Summary
Protokol histopatolojik tetkik ve folat reseptör beta makrofaj ve toplam bağışıklık hücre ilişki içinde dev hücreli arterit temporal arter biyopsisi sızmak profiline immünhistokimya kullanımını göstermektedir.
Abstract
Dev hücreli arterit (GCA) büyük yetişkin etkileyen kronik immün aracılı orta-büyük ölçekli arterlerin bir hastalıktır. GCA bildirimleri artrit ve tıkayıcı belirtiler baş ağrısı, kontur veya vizyon kaybı. Makrofajlar ve T-helper lenfositler vasküler duvar sızmak ve gemi hasar ve iskemi neden bir pro-inflamatuar yanıt üretmek. Bugüne kadar hastalık aktivite ve Kılavuzu terapötik yanıt izleyebilirsiniz hiçbir GCA biyomarker olduğunu.
Folat reseptör beta (FRB) hücre zarı üzerinde bağlantılı ve normalde myelomonocytic soy ve myeloid lösemi hücreleri de tümör ve romatoid sinovyal makrofajlar gibi çoğunluğu ifade bir glycosylphosphatidylinositol proteindir, nerede ifadesini hastalık şiddeti ile karşılıklı olarak ilişkilendirir. FRB folat bileşikleri, folik asit conjugates ve antifolate ilaçlar bağlama yeteneği o kanser ve inflamatuar hastalıkları araştırma druggable bir hedef yaptı. Bu rapor ifade ve GCAimmunopathology ile ilgili olarak FRB dağılımı değerlendirmek için kullanılan histopatolojik ve immunohistokimyasal yöntemleri açıklar.
Formalin sabit ve parafin gömülü temporal arter biyopsisi GCA ve normal denetimlerin Hematoksilen ve eozin ile doku histolojisi gözden geçirin ve patognomonik olan özellikleri bulmak için lekeli. İmmünhistokimya FRB, CD68 ve CD3 ifade algılamak için kullanıldı. Mikroskopik analiz 10 seçilen yüksek power alanlı bölümler ve ilgili konumlarını arteryel duvardaki olumlu lekeli hücre sayısı ölçmek için gerçekleştirildi.
İntimal hiperplazi tarafından Lymphohistiocytic (LH) inflamasyon eşlik ve kesintiye elastik lamina GCA içinde yok denetimlerde bulunamadı ile görüldü. LH infiltrat yaklaşık % 60 lenfositler ve % 40 makrofajlar oluşmaktadır. FRB ifade toplam CD68 + makrofaj nüfusunun % 31'i oluşan ve medya ve adventitia için yerelleştirilmiş makrofajlar, sınırlı. Hiçbir FRB denetimlerde görüldü.
Bu iletişim kuralı FRB makrofaj vasküler bağışıklık microenvironment GCA içinde göre farklı sayısal ve kayma örnek gösterdi.
Introduction
Dev hücreli arterit (GCA) orta büyük arter, aorta ve dalları hedefleme ve eski yetişkin etkileyen iltihabi bir hastalıktır. Hafif baş ağrısı, çene ağrısı, görme kaybı, kontur ve doku kangren gibi ağır iskemik komplikasyonlara sunar. Tanı eritrosit sedimantasyon hızı (ESR) ve farklı bir histopatolojik desen temporal arter biyopsisi (sekmesi)1gibi yüksek inflamatuar işaretleri tarafından onaylanır. GCA en yaygın yetişkin vaskülit ve tanı için elde edilen temporal arter erişilebilirliğini böylece bir daha kolay onun patogenezi okumaya etkinleştirme diğer vasculopathies üzerinde bir avantaj sunuyor. Tipik bulguları sekmesinde bir infiltrat makrofajlar/histiyosit ve normalde bunlar ayıran elastik lamina eşzamanlı imha ile tunica intima, medya ve adventitia tüm vasküler katmanları arasında bulunan T lenfosit içerir bölmeleri2. Geçerli kanıt GCA vasküler adventitia dendritik hücrelerde etkinleştirir bilinmeyen bir antijen içerdiğini gösterir, yardımcı işe alma tarafından takip T (Th) hücreleri, hangi interlökin-17 salgılar özellikle Th1 ve Th17 alt türlerini ve interferon-gamma (IFG) anılan sıraya göre. IFG sonra acemi ve makrofajlar sitokinler ve proteaz üretmek için etkinleştirir. Bunlar pro-inflamatuar sitokinlerin karşılıklı Th1 hücre böylece pozitif geribesleme sağlamak etkinleştirir IL-12 de dahil olmak üzere; tümör nekroz faktör ve interlökin-6, artrit ve ateş ve metalloproteases neden elastik lamina zarar verebilir. Standart kronik tedavi oluşturan sebepler (GC), kısmen Th17/IL-17 ama değil Th1/bag kol bağışıklık yanıtı3,4inceltiyorum sitokin yolları kontrol. Ne yazık ki, GC kesilmesi hastalığın nüks içinde sonuçlanır. Alternatif bir yöntem olarak metotreksat GCA tedavisinde repurposed ama daha duyarlı biyolojik tedavi izleme5için,6 kullanılmıştır değil, ancak istenen klinik bitiş noktaları sürekli olarak elde edildi değil . Hastalık kontrol ve steroid etkileri7,8tutumlu etkili bir şekilde gösterildiği gibi 2017 yılında, interlökin 6 kütük parçası, tocilizumab, GCA tedavisi için onaylanmıştır.
