Summary
O protocolo ilustra o uso do exame histopatológico e imuno-histoquímica para perfil o macrófago de beta de receptor de folato e sua relação com a célula total imune infiltrar-se na biópsia da artéria temporal na arterite de células gigantes.
Abstract
Arterite de células gigantes (GCA) é uma doença crónica, imune-mediada das artérias de tamanhos médio para grande afeta adultos mais velhos. GCA manifestos com artrite e oclusivos sintomas de dores de cabeça, derrame ou perda de visão. Macrófagos e linfócitos T-helper infiltrar a parede vascular e produzem uma resposta pro-inflamatórios que levam a lesão vascular e isquemia. Até à data, não há nenhum biomarcador de GCA que pode monitorar a resposta terapêutica guia e atividade de doença.
Beta de receptor de folato (FRB) é uma proteína de glicosilfostidilinosiol que está ancorada na membrana celular e normalmente expresso na linhagem mielomonocítica e na maioria das células de leucemia mieloide, bem como no tumor e macrófagos sinoviais reumatoides, onde sua expressão se correlaciona com a severidade da doença. A capacidade de FRB vincular compostos de ácido fólico, ácido fólico-conjugados e drogas antifolate tornou um alvo druggable na pesquisa de doenças inflamatórias e câncer. Este relatório descreve os métodos de histopatológico e imuno-histoquímicos utilizados para avaliar a expressão e a distribuição de FRB em relação GCAimmunopathology.
Biópsias de artéria temporal fixada em formol e parafina do GCA e controles normais foram coradas com hematoxilina e eosina, para rever a histologia do tecido e identificar características patognomônicas. Imuno-histoquímica foi usado para detectar a expressão FRB, CD68 e CD3. Uma análise microscópica foi realizada para quantificar o número de células coradas positivamente em 10 seções selecionadas do elevado-poder-campo e seus respectivos locais na parede arterial.
Inflamação Lymphohistiocytic (LH) acompanhado por hiperplasia da íntima e lâmina elástica interrompida foi vista em GCA com nenhum encontrado nos controles. O infiltrado de LH foi composto de aproximadamente 60% macrófagos linfócitos e 40%. FRB expressão era restrito aos macrófagos, composto por 31% da população de macrófagos CD68 + total e localizado para a mídia e adventícia. Não FRB foi visto em controles.
Este protocolo demonstrou um padrão distinto de numérico e espacial do macrófago FRB em relação o microambiente imune vascular em GCA.
Introduction
Arterite de células gigantes (GCA) é uma doença inflamatória das artérias de médio a grande, visando a aorta e seus ramos e afetando adultos mais velhos. Apresenta-se com leve a graves complicações isquêmicas, tais como dores de cabeça, dor no maxilar, perda de visão, acidente vascular cerebral e tecido gangrena. O diagnóstico é confirmado pela altos marcadores inflamatórios como taxa de sedimentação de eritrócitos (ESR) e um padrão distinto de histopatológico na artéria temporal biópsia (TAB)1. GCA é a vasculite mais comum de adulta e a acessibilidade da artéria temporal obtida para o diagnóstico apresenta uma vantagem sobre outros vasculopathies, permitindo que se estude a sua patogênese mais prontamente. Os achados típicos na guia incluem um infiltrado de histiócitos/macrófagos e linfócitos T, encontrados em todas as camadas vasculares da túnica íntima, mídia e adventícia com simultânea destruição da lâmina elástica que normalmente separa estas compartimentos2. A evidência atual demonstra que o GCA envolve um antígeno desconhecido que ativa as células dendríticas no adventitia vascular, seguido pelo recrutamento de auxiliar células T (Th), especificamente Th1 e Th17 subtipos que secretam Interleucina-17 e interferon-gama (IFG) respectivamente. IFG então recrutas e ativa macrófagos a produzir citocinas e proteases. Estes incluem citocinas pró-inflamatórias; incluindo a IL-12, que reciprocamente, ativa as células Th1, proporcionando assim uma retroalimentação positiva; fator de necrose tumoral e interleucina-6, que causam artrite e febres e metaloproteases que danificam a lâmina elástica. Glicocorticoides (GC), que constituem a padrão terapêutica crónica, parcialmente controlam as vias de citocina, atenuando o Th17/IL-17, mas não o braço de Th1/IFG da resposta imune3,4. Infelizmente, a descontinuação do GC resulta em recaída da doença. Como uma modalidade alternativa, metotrexato tem foi realocado para o tratamento de GCA, mas os pontos de extremidade clínicos desejados não foram consistentemente alcançados, embora mais sensíveis biomarcadores não tenham sido utilizados para terapêutica monitoramento5,6 . Em 2017, o bloqueador de interleucina 6, tocilizumab, foi aprovado para o tratamento de GCA como demonstrou efetivamente o controle de doença e esteroide poupadores efeitos7,8.
