Summary
在这里, 我们提出了一个深度测序方法, 提供了一个公正的确定新生 3 '-终端以及突变的分布的单链 dna 分子。主要应用是对新生的抗逆转录病毒补充 dna (cDNAs) 的表征, 这是在逆转录病毒逆转录酶过程中产生的中间体。
Abstract
在病毒复制过程中对核酸中间体进行监测, 可深入了解抗病毒化合物和宿主细胞蛋白对病毒 dna 合成的作用及其机制。在这里, 我们解决缺乏一种基于细胞的、高覆盖率和高分辨率的检测方法, 该检测方法能够在病毒感染的生理环境中定义抗逆转录病毒逆转录酶中间体。所述方法在单核苷酸分辨率下捕获 hiv-1 感染细胞中新生互补 dna (cdna) 分子的 3 '-末端。该协议涉及采集整个细胞 dna、通过混合捕获有针对性地浓缩病毒 dna、适应结扎、通过凝胶纯化进行大小分馏、pcr 扩增、深度测序和数据分析。一个关键的步骤是有效和无偏见的结扎适配器分子打开 3 '-dna 终端。所描述的方法的应用决定了给定样本中每个特定长度的反向文字记录的丰度。它还提供了关于 (内部) 序列变化的信息, 在反写文字记录, 从而任何潜在的突变。一般来说, 该检测适用于与 dna 3 '-扩展相关的任何问题, 前提是模板序列是已知的。
Introduction
为了充分剖析和理解病毒复制, 需要越来越精细的技术来捕获复制中间体。特别是, 在受感染细胞的背景下, 病毒核酸物种的精确定义可以提供新的见解, 因为许多病毒复制机制迄今已在孤立的体外反应中进行了检查。一个很好的例子是逆转录酶病毒的逆转录化过程, 如人体免疫缺陷病毒 1 (hiv-1)。hiv-1 逆转录酶的各个步骤, 在这期间, 病毒酶逆转录酶 (rt) 将单链 rna 基因组复制到双链 dna 中, 主要研究了纯化蛋白质和细胞核的引物扩展分析酸1,2,3,4,5。虽然确立了基本原则, 但这种检测并不包括所有病毒和细胞成分, 也可能不反映相关因素的生物学相关化学因素。因此, 我们设计了一种强大的技术来确定逆转录酶中间体的光谱, 它们的精确 cdna 3 '-终端 (即, 确定它们的确切长度) 和核苷酸序列在生活感染的背景下单元格6。从时间过程实验中收集的数据可用于比较各种条件下的记录的概况, 例如抗病毒分子或蛋白质的存在, 这些条件可能会影响 dna 合成的效率和可扩展性,积累。这使得人们能够更详细地了解自然病原体的生命周期, 这往往是有针对性的药物设计和成功的治疗干预的基础。
hiv-1 逆转录酶包括一系列连续的事件, 由 rna 引物退火到基因组 rna 模板, 然后由 rt 扩展, 以产生一个短的单链 cdna 转录, 称为微链强停 (-sss) (见图 1)。随后,-sss cdna 从 5 ' 长的末端重复 (ltr) 转移到基因组 rna 的 3 '-ltr, 在那里它退火并作为引物继续 rt 介导的延伸的减去链 dna (见评论逆转录酶 1,2,3 个,4). 第一次链转移是逆转录酶的限速步骤之一;因此,-ss cdna 是已知的积累。图 2a概述了在受感染细胞中捕获逆转录酶产品的基本工作流程和库设计。协议中使用并在表 1中列出的特定引物和分析设置的目标是所有早期逆转录酶中间体, 长度在 23 ~ 650 nt 之间, 其中包括180-182 分 sss dna。然而, 对该策略的适当的小调整将允许应用于不仅是晚期逆转录酶产物, 还有其他病毒和系统, 其目的是检测含有 dna 末端的 3 '-oh。需要考虑的重要限制包括库中最终 pcr 产品的长度范围;特别是, 开放 3 '-终端上的适配器与上游引物站点之间的距离超过 ~ 1000 nt 的模板可能会降低排序效率, 这可能会在图书馆准备过程中引入误导性的技术偏差 (有关更多详细信息和适应建议, 请参阅讨论)。
此前报道的系统测定核酸链 3 '-末端的技术主要集中在 rna, 而不是 dna, 分子。一个例子是 3 ' race (快速扩增 cdna 末端) 7, 它依赖于 mrna 的多腺化。此外, 还开发了采用 rna 脂质的适配器连接策略, 其中包括 rlm-race (rna 配体介导的 race) 8 或 lace (基于配体的 cdna 末端扩增)9。重要的是要强调的是, 基于结扎的放大是敏感的任何偏见引入的结扎反应本身。例如, 结扎的效率可能或多或少取决于 3 ' 位置、序列、总分子长度或局部结构中的特定核苷酸。这种连接酶偏好导致分子的不完全捕获和读数中的曲解, 我们和其他人已经观察到9,10.为了最大限度地减少在本文所述协议中的适配器添加步骤中的结扎偏差, 我们测试了一些结扎策略, 并发现使用 t4 dna 连接酶与发夹单链 dna 适配器 (如郭文等人所述).11) 是唯一的程序与接近定量结扎没有导致显著差异的结扎效率时, 评估与一套专门选择的控制寡核苷酸6。因此, 选择这种结扎策略是本协议成功的一个关键特征。
迄今为止, 对感染细胞中 hiv-1 rt 进展的监测主要是通过使用定量 pcr (qpcr) 测量不同长度的逆转录酶品来完成的, 这些逆转录酶链仪使用原始探针集, 以独特地测量短时间或更长的时间 (早期和早期和早期)(分别为) cdna 产品12、13、14。虽然这种 qpcr 方法适合于确定细胞系统中逆转录酶过程的内在效率, 但输出的分辨率相对较低, 没有获得序列信息。我们的新方法基于优化的适配器结扎、pcr 介导的库生成和深度测序, 解决了技术差距, 并为定量和单核苷酸时监测 hiv-1 感染期间的逆转录酶提供了机会分辨率。
我们已经说明了这种方法的效用, 在一项研究中, 区分了两个拟议的模型的能力的 hiv-1 限制因子 apobec3g (载脂蛋白 b mrna 编辑酶催化多肽类似 3g) 干扰6.
Protocol
注: 有关本协议中使用的特定试剂和设备, 请参阅材料表。
1. 病毒生产和细胞感染
注意: 传染性 hiv-1 只能在经批准的生物安全遏制实验室中处理。
注: 如步骤1.1 所述, 通过人体胚胎肾 (hek) 293t 细胞的短暂转染生产 hiv-1 颗粒是一个标准程序, 以前已经描述过 15、16.前面描述了一般的细胞培养程序17。
- 艾滋病毒-1 病毒生产。
- 在 dulbecco 的改性鹰培养基 (dmem) 中保持293t 细胞, 并在37°c 和 5% co 2 的标准细胞培养孵化器中补充10% 的胎儿牛血清 (fbs) 和1% 的青霉素/链霉素 (全 dmem).
