Summary
Durante a infecção, a Listeria monocytogenes é capaz de atravessar a barreira hemato - encefálica para colonizar o cérebro. Neste protocolo, demonstramos como avaliar a colonização bacteriana de órgãos após a infecção de camundongos. Está previsto um procedimento para executar a perfusão de órgão inteiro para determinação específica dos números bacterianas do parênquima cerebral.
Abstract
Listeria monocytogenes é um patógeno bacteriano intracelular que está frequentemente associado com infecção de origem alimentar. A capacidade de L. monocytogenes de atravessar a barreira hemato - encefálica (BBB) é relativo, pode levar a risco de vida meningite e encefalite. O BBB protege o microambiente do cérebro de vários metabólitos tóxicos e patógenos microbianos no sangue após a infecção e, portanto, suporta a homeostase do cérebro. Os mecanismos pelos quais L. monocytogenes presente na corrente sanguínea cruzar o BBB para causar cérebro infecções não são totalmente compreendidas e há também a falta de um sistema de modelo robusto para estudar infecções cerebrais por L. monocytogenes. Aqui, apresentamos um modelo de infecção de mouse simples para determinar se as bactérias cruzaram o BBB e para dosar a carga de bactérias que colonizaram o cérebro em vivo. Neste método, os animais foram infectados por via intravenosa com L. monocytogenes em humanamente foram sacrificados por exposição ao CO2 , seguido por deslocamento cervical. Perfusão cardíaca dos animais foi realizada antes da colheita de órgãos infectados. Sangue foi coletado antes da perfusão e o número de bactérias por órgão ou mL de sangue foi determinada por chapeamento diluições do sangue ou órgão homogenates em placas de ágar e contando o número de colônias formadas. Esse método pode ser usado para estudar interações ligante-receptor romance que aumentam a infecção do cérebro por L. monocytogenes e podem ser facilmente adaptado para o estudo de vários patógenos bacterianos.
Introduction
A bactéria Gram-positiva Listeria monocytogenes é um patógeno intracelular facultativo e um dos maioria dos mortais comida patógenos em todo o mundo. Ingestão de alimentos de L. monocytogenes contaminado pode levar a listeriose em humanos, uma grave doença invasiva visando principalmente grávidas, os recém-nascidos, os indivíduos idosos e imunocomprometidos1. L. monocytogenes está entre as principais causas de morte por um patógeno de origem alimentar nos Estados Unidos e taxas de fatalidade casos de listeriose são tão elevadas como 20 a 30%, o mais elevado para todos os agentes patogénicos de origem alimentar2. Nenhuma vacina atualmente existe para L. monocytogenes e a capacidade das bactérias para efetivamente espalhou para o cérebro e órgãos distais por atravessar a barreira hemato - encefálica (BBB) pode levar a risco de vida meningite e colonização do cérebro3 , 4 , 5 , 6. meningite bacteriana é geralmente severa; enquanto a maioria das pessoas que recebem tratamento recuperam, infecções podem causar sérias complicações, por exemplo, danos cerebrais, perda de audição ou dificuldades de aprendizagem em crianças. L. monocytogenes é previsto compensar pelo menos 10% de toda a Comunidade adquiriu meningite no EUA7.
Uma importante rota para a disseminação bacteriana para o cérebro e as meninges é através da corrente sanguínea. Bactérias circulantes em vasos sanguíneos no cérebro são capazes de atravessar o BBB para causar infecção cerebral. O BBB é um sistema altamente vascularizado barreira que protege o cérebro de partículas estranhas que circulam no sangue. Células endoteliais constituem uma camada que reveste a superfície interior do vasos sanguíneos8,9. Além de L. monocytogenes, vários agentes patogénicos bacterianos como Neisseria meningitidis, Streptococcus pneumoniae, Escherichia colie Haemophilus influenzae tipo b (Hib) são capazes de colonizar o cérebro através do cruzamento do BBB3,4,5,6. No entanto, ao examinar a carga bacteriana no cérebro de ratos infectados, é importante determinar que se as bactérias cruzaram o BBB, caso contrário a carga bacteriana no cérebro pode representar as bactérias que são ainda nos vasos sanguíneos do cérebro. Assim, é necessário perfundir os ratos de todo o sangue antes da determinação de unidades formadoras de Colônia (UFC) dos homogenates do cérebro.