Até à data, não há nenhuma boas biomarcadores para GCA. Como resultado, é difícil monitorar a atividade da doença e titula-se doses de drogas disponíveis para evitar efeitos adversos e reduzir a carga de custos para a sociedade. Assim, é imperativo para procurar um biomarcador de candidato que correlaciona-se com atividade de doença, fornecem introspecções novela na patogênese e ajuda nas decisões terapêuticas.
A desregulação da ativação de macrófagos é um fator crítico na patogênese do GCA. Assim, um meio eficaz de tratar a GCA pode ser a seleção de alvos de macrófagos ativados. O beta de receptor de folato (FRB) é uma glicoproteína glycosyl-fosfatidilinositol que está ancorada na membrana celular expressos nas células mielomonocítica normal, as células de leucemia mieloide e ativados macrófagos. Seu ligante, ácido fólico, é uma vitamina essencial na sua forma reduzida, o que permite que celulares DNA síntese, metilação e reparação9. Expressão de FRB é induzida em doença auto-imune e durante a carcinogênese. Sua expressão é restrito à superfície de monócitos ou pró-inflamatórias macrófagos M1 na artrite reumatoide, ou aos anti-inflamatórios M2 de macrófagos em órgãos sólidos e neoplasias mieloides10,11,12 , 13. além de seu papel potencial como um biomarcador de macrófagos ativados, a FRB pode habilitar o transporte seletivo de drogas através de um processo de várias etapa que começa com a ligação ao receptor de ácido fólico, antifolates ou drogas conjugada com ácido fólico na célula superfície, seguido de interiorização, lançamento e eventual entrega de droga desejada para a célula interna máquinas12,14,15,16. Em contraste com a FRB expressa em células cancerosas e ativados macrófagos, FRB, expressa em células hematopoiéticas normais é incapaz de vincular folatos, assegurando que entrega de droga FRB/ácido fólico-mediada é limitada a FRB-positivo inflamatória ou células cancerosas.
Em nosso estudo anterior, temos demonstrado pela primeira vez FRB é expressa em macrófagos GCA e sua expressão correlacionados com CD68 + e endotelina macrófagos de beta do receptor, que contribuem para a patogênese de GCA17. Neste relatório, descrevemos o histopatológico e imuno-histoquímica métodos utilizados para avaliar o macrófago FRB e analisaram os linfócitos totais e macrófago conta ganhar a introspecção em posição a FRB na paisagem vascular GCA.
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Protocol
Todos os métodos descritos foram aprovados pelo Conselho de revisão institucional estado de Penn.
1. histopatológica preparação, processamento e após a obtenção de biópsia da artéria Temporal
Nota: A biópsia da artéria temporal (TAB) é realizada sob anestesia local e condições estéreis por um cirurgião certificado. Depois de obter cirurgicamente uma seção arterial de 3 cm no lado mais afetado, o espécime é fixado em formalina imediatamente por 24 h, dividido em seções de 3 a 4 mm e incorporado em parafina, pagando a atenção cuidadosa para o alinhamento adequado do tecido no bloco que é então armazenado em temperatura ambiente. Seleção de amostra é realizada após verificar os registros médicos. O diagnóstico baseia-se na American College of Rheumatology 1990 critérios que requer que indivíduos cumpram 3 dos 5 domínios: idade > 50 anos, Nova dor de cabeça, sensibilidade da artéria temporal, uma taxa de sedimentação de eritrócitos > 50 mm/hora pelo método de Westergren e um guia de anormal. Para segurança, luvas de proteção devem ser usadas em todos os momentos quando manusear as amostras, produtos químicos e anticorpos.
- Dos blocos incorporados, 4-5 µm espessura seções usando um micrótomo de corte. e mancha com hematoxilina e eosina (H & E). Use uma seção de controle de tecido normal selecionado para a garantia da qualidade.
- Flutuador cortar seções sobre um banho de água quente aquecida a 40 ° C para remover rugas e pegar com um slide microscópicas de vidro revestido. Coloque as lâminas de vidro em um prato quente em um forno de 60 ° C por 60 minutos facilitar a secagem e a aderência da seção para o slide.
