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Immunology and Infection

लिस्टिरिया monocytogenes मस्तिष्क का संक्रमण

Published: October 2, 2018 doi: 10.3791/58723
Automatic Translation
1, 1
1Department of Microbiology and Immunobiology, Harvard Medical School

Summary

संक्रमण के दौरान, लिस्टिरिया monocytogenes मस्तिष्क को उपनिवेश करने के लिए रक्त-मस्तिष्क बाधा पार करने में सक्षम है । इस प्रोटोकॉल में, हम कैसे चूहों के संक्रमण के बाद अंगों के जीवाणु औपनिवेशीकरण का आकलन करने के लिए प्रदर्शन. मस्तिष्क पैरेन्काइमा में बैक्टीरिया की संख्या के विशिष्ट निर्धारण के लिए पूरे अंग छिड़काव करने के लिए एक प्रक्रिया प्रदान की जाती है ।

Abstract

लिस्टिरिया monocytogenes एक intracellular जीवाणु रोगज़नक़ है कि अक्सर भोजन जनित संक्रमण के साथ जुड़ा हुआ है । रक्त मस्तिष्क बाधा (BBB) को पार करने के लिए एल monocytogenes की क्षमता के रूप में यह जीवन के लिए खतरा दिमागी बुखार और इन्सेफेलाइटिस के लिए नेतृत्व कर सकते हैं । BBB विभिन्न विषाक्त चयापचयों से मस्तिष्क microenvironment की सुरक्षा करता है और माइक्रोबियल रोगजनकों रक्त निम्नलिखित संक्रमण में पाया, और इसलिए मस्तिष्क homeostasis का समर्थन. तंत्र जिसके द्वारा एल monocytogenes खून में मौजूद BBB पार करने के लिए मस्तिष्क संक्रमण का कारण पूरी तरह से समझ नहीं रहे है और वहां भी एक मजबूत मॉडल प्रणाली की कमी के लिए एल monocytogenesद्वारा मस्तिष्क संक्रमण का अध्ययन है । यहां, हम एक सरल माउस संक्रमण मॉडल वर्तमान निर्धारित करने के लिए कि क्या बैक्टीरिया BBB पार कर चुके है और बैक्टीरिया है कि vivo मेंमस्तिष्क बृहदांत्र है के बोझ quantitate । इस विधि में, जानवरों नसों से एल monocytogenes के साथ संक्रमित थे और2 ग्रीवा विस्थापन के बाद सह करने के लिए जोखिम से humanely euthanized थे । पशुओं की कार्डियक छिड़काव संक्रमित अंगों की कटाई से पहले किया जाता था । रक्त छिड़काव से पहले एकत्र किया गया था और अंग या रक्त की मिलीलीटर प्रति बैक्टीरिया की संख्या प्लेटों पर रक्त या अंग homogenates के कमजोर पड़ने से चढ़ाना द्वारा निर्धारित किया गया था और गठन की कालोनियों की संख्या की गिनती । इस विधि के लिए उपंयास रिसेप्टर-ligand बातचीत है कि एल monocytogenes द्वारा मस्तिष्क के संक्रमण को बढ़ाने का अध्ययन किया जा सकता है और आसानी से कई जीवाणु रोगजनकों के अध्ययन के लिए अनुकूलित किया जा सकता है ।

Introduction

ग्राम पॉजिटिव जीवाणु लिस्टिरिया monocytogenes एक facultative intracellular रोगज़नक़ और दुनिया भर में सबसे घातक भोजन जनित रोगजनकों में से एक है । एल monocytogenes दूषित भोजन की घूस मनुष्यों में listeriosis के लिए नेतृत्व कर सकते हैं, एक गंभीर इनवेसिव ज्यादातर गर्भवती महिलाओं को लक्षित रोग, नवजात शिशुओं, बुजुर्ग, और प्रतिरक्षा व्यक्तियों1। एल monocytogenes की मौत के प्रमुख कारणों में से एक है अमेरिका और listeriosis से मामले में विपत्ति दर में भोजन जनित रोगज़नक़ 20 के रूप में उच्च के रूप में कर रहे है-30%, सभी खाद्य जनित रोगजनकों के लिए सबसे अधिक2। कोई वैक्सीन वर्तमान में एल monocytogenes के लिए मौजूद नहीं है और बैक्टीरिया की क्षमता को प्रभावी ढंग से बाहर के अंगों और मस्तिष्क को पार करने के लिए रक्त मस्तिष्क बाधा (BBB) को फैलाने के लिए जीवन-धमकी दिमागी बुखार और मस्तिष्क के औपनिवेशीकरण के लिए नेतृत्व कर सकते हैं3 , 4 , 5 , 6. बैक्टीरियल दिमागी बुखार आम तौर पर गंभीर; जबकि ज्यादातर लोग हैं, जो उपचार पुनर्प्राप्त प्राप्त करते हैं, संक्रमण गंभीर जटिलताओं का कारण बन सकता है, जैसे, मस्तिष्क क्षति, सुनवाई हानि, या बच्चों में विकलांग सीखने । एल monocytogenes के लिए खाते में भविष्यवाणी की है सभी समुदाय के ंयूनतम 10% अमेरिका7में दिमागी बुखार का अधिग्रहण किया ।