- 在标准层流组织培养罩中, 去除生长介质, 并在293t 细胞的近融合10厘米细胞培养盘 (~ 1.2 x10细胞) 中添加3毫升预热 (37°c) 胰蛋白酶。将盘子放回孵化器2-3分钟。
- 把盘子从孵化器拿回组织培养罩, 加入7毫升的全介质。在盘子内上下多次移液器重新悬浮细胞。将细胞1:4 拆分, 在新的10厘米的盘子中加入2.5 毫升的细胞悬浮液, 并将其填充7.5 毫升的全介质。
- 第二天, 将10微克的 proviv-1 质粒 dna (如 pnl4.3) 与1毫升无血清最小必要介质混合, 并在每1微克 dna 4.5 μl 的情况下添加聚乙烯胺 (pei) 溶液 (25, 000 mL, 1 mgml ph 7)。在 rt 中培养 10分钟, 并在293t 细胞中滴注。
- 转染后 24小时, 取出培养基, 在 20 u/ml 培养基上取出含有无 rnasl dnase 的全 dmem 6 毫升。6小时后, 将介质替换为10毫升的全 dmem。
- 转染48小时后, 通过0.22μm 过滤器, 使用 10 ml 注射器, 将其过滤成15毫升聚丙烯管。
- 在一根开顶薄壁超离心管中加入2毫升无菌20% 蔗糖, 在1x 磷酸盐缓冲盐水 (pbs) 中加入。慢慢地覆盖与过滤细胞上清液蔗糖。
- 用超离心机在134000xg 的温度下在 14000 x g 的温度下离心1小时15分钟。
- 小心地从超离心机上取下管子。慢慢地使用吸力或移液器脱下上清液和蔗糖。当取出最后一个蔗糖溶液时, 使用较小的移液器并倾斜管道。将颗粒状病毒留在试管底部。
注: 颗粒将不可见。 - 加入200μl 的 1x pbs, 留在冰箱中4至 12小时, 重新悬浮并冻结在20μl 的 aliquots-80°c。
- 使用 p24 hiv-1 抗原 elisa 试剂盒 (按照制造商的说明) 确定 p24gag含量。
- t 细胞系感染。
- 在 roswell park 纪念研究所 (rpmi) 1640 培养基中培养出不朽的 t 细胞系 (如cem-ss 细胞) 1640 培养基, 辅以10% 的 fbs 和1% 的 penicilin/链霉素 (全 rpmi)。用血细胞仪18和种子1井每样品与1毫升的完整 rpmi 2 x 10 6 细胞/ml 在 12井格式的细胞培养板计数。
- 加入相当于150纳克 p24gag 的hiv-1 颗粒, 并将其放入带有生物封闭盖的摆动离心机桶中, 在30°c 下, 在 2, 000 x g 的情况下, 在 2, 000 x g 的台式离心机中离心 2小时, 从而产生自旋感染。
- 从离心机中取出板, 让其在37°c 和 5% co 2 的标准组织培养孵化器中休息 1小时.
- 要洗掉输入病毒, 收集细胞通过将细胞悬浮液转移到微离心管和离心机在 rt (rt) 的微离心机在 500 x g, 2分钟。在不干扰细胞颗粒的情况下脱下上清液。
- 将细胞颗粒在预热 (37°c) 的1毫升中重新使用, 无菌 1x pbs。重复离心、上清液去除和再悬浮步骤两次。
- 再次离心, 去除上清液, 并在1毫升的完整 rpmi 中重新悬浮细胞颗粒。在一个新的12井板中, 将每个悬架添加到一个井中。
- 在最初添加病毒后 6小时 (离心后 4小时), 按照步骤1.2.4 的步骤通过离心来收获细胞。取下并丢弃上清液。细胞颗粒可以在-80°c 下冷冻, 也可以直接进行 dna 提取处理。
2. dna 提取、hiv-1 dna 定量和混合捕获浓缩
- 通过遵循组织培养细胞试剂盒手册, 用血液和组织总 dna 提取试剂盒提取整个细胞 dna。唯一的变化是在200μl 无核酸酶h2o中的洗脱, 而不是所提供的洗脱缓冲液。
注: 在添加了碎屑裂解缓冲液 (试剂盒的 "al 缓冲液") 和蛋白酶后, 可以从生物安全封闭实验室取出样品, 并在标准安全级别实验室处理协议的其余部分。 - 用 qpcr 确定 hiv-1 cdna 的复制数量。
- 从2.1 步取17μl 洗脱液, 加入2μl 的10倍限制酶缓冲液和1μl 的 dpni 限制性酶。在37°c 下培养 1小时, 从转染中去除任何潜在的残留输入质粒 dna。
- 利用以下引物探针集对微小链-强阻 cdna 进行 qpcr: ohc64 (5 '-taactaggaccaccc-3 ') 和 oHC64 (5 '-ggtagagattttacactg-3 ') 和探针 oHC64 (5 '-famacacacacacgcacacacacta-tamra-3 ')。qpcr 的设置和确切的条件可以在参考6,13中找到。携带样品与连续稀释 pnl4.3 提供质粒作为一个标准曲线, 以确定 cdna 分子的复制数量。
注: 请参阅有关预期数量的讨论。
- 通过杂交捕获来浓缩 hiv-1 dna。
注: 从这一步开始, 最好使用核酸结合特性较低的微离心管, 以及所有 dna 样本的气溶胶过滤器移液器吸头。如果可能, 请在 pcr 工作站中工作。除非另有说明, 所有步骤和试剂均在 rt (rt)。- 为了制备磁性链霉素珠的主混合, 将每个样品的移液器100μl 珠放入单个微离心管中。将管子放在适合微型离心管的磁铁上。
- 在珠子向管的磁铁侧沉淀 (~ 1分钟) 后, 取下存储缓冲液, 从磁铁中取出管, 并在500μl 的结合和洗涤缓冲液中重新悬浮磁珠 (bw 缓冲液, 5 mm tris-hcl ph 7.5, 0.5 mm edta, 1 m ncl) 洗。
- 将管子放回磁铁上, 取出上清液, 加入500μl 酪蛋白溶液。取磁铁, 重新悬浮并在 rt 孵育 10分钟, 然后用 bw 缓冲液清洗。
注: 清洗是指将管子放在磁铁上, 脱下上清液, 将管子从磁铁上拿下来, 加入缓冲器, 然后重新悬浮。 - 将管子放回磁铁上, 脱下上清液, 在500μl 的 bw 缓冲液中重新悬浮珠子。在每个样本中添加 50 pmol, 每次捕获生物基化寡核苷酸 (见表 1, 本例为3个寡核苷酸)。(例如, 如果要处理 5个 dna 样本, 请使用来自步骤2.3.1 的500μl 磁珠, 并使用每个寡核苷酸的 250 pmol)。
- 在 rt 中孵化 30分钟, 同时在端上搅拌机中摇晃。
- 用固定化寡核苷酸清洗两次珠子, 用500μl 的 1x ten 缓冲液 (10 mm tris hcl ph 值 8.0, 1 mm edta, 100 mm ncl)。
- 在每个样品的 1x ten 缓冲液10μl 中重新扫描珠子。
- 对于每个样品标签, 一个微离心管, 并添加10μl 的珠子悬浮液, 170μl 的 dna (从步骤 2.1) 和90μl 的 3x ten 缓冲液。在92°c 的干热块中培养 2分钟, 使 dna 变性。
- 将试管移动到另一个干燥的热块, 设置为 52°c, 孵育 1小时. 在此孵育过程中, 反转定期混合 (约每 10分钟)。
- 用500μl 的 1x ten 缓冲液清洗一次, 并在35μl 无核酸酶h2o中重新悬浮。
- 为了洗脱, 在干热块中在92°c 下孵育管2分钟。然后, 快速将管移动到磁铁上 (一次一个管)。一旦珠子被绑在试管的一侧, 将含有 hiv-1 dna 的上清液转移到新鲜的试管中。
- 可选: 重复 qpcr (如步骤 2.2.2), 以确定回收的 hiv-1 cdna。
注: 请参阅有关预期数量的讨论。
3. 适配器结扎
- 准备适配器
- 在100μm 的无核酸酶 h2o 中重新使用冻干适配器 (见表 1 "完整的 kwok + miseq")。
- 每个样品加一个对照样品, 将 10倍 t4 dna 连接酶缓冲液0.45μl、4μl 适配器和0.05μl 无核酸酶 h2o. 加热到 92°c, 每次冷却 20分钟, 然后慢慢冷却。
注: 如果选项可用, 请使用冷却速率可调的 pcr 机器 (使用2% 的冷却速率)。从92°c 到16°c 大约需要30分钟。或者, 在92°c 时使用干式热块并关闭。当热块回到 rt 时, 将适配器的主人混合掉。这是为了让适配器形成一个发夹结构 (见图 2b)。
- 用一组合成的寡核苷酸 (见表 2) 而不是从细胞中提取的 dna 制备控制反应。
- 对每个寡核苷酸进行100μm 的库存。将17个寡核苷酸中的每一种混合 1μl, 并在最终体积为25μl 的情况下, 为等量比添加 8μl h2o.