- Coloque as lâminas de vidro em um prato quente em um forno de 60 ° C por 60 minutos facilitar a secagem e a aderência da seção para o slide.
- Monte 3 seções em corrediças do microscópio.
- Coloque slides em um rack vertical e secar durante a noite a 37 ° C por 24 h.
- Coloque slides em um recipiente e em 4 ° C.
2. imuno-histoquímica preparação, desparafinagem, recuperação do antígeno e coloração15,18,19,20
- Carregar slides em um rack de slide. Execute o rack através de pratos como segue: duas vezes em xilol 100% por 5 minutos com 10 segundos de agitação suave em 30 segundos, uma vez em 100% de etanol com agitação de 10 segundos, uma vez em etanol a 90% com agitação de 10 segundos, uma vez em etanol a 70% com agitação de 10 segundos , e duas vezes em bidestilada H2O com agitação de 10 segundos.
Nota: Manipulação de xileno e a acetona deve ser feita em capas ventiladas para evitar a inalação e toxicidade respiratória. - Recuperar o antígeno pela transferência do rack para um recipiente de vidro com 200 mL de 10 mmol/L, pH 6.0 tampão pré-aquecido a 95 ° C. Definir o timer por 30 minutos em banho-maria e, em seguida, esfriar em temperatura ambiente por 20 minutos, em seguida, enxaguar com água corrente por 5 minutos.
- Remova a atividade peroxidase endógena incubando em 200 mL de água oxigenada 3% por 10 minutos. Lave slides 3 vezes em 200 µ l de solução salina tampão Tris (TBSS).
- Remover as lâminas do rack e pincele cada um com cuidado para limpar o buffer de excesso. Para a coloração, adicione 200 µ l dos seguintes anticorpos primários, adicionar lamínulas em slides e incubar em uma câmara úmida por 1 hora em temperatura ambiente:
1:800 anticorpo anti-FRB diluído
Anti-humanos de anticorpo monoclonal de rato CD68, diluição de 1: 200
Diluição de 1: 100 policlonal de coelho anti-CD3
Nota: Secções de parafina fixada em formol da placenta também foram processadas conforme descrito em passos 2.1 a 2.9 e incubadas com anti-FRB18 e usadas como controle positivo. Coloração resultados foram obtidos por encontrar a concentração do anticorpo e foi realizada por titulação do anticorpo em diluições duplas (por exemplo, 01:50, 1: 100, 1: 200, 1: 400, 1:800, 1:1600). - Remova a lamínula após incubação e descarte. Enxágue slides 3 vezes por 2 minutos cada com TBSS, drenar e limpar o buffer de excesso.
- Adicione 200 µ l de solução anticorpo secundário contendo Rabbit/Mouse secundário biotinilado para reagir com o anticorpo primário unconjugated vinculado ao antígeno de tecido. Coloque as lamelas em slides e incubar em uma câmara húmida durante 45 minutos à temperatura ambiente.
- Remova a lamínula após incubação e descarte. Enxágue slides 3 vezes por 2 minutos cada com TBS, drenar e limpar o buffer de excesso.
- Adicionar 200 µ l de diaminobenzidina (DAB) + tampão de substrato (imidazol HCl)-sistema de cromogénio e incubar durante 10 minutos para visualizar a coloração padrão. Lavar com TBSS em seguida em água corrente por 10 minutos.
- Counterstain com hematoxilina durante 3 minutos.
- Monte os slides aplicando 70 µ l de meio de montagem à superfície da lâmina. Lentamente, dica a lamela sobre o meio de montagem e evitar criar bolhas como desligá-lo no lugar. Espere 24 horas para secar.
3. histopatológico e imuno-histoquímica (IHC) análise
Examine o H & E e IHC manchado seções de assuntos positivos e normais GCA, usando um microscópio de luz.
-
Para a H & E manchado seções:
- Avaliar a arquitetura vascular e identificam as células endoteliais na túnica íntima, células musculares lisas na túnica média e fibroblastos e vasa vasorum na túnica adventícia21,22.
- Identifica características do GCA, que incluem os linfócitos e infiltração de macrófagos/histiócitos, hiperplasia celular e degradação da lâmina elástica interna.
- Analise o infiltrado lymphohistiocytic, identificando e quantificando o número de macrófagos em relação os linfócitos. Avaliar o grau de rompimento da lâmina elástica interna e alterações hiperplásicas nas células residentes e comparar com os controles.