Neste estudo, descrevemos na vivo métodos para examinar a infecção de L. monocytogenes do cérebro. Para os métodos descritos aqui, usamos a L. monocytogenes estirpe 10403S. L. monocytogenes 10403S é uma das variedades de laboratório mais amplamente utilizado para estudar a listeriose sistêmica no modelo do rato de infecção10. Este protocolo é baseado em padrão injecção intravenosa de L. monocytogenes , seguido de perfusão dos ratos. Um esboço esquemático do protocolo de infecção em camundongos é mostrado na Figura 1. L. monocytogenes-cérebros infectados e outros órgãos de ratos perfundidos ou não perfundidos foram coletados e a carga bacteriana órgão determinado. Esses métodos são úteis para determinar não só a colonização bacteriana total do cérebro de animais infectados, mas também são benéficos para determinar se a bactéria ter penetrado o BBB na vivo para mediar a invasão do cérebro. É importante salientar que este protocolo do laboratório deve ser realizado após consulta com a gestão de instalações de biossegurança institucional relevante Comissão e animal.
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Protocol
Todos os animais estão a ser mantida e tratada com o máximo cuidado para minimizar o desconforto durante o curso do procedimento. O procedimento está a ser conduzida em conformidade com o cuidado de Animal institucional e Comissão de uso e todas as leis federais, estaduais e locais. Observe também que os experimentos de laboratório devem ser conduzidos de acordo com as diretrizes de biossegurança nível 2.
1. crescimento de L. monocytogenes para estudos de infecção de Mouse
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500 mL de ágar-ágar infusão de cérebro coração (BHI) em um frasco de Erlenmeyer de 1L para preparar pratos de meios sólidos de autoclave. Permitir que os meios de comunicação resfriar em um banho de 56 ° C e em seguida, adicione em uma concentração final de 100 µ g/mL Estreptomicina.
- Despeje a 25 mL de mídia/placa de Petri em placas de Petri. Permitir que as placas secar à temperatura ambiente (22 óC-25 ° C). Se necessário, as placas podem ser secos a 37 ° C até completamente seco.
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Utilizando uma ansa inoculando estéril e técnica asséptica, obter um loop completo de congelados de L. monocytogenes estirpe 10403S11,12 de uma cultura de estoque congelada em glicerol de mídia mais 30% BHI e manter em um freezer-80 ° C.
- Raia a L. monocytogenes em uma ágar BHI/estreptomicina placa tal que único colônias bacterianas podem ser isoladas. Coloque as placas em uma incubadora de 37 ° C durante a noite (18 h a 24 h) para crescer as colônias de L. monocytogenes .
- Usando um loop inoculando estéril, escolher uma única colônia de L. monocytogenes de agar BHI placa e inocular a colônia para um tubo de ensaio estéril contendo 5 mL de caldo BHI contendo 100 estreptomicina µ g/mL.
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Incube o tubo de cultura de L. monocytogenes ligeiramente inclinado a 30 ° durante a noite em uma incubadora de estática.
- No dia seguinte, inspecione visualmente a cultura de L. monocytogenes para o crescimento (os meios de comunicação BHI será turvos) e vórtice brevemente para assegurar uma suspensão uniforme da cultura.
- Assepticamente, retirar uma alíquota de 1ml da cultura bacteriana e medir a densidade óptica em 600 nm (OD600), utilizando um espectrofotômetro.
Nota: Caldo BHI estéril é usado como o espaço em branco para o espectrofotômetro lendo antes de medir a densidade óptica da cultura L. monocytogenes . A cultura de L. monocytogenes pode também ser diluída (duas a cinco vezes) em BHI antes da leitura da densidade óptica. - Determine o número de L. monocytogenes unidades formadora de Colônia (UFC) por mL de cultura BHI por chapeamento 10 vezes diluições em série da cultura. Isso é útil para estabelecer uma relação entre a densidade óptica da cultura L. monocytogenes e o número de bactérias por mL de cultura. Em geral, uma OD600 de 1.0 para uma cultura de L. monocytogenes é igual a aproximadamente 1 x 109 UFC de bactérias por mL.