Bugüne kadar hiçbir iyi biyolojik GCA için vardır. Sonuç olarak, hastalık etkinliğini izlemek ve yan etkileri önlemek ve topluma maliyet yükü azaltmak için kullanılabilir uyuşturucu doz titre zordur. Böylece, bir aday biyomarker hastalık aktivitesi ile ilişkilendirir sağlamak yeni anlayışlar patogenez ve tedavi edici kararlar yardım aramak için zorunludur.
Makrofaj harekete geçirmek bozukluk GCA patogenezinde önemli bir faktördür. Böylece, GCA tedavi için etkili bir yol aktif makrofajlar seçici hedefleme olabilir. Folat reseptör beta (FRB) hücre membran üzerinde bağlantılı bir glikosil-phosphatidylinositol glikoprotein ifade normal myelomonocytic hücrelerde, myeloid lösemi hücreleri ve makrofajlar harekete geçirmek olduğunu. Onun ligand, folik asit, hücresel DNA sentezi, metilasyonu ve onarım9sağlar onun azaltılmış formundaki gerekli bir vitamindir. FRB ifade otoimmün hastalığı ve karsinojenezis sırasında indüklenen. İfadesini solid organ ve myeloid maligniteler10,11,12 monosit veya pro-inflamatuar M1 makrofajlar Romatoid Artritte yüzeyine veya anti-inflamatuar M2 makrofajlar sınırlıdır , 13. bir biyomarker aktif makrofajlar gibi potansiyel rolüne ek olarak, FRB seçici uyuşturucu taşıma başlatmak için folik asit, antifolates veya folat Birleşik ilaçlar hücre reseptör bağlama ile bir çok adımlı işlem aracılığıyla etkinleştirebilirsiniz yüzey, ardından içselleştirilmesi, yayın ve istenen uyuşturucu nihai teslimat iç hücre makine12,14,15,16. Aksine FRB kanser hücrelerinde ifade ve makrofajlar aktif, normal hematopoetik hücrelerin içinde ifade FRB böylece FRB/folat-aracılı ilaç dağıtım FRB pozitif enflamatuar veya kanser hücrelerinin sınırlıdır sağlanması folates bağlamak yapamaz.
Bizim önceki çalışmada FRB GCA makrofajlar içinde ifade edilir ilk kez gösterdi ve ifadesini CD68 + ve endotelin reseptör beta makrofajlar, GCA Patogenez17' ye katkıda korelasyon. Bu raporda, tarif biz histopatolojik ve immunohistokimyasal yöntemleri FRB makrofaj değerlendirmek için kullanılan ve toplam lenfosit analiz ve makrofaj GCA vasküler manzara FRB'ın bulunduğu bir anlayış kazanmak için sayar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Tüm yöntem tanımlamak Penn State kurumsal İnceleme Kurulu tarafından kabul edildi.
