I Vivo Målrettet uttrykk for Optogenetic proteiner med silke/AAV filmer

Summary

Her presenterer vi en metode for å levere viral uttrykk vektorer i hjernen ved hjelp av silke fibroin filmer. Denne metoden gir målrettet levering av uttrykket vektorer silke/AAV belagt optiske fibre, konisk optiske fibre og kraniale windows.

Abstract

Forsøk på å forstå hvordan nevrale kretser prosessinformasjon for å kjøre atferdsmessige produksjon har vært sterkt hjulpet av nylig utviklet optiske metoder for å manipulere og overvåke aktiviteten til neurons i vivo. Disse typer eksperimenter er avhengige av to hovedkomponenter: 1) implanterbare enheter som optiske tilgang til hjernen, og 2) lys-sensitive proteiner som endre neuronal excitability eller gi en presentasjon av neuronal aktivitet. Det er flere måter å uttrykke lys-sensitive proteiner, men stereotaxic injeksjon av viral vektorer er for tiden den mest fleksible tilnærmingen fordi uttrykk kan kontrolleres med genetisk anatomiske og tidsmessige presisjon. Til tross for stor nytte av viral vektorer, leverer viruset til området av optisk implantater utgjør mange utfordringer. Stereotaxic virus injeksjoner er krevende operasjoner som øke kirurgisk, øke kostnaden for studier og utgjør en risiko til dyrets helse. De omkringliggende vev kan være fysisk skadet ved injeksjon sprøyten og immunogenic betennelse forårsaket av brå levering av bolus av høy-titer virus. Justere injeksjoner med optisk implantater er spesielt vanskelig når målretting små dypt i hjernen. For å overvinne disse utfordringene, beskriver vi en metode for belegg flere typer optisk implantater med filmer består av silke fibroin og Adeno-assosiert virus (AAV) vektorer. Fibroin, en polymer avledet fra kokong av Bombyx mori, kan kapsle og beskytte biomolecules og kan bearbeides til former fra løselig filmer til keramikk. Når implantert i hjernen, slipper silke/AAV belegg virus på grensesnittet mellom optiske elementer og omkringliggende hjernen, kjører uttrykk nøyaktig hvor det er nødvendig. Denne metoden implementeres enkelt og lover å forenkle i vivo studier av nevrale krets-funksjonen.

Introduction

Det siste tiåret har produsert en eksplosjon av konstruert lys-sensitive proteiner for overvåking og manipulere nevrale aktivitet¹. Virus gir enestående fleksibilitet for å uttrykke verktøyene optogenetic i hjernen. Sammenlignet med transgene dyr, er virus langt enklere å produsere, transportere og lagre, tillater rask implementering av de nyeste optogenetic verktøyene. Uttrykket kan være målrettet genetisk til forskjellige neuronal befolkninger, og virus designet for retrograd transport kan også brukes til å målrette uttrykk basert på neuronal tilkobling².

Virus er vanligvis introdusert stereotaxic injeksjoner, som kan være tidkrevende og utfordrende. Nøyaktig målretting små kan være vanskelig, mens kjører uttrykk over brede områder ofte krever mange injeksjoner. Videre, når en optisk enhet er senere implantert i hjernen til å levere lys i vivo, protesen må være riktig justert med viral injeksjon. Her beskriver vi en enkelt-implementert metode for å levere viral vektorer til vev rundt en implantert enhet med silke fibroin filmer³. Silke fibroin er kommersielt tilgjengelig, godt tolerert av nevrale vev, og kan brukes til å produsere materiale med variert egenskaper. Silke filmer kan bli brukt til implantater bruk vanlig laboratoriet som microinjection Pipetter eller hånd pipetter. Silke/AAV filmer eliminere behovet for to surgical prosedyrer og sikre at virus-mediert uttrykk er riktig justert til optiske implantatet. Det resulterende uttrykket er begrenset til spissen av fiber og resultater i mindre uønskede uttrykk langs sporet fiber enn stereotaxic injeksjoner.