2. preparação de L. monocytogenes para infecção de ratos
- Dezoito a vinte e quatro horas antes da infecção animal, crescer culturas de L. monocytogenes em caldo BHI contendo 100 estreptomicina µ g/mL e determinar o OD600/ ~ CFU / mL, conforme indicado na etapa 1.
Nota: Ratos são geralmente ordenados uma semana antes da infecção e são aclimatados para as instalações de animais antes da infecção são efectuados estudos. Neste estudo, 6 – 8 semanas camundongos BALB/c de fêmeas velhos (5 ratos por grupo) foram alojados em um ambiente de barreira na instalação de contenção de animais de nível BSL2 Harvard Medical School em forneceu comida e água ad libitum. - Determinar a quantidade de L. monocytogenes cultura necessária para infectar cada rato baseado o ~ CFU / mL de cultura bacteriana. Fazer uma diluição da cultura L. monocytogenes em estéril tampão fosfato salina pH 7,2 (PBS) para a concentração adequada de bactérias. Os ratos estão normalmente infectados por via intravenosa com 200 µ l de PBS contendo 1 – 2 × 104 UFC de bactérias/animal.
- Verifique se o número de L. monocytogenes em inóculo por chapeamento 10 vezes diluições em série em placas de ágar BHI contendo 100 estreptomicina µ g/mL. Incube as placas em uma incubadora de 37 ° C durante a noite para determinar o número de L. monocytogenes inoculada por rato como segue:
Inóculo (CFU) = (número de colônias x fator de diluição) / mL banhado x volume (mL) injetado
3. infecção de ratos com L. monocytogenes através de injeção de veia de cauda intravenosa
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Remover as lixeiras tampa e comida da gaiola contendo os ratos e coloque a gaiola sob uma lâmpada de calor infravermelho W 250 por 5 min.
Nota: Este método permite que as veias de cauda dilatar, garantindo que as injeções são mais fáceis de realizar.- Cuidadosamente coloque o animal em um tamanho apropriado do mouse dispositivo para reprimir com segurança o animal durante injeções de veia da cauda de restrição.
- Misture o inóculo de L. monocytogenes (passo 2.2) e carregar o inóculo em uma seringa de 1 mL, equipada com uma agulha 26G.
- Localizar uma veia lateral da cauda do rato e limpe o local da injeção, usando uma compressa embebida em álcool ou um spray de álcool etílico de 75%.
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Injecte suavemente o mouse com 200 µ l de suspensão de L. monocytogenes na veia lateral da cauda usando a seringa com a agulha 26G.
- Use gaze de algodão para brevemente, aplicar pressão no local da injeção para estancar qualquer hemorragia e colocar o animal em uma gaiola nova.
Nota: Execute este processo para todos os ratos para ser injetado e marcar a gaiola com Etiquetas apropriadas. Para determinar a concentração de pós-injeção do inóculo L. monocytogenes , repita a etapa 2.3 usando a quantidade restante de inóculo. A intravenosa inóculo de infecção de L. monocytogenes por rato é relatado como o UFC médio medido a partir das amostras de inóculo de pré e pós-injeção.
- Use gaze de algodão para brevemente, aplicar pressão no local da injeção para estancar qualquer hemorragia e colocar o animal em uma gaiola nova.
- Monitorar os animais infectados diariamente e observe quaisquer sinais aparentes da doença (por exemplo, babados de peles, postura encurvada, movimento lento, perda de peso). Remova animais que parecem ser significativamente moribundo antes da pós-infecção 72 h (por exemplo, 24, 48 h pós-infecção) do estudo e humanamente sacrificar. Continue a acompanhar diariamente, até que todos os restantes animais são sacrificados a pós-infecção 72 h.
Nota: A dose letal 50% (LD50) para a tensão 10403S de L. monocytogenes em camundongos BALB/c é ~ 1 – 2 x 104 UFC/animal. Camundongos infectados com doses de50 LD de L. monocytogenes usando este protocolo podem apresentar sinais de doença, como indicado acima, e os investigadores poderiam esperar os ratos para começar a sucumbir à infecção após pós-infecção 72 h.