- 在连续稀释中, 将混合物1:2500 稀释为无核酸酶的 h2o。将混合物的1μl 与17.3μl 的无核酸酶h2o结合在控制样品结扎中 3.3.1, 使每个寡核苷酸在 1.6 fmol 时出现 (在60μl 反应中相当于 0.026 nm)。
- 设置结扎
- 对于 pmol 管中的60μl 最终体积反应, 将6μl 的 10倍 t4 dna 连接酶缓冲液结合起来, 40μl 的聚乙二醇、5m 甜菜因的6μl、适配器的 4.5μl (400 pmol) (前安内莱德 3.1.2)、1.2μl 的 t4 dna 连接酶 (2, 000, 000 unitsml) 和18.3μl 的 dna (来自步骤 2.3.11)
注: 对 40% peg 等粘性溶液特别小心, 以保持准确的体积。不要做一个大师组合。 - 建立与步进相同的反应3.3.1 但与3.2.2 的控制寡核苷酸混合物一起制备。
- 将反应很好地混合, 在16°c 的 pcr 机器中孵育一夜。
- 对于 pmol 管中的60μl 最终体积反应, 将6μl 的 10倍 t4 dna 连接酶缓冲液结合起来, 40μl 的聚乙二醇、5m 甜菜因的6μl、适配器的 4.5μl (400 pmol) (前安内莱德 3.1.2)、1.2μl 的 t4 dna 连接酶 (2, 000, 000 unitsml) 和18.3μl 的 dna (来自步骤 2.3.11)
4. 适配器拆卸和尺寸分离
- 变性凝胶电泳
- 在每个结扎反应中加入30μl 含甲酰 dna 凝胶加载缓冲液。通过移液很好地混合。
- 在 pcr 机器中, 在94°c 下加热 2分钟, 然后立即放在冰上。
- 将预制的 6% Tris/borate/EDTA (tbe) 变性尿素聚丙烯酰胺凝胶 (10 孔梳子) 放入适当的凝胶罐中。加入 1x tbe (89 mm Tris-base, 89 mm 硼酸, 2 mm edta) 运行缓冲液, 并在 250 v/最大常数下预运行凝胶20分钟。
- 用注射器和21g 针用运行缓冲液冲洗凝胶口袋。
- 将每个90μl 样品装入三口井 (每口井 30μl), 运行 20分钟 (250 vp 最大值), 直到深蓝色染料前部大约经过凝胶一半。
- 从凝胶中染色和切割核酸
- 使用 21 g 注射器针将孔刺入底部, 为每个样品准备3个小型微型离心管 (0.5 ml) (在使用锐器时要小心)。将每个制备的管插入 2.0 ml 的微离心管中, 并在其上贴上样品名称加 "低"、"中" 或 "高" 的标签。
- 拿出来撬开凝胶盒。用剃须刀片垂直切割凝胶, 用3口装的样品慷慨地切除条带。将凝胶条加入 1个 tbe (约 30 ml) 和5μl 氰基核酸染色的容器中。孵化3-5分钟。
注: 凝胶提取步骤对交叉污染特别敏感。建议每种凝胶只运行1个样品, 每个凝胶染色使用单独的、干净的容器。如果凝胶颗粒接触戴手套的手指, 则应更换手套。 - 用 ddh2o彻底清洁蓝光透射灯的表面。从染色容器中取出凝胶片, 并将其添加到灯箱中。
- 打开灯箱, 通过橙色滤镜检查染色的核酸。
注: 适配器通常会出现超载, 并运行与连接的 hiv-1 dna 运行以上的条纹大 "斑点"。 - 使用新的剃须刀片, 切掉凝胶的两侧, 如果有没有加载样品的区域仍然存在。接下来, 在适配器上方切割, 以卸下适配器和较低的凝胶部件。最后, 切掉凝胶的顶部, 包括大约1毫米的凝胶口袋, 通常有一个更高分子量 dna 的尖锐强烈信号。
- 将含有样品的剩余凝胶片 (通常为 ~ 2x3 厘米) 水平分成三个偶数片: "低"、"中" 和 "高" 分子量区域。
注: 每块现在将单独处理 [即, 每个原始样品将有三个管 (低、中、高)]。 - 将三个凝胶碎片中的每一个切割成更小的颗粒 (~ 2 x 2 毫米颗粒), 并将它们转移到准备好的 0.5 ml 微离心管中 (步骤 4.2.1)。
- 最高速度旋转与开放的盖子 1分钟, 挤压凝胶件通过孔到2毫升管, 以创建一个凝胶泥泞。如果任何凝胶颗粒仍留在 0.5 ml 管的底部, 请使用针头或移液器尖端手动将其转移到2毫升管。
- 脱氧核糖核酸提取
- 加入1毫升尿素凝胶萃取缓冲液 (0.5 mnh4ch3 co2, 1 mm edta, 0.2% sds) 到凝胶泥浆中。使用端端混合器在 rt 旋转管至少 3小时 (可接受隔夜)。
- 使用一套干净的推子, 在离心机柱上添加一个小的圆形玻璃纤维过滤器, 使用醋酸纤维素膜过滤器 (0.2μm), 避免膜堵塞。将滤清器放置在带有倒置移液器尖端的位置。
- 将凝胶泥和萃取缓冲液在微型离心机中简单地旋转2毫升管, 并将上清液的700μl 转移到制备的过滤柱中。保持凝胶泥泞和剩余的上清液。
- 以最高速度在微型离心机中离心过滤柱 1分钟, 将流量转移到新的 2.0 ml 微离心管中。
- 将剩余的上清液重新装上列。尝试从萃取泥中获得尽可能多的液体。凝胶件的转移不是一个问题。再次旋转, 并结合相同提取示例的流。
- dna 沉淀
- 加入3μl 的多烯形 rna (1μgμl; 作为载体)、1μl 的糖原和 0.7 ml 的异丙醇, 从步骤4.3.5 流动。旋涡短暂, 夜间冻结在-80°c。
- 从-80°c 的冰柜中取出样品, 让它们短暂解冻。将它们放入冷却 (4°c) 的微型离心机中, 以最高速度旋转30分钟。
- 取下并丢弃上清液。要非常小心, 不要取出颗粒。如果不确定颗粒是否会被去除, 请留下30至50μl 的液体。
注: 通常情况下, 所有 "高" 样本都比 "中" 和 "低" 样品显示更明显的颗粒。 - 加入800μl 的80% 乙醇。在最高速度下, 将管道反转并再次旋转1分钟。用移液器去除大部分乙醇, 再次短暂旋转试管, 用较小体积的移液器去除更多的乙醇。
- 将开盖的管子放入55°c 的干热块中, 让任何剩余的乙醇蒸发。当样品干燥 (2-4) 时, 加入20μl 的无核酸酶h2o,并在管底周围扩散, 以确保 dna 颗粒被溶解。dna 样本可储存在-20°c。
5. pcr 扩增和图书馆准备
- 与20μl 的 dna 聚合酶预混合建立 40μl pcr 反应, 18μl 沉淀和还原溶解的 dna 从步骤 4.4.5, 1μl 的正向引物 "mp1.0 + 22hiv" (10μm) (10μm) (见表 1), 和1μl 的多聚少核苷酸引物 (指数引物1至 24) (见ma 表terials)。