मस्तिष्क और मेनिन्जेस के जीवाणु प्रसार के लिए एक प्रमुख मार्ग खून के माध्यम से है । मस्तिष्क में रक्त वाहिकाओं में परिचालित बैक्टीरिया मस्तिष्क संक्रमण के कारण BBB को पार करने में सक्षम होते हैं । BBB एक उच्च संवहनी बाधा प्रणाली है कि रक्त में प्रसारित विदेशी कणों से मस्तिष्क की रक्षा करता है । Endothelial कोशिकाओं एक परत है कि लाइनों रक्त वाहिकाओं के आंतरिक सतह8,9का गठन । एल monocytogenesके अलावा, कई बैक्टीरिया रोगजनकों जैसे नेइसेरिया meningitidis, स्ट्रेप्टोकोकस निमोनिया, ई कोलाई, और Haemophilus इंफ्लूएंजा प्रकार बी (Hib) बस्तियां में सक्षम हैं BBB3,4,5,6पार करके मस्तिष्क । हालांकि, संक्रमित चूहों के मस्तिष्क में बैक्टीरियल बोझ की जांच करते समय, यह निर्धारित करना महत्वपूर्ण है कि क्या बैक्टीरिया BBB पार कर चुके हैं, अन्यथा मस्तिष्क में जीवाणु का बोझ मस्तिष्क के रक्त वाहिकाओं में अभी भी बैक्टीरिया का प्रतिनिधित्व हो सकता है । इस प्रकार ब्रेन homogenates की कॉलोनी बनाने वाली इकाइयों (CFU) का निर्धारण करने से पूर्व सभी रक्त के चूहों को perfuse करना आवश्यक है.

इस अध्ययन में, हम vivo तरीकों में वर्णन करने के लिए मस्तिष्क के एल monocytogenes संक्रमण की जांच । यहां बताए गए तरीकों के लिए हमने एल monocytogenes तनाव 10403S का इस्तेमाल किया । एल monocytogenes 10403S10संक्रमण के माउस मॉडल में प्रणालीगत listeriosis का अध्ययन करने के लिए सबसे व्यापक रूप से इस्तेमाल किया प्रयोगशाला उपभेदों में से एक है । इस प्रोटोकॉल पर आधारित है एल monocytogenes के मानक नसों में इंजेक्शन चूहों के छिड़काव द्वारा पीछा किया । चूहों में संक्रमण प्रोटोकॉल के एक योजनाबद्ध रूपरेखा चित्रा 1में दिखाया गया है. एल monocytogenes-संक्रमित दिमाग और गैर-perfused या perfused चूहों से अन्य अंगों को एकत्र किया गया और बैक्टीरियल अंग का बोझ निर्धारित कर दिया गया. इन तरीकों न केवल संक्रमित पशुओं में मस्तिष्क के कुल बैक्टीरियल औपनिवेशीकरण का निर्धारण करने के लिए उपयोगी हैं, लेकिन यह भी निर्धारित करने के लिए लाभकारी है कि क्या बैक्टीरिया मस्तिष्क के आक्रमण मध्यस्थता करने के लिए vivo में BBB प्रवेश किया है. यह उजागर करने के लिए महत्वपूर्ण है कि इस प्रयोगशाला प्रोटोकॉल संबंधित संस्थागत सुरक्षा समिति और पशु सुविधा प्रबंधन के साथ परामर्श के बाद आयोजित किया जाना चाहिए ।

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Protocol

सभी जानवरों को बनाए रखा और अधिकतम देखभाल के साथ संभाला करने के लिए प्रक्रिया के दौरान असुविधा को कम कर रहे हैं । प्रक्रिया संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति और सभी संघीय, राज्य और स्थानीय कानूनों के अनुपालन में आयोजित किया जाना है । यह भी ध्यान दें कि प्रयोगशाला प्रयोगों के अनुसार किया जा करने के लिए कर रहे हैं में सुरक्षा स्तर 2 दिशानिर्देश.