1. histopatolojik hazırlık ve Temporal arter biyopsi alma sonra işleme
Not: Temporal arter biyopsisi (sekmesi) lokal anestezi ve steril koşullarda sertifikalı bir cerrah tarafından gerçekleştirilir. Cerrahi olarak 3 cm arteryel kısım daha etkilenen tarafta elde ettikten sonra numune formalin 24 h için hemen sabit, 3-4 mm bölümlere ayrılmış ve parafin blok dokusunun doğru hizalaması dikkatli dikkat, gömülü olan daha sonra oda sıcaklığında depolanır. Örnek seçimi tıbbi kayıtları doğruladıktan sonra gerçekleştirilir. Tanı Amerikan konular 3 5 etki alanlarının yerine getirmek gerektiren Koleji üzerinde Romatoloji 1990 kriterlerinin dayanmaktadır: Yaş > 50 yıl, yeni baş ağrısı, temporal arter hassasiyet, eritrosit sedimentasyon hızı > 50 mm/saat Westergren yöntemi tarafından ve anormal bir sekme. Güvenliğiniz için koruyucu eldiven giymiş her zaman numuneler, kimyasallar ve antikorlar işlerken.
- Gömülü bloklardan bir microtome kullanma 4-5 µm kalınlığında bölümlerine kesti. ve hematoksilen eozin (H & E) ile leke. Seçili normal doku denetim bölümünü kalite güvencesi için kullanın.
- Kırışıklıkların kaldırmak ve kaplamalı cam mikroskobik slayt ile almak için 40 ° c sıcak su banyosu bölümlerde kesmek float ısıtmalı. Cam slaytlar kurutma ve slayt bölümünün bağlılık kolaylaştırmak 60 dakika 60 ° C fırında sıcak bir tabak yerleştirin.
- Cam slaytlar kurutma ve slayt bölümünün bağlılık kolaylaştırmak 60 dakika 60 ° C fırında sıcak bir tabak yerleştirin.
- 3 bölümden mikroskop slaytlarda bağlayın.
- Slaytları dikey raf ve 37 ° C'de kuru gece 24 h için yerleştirin.
- Bir konteyner ve mağaza 4 ° C'de slaytlar yeri
2. immunohistokimyasal hazırlık, mum eritme, antijen alma ve15,18,19,20 boyama
- Slaytları bir slayt raf yükleyin. Raf yemekleri ile aşağıdaki gibi çalıştırın: % 100 ksilen nazik ajitasyon her 30 saniyede, bir kez bir kez bir kez 10 saniye ajitasyon ile % 70 etanol içinde 10 saniye ajitasyon ile % 90 etanol içinde 10 saniye ajitasyon ile % 100 etanol 10 saniye ile 5 dakika içinde iki kere , ve iki kez içinde çift distile H2O 10 saniye ajitasyon ile.
Not: Ksilen ve aseton taşıma havalandırılmış davlumbaz inhalasyon ve solunum toksisite önlemek için yapılmalıdır. - Bir cam kaba 10 mmol/L, pH 6,0 sitrat arabellek 95 ° C'ye prewarmed 200 mL ile raf aktararak antijen almak Su banyosunda 30 dakika çekim ayarlayın, sonra oda sıcaklığında 20 dakika sonra 5 dakika boyunca akan su ile durulama için serin.
- Endojen peroksidaz aktivitesi 10 dakika boyunca 200 mL %3 hidrojen peroksit kuluçka tarafından kaldırın. Slaytlar tuzlu çözüm (TBSS) Tris tamponlanmış 200 µL içinde 3 kez yıkayın.
- Slaytlar rafa kaldırmak ve her birine aşırı arabellek hafifçe silin kurulamak. Boyama için aşağıdaki birincil antikorların 200 µL slaytlarda kapak irsaliyeleri eklemek ve nemli bir odası, oda sıcaklığında 1 saat kuluçkaya ekleyin:
1:800 Anti-FRB antikor seyreltilmiş
Monoklonal fare anti-insan CD68, 1: 200 seyreltme
Poliklonal tavşan anti-CD3 1: 100 seyreltme
Not: Parafin gömülü bölümleri plasenta Formalin sabit Ayrıca adımlar 2,1 2,9 ve anti-FRB18 ile inkübe özetlenen işlenen ve pozitif kontrol olarak kullanılan. Boyama sonuçları en iyi antikor konsantrasyon bularak elde edilmiştir ve çift dilutions (1:50, 1: 100, 1: 200, 1: 400, 1:800, 1:1600) antikor titrating tarafından gerçekleştirildi. - Kapak notu kuluçka ve atma sonra kaldırın. TBSS ile her 1 dakika için 3 kez slaytlar durulama, drenaj ve aşırı arabellek silin.