注: 在单独的 pcr 反应中运行每个样品的三种反应 (低、中、高), 但使用相同的索引底漆。对每个原始感染样本使用不同的索引。- 在下列条件下运行 pcr 反应: 94°c 变性时 2分钟, 然后 18个3步 pcr 周期;94°c 变性时为 15秒, 55°c 退火为 15秒, 68°c 时延长30秒。
- 作为一种质量控制方案, 用高灵敏度的全自动凝胶电泳系统分析 pcr 反应。采取2μl 的低, 中, 高样品运行按照制造商的指示。
注: 两个引物应该是可见的, 并且通常以计算出的长度约45和 95 nt 运行 (实际长度不同)。此外, dna 应检测到150到 500 nt。如果不存在信号, 建议添加额外的 pcr 周期, 在2到10个额外周期之间。不要为在步骤3.3.2 中创建的寡核苷酸控制样本添加额外的周期。 - 要去除引物, 请使用顺磁性珠 pcr 清理系统。
- 取每个 pcr 反应的 20μl, 并将样品混合在一起 (此时混合所有样品)。在-20°c 时, 将剩余的20μl 反应冻结为备份。
- 让顺磁珠子进入 rt, 将共混 pcr 反应与珠子溶液的1.8 倍混合。通过移液和孵育5分钟混合。
注: 例如, 如果制备了4个样品, 每个样品都有低、中和高反应, 则体积为 4 x 3 x 20μl = 240μl pcr 反应, 并带有432μl 珠溶液。 - 将管放在微离心管磁铁上, 让珠子捆绑约 1分钟, 并脱下上清液丢弃。将管子留在磁铁上, 加入500μl 的80% 乙醇。
- 将乙醇放置 30秒, 然后彻底脱下, 让珠子吹干 ~ 5分钟, 加入40μl 无核酸酶h2o, 将磁铁上的管, 上下多次移液器。
- 离开悬架 5分钟, 把管子放回磁铁上, 让珠子固定在一边, 然后将上清液转移到新的管上。这就是图书馆。采取10μl 的脂肪进行质量控制, 并将其余的冻结在-20°c。
6. 评估图书馆
- 确定库的质量、浓度和摩尔度。
- 使用荧光定量方法。根据制造商的说明, 使用高灵敏度 dsdna 检测试剂盒测量库的1μl 和3μl。
注: 典型浓度在1至10ng/μl 之间。 - 如上文所述 (步骤 5.2), 通过高灵敏度的自动凝胶电泳测量文库 dna 分子量谱。
- 利用自动凝胶电泳分析确定文库的平均分子量, 并计算出无核酸酶 h2o 至 4 nm 的文库稀释.只要所有索引都是唯一的, 就可以组合多个库。
- 使用荧光定量方法。根据制造商的说明, 使用高灵敏度 dsdna 检测试剂盒测量库的1μl 和3μl。
- 可选的低吞吐量质量控制
- 将 dna 文库与 ta 克隆19进行克隆, 将文库分子插入载体进行扩增。按照试剂盒的指示, 生长出 ~ 10-20 个菌落, 并通过微制备协议提取 dna, 如下所述 20。
- 序列向量使用局部测序服务, 并检查插入物是否包含所需的 hiv-1 派生序列和特定于库的适配器。
7. 高通量测序运行
- 使用与测序平台提供的商业软件创建排序示例表。
- 指示所选测序工具包。通常情况下, 选择一个150循环套件, 但其他套件适用于所需的读取长度。
- 选择 "仅 fastq" 作为应用程序工作流。选择包含多重寡核苷酸试剂盒中存在的24个索引的模板之一 (如试剂盒手册所示)。
- 在第1版中选择 "25 n", 为阅读2选择 "125 nt"。对于读取单个索引, 请保留6。
注: 在内部分析中, 分析中只使用了 read2。为了测序平台算法的目的, 请将 read1 保持在至少25nt 的状态。
- 按照制造商的说明精确地进行预运行库的准备和设置。选择最大 20 pm 浓度, 并使用 15% phix 尖峰, 因为库的复杂性非常低。
8. 数据分析
- 根据测序平台制造商的指导原则, 检查通过筛选器百分比和平均 q30 质量得分是否可以接受。
注: 通过筛选器通常 > 90%, q30 分数通常 > 80%。 - 从制造商的测序中心下载. fastq. gz 文件。
- 设置排序脚本
- 创建一个名为 "analysisxyz" 的新目录 (文件夹), 并转到 https://github.com/malimlab/seqparse 将所有源代码文件 (解析 _ sams. pl, rc _ ext. pl, parse.sh) 下载到此目录中。
- 下载短读的阿利格纳 bowtie, 版本 1.1.2, 从 http://bowtie-bio.sourceforge.net/index.shtml 到同一个目录。
- 下载将在 "analysisxyz" 中创建一个名为 "bowtie-1.1.2" 的子目录。在此目录中, 打开子目录 "索引" 并下载由6个具有. ebwt 扩展名的文件组成的模板序列。
- 下载 fastqa 短读取预处理工具包快速0.0.13 从 http://hannonlab.cshl.edu/fastx_toolkit/download.html 到 "analysxyz" 目录。
- 将 samtools (https://sourceforge.net/projects/samtools/files/) 和 bam-readocount (https://github.com/genome/bam-readcount) 下载到 "文档" 目录中。
- 将在步骤8.2 中下载的. fastq. gz 文件 (以... _R2_001.fastq.gz 结尾) 移动到 "analysisxyz" 目录中。
- 打开命令控制台/终端。移动到 "分析 xyz" 作为当前目录使用 cd 命令。键入 "./parsee. sh" 来运行脚本。
- 查找包含所有样本的总读取计数、长度调整读取计数的摘要的. csv 文件, 并对 "分析 xyz" 目录中名为 pro-设为 "解析 _ 结果" 的目录中的每个示例进行规范化读取计数, 以及具有基本变化的文件。
注: 有关分析过程的详细信息, 请参阅讨论。该脚本返回 csv 文件, 并沿 hiv-1nl4.3强停止序列和第一次链转移, 直到核苷酸 635, 每个核苷酸的总读数。作为指导, 在具有指示细胞数和病毒接种的感染样本中, 通常可以观察到 50, 000 到 100, 000次独特的读数, 并且没有抗病毒蛋白或化合物。寡核苷酸控制样品通常产生10万到 200, 000次读数。
Representative Results