1. माउस संक्रमण अध्ययन के लिए एल monocytogenes की वृद्धि

  1. आटोक्लेव ५०० एमएल ऑफ ब्रेन हार्ट इन्फ्यूश़न (BHI) आगर में एक 1 एल Erlenmeyer कुप्पी में सॉलिड मीडिया प्लेट तैयार करने के लिए । एक ५६ ° c पानी स्नान में शांत करने के लिए मीडिया की अनुमति दें और फिर १०० µ g/एमएल के एक अंतिम एकाग्रता में streptomycin जोड़ें ।
    1. पेट्री डिश प्लेट्स में मीडिया/पेट्री डिश के 25 मिलीलीटर डालो । प्लेटों को कमरे के तापमान (22 ओसी-25 डिग्री सेल्सियस) पर सूखने दें । यदि आवश्यक हो, प्लेटें ३७ डिग्री सेल्सियस पर सूख जा सकता है जब तक पूरी तरह से सूख ।
  2. एक बाँझ inoculating पाश और अपूतित तकनीक का प्रयोग, एक स्टॉक BHI मीडिया प्लस 30% ग्लिसरॉल में जमे हुए संस्कृति से जमे हुए एल monocytogenes तनाव 10403S11, 12 से भरा एक पाश प्राप्त करते हैं और एक-८० डिग्री सेल्सियस फ्रीजर में बनाए रखने.
    1. लकीर एल monocytogenes पर एक BHI आगर/streptomycin प्लेट ऐसी है कि एक जीवाणु कालोनियों अलग किया जा सकता है । एक ३७ डिग्री सेल्सियस मशीन रात भर (18 ज से 24 ज) में प्लेटें एल monocytogenes कालोनियों को विकसित करने के लिए रखें ।
    2. एक बाँझ inoculating पाश का उपयोग करना, bhi आगर प्लेट से एक एकल एल monocytogenes कॉलोनी लेने के लिए और एक बाँझ परीक्षण ट्यूब १०० µ जी/एमएल streptomycin युक्त BHI शोरबा के 5 मिलीलीटर युक्त में कॉलोनी inoculate ।
  3. monocytogenes संस्कृति ट्यूब थोड़ा एक स्थिर मशीन में रात भर 30 डिग्री पर झुका ।
    1. अगले दिन, नेत्रहीन विकास के लिए एल monocytogenes संस्कृति का निरीक्षण (BHI मीडिया पंकिल हो जाएगा) और भंवर संक्षेप में संस्कृति का एक समान निलंबन सुनिश्चित करने के लिए ।
    2. Aseptically बैक्टीरियल संस्कृति के एक 1 मिलीलीटर aliquot निकालें और एक spectrophotometer का उपयोग कर ६०० एनएम (आयुध डिपो६००) पर ऑप्टिकल घनत्व उपाय ।
      नोट: बाँझ BHI शोरबा एल monocytogenes संस्कृति के ऑप्टिकल घनत्व को मापने से पहले spectrophotometer पढ़ने के लिए खाली के रूप में प्रयोग किया जाता है । एल. monocytogenes कल्चर को ऑप्टिकल घनत्व पढ़ने से पहले भी BHI में (दो से पांच गुना) पतला किया जा सकता है ।
    3. monocytogenes कॉलोनी बनाने इकाइयों की संख्या का निर्धारण (CFU) प्रति मिलीलीटर संस्कृति के 10-गुना धारावाहिक कमजोर पड़ने से चढ़ाना द्वारा । यह एल monocytogenes संस्कृति के ऑप्टिकल घनत्व और संस्कृति के प्रति मिलीलीटर बैक्टीरिया की संख्या के बीच एक संबंध स्थापित करने के लिए उपयोगी है । सामान्य तौर पर, एक एल monocytogenes संस्कृति के लिए १.० के एक आयुध डिपो६०० लगभग 1 x 109 बैक्टीरिया की CFU प्रति मिलीलीटर के बराबर होती है ।