4. dissecção e cardíaco perfusão de camundongos infectados com L. monocytogenes
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A pós-infecção 72 h (ou em um ponto antes do tempo desejado), eutanásia os ratos infectados usando um protocolo aprovado pelo Comitê de ética Animal institucionais, tais como CO2 asfixia seguida por deslocamento cervical.
Nota: Se a coleta de sangue é para ser realizado, minimize rasgando dos vasos sanguíneos durante a execução de deslocamento cervical.- Confirme os ratos têm sido sacrificados pela ausência de uma resposta de contração pata.
Nota: Se perfusão cardíaca deve ser realizada, criar um sistema de bomba/perfusão automatizado em uma taxa de fluxo de volume de 4 mL/min.
- Confirme os ratos têm sido sacrificados pela ausência de uma resposta de contração pata.
- Colocar o animal em sua parte traseira em uma bandeja de dissecação e aplicar 75% de etanol na superfície da pele/pele abdominal.
- Usando a tesoura, faça uma incisão na parede abdominal e expandir a incisão para apenas abaixo da caixa torácica.
- Expor o diafragma e órgãos viscerais.
Nota: Tenha cuidado para não dilacerar qualquer órgãos viscerais. - Abra a cavidade torácica cortando o diafragma e cortar a caixa torácica bilateralmente para expor o ventrículo esquerdo do coração.
- Usando fórceps rombudo, segure cuidadosamente no coração e inserir uma agulha tipo borboleta 21G conectado a um sistema de perfusão para o ventrículo esquerdo e cuidadosamente corte aurícula direita para coletar o sangue (~0.2 mL) em um tubo de 2 mL contendo ácido etilenodiaminotetracético 10mm ácido (EDTA) para evitar a coagulação. Um diagrama esquemático da perfusão cardíaca no mouse é mostrado na Figura 2.
Nota: Se perfusão não for executada, sangue pode ser coletado por punção cardíaca, utilizando uma seringa de 1 mL e rapidamente transferido para um tubo de 2 mL contendo 10 mM EDTA para evitar a coagulação. L. monocytogenes -infectados órgãos são então colhidos como descrita (etapa 5.1). - Iniciar a perfusão e perfundir o animal por 4 min com 15-20 mL de PBS contendo 10 mM de EDTA.
Nota: Avalie perfusão, observando o sangue e a solução de PBS-EDTA fluindo através do átrio direito e dentro da panela de dissecação. O cérebro e o fígado vão aparecer descascadas após perfusão completa, garantindo que as bactérias restantes são de órgãos colhidos e não o sangue circulando.
5. órgão colheita e a determinação dos encargos bacterianas
- Seguir de perfusão, a colheita de órgãos (por exemplo, fígado, baço) removendo cuidadosamente qualquer vasculatura e ligamentos anexado e colocar os órgãos separadamente em um tubo cônico estéril 15 mL contendo 5 mL de estéril frio (4 ° C) PBS. Armazenar as amostras no gelo até que ocorra a transformação.
-
Para colher o cérebro, decapitar a cabeça atrás das orelhas com uma tesoura e cortar a pele do couro cabeludo entre os olhos do animal para baixo da linha média. Se necessário, apare o excesso de tecido mantendo a tesoura pressionada contra o crânio.
- Suavemente Insira uma ponta da tesoura o foramen magnum (o furo da base do crânio através do qual passa a medula espinhal) e cortar lateralmente o crânio em ambos os lados.
- Delicadamente corte o crânio entre olhos do roedor para baixo da linha mediana, certificando-se de aplicar pressão lateral. Evitar a perturbação do cérebro e manter contato mínimo entre o tecido cerebral e a tesoura.
- Usando pinças de ponta fina, abra o crânio para expor o cérebro e coloque uma espátula entre a parte inferior do cérebro e da base do crânio para remover o cérebro.
Nota: Isto resulta em rasgar as fibras nervosas do cérebro. - Transferi com cuidado o cérebro para um tubo cônico de 15 mL contendo 5 mL de PBS estéril de frio.
- Descartar a carcaça do mouse e repita essas etapas para os restantes animais.
Nota: Uma vez que todos os órgãos foram colhidos, limpe a área de procedimento e se preparar para a homogeneização de órgão determinar a carga bacteriana.