本文中描述的技术被应用于更广泛的研究, 以解决抗逆转录病毒人类蛋白 apodec3g (a3g)6抑制 hiv-1 逆转录酶的机制。图 3显示了在没有或不存在 a3g 的情况下, 在感染病毒缺乏hiv-1 的 cem-ss t 细胞样本中使用该协议后获得的具有代表性的结果。图 3a绘制了在筛选出具有相同的6个条形码和相同长度 (由提供的分析软件执行) 的任何 pcr 重复项后从每个样本中获得的唯一读取总数。a3g 水平的增加减少了反映 a3g 对 rt 介导的 cdna 合成的抑制作用的总读取量, 此前由 qpcr6、13、21、22描述和测量。在图 3b 中, 显示了前 182 nt 内每个可能长度的分子的分数。对于在没有 a3g 的情况下感染 hiv-1 病毒, 最丰富的物种是主要的180分强阻分子本身, 在较短的范围内 (23 至40分) (上图, 蓝色直方图) 中积累了一些读数。a3g 的加入改变了这一轮廓, 因为在检测到几个非常具体、可重复的位置 (中、下图) 的短、截断的 cdna 分子急剧增加。由于 a3g 是一种胞苷脱氨酶, 当 a3g 存在于感染病毒21、23、24时, cdna 中的胞苷-尿嘧啶 (被识别为 c 到 t) 突变发生。利用所获得的测序信息, 在同一图 (红色虚线) 上绘制了 c 到 t 突变的百分比。应该注意的是, 突变剖面来自所有独特的读数组合和每个核苷酸的覆盖范围将有所不同。然而, 如果所需的序列信息可以与每个分子相关, 并与特定的 3 '-终点相关。所提供的数据来自 pollpeter等人.6和突变与 cdna 长度分布之间的相关性被证明是由于检测和裂解的脱层 cdna 由细胞 dna 修复机械。
通过处理已知序列、长度和浓度的合成寡核苷酸池, 可以很容易地对 3 '-映射方法进行阳性控制。此控件在步进的适配器连接处添加3.3.2 并建议包含在所有多路复用库中。从对照样本获得的数据应具有预期输入比率的所有寡核苷酸, 只有非常小的背景读取。图 4显示了17个化学合成寡核苷酸的阳性控制集的结果 (对于序列, 见表 2), 这些结果按等量比混合。正如所料, 所有的分子都出现在接近相同的丰度, 只有很小的变化 (上图)。虽然在-ss dna 序列中没有寡核苷酸回归零读数计数的大多数位置, 我们观察到的小物种比实际对照寡核苷酸短1或2。我们没有进一步调查这些小物种, 但假定它们代表了可能存在于所提供的寡核苷酸种群中的降解或不完整产品 (寡核苷酸被订购为高效液相色谱纯化,纯度为 80%)。下图显示了来自不同库运行的控制样本, 其中17个寡核苷酸之间的变化略高, 并且与总长度相关, 因为较长的控制分子的检测效率比较短的分子更高。这可能是由于在 pcr 反应或在 miseq 测序过程中的聚类分析中稍有偏差, 而 mseq 测序的插入尺寸是最佳的, 并且可能发生在具有特别宽的插入范围的库中。解决这种偏差的一个基本方法是应用基于斜率的归一化因子, 该斜率指示与分子长度 (粉红色线) 相关的偏置。所需的计算包括在分析程序中 (请参阅协议中的步骤 8.3)。
图 1:显示 hiv-1 逆转录酶的第一步的图表.这个过程从 tRNA(Lys,3) (橙色) 退火到基因组病毒 rna (步骤 1) 中的引物结合位点 (pbs) 开始, 它允许病毒 cdna 的启动和伸长 (蓝色, 步骤 2)。同时, 模板基因组 rna 被 rt 的 rnaseh 活性降解 (第3步)。逆转录酶过程中的第一个完整中间体是微链-停止 (-) sss cdna, 当 rt 催化聚合到达 grna 重复区域的 5 '-终点 (步骤 3) 时完成。(-) sss 中间体通过退火到互补的 3 ' 长的末端重复 (ltr) r 区域, 转移到基因组 rna 模板的 3 '-末端。从这里开始, 聚合继续 (第4步)。在所述方法中, 逆转录酶的进展是通过映射新生病毒 cdna (蓝色) 的确切长度来确定的。ppt, 聚吡咯道;u5, 唯一的 5 '-序列;u3, 唯一的 3 '-序列。此数字将从以前的出版物6中重新发布。请点击这里查看此图的较大版本.
图 2: 适配器结扎和 pcr 扩增策略的工作流程大纲和原理图.(a) 工作流程概述了所述技术的主要步骤, 以确定受感染细胞中 hiv-1 逆转录病毒文字记录的 3 '-终端。该图改编自以前的一份出版物6。(b) 适配器结扎原理图和 pcr 扩增策略。在前面的步骤中纯化的不同长度的鼻腔 cdna 分子被连接到使用 t4 dna 连接酶的单链 dna 适配器上。发夹适配器 (名为 "完整的郭 + 三塞", 见表 1) 的设计灵感来自郭等人. 11. 适配器带有一个随机的6nt 条形码序列, 允许基对, 以方便连接, 同时作为唯一读取的标识符。适配器的 3 '-终端带有一个间隔器 (spc3), 以防止自结扎。通过变性聚丙烯酰胺凝胶电泳 (page) 将结扎产物从多余的适配器中分离出来。凝胶中的核酸被染色, 并切割成三个独立的, 大小相等的凝胶件在该区域从上面的适配器, 以及在25.在洗脱、沉淀和再悬浮后, 产品通过引物退火扩增到适配器的已知序列 (引物1、多路寡核苷酸试剂盒, 见材料表) 和携带 hiv-1 前22分的底漆5 '-ltr 序列紧跟 trna (引物 2, mp1.0 + 22hiv)。所选引物的 5 '-终端携带所选测序平台 (p5 和 p7) 的适配器以及在同一库中运行的单个样本的索引序列。指出了测序读取引物的起点。蓝色框表示感兴趣的区域, 以确定捕获的分子的原始 3 '-终端。这一数字改编自以前的一份出版物6。请点击这里查看此图的较大版本.
图 3: 具有代表性的结果.(a) 使用所述议定书处理的代表性样品的读总数。这包括所有被确定为 hiv-1 分子的唯一读取的序列, 其 3 '-末端在负链 cdna 的前635分 (直到 ppt, 见图 1)。感染 hiv-1 不携带 a3g 产生的读取次数最多, 而 a3g 抑制 cdna 合成, 从而减少总读取计数。未感染的细胞起到了负面控制的作用, 而一组合成寡核苷酸则提供了积极的控制。b) hiv-1nl4.3序列 (x 轴) 的位置23和 182 (全长-sss cDNAs 为180至 182 nt) 之间的每个长度的 cDNAs 相对丰度以蓝色直方图显示 (左 y 轴上的刻度)。cdna 的相对丰度是根据-sss cdna 序列中终止于给定核苷酸的序列的绝对数量计算的, 除以测量182nt 或更少的所有读数的总和。在虚线中显示的红线是在相应位置 (右 y-轴上的刻度) 携带 c 到 tmu 突变的读取的百分比。图 3b从以前的出版物6中重新发布。请点击这里查看此图的较大版本.