2. चूहों के संक्रमण के लिए एल monocytogenes की तैयारी

  1. अठारह से चौबीस घंटे पशु संक्रमण से पहले, हो जाना एल monocytogenes संस्कृतियों में १०० µ जी/एमएल streptomycin और६००/~ CFU प्रति एमएल के रूप में संकेत के रूप में 1/
    नोट: चूहों आम तौर पर संक्रमण के अग्रिम में एक सप्ताह का आदेश दिया है और संक्रमण अध्ययन किया जाता है इससे पहले पशु सुविधा के लिए आदत हैं । इस अध्ययन में, 6-8 सप्ताह पुरानी महिला बालब/चूहे (प्रति समूह 5 चूहों) हार्वर्ड मेडिकल स्कूल BSL2 स्तर के पशु रोकथाम की सुविधा में एक बाधा वातावरण में स्थित थे और भोजन और पानी की आपूर्ति की विज्ञापन libitum।
  2. एल monocytogenes संस्कृति की मात्रा का निर्धारण प्रत्येक माउस के आधार पर संक्रमित करने के लिए आवश्यक ~ CFU बैक्टीरियल संस्कृति के प्रति मिलीलीटर । बाँझ फॉस्फेट में एल monocytogenes संस्कृति का एक कमजोर पड़ने-buffered खारा पीएच ७.२ (पंजाब) बैक्टीरिया की उचित एकाग्रता के लिए । चूहों आमतौर पर नसों के साथ २०० µ एल के साथ संक्रमित कर रहे हैं 1 – 2 × 104 बैक्टीरिया के CFU/
  3. १०० µ जी/एमएल streptomycin युक्त इनोक्युलम प्लेट पर 10 गुना धारावाहिक कमजोर पड़ने से चढ़ाना द्वारा एल monocytogenes की संख्या की पुष्टि करें । इस प्रकार के रूप में माउस प्रति एल monocytogenes inoculated की संख्या निर्धारित करने के लिए रातोंरात एक ३७ डिग्री सेल्सियस मशीन में प्लेटें:
    इनोक्युलम (CFU) = (कालोनियों की संख्या x कमजोर पड़ने फैक्टर)/एमएल मढ़वाया एक्स मात्रा (एमएल) इंजेक्शन

3. नसों पूंछ नस इंजेक्शन के माध्यम से एल monocytogenes के साथ चूहों का संक्रमण

  1. चूहे युक्त पिंजरे से ढक्कन और भोजन डिब्बे निकालें, और 5 मिनट के लिए एक २५० डब्ल्यू अवरक्त गर्मी लैंप के तहत पिंजरे जगह है ।
    नोट: इस विधि पूंछ नसों को चौड़ा करने की अनुमति देता है, यह सुनिश्चित करना है कि इंजेक्शन करने के लिए आसान कर रहे हैं ।
    1. सावधानी से पूंछ नस इंजेक्शन के दौरान जानवरों को सुरक्षित रूप से नियंत्रित करने के लिए एक उचित आकार माउस निरोधक डिवाइस में पशु जगह ।
  2. मिश्रण एल monocytogenes इनोक्युलम (चरण २.२) और एक 1 मिलीलीटर एक 26 ग्राम सुई से सुसज्जित सिरिंज में इनोक्युलम लोड ।
  3. माउस की एक पार्श्व पूंछ नस का पता लगाने और इंजेक्शन साइट एक शराब पैड या एक ७५% इथेनॉल स्प्रे का उपयोग कर साफ ।
  4. धीरे एक पार्श्व पूंछ 26 जी सुई के साथ सिरिंज का उपयोग कर नस में एल monocytogenes निलंबन के २०० µ एल के साथ माउस सुई ।
    1. किसी भी रक्तस्राव को रोकने के लिए इंजेक्शन साइट पर दबाव को संक्षेप में लागू करने के लिए कपास की धुंध का उपयोग करें, और एक नए पिंजरे में जानवर रखें ।
      नोट: सभी चूहों के लिए यह प्रक्रिया करने के लिए इंजेक्शन और पिंजरे उचित लेबल के साथ चिह्नित किया जाना है । के बाद इंजेक्शन एकाग्रता का निर्धारण करने के लिए एल monocytogenes इनोक्युलम, इनोक्युलम की शेष राशि का उपयोग कर चरण २.३ दोहराएँ । प्रति माउस नसों में monocytogenes संक्रमण इनोक्युलम औसत CFU पूर्व और पोस्ट इंजेक्शन इनोक्युलम नमूनों से मापा के रूप में रिपोर्ट की जाती है ।
  5. संक्रमित जानवरों की दैनिक निगरानी और बीमारी के किसी भी प्रकट संकेत नोट (जैसे, व्याकुल फर, कूबड़ मुद्रा, सुस्त आंदोलन, वजन घटाने) । गौरतलब है कि पशुओं को निकालने के लिए काफी पहले ७२ एच पोस्ट संक्रमण (जैसे, 24, ४८ एच के बाद संक्रमण) के अध्ययन और humanely बलि से मरणासन्न प्रतीत होता है । सभी शेष पशुओं ७२ एच पद संक्रमण पर बलि दी जाती है जब तक दैनिक निगरानी जारी रखें ।
    नोट: बालब/c चूहों में ५०% घातक खुराक (LD५०) L monocytogenes तनाव 10403S के लिए है ~ 1 – 2 x 104 CFU/ चूहों एल monocytogenes के LD५० खुराक के साथ संक्रमित इस प्रोटोकॉल का उपयोग बीमारी के लक्षण प्रदर्शित कर सकते हैं, जैसा कि ऊपर संकेत दिया, और जांचकर्ताओं चूहों की उंमीद कर सकते है संक्रमण के सामने झुकने शुरू करने के लिए ७२ एच के बाद संक्रमण ।