- Limpar e esterilizar a ponta de um homogeneizador de colocado em uma biossegurança armário introduzindo a ponta e executando o homogenizador para bleach 10 s sequencialmente em 5%, água estéril, 75% de etanol, água esterilizada cada contido em um tubo cônico de 15ml separado.
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Homogeneizar o cérebro infectado (~ 20 s na configuração 6, rpm máxima) no tubo cónico de 15 mL até permanecem sem fragmentos de tecido visível.
- Limpa o homogenizador conforme descrito na etapa 5.3 para evitar bactérias transitar contaminação para a próxima amostra de órgão.
- Execute o processo de homogeneização para todos os outros órgãos (por exemplo, fígado, baço).
- Uma vez concluído o processo de homogeneização, limpe o homogenizador conforme descrito na etapa 5.3 e loja até nova utilização.
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Prepare-se 10 vezes diluições em série do órgão homogenates em PBS estéril e as diluições em placas de ágar/estreptomicina BHI para determinar o CFU por órgão da placa.
Nota: Um método similar é realizado para determinar o UFC / mL de sangue.- Depois de todas as diluições são banhadas, transferi as placas para uma incubadora de 37 ° C durante a noite.
- No dia seguinte, conte o número de colônias em cada placa para determinar o número total de bactérias por órgão ou mL de sangue da seguinte forma:
CFU/órgão = (número de colônias x fator de diluição) / mL de homogenate chapeado x 5
UFC/mL de sangue = (número de colônias x fator de diluição) / mL de sangue banhado
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Representative Results
O cérebro é altamente vascularizado e L. monocytogenes é conhecido para infectar os tipos de células presentes no sangue3,13. O protocolo descrito é usado para demonstrar a capacidade de L. monocytogenes de atravessar a barreira hemato - encefálica (BBB) levando a infecção do cérebro de ratos. Para determinar se as bactérias cruzaram o BBB na vivo, perfusão de sangue no mouse é executada antes de determinar a carga bacteriana no cérebro. Caso contrário, o UFC obtido pode incluir bactérias que estão presentes nos vasos sanguíneos do cérebro. L. monocytogenes infectado cérebros (Figura 3A) e fígado (Figura 3B) antes ou depois de perfusão na pós-infecção 72 h é mostrado. A Figura 4 mostra a carga bacteriana em L. monocytogenes -rato infectado órgãos e ilustra o número de bactérias presentes no cérebro, sangue, fígado e baço de cada rato. Estes dados sugerem que perfusão dos animais não afetou significativamente a carga bacteriana nos órgãos do rato examinados neste estudo (Figura 4).
Figura 1 : Contorno esquemático do L. monocytogenes em vivo protocolo de infecção. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2 : Diagrama esquemático do processo de perfusão cardíaca. Perfusão no coração de rato, mostrando a inserção da agulha da perfusão no ventrículo esquerdo (etapa 4.6). Após a inserção da agulha, uma imediata incisão é feita na aurícula direita para iniciar o procedimento de perfusão. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3 : Colhidas órgãos do rato após infecção com L. monocytogenes. Camundongos BALB/c foram infectados por via intravenosa através de injeção de veia lateral da cauda com o selvagem-tipo L. monocytogenes 10403S, (1-2 x 104 bactérias/animal). A pós-infecção 72 horas, os ratos foram sacrificados e órgãos do mouse foram coletados ou sacrificados ratos foram perfundidos através do coração com 15-20 mL de PBS contendo 10 mM EDTA antes da colheita de órgãos. Inteligência representativa (A) e (B) do fígado é mostrado de ratos perfundidos ou não perfundidos. Note-se que os órgãos do mouse aparecerá branco/pálido (descascado) após perfusão assegurando que CFU bacteriana é os tecidos de órgãos colhidos e não o sangue circulando dentro do tecido. Esta figura foi modificada em Ghosh et al, 201814. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4 : Encargos bacterianos em órgãos infectados rato. Camundongos BALB/c foram infectados por via intravenosa com o selvagem-tipo L. monocytogenes 10403S conforme descrito na Figura 3. A pós-infecção 72 h, o cérebro, sangue, fígado e baço de cada rato foram coletados e determinada a carga bacteriana. Em experimentos separados, perfusão de corpo inteiro de ratos foi realizado e a carga bacteriana dentro de cada órgão determinado. As linhas horizontais indicam valores medianos. * Para este grupo, o sangue foi coletado imediatamente antes do início da perfusão cardíaca. Esta figura foi modificada em Ghosh et al, 201814. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
L. monocytogenes é capaz de causar meningoencefalite fatais em seres humanos. Estudos prévios têm demonstrado a capacidade das bactérias para atravessar a sangue-cérebro-barreira (BBB) e a colonizar o cérebro. Três rotas de invasão do cérebro têm sido propostas durante a infecção: direto a penetração do BBB por bactérias, stealth transporte por bactérias contidas dentro de células mononucleares3e migração axonal por cepas de L. monocytogenes que causam rhombencephalitis15. Desde que o cérebro é altamente vascularizado e L. monocytogenes é conhecido que circulam no sangue durante a infecção sistêmica, determinação da extensão L. monocytogenes é capaz de penetrar os vasos sanguíneos para colonizar o sistema nervoso central e cérebro é fundamental.