-
Para a IHC manchado seções:
- Examinar o padrão de coloração das FRB, tomando nota de sua expressão por um determinado tipo ou tipos de células e sua distribuição dentro as camadas vasculares e sua relação para o infiltrado total imune, o marcador para macrófagos total, anti-CD68 e o pan marcador de linfócitos anti-CD3.
- Quantificar a expressão das FRB, CD68 e CD3 células através da contagem das células coradas positivamente em 10 vários campos selecionados aleatoriamente de alta potência (hpf) e gravar os meios.
Nota: A identificação dessas células normais e patológicas e estruturas foram realizados por um patologista cardiovascular certificado (J.M.) e reumatologista (V.A.A) e os resultados foram registrados em todos os casos. - Capture imagens representativas, usando uma câmera digital.
Nota: Após estas etapas, permanecendo alíquotas pode ser armazenada a-80 ° C.
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Representative Results
Achados histopatológicos
A H & E manchas em anatomia arterial normal de espécimes normal demonstrada com células endoteliais na túnica íntima, células musculares lisas da túnica média, e uma matriz de colagénio heterogêneo incluem fibroblastos e vasos alimentador chamado vasa vasorum no adventitia túnica. Não há nenhum infiltrado inflamatório identificado. Artérias temporais positivas de GCA demonstraram moderada a severa inflamação com agregados de macrófagos/histiócitos, linfócitos, plasmócitos ocasionais e células gigantes multinucleadas. Estreitamento Luminal foi observado e acompanhado por ruptura da íntima de espessamento e 90% da lâmina elástica interna (Figura 1).
Achados de imuno-histoquímica
Linfócitos CD3 + e macrófagos CD68 + estavam presentes em todos os espécimes GCA + e demonstraram padrões de coloração semelhantes em todas as biópsias. Os linfócitos predominam sobre macrófagos com um rácio de CD3/CD68 de 1.6. Coloração para FRB era restrito aos macrófagos e células gigantes multinucleadas que preferencialmente localizada à adventícia e mídia (tabela 1 e Figura 2). Controlar espécimes mostrou mínimos leucócitos (< 5 campo células/elevado-poder) e sem expressão de FRB.
Figura 1: H & E imagens das artérias temporais. (A) representante H & E imagem de uma artéria temporal normal com camadas distintas da adventícia túnica (t), mídia e íntima do mais externo para o interno/Luminal lado respectivamente. Observe a rede de colágeno e vasa vasorum em adventitia (setas grossas), as células de músculo liso na mídia (setas finas) e as células endoteliais em íntima (ampliação de 10x). (B) uma micrografia alargada da interface-intimal é realçada pelo baixo-relevo retangular na e é separada pela lâmina elástica interna (setas) (ampliação de 20 x). (C) representante H & E a imagem de um TA com arterite de células gigantes, marcado por um infiltrado de lymphohistiocytic transmural (setas grossas), hiperplasia da íntima e destruição da lâmina elástica interna (setas) (ampliação de 10x). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: coloração imuno-histoquímica de artérias temporais com arterite de células gigantes. (A) imagens representativas demonstram um extenso infiltrado inflamatório com CD68 positivos macrófagos e células gigantes (setas) encontrado principalmente na mídia e adventícia (ampliação de 10x). (B) beta de receptor de folato (FRB) foi seletivamente expressos em macrófagos ativados (setas) (ampliação de 10x). Imagem tirada pelo poder superior demonstrado FRB positivos macrófagos em (C) e CD68 macrófagos positivos em (D) (ampliação 100x). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| Assuntos de GCA (n = 5) | Quer dizer (±SD) |
| CD3 (% de infiltrado imune) | 61,7 ± 4.1 |
| CD68 (% de infiltrado imune) | 38,3 ± 4.1 |
| CD68 histiócitos/macrófagos (células/hpf) | ± 34,8 10.4 |
| FRB + macrófagos (células/.hpf) | 10,8 ± 4,4 |
| %FRB/%CD68 | 31 ± 12,7 |
Tabela 1: Resumo de expressão FRB, CD68 e CD3.