४. monocytogenes से संक्रमित चूहों का विच्छेदन और हृदय छिड़काव

  1. पर ७२ एच के बाद संक्रमण (या एक पूर्व वांछित समय बिंदु पर), euthanize एक संस्थागत पशु नैतिकता समिति द्वारा अनुमोदित प्रोटोकॉल का उपयोग कर संक्रमित चूहों, इस तरह के रूप में सह2 ग्रीवा के विस्थापन के बाद asphyxiation ।
    नोट: रक्त संग्रह किया जा करने के लिए है, तो गर्भाशय ग्रीवा विस्थापन प्रदर्शन करते हुए रक्त वाहिकाओं के फाड़ को कम ।
    1. चूहों की पुष्टि एक पंजा-चिकोटी प्रतिक्रिया के अभाव से euthanized गया है ।
      नोट: यदि कार्डियक छिड़काव को निष्पादित किया जाना है, तो एक स्वचालित पम्प/छिड़काव सिस्टम की एक प्रवाह दर 4 मिलीलीटर मात्रा/
  2. एक विच्छेदन पैन में अपनी पीठ पर पशु प्लेस और उदर फर पर ७५% इथेनॉल लागू/
  3. कैंची का प्रयोग, पेट की दीवार में एक चीरा बनाने के लिए और सिर्फ रिब पिंजरे के नीचे करने के लिए चीरा का विस्तार ।
  4. डायाफ्राम और आंत अंगों बेनकाब ।
    नोट: किसी भी आंत अंगों रुखा करने के लिए नहीं सावधान रहना ।
  5. डायाफ्राम काटने और रिब पिंजरे को द्विपक्षीय रूप से काटने के लिए दिल की बाईं निलय को बेनकाब करके वक्ष गुहा खोलो ।
  6. कुंद संदंश का प्रयोग, धीरे से दिल समझ और एक 21 जी तितली सुई बाईं निलय में एक छिड़काव प्रणाली से जुड़ा है और फिर ध्यान से कट सही atrium रक्त (~ ०.२ एमएल) एक 2 मिलीलीटर ट्यूब 10 मिमी युक्त में इकट्ठा ethylenediaminetetraacetic थक्के को रोकने के लिए एसिड (EDTA) । माउस में कार्डियक छिड़काव का एक योजनाबद्ध आरेख चित्रा 2में दिखाया गया है.
    नोट: यदि छिड़काव नहीं है, रक्त हृदय पंचर द्वारा एकत्र किया जा सकता है एक 1 मिलीलीटर सिरिंज का उपयोग कर और जल्दी से एक 2 मिलीलीटर 10 मिमी EDTA युक्त ट्यूब में स्थानांतरित करने के लिए जमावट को रोकने के । L. monocytogenes-संक्रमित अंगों को तो काटा जाता है जैसा कि वर्णित (स्टेप ५.१).
  7. छिड़काव शुरू और 15 के साथ 4 मिनट के लिए पशु perfuse-10 मिमी EDTA युक्त पंजाब के 20 मिलीलीटर ।
    नोट: रक्त और पंजाबियों-EDTA समाधान सही atrium के माध्यम से बह रही है और विच्छेदन पैन में देख कर छिड़काव का आकलन करें । मस्तिष्क और जिगर छिड़काव पूरा होने के बाद आधे उबले हुए दिखाई देगा कि शेष बैक्टीरिया की कटाई अंगों और नहीं घूम रक्त से कर रहे हैं ।