- 200 µL çekimsiz birincil antikor bağlı doku antijen ile tepki biotinylated Rabbit/fare ikincil antikor içeren ikincil antikor çözüm ekleyin. Coverslips slaytlar üzerine yerleştirin ve nemli bir odasında 45 dakika oda sıcaklığında kuluçkaya.
- Kapak notu kuluçka ve atma sonra kaldırın. TBS ile her 1 dakika için 3 kez slaytlar durulama, drenaj ve aşırı arabellek silin.
- Diaminobenzidine (DAB) + substrat arabellek (Imidazole HCl) 200 µL eklemek-Kromojen sistem ve desen boyama görselleştirmek için 10 dakika için kuluçkaya. TBSS ile sonra 10 dakika için musluk suyu çalışan yıkayın.
- Hematoksilen ile 3 dakika counterstain.
- Slaytları Slayt yüzeye montaj orta 70 µL uygulayarak bağlayın. Yavaş yavaş coverslip üzerine montaj orta uç ve yerine düşürdükçe kabarcıklar oluşturmaktan kaçının. Kuru için 24 saat bekleyin.
3. histopatolojik ve immunohistokimyasal (IHC) analiz
H & E ve hafif bir mikroskop kullanarak GCA olumlu ve normal konular bölümlerden lekeli IHC inceleyin.
-
H & E için bölümler lekeli:
- Vasküler mimari değerlendirmek ve tunica intima düz kas hücrelerinde tunica medya ve fibroblast ve vasa vasorum tunica adventitia21,22endotel hücrelerine tanımlar.
- Lenfosit, makrofaj/histiocyte infiltrasyon, hücresel hiperplazi ve iç elastik lamina bozulması içermektedir GCA özellikleri tanımlayın.
- Belirlenmesi ve makrofajlar göre lenfosit sayısı miktarının lymphohistiocytic infiltrat analiz. İç elastik lamina bozulma ve yerleşik hücre hyperplastic değişiklikler değerlendirmek ve kontrolleri ile karşılaştırın.
-
Bölümler lekeli IHC için:
- FRB toplam bağışıklık infiltrat, toplam makrofaj marker, anti-CD68 ve pan onun ifade belirli bir tip veya hücreleri ve vasküler katmanları ve ilişki içinde dağıtım türleri tarafından not alma, boyama desen incelemek lenfosit marker CD3 anti.
- Ifade FRB, CD68 ve CD3 hücre 10 olumlu lekeli hücreleri sayarak birden fazla rasgele seçilen yüksek güç alanı (hpf) ölçmek ve kayıt anlamına gelir.
Not: Bu normal ve patolojik hücre ve yapıları sertifikalı kardiyovasküler patolog (J.M.) tarafından gerçekleştirilen ve romatolog (S.A.A.) ve sonuçları tüm durumlar için kaydedildi. - Bir dijital kamera ile temsilcisi çekim.
Not: Bu adımlardan sonra aliquots kalan-80 ° C'de depolanmış olabilir
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Histopatolojik bulgular
H & E normal örnekler gösterdi normal damar anatomi içinde tunica intima, düz kas hücreleri tunica ortamda, endotel hücreleri ile lekeleri ve fibroblast ve besleyici damarları içeren bir hànzú kollajen matris vasa vasorum denilen tunica adventitia. Tanımlanan hiçbir enflamatuar infiltrat vardır. GCA olumlu temporal arter orta şiddetli inflamasyon Toplamları makrofajlar/histiyosit, lenfositler, ara sıra plazma hücreleri ve multinucleated dev hücreler ile gösterdi. Luminal daralma kaydetti ve intimal kalınlaşma ve % 90 kesintiye uğraması iç elastik lamina (Şekil 1) tarafından eşlik etti.
İmmunohistokimyasal bulgular
CD3 + lenfositlerinin ve CD68 + makrofajlar tüm GCA + numune içinde vardı, tüm biyopsiler benzer boyama desenleri gösterdi. Lenfosit makrofajlar 1.6 CD3/CD68 oranında üzerinden ağırlığında. FRB için boyama makrofaj ve tercihen adventitia ve medya (Tablo 1 ve Şekil 2) Lokalize multinucleated dev hücreler sınırlı. Kontrol örnekler en az lökosit gösterdi (< 5 hücreleri/yüksek-power alan) ve hiçbir FRB ifade.
