline solution (TBS) | Dako Wash BufferS3006 | ||
| 3% hydrogen peroxide in TBS | |||
| Diaminobenzidine (DAB) | Sigma Fast Tablet set | ||
| Chemical Permount Mounting Medium | Fisher Scientific | SP-15-100 | |
| Harleco Gill's III Hematoxylin | Fiisher Scientific 23-750-019 | ||
| Harleco Eosin Y 1% Alcoholic Stock Solution | Fisher Scientific | 23-749-977 | |
| 10 mM citric acid monohydrate (pH 6.0) | |||
| Polyclonal rabbit anti-folate receptor beta | Manohar Ratnam | optimized at 1:800 | |
| Monoclonal mouse anti-human CD68 | Dako | M071801 | optimized at 1:200 |
| Polyclonal rabbit anti-CD3 | Agilent Dako | A0452 | optimized at 1:100 |
| Polymer goat anti- rabbit/mouse secondary antibody | Dako | ||
| Placental tissue | for FRB positive control |
References
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