5. अंग संचयन और बैक्टीरियल बोझ का निर्धारण

  1. निम्नलिखित छिड़काव, फसल अंगों (जैसे, जिगर, तिल्ली) ध्यान से किसी भी vasculature और बंधन से जुड़ी हटाने और एक बाँझ में अलग जगह 15 मिलीलीटर शंकु ट्यूब बाँझ ठंड के 5 मिलीलीटर (4 डिग्री सेल्सियस) पंजाब. आगे प्रसंस्करण होता है जब तक बर्फ पर नमूनों की दुकान.
  2. मस्तिष्क फसल के लिए, decapitate कैंची का उपयोग कर कान के पीछे सिर और midline नीचे जानवरों की आंखों के बीच में खोपड़ी त्वचा में कटौती । यदि आवश्यक हो, तो खोपड़ी के खिलाफ दबाया कैंची रखने के अतिरिक्त ऊतक ट्रिम कर दीजिए ।
    1. धीरे फोरमेन मैग्नम में कैंची के एक टिप डालने (खोपड़ी के आधार में छेद जिसके माध्यम से रीढ़ की हड्डी गुजरता है) और दोनों पक्षों पर खोपड़ी में बाद में कटौती ।
    2. धीरे midline के नीचे है कुतर आंखों के बीच में खोपड़ी में कटौती, पार्श्व दबाव लागू करने के लिए सुनिश्चित किया जा रहा । मस्तिष्क के गड़बड़ी से बचें और मस्तिष्क के ऊतकों और कैंची के बीच न्यूनतम संपर्क बनाए रखें ।
    3. ठीक टिप संदंश का प्रयोग, खोपड़ी को खोलने के लिए मस्तिष्क का पर्दाफाश और मस्तिष्क के नीचे और खोपड़ी के आधार के बीच एक रंग जगह मस्तिष्क को दूर करने के लिए ।
      नोट: मस्तिष्क तंत्रिका तंतुओं के फाड़ में यह परिणाम है ।
    4. ध्यान से एक 15 मिलीलीटर शंकु ट्यूब बाँझ ठंड पंजाबियों के 5 मिलीलीटर युक्त करने के लिए मस्तिष्क हस्तांतरण ।
    5. माउस लोथ छोड़ें, और शेष पशुओं के लिए इन चरणों को दोहराएँ ।
      नोट: एक बार सभी अंगों को काटा गया है, प्रक्रिया क्षेत्र को साफ और बैक्टीरियल बोझ निर्धारित करने के लिए अंग homogenization के लिए तैयार करते हैं ।
  3. स्वच्छ और एक ऊतक homogenizer की नोक को शामिल टिप डालने और 10 एस के लिए homogenizer चल रहा है 5% ब्लीच, बाँझ पानी, ७५% इथेनॉल, बाँझ पानी प्रत्येक एक अलग 15 मिलीलीटर शंकु ट्यूब में निहित द्वारा एक सुरक्षा कैबिनेट में रखा ।
  4. संक्रमित मस्तिष्क Homogenize 15 मिलीलीटर शंकु ट्यूब में 6, अधिकतम rpm की स्थापना पर (~ 20 एस) नहीं दिखाई ऊतक टुकड़े तक रहते हैं ।
    1. अगले अंग नमूने के लिए बैक्टीरिया को रोकने के लिए ५.३ कदम में वर्णित के रूप में homogenizer साफ ।
    2. अन्य सभी अंगों (जैसे, जिगर, तिल्ली) के लिए homogenization प्रक्रिया को पूरा करें ।
    3. homogenization प्रक्रिया के पूरा होने के बाद, homogenizer चरण ५.३ में वर्णित के रूप में साफ और आगे उपयोग जब तक दुकान ।
  5. बाँझ पंजाबियों में अंग homogenates के 10 गुना धारावाहिक कमजोर पड़ने की तैयारी और streptomycin प्लेट पर कमजोर पड़ने की थाली/CFU प्रति अंग निर्धारित करने के लिए ।
    नोट: एक समान विधि CFU प्रति मिलीलीटर रक्त का निर्धारण करने के लिए किया जाता है ।
    1. सभी कमजोर पड़ने के बाद चढ़ाया जाता है, एक ३७ डिग्री सेल्सियस मशीन रात भर के लिए प्लेटों हस्तांतरण ।
    2. अगले दिन, प्रत्येक प्लेट पर कालोनियों की संख्या गिनती अंग या रक्त के एमएल प्रति बैक्टीरिया की कुल संख्या निम्नानुसार निर्धारित करने के लिए:
      CFU/अंग = (कालोनियों की संख्या x कमजोर पड़ने फैक्टर)/homogenate मढ़वाया एक्स 5 के एमएल
      CFU/एमएल रक्त के = (कालोनियों की संख्या x कमजोर पड़ने फैक्टर)/