Şekil 1: temporal arterler H & E görüntülerini. (A)temsilcisi H & E görüntü farklı katmanları ile normal bir temporal arter tunica (t) adventitia, medya ve en içteki/Luminal için gelen en dıştaki intima yan sırasıyla. Kollajen ve vasa vasorum adventitia (kalın oklar), medya (ince oklar) düz kas hücrelerinde ve intima (10 x büyütme) endotel hücrelerinde ağ unutmayın. (B) intima-media arabiriminin genişlemiş bir test a dikdörtgen iç metin vurgulanır ve iç elastik lamina (ok) (20 x büyütme) tarafından ayrılır. (C) temsilcisi H & E görüntüsü ile dev hücreli arterit transmural lymphohistiocytic infiltrat (kalın oklar), intimal hiperplazi ve iç elastik lamina (ok) (10 x büyütme) imha ile işaretlenmiş bir asistan. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 2: dev hücreli arterit ile temporal arter immunohistokimyasal boyama. (A)temsilcisi görüntüleri göstermek çoğunlukla medya ve adventitia (10 x büyütme) bulunan geniş bir enflamatuar infiltrat ile CD68 olumlu makrofaj ve dev hücreler (oklar). (B) folat reseptör beta (FRB) seçerek aktif makrofajlar (oklar) (10 x büyütme) ifade. Yüksek güç alınan görüntü gösterdi FRB olumlu makrofajlar (C) ve (D) CD68 olumlu makrofajlar (100 x büyütme). Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
| GCA konular (n = 5) | (±SD) demek |
| CD3 (bağışıklık infiltrat %) | 61.7 ± 4.1 |
| CD68 (bağışıklık infiltrat %) | 38.3 ± 4.1 |
| CD68 histiyosit/makrofajlar (hücre/hpf) | 34.8 ± 10,4 |
| FRB + makrofajlar (hücre/.hpf) | 10.8 ± 4.4 |
| %FRB/%CD68 | 31 ± 12,7 |
Tablo 1: Özet FRB, CD68 ve CD3 ifade.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
GCA erişkinlerde en sık görülen vaskülit ve onun patolojik hallmark T helper lenfositler güçlü bir kombinasyon örneğidir ve ayrıca diğer granülomatöz hastalıkların ya da sarkoidoz gibi vasculopathies bulunabilir makrofajlar aktif ve granülomatöz polyangiitis2,3. GCA, temporal arter orta-büyük ölçekli arter iyi bir gösterimini sağlar ve böylece ortaya çıkan tanı rolleri çalışma için fırsatlar yaratmak için yıl, parafin blok içinde saklanabilir büyükçe bir örnek TA biyopsi verir ve tedavi hedefleri FRB vasculitic microenvironment seviyorum. Biz erişilebilir doku ve FRB güvenilir IHC analiz edilebilir olup olmadığını sormak için standart immunopathologic yöntemleri tarafından sunulan kullandı. Cihazla ilgili izlenimlerimizi histopatoloji ve IHC değerli araçlar sadece tanı ve vasküler hasar ölçüde doğrulayan zamanda rol GCA farklı makrofaj türlerinden doğrulama olarak hizmet verebilir göstermektedir.
Her ikisi de yoğun emek ve histochemical teknisyeni, patolog ve romatolog beceri gerektiren, ama teknikleri iyi kurulmuş ve gibi diğer yöntemleri kullanarak için bir atış yastığı olarak hizmet verebilir histopatoloji ve IHC yöntemleri olan ayirt ve akış sitometresi. Tür yöntemler dezavantajı ancak, muhtemel koleksiyonu gerektirir taze donmuş doku için ihtiyaç vardır. Histopatolojik muayene, birlikte IHC özellikle roman proteinler FRB gibi ortaya çıkması ile Art arda erişilen ve analiz vasküler bağışıklık microenvironment panoramik bir bakış sunan ölçülemez. Hematoksilen ve eozin (H & E) boyama doku histolojisi gözden sağlar. Hematoksilen çekirdeği lekeleri ve eozin nükleer ve sitoplazmik özellikleri arasındaki farklar gösteren yardımcı olur bir counterstain olarak hizmet veren ise nükleer ayrıntıları vurgular. Bir denetimi bölümünde seçili normal doku kullanımı kalite güvencesi için değerlendirmek için esastır.