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Discussion
GCA é a vasculite mais comum em adultos, e sua marca patológica exemplifica uma potente combinação de linfócitos T helper e ativados macrófagos que também podem ser encontrados em outras doenças granulomatosas ou vasculopathies como sarcoidose e granulomatosa poliangiite2,3. Em GCA, a artéria temporal fornece uma boa representação de tamanho médio a grande artéria e a biópsia TA dá uma amostra considerável que pode ser armazenada em blocos de parafina durante anos, criando assim oportunidades para estudar os papéis de emergentes diagnósticos e alvos terapêuticos como FRB no microambiente Vasculitis. Tiramos a vantagem apresentada pelo tecido acessível e métodos de immunopathologic padrão de perguntar se a FRB pode ser fiavelmente analisada através de IHC. Nossos resultados demonstram que a histopatologia e IHC podem servir como ferramentas valiosas, não só em confirmar o diagnóstico e a extensão do dano vascular, mas também em validar o papel dos subtipos diferentes do macrófago em GCA.
A histopatologia e métodos IHC são ambos trabalham intensivo e requerem as habilidades do técnico histoquímico, patologista e reumatologista, mas as técnicas foram bem estabelecidas e podem servir como uma plataforma de lançamento para usar outros métodos, tais como citometria de fluxo e imunofluorescência. A desvantagem de tais métodos, no entanto, é a necessidade de tecido congelado fresco que requer coleta prospectiva. O IHC, juntamente com o exame histopatológico, é inestimável em apresentar uma perspectiva panorâmica do microambiente imune vascular que pode ser acessada e analisada repetidamente, especialmente com o surgimento de novas proteínas como a FRB. A hematoxilina e eosina (H & E) coloração permite revisar histologia do tecido. Hematoxilina manchas do núcleo e destaca os detalhes nucleares enquanto eosina serve como um corante de contraste que auxilia na demonstrando as diferenças entre as características nucleares e citoplasmáticas. O uso de uma seção de controle de tecido normal selecionado é essencial para a garantia da qualidade.
O IHC detecta o antígeno de interesse em tecidos congelados ou fixada em formol ou parafina através do uso de vários anticorpos que são visualizados por microscopia. O protocolo descrito foi adaptado de van der Heijden et al.15, que demonstraram expressão FRB em macrófagos sinoviais na artrite reumatoide. As etapas essenciais do IHC incluem a preparação do tecido, desparafinagem/deparaffinization, recuperação do antígeno e coloração23. É essencial para garantir que o tecido retirado do paciente é imediatamente fixado em formalina e tecido alinhamento e orientação meticulosamente preservados quando fixo em parafina. O tecido é seccionado em fatias finas com o uso de um micrótomo e sofre um passo desparafinagem que requer várias lavagens em água, etanol e xileno. O próximo passo, chamado de recuperação do antígeno, é necessária para quebrar as ligações de metileno formadas durante a fixação de formalina e requer um buffer de citrato e calor húmido. Os slides são tratados com peróxido de hidrogênio para bloquear as enzimas peroxidase endógena que possam interferir com a deteção do antígeno. O processo de coloração é executado em seguida incubando os slides com os anticorpos primários diluídos que associará o antígeno de interesse seguido pela aplicação de um anticorpo secundário que detectará a reação antígeno-anticorpo primário. Isto é seguido pela rotulagem com um cromógeno DAB-substrato que forma um pigmento marrom que é visualizado ao microscópio. A etapa final é a montagem cuidadosa do tecido com uma solução permanente, certificando-se que não há substâncias interferentes como bolhas são formadas entre a lamínula e a superfície. O protocolo exigido modificações para acomodar o uso do tecido arterial. Desde que o estudo foi o primeiro a avaliar FRB em GCA, a concentração de anticorpo era desconhecida e precisava de várias diluições em 01:50, 1: 100, 1: 200, 1: 400, 1:800, 1:1, 600, 1:3200 com a melhor qualidade ao mais baixo ruído de fundo ou sinal de coloração alcançado no 1:800.
A FRB membrana-associado anteriormente foi validada por Ross et al.18,24 e foi encontrado para ser expressa em células da placenta normais, neutrófilos, explosões leucêmicas de leucemia mieloide crônica, leucemia promielocítica, populações de mieloblasto mielomonocítica, e erythroleukemias e variavelmente em leucemia mieloide aguda M1/M2. O anticorpo policlonal de coelho afinidade-purified específico para FRB utilizado nestas obras anteriores desde que foram aplicados a estudos de artrite reumatoide positivo macrófagos sinoviais e tumores de órgãos sólidos. O anticorpo FRB utilizado neste protocolo não está comercialmente disponível e poderá prejudicar a aplicação ampla. É concebível, a metodologia descrita aqui pode não funcionar para outros anticorpos FRB mas exigirá otimização individual antes da sua utilização em maior número. Desde FRB é expressa significativamente na placenta, este tecido tem sido repetidamente usado como controle positivo.