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Representative Results

मस्तिष्क अत्यधिक संवहनी है और एल monocytogenes रक्त3,13में मौजूद संक्रमित कोशिका प्रकार के लिए जाना जाता है । वर्णित प्रोटोकॉल को रक्त मस्तिष्क बाधा (BBB) को पार करने के लिए एल monocytogenes की क्षमता को प्रदर्शित करने के लिए प्रयोग किया जाता है चूहों में मस्तिष्क के संक्रमण के लिए अग्रणी । यह निर्धारित करने के लिए कि बैक्टीरिया vivo मेंBBB को पार कर गया है, माउस में रक्त की छिड़काव मस्तिष्क में बैक्टीरिया के बोझ का निर्धारण करने से पहले किया जाता है । अंयथा, प्राप्त CFU बैक्टीरिया है कि मस्तिष्क के रक्त वाहिकाओं में मौजूद है शामिल हो सकते हैं । एल monocytogenes संक्रमित दिमाग (चित्रा 3ए) और जिगर (चित्र बी) से पहले या बाद में छिड़काव पर ७२ एच पद संक्रमण दिखाया गया है । चित्रा 4 एल monocytogenes-संक्रमित माउस अंगों में जीवाणु के बोझ से पता चलता है और मस्तिष्क में मौजूद बैक्टीरिया की संख्या, रक्त, जिगर, और प्रत्येक माउस की तिल्ली दिखाता है. इन आंकड़ों का सुझाव है कि पशुओं के छिड़काव इस अध्ययन (चित्रा 4) में जांच की माउस अंगों में जीवाणु के बोझ को काफी प्रभावित नहीं किया ।

Figure 1
चित्रा 1 : योजनाबद्ध रूपरेखा एल monocytogenes vivo में संक्रमण प्रोटोकॉल । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्रा 2 : कार्डियक छिड़काव प्रक्रिया की योजनाबद्ध आरेख । बाईं निलय में छिड़काव सुई की प्रविष्टि दिखा माउस दिल के माध्यम से छिड़काव (चरण ४.६). सुई प्रविष्टि के बाद, एक तत्काल चीरा छिड़काव प्रक्रिया शुरू करने के लिए सही atrium में किया जाता है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्रा 3 : के साथ संक्रमण के बाद काटा माउस अंगों एल. monocytogenes. बालब/सी चूहे नसों के माध्यम से संक्रमित थे पार्श्व पूंछ नस इंजेक्शन के साथ जंगली प्रकार एल monocytogenes 10403S, (1-2 x 104 बैक्टीरिया/ ७२ घंटे के बाद संक्रमण, चूहों euthanized थे और माउस अंगों को एकत्र किया गया या euthanized चूहों 10 मिमी EDTA से पहले अंग कटाई से युक्त पंजाब के 15-20 मिलीलीटर के साथ दिल के माध्यम से perfused थे. प्रतिनिधि दिमाग (A) और यकृत (B) गैर-perfused या perfused चूहों से दर्शाए जाते हैं. ध्यान रखें कि माउस के अंगों में सफेद/पीला (उबला हुआ) दिखाई देगा छिड़काव के बाद यह सुनिश्चित करने के लिए कि बैक्टीरियल CFU से काटा अंग ऊतक और ऊतक के भीतर घूम रक्त नहीं है । इस आंकड़े को घोष एट अल., २०१८14से संशोधित किया गया है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 4
चित्र 4 : संक्रमित माउस अंगों में बैक्टीरियल बोझ । बालब/सी चूहे नसों जंगली प्रकार एल monocytogenes 10403S के साथ संक्रमित के रूप में चित्रा 3में वर्णित थे । पर ७२ एच के बाद संक्रमण, मस्तिष्क, रक्त, जिगर, और प्रत्येक माउस की तिल्ली एकत्र किए गए थे और बैक्टीरियल बोझ निर्धारित किया है । पृथक प्रयोगों में, चूहों के पूरे शरीर छिड़काव का प्रदर्शन किया गया और प्रत्येक अंग के भीतर जीवाणु का बोझ प्रक. क्षैतिज रेखाएं माध्य मानों को इंगित करती हैं । * इस समूह के लिए, कार्डिएक छिड़काव के शुरू होने से पहले रक्त तुरंत एकत्र किया गया था । इस आंकड़े को घोष एट अल., २०१८14से संशोधित किया गया है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

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Discussion

एल monocytogenes मनुष्य में जीवन-धमकी meningoencephalitis पैदा करने में सक्षम है । पूर्व अध्ययनों ने रक्त-मस्तिष्क-अवरोध (BBB) को पार करने और मस्तिष्क को उपनिवेश करने के लिए बैक्टीरिया की क्षमता का प्रदर्शन किया है. मस्तिष्क आक्रमण के तीन मार्गों का प्रस्ताव किया गया है संक्रमण के दौरान: बैक्टीरिया द्वारा BBB के प्रत्यक्ष प्रवेश, mononuclear कोशिकाओं3के अंदर निहित बैक्टीरिया द्वारा चुपके परिवहन, और axonal प्रवासन द्वारा एल monocytogenes उपभेदों कि कारण rhombencephalitis15. के बाद से मस्तिष्क अत्यधिक संवहनी है और एल monocytogenes प्रणालीगत संक्रमण के दौरान रक्त में प्रसारित करने के लिए जाना जाता है, हद का निर्धारण l monocytogenes केंद्रीय तंत्रिका तंत्र उपनिवेश करने के लिए रक्त वाहिकाओं घुसना करने में सक्षम है और मस्तिष्क महत्वपूर्ण है ।