IHC mikroskobu tarafından görüntülenir birden fazla antikor kullanımı ile dondurulmuş veya formalin sabit ve parafin gömülü dokularda ilgi antijen algılar. Açıklanan protokolü van der Heijden adapte kim Romatoid Artritte sinovyal makrofajlar ifadede FRB gösterdi ve ark.15,. Temel IHC adımlar doku hazırlanması, mum eritme/deparaffinization, antijen alma ve23boyama içerir. Hastanın kaldırıldı doku hemen formalin ve doku hizalama ve titizlikle parafin içinde tamir ederken korunmuş yönünü sabit sağlamak için önemlidir. Doku bir microtome kullanımı ile ince kesitli ve Ksilen, etanol ve su birden fazla yıkama gerektirir bir dewaxing adım geçer. Antijen alma, denilen bir sonraki adım formalin fiksasyon sırasında oluşan metilen bağlantıları yıkmak için gerekli ve sitrat tabanlı arabellek ve nemli ısı gerektirir. Slaytları antijen algılaması ile engelleyebilir endojen peroksidaz enzimleri engellemek için hidrojen peroksit ile tedavi edilir. Boyama yordam sonraki birincil antijen-antikor reaksiyonu tespit edecek bir ikincil antikor uygulayarak takip ilgi antijen bağlayacaksınız seyreltilmiş birincil antikorlar ile slaytlar kuluçka tarafından gerçekleştirilir. Bu mikroskop altında görüntülenir bir kahverengi pigment oluşturan DAB-substrat Kromojen ile etiketleme tarafından takip ediyor. Kabarcıklar gibi müdahale yok maddeler kapak notu ve yüzey arasında oluşturulur emin kalıcı bir çözüm ile dokusunun dikkatli montaj son adımdır. Protokol arteryel doku kullanımı karşılamak için değişiklik gerekli. Çalışma FRB GCA içinde değerlendirmek için ilk olduğu için en iyi antikor konsantrasyon bilinmeyen ve birden fazla dilutions gerekli 1:50, 1: 100, 1: 200, 1: 400, 1:800, 1:1, 600, 1:3200 en iyi kalite, en düşük fiyat arka plan gürültü veya sinyal boyama ile elde 1:800.
Membran ilişkili FRB daha önce Ross tarafından doğrulandı vd.18,24 ve ifade için normal plasental hücreleri, nötrofiller, Kronik Myeloid Lösemi, promyelötik lösemi, lösemi patlamaların bulundu myeloblast nüfus myelomonocytic ve erythroleukemias ve degisken M1/M2 akut myeloid lösemi. Bu önceki kullanmıştır FRB için belirli yakınlık saf tavşan poliklonal antikor romatoid artrit olumlu sinovyal makrofajlar ve solid organ tümörler çalışmaları için beri uygulanan. Bu protokol için kullanılan FRB antikor ticari olarak mevcut değildir ve geniş uygulama engel olabilir. Makul, burada açıklanan yöntemi de diğer FRB antikorlar için işe yarayabilir ama bireysel optimizasyonu kullanımı daha büyük sayıda önce gerektirecektir. FRB önemli ölçüde plasenta içinde ifade edilir beri bu doku olumlu bir denetim olarak tekrar tekrar kullanılmıştır.
Çalışma tasarım bir küçük örnek boyutuyla sınırlı ve ideal GCA erken ve geç aşamalarında alınan sekme daha büyük sayıda doğrulama gerektirir. FRB makrofaj folik konjuge ajanlar ve antifolates ile potansiyel bir tanı ve tedavi edici hedef olarak hizmet verebilir beri Ayrıca, burada elde edilen veriler daha fazla FRB fenotip M1 ve M2 makrofaj bağlamında incelemek gerek destekler Polarizasyon. Diğer tanılama ile ilgili olarak bu sonuçları açık fırsatlar için non-invaziv görüntüleme yaklaşımlar hedefleyen FRB folik asit ile aracıları Imaging PET SPECT Birleşik. Ayrıca, bu Protokolü'nün kullanılmasına makrofaj infiltrasyonu hastalık ilerleme ve ateroskleroz, skleroderma, sarkoidoz ve romatoid artrit faaliyet damgasını olduğunu göz önüne alındığında, bu şartlarda uygulamalar bulabilirsiniz.