图 4: 具有代表性的控制样本结果.对于含有17种不同长度的合成寡核苷酸的等色量的池, 显示了两个剖面。这些寡核苷酸的序列来自 hiv-1nl4.3,并被选择用于覆盖不同的长度, 并将所有4个碱基呈现为 3 '-核苷酸 (见表 2)。上图显示了图 3a中的正控制样本。没有明显的偏置分子长度或开放 3 '-终端被检测到。底部图显示了不同的库运行, 这在排序上产生了轻微的长度偏差。在这种情况下, 建议应用归一化因子, 该因子是从表示大小偏差的斜率 (以粉红色显示) 派生的。此数字将从以前的出版物6中重新发布。请点击这里查看此图的较大版本.
| 奥利戈名称 | 长度 (单位) | 序列 | 目的 | 制造商 (净化) | ||||||||||||||
| 完整的郭 + 三塞 | 61 | 5 '-pho-tgagaggaggtagttagtcgtknnnngtgggccgaggcacctc-spc3-3 ' | 适配器 | idt dna 技术 (hplc) | ||||||||||||||
| 2xBiotin ss 诱饵 | 40 | 5 '-biotin-cagtggggg割塔卡 | 混合捕获 | mwg eurofins (hplc) | ||||||||||||||
| 生物素 1-16 ss | 22 | 5 '-cagtgtggggaatctttagag-biteg-3 ' | 混合捕获 | mwg eurofins (hplc) | ||||||||||||||
| 生物素 trna + ctg | 16 | 5 '-cagggccccccgcga-biteg-3 ' | 混合捕获 | mwg eurofins (hplc) | ||||||||||||||
| mp1.0 + 22hiv | 82 | 5 '-aatgatggggggacgacgactcttctccctcccacgctctctcgatctagatctagtcactcactg-3 ' | pcr 扩增 | mwg eurofins (hplc) | ||||||||||||||
表 1: 所述协议中使用的寡核苷酸表, 包括长度、序列和修改.该表格改编自以前的出版物6。请点击这里下载此表作为 excel 文件.
| 奥利戈名称 | 长度 (单位) | 序列 | 制造商 (净化) | |||||||||||||
| htp con long c | 1120 | 5 '-cggagagattacactacactacactacactactactactaagtgtggggggggtgtgtgtgtagtagtacacacacgggtccttcttagttagta-3 ' | mwg eurofins (hplc) | |||||||||||||
| htp con long g | 119 | 5 '-cggagagattacactacactacactactactactacttaagtgggggggggggtggtgtgtagtagtacacacacacgggtccttcttagtagtagtagttagtagttagtagta-3 ' | mwg eurofins (hplc) | |||||||||||||
| htp con long t | 116 | 5 '-cggtagagattactactactactactactactactaagtgtgggggggggggtggtggtgtagtagtacacacacacacactttgggtgtcactctttttttttt-3 ' | mwg eurofins (hplc) | |||||||||||||
| htp con long a | 118 | 5 '-cggagagattactacactacactactactactacttaagtggggggggggggtgtgtgtagtagtagtacacacacacgggtccttctctagttaga-3 ' | mwg eurofins (hplc) | |||||||||||||
| htp con 中 c | 76 | 5 '-ctggagagattattacacgacgactaaagtgggtgtgtgtgtgtgttagttagtagacacacgcacgcacgcaccacc-3 ' | mwg eurofins (hplc) | |||||||||||||
| htp con 中 g (a) | 71 | 5 '-cgggagagattacacacgactaaagtggggggggtggtgtgtgttagtagtacacacacacacacacacacacacga-3 ' | mwg eurofins (hplc) | |||||||||||||
| htp con 中 g (b) | 72 | 5 '-cgggagattattacacacgtaaagtgggggtggtgtgtgtgttagtagtagacacacacaggggc-3 ' | mwg eurofins (hplc) | |||||||||||||
| htp con a 中 | 69 | 5 '-cgggagagattattacacactaaagtgtggtggtgtgtgtgtgttagtagtcacacacacacacaga-3 ' | mwg eurofins (hplc) | |||||||||||||
| htp con 中 t | 85 | 5 '-cgggagagattattacacacgacgactaaagtggggggtggtgtgtgtgtgtgttagtacacacacacacacacacacacacactt-3 ' | mwg eurofins (hplc) | |||||||||||||
| htp con short a | 40 | 5 '-cggggagattattccacactataagtgggggggggggggggga-3 ' | mwg eurofins (hplc) | |||||||||||||
| htp con short t | 33 | 5 '-ctggagagattttacacacgactaagggt-3 ' | mwg eurofins (hplc) | |||||||||||||
| htp con short g | 41 | 5 '-cggggagattattccacactaaagtgggggggggggggg3-3 ' | mwg eurofins (hplc) | |||||||||||||
| htp con short c | 34 | 5 '-ctggagagattttacacacgtaagtaagtc-3 ' | mwg eurofins (hplc) | |||||||||||||
| htp con 46 (t) | 46 | 5 '-ctggagagattatttccacactg actaagtgggggggtctct-3 ' | mwg eurofins (hplc) | |||||||||||||
| htp con 83 (c) | 83 | 5 '-cgggagattattattattacactg actaagtgggggggggtggtgtgtgtgttagtagtacacacacacacacacacacacacacacacacacacactc-3 ' | mwg eurofins (hplc) | |||||||||||||
| htp con 103 (c) | 103 | 5 '-cgggagagattattccacactg actaagtggggggggggggggggggggggggggtacacacggcacacactttgactactactactactactactattcactactactactactactactactactactactactactattattatttattactactactactactactactactactactactactactcactcactcactcactcactactactactactattactactactactactactactactacttachtactactactactactac | mwg eurofins (hplc) | |||||||||||||
| htp con 107 (a) | 107 | 5 '-cgggagattattattattacactg actaagtgggggggggggggggggggtgtgtagtacacacacacgggcacactttttgcactctttttt3 ' | mwg eurofins (hplc) | |||||||||||||
表 2: 作为阳性对照样品的17个合成对照寡核苷酸表.前13个寡核苷酸是根据大小 [长 (116 至120非)、中 (69 至 85 t)、短 (33 至 41 nt)] 以及它们的 3 '-末端选择的。该表格改编自以前的出版物6。 请点击这里下载此表作为 excel 文件.