वर्णित प्रोटोकॉल में नसों में पूंछ नस इंजेक्शन एक प्रणालीगत एल monocytogenes संक्रमण चूहों में स्थापित करने के लिए प्रयोग किया जाता है । इस विधि आंत्र बाधा बाईपास और खून से BBB के विशेष रूप से बैक्टीरियल आक्रमण का आकलन करने के लिए उपयोगी है । प्रोटोकॉल कई महत्वपूर्ण मापदंडों का वर्णन करता है । एक महत्वपूर्ण पैरामीटर vivo प्रयोगों में के दौरान उपयुक्त जीवाणु संक्रमण खुराक का उपयोग है । यह बैक्टीरियल CFU एल monocytogenesसे संक्रमित विभिंन पशु समूहों से प्राप्त की तुलना करने में सक्षम होने के लिए महत्वपूर्ण है । एक अंय महत्वपूर्ण पहलू पर विचार के लिए एल monocytogenes प्रयोगात्मक अध्ययन के लिए इस्तेमाल किया तनाव है । कई रिपोर्टों उनके pathogenicity और मस्तिष्क को संक्रमित करने की क्षमता में विभिंन एल monocytogenes उपभेदों के बीच मतभेदों का सुझाव दिया है10,16।

प्रोटोकॉल यहां वर्णित एल monocytogenes संक्रमण जीवविज्ञान के अंय पहलुओं की परीक्षा की सुविधा के लिए संशोधित किया जा सकता है । एल monocytogenes संक्रमित अंगों और histopathological विश्लेषण के लिए संसाधित किया जा सकता है संक्रमित माउस अंगों में दिखाई भड़काऊ परिवर्तन निरीक्षण करने के लिए संक्रमित नियंत्रण पशुओं की तुलना में । वर्णित तरीकों को और अधिक रोग phenotypes monocytogenes मानव संक्रमण में शामिल उपभेदों के रूप में के रूप में अच्छी तरह से उपभेदों संभावित डाह निर्धारकों में परिभाषित म्यूटेंट बंदरगाह के लिए प्रासंगिक विशेषताएं लागू किया जा सकता है । इस तरह के एक आवेदन हाल ही में एक उपंयास रिसेप्टर-ligand बातचीत है कि एल monocytogenes द्वारा मस्तिष्क के संक्रमण को बढ़ाता है प्रकट करने के लिए प्रदर्शन किया गया था और आगे होस्ट में मेजबान सेल सतह vimentin के महत्व पर प्रकाश डाला-रोगज़नक़ बातचीत 14.

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Disclosures

लेखक कोई प्रतिस्पर्धी वित्तीय हितों की घोषणा ।

Acknowledgments

यह काम स्वास्थ्य के राष्ट्रीय संस्थानों से अमेरिकी जन स्वास्थ्य सेवा अनुदान AI103806 द्वारा समर्थित किया गया था.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Brain Heart Infusion media Becton Dickinson 237200
Streptomycin sulfate  Amresco 0382-50G
Petri dishes VWR 25384-342
Glycerol VWR 97062-832
IKA T18 ULTRA-TURRAX Basic Homogenizer IKA 3352109 Model: T18BS1
Spectrophotometer Beckman Coulter DU 800 series
BALB/c mice Jackson Laboratory Model #000651
1 mL syringes Becton Dickinson 309659
26 G needles Becton Dickinson 305115
21 G butterfly needles Becton Dickinson 367281
Ethylenediaminetetraacetic acid  Sigma-Aldrich 60004
15 mL conical tubes VWR 21008-918
Round-bottom test tubes VWR 60819-546
Phosphate-buffered saline  Corning 46-013-CM
Stainless steel spatula VWR 82027-520
Stainless steel scissors (6.5 in) VWR 82027-592
Stainless steel scissors (4.5 in) VWR 82027-578
Stainless steel blunt forceps  (4.5 in) VWR 82027-440
Stainless steel fine tip forceps  (6 in) VWR 82027-406

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References

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इम्यूनोलॉजी और संक्रमण अंक १४० मस्तिष्क रक्त मस्तिष्क बाधा संक्रमण intracellular रोगज़नक़ लिस्टिरिया monocytogenes meningoencephalitis आसंजन आक्रमण छिड़काव
<em>लिस्टिरिया monocytogenes</em> मस्तिष्क का संक्रमण
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Ghosh, P., Higgins, D. E.… More

Ghosh, P., Higgins, D. E. Listeria monocytogenes Infection of the Brain. J. Vis. Exp. (140), e58723, doi:10.3791/58723 (2018).

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