Bu ifade ve GCA FRB dağılımı keşfetmek için ilk protokoldür. IHC bir panoramik izin kesitsel ve TA birden çok görünümünü ve bağışıklık sızmak ve arteriyel microenvironment arasındaki sayısal ilişkileri analiz sağlar. Damar duvarının tüm katmanları sızmış toplam makrofajlar % 30'u FRB oluşur, ama ilginçtir, FRB değil intima içinde bulundu ve yalnızca adventitia ve medya için yerelleştirilmiş. Bu desen dağıtım FRB makrofaj tropism bulunan medya ve adventitial katmanlar25fark kollajen kompozisyon roman anlayışlar ortaya çıkarabilir. Bağışıklık infiltrat (pan-lenfosit marker anti-CD3 tarafından ölçülen) yaklaşık %60 lenfositler ve % 40 makrofajlar (pan-makrofaj marker anti-CD68 tarafından işaretlenmiş) oluşuyordu. Başka bir CD68 ifade daha yüksek hastalık aktivitesi bağlı iken yapılan bir çalışmada CD3 GCA tanı için daha yüksek bir hassasiyet ile ilişkili. Böylece, önerdiğimiz erken GCA vasküler bağışıklık ortamı lenfositleri: makrofajlar 60:40 oranında FRB olumlu olmak makrofajlar % 30'u ile başlar. Olup olmadığı bu için de geçerlidir ve sürekli olarak erken hastalığı bulunan olgularda gösterdi daha da gelecekte doğrulanmış ve gelecekteki deneyler olmalıdır. Bu hücresel infiltrat dağıtım sürekli tutuyorsa, o zaman biyomarker kompozit GCA hastalık aktivitesi için olarak sunabilir.
Sonuç olarak, bu iletişim kuralını adventitia GCA temporal arter ve FRB infiltrasyon medya varlığı ilk kez gösterdi. Yaklaşık üçte bir erken toplam makrofaj nüfusun ve % 60 lenfositler ve % 40 makrofajlar oluşan etkin GCA microenvironment temsil FRB makrofajlar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar ifşa gerek yok.
Acknowledgments
Bu eser Dr. Douglas merdiven, Marianne Klinger, Ann Benko, bölünme, Romatoloji/bölümü tıp ve moleküler ve histopatolojik çekirdek laboratuvar, Penn State Üniversitesi Tıp Fakültesi, Hershey PA de desteğiyle mümkün yapıldı
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Microtome | Reichert-Jung | ||
| plain and frosted microscope slides and cover slips | Fisher Scientific | ||
| Vertical rack | Fisher Scientific | ||
| Light microscope | Olympus BX60 microscope | ||
| Xylene | |||
| Acetone in distilled water | concentrations 100%, 90%, 70% | ||
| Tris-buffered saline solution (TBS) | Dako Wash BufferS3006 | ||
| 3% hydrogen peroxide in TBS | |||
| Diaminobenzidine (DAB) | Sigma Fast Tablet set | ||
| Chemical Permount Mounting Medium | Fisher Scientific | SP-15-100 | |
| Harleco Gill's III Hematoxylin | Fiisher Scientific 23-750-019 | ||
| Harleco Eosin Y 1% Alcoholic Stock Solution | Fisher Scientific | 23-749-977 | |
| 10 mM citric acid monohydrate (pH 6.0) | |||
| Polyclonal rabbit anti-folate receptor beta | Manohar Ratnam | optimized at 1:800 | |
| Monoclonal mouse anti-human CD68 | Dako | M071801 | optimized at 1:200 |
| Polyclonal rabbit anti-CD3 | Agilent Dako | A0452 | optimized at 1:100 |
| Polymer goat anti- rabbit/mouse secondary antibody | Dako | ||
| Placental tissue | for FRB positive control |
References
- Klippel, J. H., Stone, J. H., White, P. H. Primer on the rheumatic diseases. , Springer Science & Business Media. (2008).
- Weyand, C. M., Goronzy, J. J. Immune mechanisms in medium and large-vessel vasculitis. Nature Reviews Rheumatol. 9 (12), 731-740 (2013).
- Weyand, C. M., Liao, Y. J., Goronzy, J. J. The immunopathology of giant cell arteritis: diagnostic and therapeutic implications. Journal of Neuro-ophthalmology. 32 (3), 259-265 (2012).
- Deng, J., Younge, B., Olshen, R., Goronzy, J., Weyand, C. Th17 and Th1 T-cell responses in giant cell arteritis. Circulation. 121, 906-915 (2010).