Discussion
快速、可靠和经济高效的深度测序技术使生命科学领域的许多方面发生了革命性的变化, 使基于测序的分析具有很大的深度。剩下的挑战在于创新设计和创建具有代表性的测序库。在这里, 我们描述了一个捕获新生病毒 cdna 分子的协议, 特别是 hiv-1 逆转录酶过程的中间体。
在这一战略中最关键的一步是连接一个适配器开放 3 '-终端在数量和公正的方式。针对各种应用11、26、27、28、29,研究并优化了两个分子内和分子内的两个 ssdna 末端之间结扎的效率。选择在步骤3.3 所述条件下使用带有 t4 dna 连接酶的发夹适配器是经验优化的结果, 我们在实验中评估了不同的配体、适应剂和试剂, 用于合成寡核苷酸的结扎hiv-1 序列 (表 2) (未显示数据)。在这些体外试验反应中, 我们证实 t4 dna 连接酶介导了发夹适配器的结扎, 如郭等人所述. 11、具有非常低的偏置, 当适配器过度使用时, 可实现受体分子的接近完全结扎。结扎效率不受添加核苷酸序列的影响, 使适配器与多路引物系统兼容 (见图 4)。相比之下, 我们发现, 热稳定性 5dna/rna 连接酶 ("连接酶 a", 见材料表比较确切的结扎酶), 这是一种工程 rna 连接酶, 开发的部分原因是为了提高以 ssdna 为受体的结扎效率27, 确实比 rna 连接酶 ("连接酶 b") 更有效地结扎两个 ssdna 分子, 但有明显的偏差, 即使在单碱基长度差异的寡核苷酸之间, 结扎效率也有很强的差异 [表2;htp 中 g (a) 和 (b)]。此外, 我们发现与 "ligase c" 的反应中只有最小的偏差, 并与带有随机 5 '-终端 (一种用于抵消已知的 "ligase c" 核苷酸偏倚的策略) 的适配器结合使用. 30). 然而, "连接酶 c" 介导的分子间结扎不完整, 使 t4 dna 连接酶系统的首选。
在协议过程中的几个质量控制步骤以及包含积极和消极的控制, 可以在检测继续之前检测潜在问题, 并为故障排除工作提供指导。qpcr 2.2.2 和2.3.12 中的步骤进行量化, 以确保输入材料的数量充足。200μl 洗脱 (步骤 2.1) 中的典型 cdna 拷贝数从每μl 10, 000 到 300, 000 不等。混合捕获步骤可能会导致 hiv-1 cdna 总量的一些损失, 但应该会导致在细胞 dna 上的特定 hiv-1 cdna 的大量丰富, 这可以通过使用适当的引物来确定基因组 dna 在浓缩前后的或通过测量总 dna 浓度。在混合捕获步骤后恢复的 hiv-1 cdna 应至少占输入的10%。低起始材料可以解释一个成功的寡核苷酸阳性控制 (见步骤 3.3.2), 但只有有限的读数在样品中实现。总体读数低的原因还可能是由于没有 miseq 适配器的 dna 物种不相关, 高估了图书馆的浓度。这将导致低聚类密度, 并可以通过 qpcr 确定库中 hiv-1 序列的浓度, 以及通过荧光测定的总 dna 量来改进。由于该方法的高度敏感性, 应特别注意避免来自其他样品 (特别是高浓度控制寡核苷酸库存) 和实验室设备的甚至低水平的污染。在紫外线灭菌 pcr 工作站上工作在这方面是有益的。最终库的自动凝胶电泳 (步骤 6.1.2) 是进一步的质量控制措施。通常观察到的核酸大小范围在150至 500 nt 之间, 现在应该不存在 pcr 后和纯化前可在可选控制中检测到的底漆 (见步骤5.2 中的说明)。在一个具有代表性的结果中, 样本强度曲线的峰值在160到 170, 40nm 左右, 第二个更锐利的峰值在320至 350 nt 左右。这可能反映了经常看到的较高的丰度, 无论是相对较短 (1 至20nt 插入长度) 和全长强停 (180 至 182 nt 插入长度) (图 3b)。
虽然所提出的协议和选定的引物是特定于早期 hiv-1 逆转录酶结构, 该方法是普遍适用于任何研究, 旨在确定开放 3 '-终止的 dna。其他上下文中需要的主要修改将是混合捕获的方法和引物设计策略。例如, 如果要使目标适应后期的 hiv-1 转录, 在 cdna 长度内退火更多的不同生物基化寡核苷酸将是可取的, 并可能减少混合捕获步骤中的损失。正如在导言中提到的, 在设计检测 3 '-终端的范围时, 必须考虑到限制, 以避免不同的偏差源。首先, 如果带有适配器的模板长度差别很大, 则 pcr 反应可能会有偏差。其次, 此处使用的排序平台 (例如, miseq) 具有最佳聚类的首选插入长度范围, 并且可能无法以相同的效率对产品进行排序。在一定程度上, 这可以通过计算来解决, 就像通过计算线性长度偏置的修正系数所做的那样 (参见图 4, 下图)。但是, 如果需要 3 '-终端映射的区域很长 (> 1000 nt), 则更建议将反应与结扎的文字记录分开, 并使用多个上游引物来评估部分中的 3 '-终端。
分析程序是在内部编写的, 其具体目的是分析与固定适配器序列相邻的 hiv-1 序列的最后一个核苷酸, 以及所有碱基的基部变异, 以识别任何突变。各个步骤包括以下几个步骤: 首先, 使用快速0.0.13 工具包对适配器序列进行修剪;然后, 删除复制的任何序列 (表示包含条形码的相同序列)。然后使用 bowtie (http://bowtie-bio.sourceforge.net/index.shtml) 将所有剩余的唯一读取与 hiv-1 序列对齐, 最大不匹配设置在三个碱基。模板序列由 hiv-1 cdna (nl4.3 菌株) 的前635吨组成, 其中包括-sss 序列和第一个链转移产品, 直至 polypurine 轨道 (u5-r-u3-ppt; 见图 1)。因此, 所提供的软件和模板只有在该方法用于同一应用时才直接适用 (检测 hiv-1nl4.3 的早期反录)。必须对其他目标序列进行调整。每个读取的 3 '-终端的位置由对齐中的位置决定。记录每个位置的基本调用, 并根据每个基数的总覆盖率计算变异率, 这一点各不相同, 因为读取长度不同, 而在 read2 中的125个基测序可能并不完全覆盖长的插入。
最后, 我们认为所描述的方法是许多类型研究的宝贵工具。明显的应用包括通过抗逆转录病毒药物或细胞限制因子对逆转录酶抑制的机制进行研究。然而, 只需要进行相对较小的调整, 就需要使系统适应其他单链 dna 病毒中间体中的 3 '-末端图谱, 例如, 在细小病毒复制中存在这种情况。此外, 该方法的原理, 特别是其优化的结扎步骤, 可以为图书馆准备设计的核心部分提供任何 3 '-dna 延伸的表征, 包括由细胞双链 dna 催化的伸长率聚合 酶。
Disclosures
提交人声明, 他们没有什么可披露的。
Acknowledgments
提交人感谢 malim 实验室成员 luis Apolonia、jernej ule 和 rebecca oakey 的支持。作者感谢伦敦国王学院基因组中心的马特·阿诺和伦敦大学学院 (ucl) 的黛比·休斯, 下一代神经病学测序设施, 感谢他们在 miseq 测序运行方面提供的帮助。这项工作得到了英国医学研究理事会 (g1000196 和 mr/m00112/1 至 m. m.)、wellcome 信托基金 (10622z/z/z 至 m. m.)、欧洲联盟委员会第七个框架方案 (fp72007-2013) 的支持。piif-gaa-2012-329779 (至 d. p.) 和卫生部通过国家卫生研究所综合生物医学研究中心与伦敦国王学院和国王学院合作, 向盖伊和圣托马斯国家医疗服务体系基金会信托基金颁发了奖项。学院医院 nhs 基金会信托基金。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 293T cells | ATCC | CRL-3216 | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium | Gibco | 31966-021 | |
| Penicillin/Streptomycin | Gibco | 15150-122 | |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 10270-106 | |
| HeraCell Vios 250i CO2 Incubator | Thermo Scientific | 51030966 | |
| Laminar flow hood - CAS BioMAT2 | Wolflabs | CAS001-C2R-1800 | |
| 10mm TC-treated culture dish | Corning | 430167 | |
| TrypLE™ Express (1x), Stable Trypsin Replacement Enzyme | Gibco | 12605-010 | |
| OptiMEM® (Minimal Essential Medium) | Gibco | 31985-047 | |
| HIV-1 NL4-3 Infectious Molecular Clone (pNL4-3) | NIH Aids reagent program | 114 | |
| Polyethylenimine (PEI) - MW:25000 | PolySciences Inc | 23966-2 | dissolved at 1mg/ml and adjusted to pH7 |
| RQ1- Rnase free Dnase | Promega | M6101 | |
| Filter 0.22 μm | Triple Red Limited | FPE404025 | |
| 15 mL polypropylene tubes | Corning | CLS430791 | |
| Sucrose | Calbiochem | 573113 | |
| Phosphate Buffered Saline (1x) | Gibco | 14190-094 | |
| Ultracentrifuge tubes | Beckman Coulter | 344060 | |
| Ultracentrifuge | Sorval | WX Ultra Series | Th-641 Rotor |
| Alliance HIV-1 p24 antigen ELISA kit | Perkin Elmer | NEK050001KT | |