O protocolo descrito, injeção de veia de cauda intravenosa é usada para estabelecer um sistêmico infecção de L. monocytogenes em camundongos. Este método é útil para contornar a barreira intestinal e avaliar especificamente uma invasão bacteriana do BBB da corrente sanguínea. O protocolo descreve vários parâmetros importantes. Um parâmetro importante é o uso da dose adequada de infecção bacteriana durante experimentos na vivo . Isto é crítico para poder comparar CFU bacteriana obtido de diferentes grupos de animais infectados com L. monocytogenes. Outro aspecto importante a considerar é a cepa de L. monocytogenes utilizada para estudo experimental. Vários relatórios sugeriram diferenças entre várias cepas de L. monocytogenes em sua patogenicidade e a capacidade de infectar o cérebro10,16.
O protocolo descrito aqui pode ser modificado para facilitar a análise de outros aspectos da biologia de infecção de L. monocytogenes . Os órgãos de L. monocytogenes infectado podem ser processados mais para análises histopatológicas observar alterações inflamatórias visíveis no mouse infectado órgãos em comparação com animais controle não infectados. Os métodos descritos podem ser aplicados para caracterizar ainda mais os fenótipos de doença relevantes para as cepas de L. monocytogenes envolvidas em infecções humanas, bem como cepas abrigando mutantes definidos em potenciais determinantes de virulência. Esse requerimento foi realizado recentemente para revelar uma interação ligante-receptor romance que aumenta a infecção do cérebro por L. monocytogenes e promoveu destacou a importância do acolhimento célula superfície vimentina em interações patógeno-hospedeiro 14.
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Disclosures
Os autores declaram não concorrentes interesses financeiros.
Acknowledgments
Este trabalho foi apoiado pelo serviço de saúde pública dos EUA conceder AI103806 do National Institutes of Health.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Brain Heart Infusion media | Becton Dickinson | 237200 | |
| Streptomycin sulfate | Amresco | 0382-50G | |
| Petri dishes | VWR | 25384-342 | |
| Glycerol | VWR | 97062-832 | |
| IKA T18 ULTRA-TURRAX Basic Homogenizer | IKA | 3352109 | Model: T18BS1 |
| Spectrophotometer | Beckman Coulter | DU 800 series | |
| BALB/c mice | Jackson Laboratory | Model #000651 | |
| 1 mL syringes | Becton Dickinson | 309659 | |
| 26 G needles | Becton Dickinson | 305115 | |
| 21 G butterfly needles | Becton Dickinson | 367281 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid | Sigma-Aldrich | 60004 | |
| 15 mL conical tubes | VWR | 21008-918 | |
| Round-bottom test tubes | VWR | 60819-546 | |
| Phosphate-buffered saline | Corning | 46-013-CM | |
| Stainless steel spatula | VWR | 82027-520 | |
| Stainless steel scissors (6.5 in) | VWR | 82027-592 | |
| Stainless steel scissors (4.5 in) | VWR | 82027-578 | |
| Stainless steel blunt forceps (4.5 in) | VWR | 82027-440 | |
| Stainless steel fine tip forceps (6 in) | VWR | 82027-406 |
References
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