- Mahr, A. D., et al. Adjunctive methotrexate for treatment of giant cell arteritis: an individual patient data meta-analysis. Arthritis & Rheumatology. 56 (8), 2789-2797 (2007).
- Hoffman, G. S., et al. A multicenter, randomized, double-blind, placebo-controlled trial of adjuvant methotrexate treatment for giant cell arteritis. Arthritis & Rheumatology. 46 (5), 1309-1318 (2002).
- Stone, J. H., Klearman, M., Collinson, N.
- Milman, N. Tocilizumab increased sustained glucocorticoid-free remission from giant cell arteritis. Annals of Internal Medicine. 167 (12), JC63 (2017).
- Xia, W., et al. A functional folate receptor is induced during macrophage activation and can be used to target drugs to activated macrophages. Blood. 113 (2), 438-446 (2009).
- Shen, J., et al. Folate receptor-beta constitutes a marker for human proinflammatory monocytes. Journal of Leukocyte Biology. 96 (4), 563-570 (2014).
- Salazar, M. D., Ratnam, M. The folate receptor: what does it promise in tissue-targeted therapeutics. Cancer and Metastasis Reviews. 26 (1), 141-152 (2007).
- Low, P. S., Henne, W. A., Doorneweerd, D. D. Discovery and development of folic-acid-based receptor targeting for imaging and therapy of cancer and inflammatory diseases. Accounts of Chemical Research. 41 (1), 120-129 (2008).
- Puig-Kroger, A., et al. Folate receptor beta is expressed by tumor-associated macrophages and constitutes a marker for M2 anti-inflammatory/regulatory macrophages. Cancer Research. 69 (24), 9395-9403 (2009).
- Nakashima-Matsushita, N., et al. Selective expression of folate receptor beta and its possible role in methotrexate transport in synovial macrophages from patients with rheumatoid arthritis. Arthritis & Rheumatology. 42 (8), 1609-1616 (1999).
- vander Heijden, J. W., et al. Folate receptor beta as a potential delivery route for novel folate antagonists to macrophages in the synovial tissue of rheumatoid arthritis patients. Arthritis & Rheumatology. 60 (1), 12-21 (2009).
- Jansen, G., Peters, G. J. Novel insights in folate receptors and transporters: implications for disease and treatment of immune diseases and cancer. Pteridines. 26 (2), 41-53 (2015).
- Albano-Aluquin, S., Malysz, J., Aluquin, V. R., Ratnam, M., Olsen, N. An immunohistochemical analysis of folate receptor beta expression and distribution in giant cell arteritis - a pilot study. American Journal of Clinical and Experimental Immunology. 6 (6), 107-114 (2017).
- Ross, J. F., Chaudhuri, P. K., Ratnam, M. Differential regulation of folate receptor isoforms in normal and malignant tissues in vivo and in established cell lines. Physiologic and clinical implications. Cancer. 73 (9), 2432-2443 (1994).
- Reiner, N. E. Methods in molecular biology. Macrophages and dendritic cells. Methods and protocols. Preface. Methods in Molecular Biology. 531, v-vi (2009).
- Robertson, D., Savage, K., Reis-Filho, J. S., Isacke, C. M. Multiple immunofluorescence labelling of formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) tissue. BMC Cell Biology. 9, 13 (2008).
- Pawlina, W. Histology: A text and atlas with correlated cell and molecular biology. , Walters Kluwer. (2016).
- Kumar, V., Abbas, A., Robbins Aster, J. Robbins and Cotran pathologic basis of disease. , Elsevier Saunders. (2015).
- Dabbs, D. J. Diagnostic immunohistochemistry. , Elsevier, Inc. (2019).
- Ross, J. F., et al. Folate receptor type beta is a neutrophilic lineage marker and is differentially expressed in myeloid leukemia. Cancer. 85 (2), 348-357 (1999).
- Holzapfel, G. A. Collagen in arterial walls: biomechanical aspects. Collagen. Structure and Mechanics. Fratzl, P. , Springer-Verlag. Heidelberg. 285-324 (2008).
- Sultan, H., Smith, S. V., Lee, A. G., Chevez-Barrios, P. Pathologic Markers Determining Prognosis in Patients with Treated or Healing Giant Cell Arteritis. American Journal of Ophthalmology. , (2018).