| CEM-SS cells | NIH Aids reagent program | 776 | |
| Roswell Park Memorial Institute Medium | Gibco | 31870-025 | |
| CoStar® TC treated multiple well plates | Corning | CLS3513-50EA | |
| Benchtop centrifuge: Heraus™ Multifuge™ X3 FR | Thermo Scientific | 75004536 | |
| TX-1000 Swinging Bucket Rotor | Thermo Scientific | 75003017 | |
| Microcentrifuge: 5424R | Eppendorf | 5404000060 | |
| Total DNA extraction kit (DNeasy Blood and Tissue kit) | Qiagen | 69504 | |
| Nuclease free H2O | Ambion | AM9937 | |
| Cutsmart buffer | New England Biolabs (part of DpnI enzyme) | R0176S | |
| DpnI restriction enzyme | New England Biolabs | R0176S | |
| Oligonucleotides for qPCR | MWG Eurofins | N/A | HPSF purification |
| TaqMan PCR Universal Mastermix | Thermo | 4304437 | |
| LoBind Eppendorf® tubes | Eppendorf | 30108078 | |
| Axygen™ aerosol filter pipette tips, 1000 μL | Fisher Scientific | TF-000-R-S | |
| Axygen™ aerosol filter pipette tips, 200 μL | Fisher Scientific | TF-200-R-S | |
| Axygen™ aerosol filter pipette tips, 20 μL | Fisher Scientific | TF-20-R-S | |
| Axygen™ aerosol filter pipette tips, 10 μL | Fisher Scientific | TF-10-R-S | |
| PCR clean hood | LabCaire | Model PCR-62 | |
| DynaMag™2-magnet | Thermo | 12321D | |
| Streptavidin MagneSphere® paramagnetic particles | Promega | Z5481 | |
| Casein | Thermo Scientific | 37582 | |
| End over end rotator, Revolver™ 360° | Labnet | H5600 | |
| Tris-Base | Fisher Scientific | BP152-5 | |
| Hydrochloric Acid | Sigma | H1758-100ML | |
| EDTA disodium salt dihydrate | Electran (VWR) | 443885J | |
| Sodium Chloride | Sigma | S3014 | |
| Dri-Block® Analog Block Heater | Techne | UY-36620-13 | |
| PCR tubes and domed caps | Thermo Scientific | AB0266 | |
| PCR machine | Eppendorf | Mastercycler® series | |
| T4 DNA ligase | New England Biolabs | M0202M | |
| 40% Polyethylene glycol solution (PEG) in H2O, MW: 8000 | Sigma | P1458-25ML | |
| Betaine solution, 5M | Sigma | B0300-1VL | |
| Gel loading buffer II (formamide buffer) | Thermo Scientific | AM8546G | |
| Precast 6% TBE urea gels | Invitrogen | EC6865BOX | |
| Mini cell electrophoresis system | Invitrogen, Novex | XCell SureLock™ | |
| Tris/Borate/EDTA solution (10x) | Fisher Scientific | 10031223 | |
| Needle 21 G x1 1/2 | VWR | 613-2022 | |
| SYBR Gold nucleic acid stain (10000x) | Life Technologies | S11494 | |
| Dark Reader DR46B transilluminator | Fisher Scientific | NC9800797 | |
| Ammonium acetate | Merck | 101116 | |
| SDS solution 20% (w/v) | Biorad | 161-0418 | |
| Centrifuge tube filter | Appleton Woods | BC591 | |
| Filter Glass Fibre Gf/D 10mm | Whatman (VWR) | 512-0427 | |
| polyadenylic acid (polyA) RNA | Sigma | 10108626001 | |
| Glycogen, molecular biology grade | Thermo Scientific | R0561 | |
| Isopropanol (2-propanol) | Fisher Scientific | 15809665 | |
| Ethanol, molecular biology grade | Fisher Scientific | 10041814 | |
| Accuprime™ Supermix I (DNA polymerase premix) | Life Technologies | 12342-010 | |
| NEBNext® Multiplex Oligo for Illumina (Index Primer Set 1 and 2) | New England Biolabs | E7335S; E7500S | |
| Tapestation D1000 Screentape High sensitivity | Agilent Technologies | 5067- 5584 | |
| Tapestation D1000 Reagents | Agilent Technologies | 5067- 5585 | |
| 2200 Tapestation - automated gel electrophoresis system | Agilent Technologies | G2965AA | |
| Agencourt® AMPure® beads XP | Beckman Coulter | A63880 | |
| Qubit™ dsDNA HS Assay Kit | Invitrogen | Q32851 | |
| Qubit™ 2.0 Fluorometer | Invitrogen | Q32866 | |
| Topo™ TA cloning Kit | Invitrogen | 450071 | |
| Sequencing platform: MiSeq System | Illumina | ||
| Experiment Manager (Sample sheet software) | Illumina | Note: Use TruSeq LT as a template | |
| Miseq™ Reagent kit V3 (150 cycle) | Illumina | MS-102-3001 | |
| Sequencing hub: Basespace | Illumina | https://basespace.illumina.com | |
| Ligase A: Thermostable 5’ App DNA/RNA ligase | NEB | M0319S | Not used in this protocol, but tested in optimization process with results described in the discussion. |
| Ligase B: T4 RNA ligase 1 | NEB | M0204 | Not used in this protocol, but tested in optimization process with results described in the discussion. |
| Ligase C: CircLigase | Epicentre | CL4111K | Not used in this protocol, but tested in optimization process with results described in the discussion. |
References
- Herschhorn, A., Hizi, A. Retroviral reverse transcriptases. Cellular and Molecular Life Sciences. 67 (16), 2717-2747 (2010).
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