O projeto de estudo foi limitado por um pequeno tamanho da amostra e requer validação em maior número de guias idealmente obtidos em fases precoce e tardia do GCA. Além disso, desde que o macrófago FRB pode servir como um alvo potencial de diagnóstico e terapêutico com ácido fólico agentes conjugados e antifolates, os dados obtidos aqui apoia a necessidade de aprofundar a análise de fenótipo FRB no contexto do macrófago M1 e M2 polarização. Em relação a outros diagnósticos, estes resultados aberto oportunidades para abordagens de imagem não-invasiva com o ácido fólico FRB alvejado conjugados SPECT de PET, agentes de imagem. Além disso, dado que a infiltração de macrófagos é uma marca registrada de progressão da doença e a atividade na artrite reumatoide, Esclerodermia, sarcoidose e aterosclerose, a utilização do presente protocolo pode encontrar aplicações nestas condições.
Este é o primeiro protocolo para explorar a expressão e a distribuição da FRB em GCA. O IHC permitida uma panorâmica transversais e vários modos de exibição do TA e permite a análise das relações numéricas entre o infiltrado imune e o microambiente arterial. A FRB composta por 30% do totais macrófagos que infiltrou-se todas as camadas da parede vascular, mas curiosamente, a FRB não foi encontrada na íntima e localizada, apenas a adventícia e a mídia. Este padrão de distribuição pode revelar novos insights sobre tropismo do macrófago FRB para a composição de colágeno diferencial encontrado na mídia e camadas adventícia25. O infiltrado imune consistia de cerca de 60% linfócitos (medida pelo panlinfócito marcador anti-CD3) e 40% de macrófagos (marcados por pan-macrófagos marcador anti-CD68). Um estudo recente correlacionados CD3 com uma maior sensibilidade para o diagnóstico de GCA enquanto outro ligado a atividade de doença maior expressão CD68. Assim, propomos que o início meio imune GCA-vascular começa com uma proporção de 60: 40 de linfócitos: macrófagos com 30% de macrófagos sendo FRB positivo. Se isto prende verdadeiro para e consistentemente demonstrado em pacientes com doença precoce deve ser ainda mais experimentos prospectivos e validados no futuro. Se esta distribuição infiltrado celular detém consistentemente, então poderá servir como composto de biomarcador para atividade de doença do GCA.
Em conclusão, este protocolo demonstrado pela primeira vez a presença de infiltração FRB na mídia e adventícia das artérias temporais em GCA. Macrófagos de FRB representados cerca de um terço da população total de macrófagos em fases iniciais e microambiente de GCA ativo composto por macrófagos linfócitos e 40% de 60%.
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Disclosures
Os autores não têm nada para divulgar.
Acknowledgments
Este trabalho foi feito possível pelo suporte de Stairs de Douglas do Dr., Marianne Klinger, Ann Benko, divisão de Reumatologia/departamento de medicina e o Molecular e histopatológico de núcleo de laboratório, Estado Penn University College of Medicine, Hershey PA.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Microtome | Reichert-Jung | ||
| plain and frosted microscope slides and cover slips | Fisher Scientific | ||
| Vertical rack | Fisher Scientific | ||
| Light microscope | Olympus BX60 microscope | ||
| Xylene | |||
| Acetone in distilled water | concentrations 100%, 90%, 70% | ||
| Tris-buffered saline solution (TBS) | Dako Wash BufferS3006 | ||
| 3% hydrogen peroxide in TBS | |||
| Diaminobenzidine (DAB) | Sigma Fast Tablet set | ||
| Chemical Permount Mounting Medium | Fisher Scientific | SP-15-100 | |
| Harleco Gill's III Hematoxylin | Fiisher Scientific 23-750-019 | ||
| Harleco Eosin Y 1% Alcoholic Stock Solution | Fisher Scientific | 23-749-977 | |
| 10 mM citric acid monohydrate (pH 6.0) | |||
| Polyclonal rabbit anti-folate receptor beta | Manohar Ratnam | optimized at 1:800 | |
| Monoclonal mouse anti-human CD68 | Dako | M071801 | optimized at 1:200 |
| Polyclonal rabbit anti-CD3 | Agilent Dako | A0452 | optimized at 1:100 |
| Polymer goat anti- rabbit/mouse secondary antibody | Dako | ||
| Placental tissue | for FRB positive control |
References
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