I tillegg produserer målrettet uttrykk på spissen av små fibre, silke/AAV filmer kan brukes til å kjøre utbredt (> 3 mm diameter) kortikale uttrykk under skallen windows. I vivo 2-fotonet avbilding av fluorescerende aktivitet sensorer har blitt et uunnværlig verktøy for å vurdere rollen neuronal aktivitet i kjøring sensorisk og kognitive behandling. Men for å kjøre uniform uttrykk over den brede kortikale områder, forskere ofte utføre flere injeksjoner. Disse injeksjoner kan være svært tidkrevende og kan føre til inkonsekvent uttrykk over synsfelt. Silke/AAV-belagt skallen windows er ekstremt lett å produsere reduserer tiden som kreves for operasjoner og mest bemerkelsesverdig kjøre uttrykket hundrevis av mikron under kortikale overflaten.

Protocol

Alle eksperimenter som involverer dyr ble utført i henhold til protokoller godkjent av Harvard stående komite på Animal Care følgende beskrevet i oss NIH Guide og bruk av forsøksdyr. Voksen C57BL/6 mus av begge kjønn (6-15 ukens av alderen) ble brukt for alle eksperimentene.

1. få vandig silke Fibroin

1. Forberede eller kjøpe vandig silke fibroin (5-7,5% w/v).

2. Bland vandig silke med AAV uttrykk vektorer

1. Velg en AAV uttrykk vektor å kjøre optogenetic protein- eller fluorescerende indikator på valg.
   Merk: For å redusere volumet på silke/AAV som må brukes på implantater mens du fremdeles kjører robust uttrykk, lager-titer AAV (stock titers vanligvis innhentet fra vektor kjerner er rundt ~ 10¹³ gc/mL) anbefales.
2. Umiddelbart før belegget implantater, tine en aliquot av AAV og kombinere med 5-7,5% vandig silke fibroin (denne blandingen vil bli referert til som silke/AAV). I en 200 µL PCR tube, bland vandig fibroin og AAV i en 1:1 ratio (for kraniale windows bruk 1:4) umiddelbart før søknaden. Pipetter forsiktig løsningen ut flere ganger å grundig blande fibroin og AAV.
3. Holde silke/AAV blanding på is før å bruke.

3. forberedelse utstyr for fabrikasjon og lagring av silke/AAV-belagt enheter

1. Fremskaffe utstyr for belegg optiske fibre og gradering-Index (GLIS) linser (figur 1, 2).
   1. Konstruere en stabil ferrule holder. For å holde keramiske ferrules, bore 1,25 mm hull i en blokk med ¼" ark akryl. Tapp hull for å sette inn festeskruene fra side å holde ferrules på plass.
      Merk: Noen bøyle kan brukes til dette formålet.
   2. Plasser en manipulator med sub millimeter presisjon flytte optisk fiber (stereotaxic apparat eller andre presisjon micromanipulator).
   3. Sett sammen en stabil holder for å plassere microinjector.
   4. Bruk en stereoscope for å visualisere optiske fibre og silke slippverktøy.
   5. Plasser en lyskilde for å belyse de optiske fibrene.
2. Forberede utstyr for belegg skallen windows (Figur 3).
   1. Velg alle P10 hindre.
   2. Få en beholder med lokk.
      Merk: Alle beholdere med silikon bunn foreslås-myk bunnen forenkler løfte skallen windows.
3. Forberede utstyr til å lagre ferdig implantater (Figur 4).
   1. Få en liten (1-5 L) vakuum kammer.
   2. Kontroller at det er plass til å lagre implantater i 4 ° C kjøleskap.

4. bruke silke/AAV Film enheter

1. Belegg optiske fibre til stasjonen fokal uttrykk på fiber spissen
   1. Forberede kronisk fiber implantater som beskrevet tidligere⁴.
   2. Før bruk, skyll implantater med etanol, så med ultrapure vann for å sikre at de optiske fibrene er ren.
      Merk: Silke filmer følge mer pålitelig for å rengjøre glassoverflater.
   3. Forbered en enhet til å holde fiber ferrules. Typisk 1,25 mm diameter ferrules, bruk en blokk ¼ tomme klar akryl, med ~1.3 mm hull og tappet festeskruene inn fra siden til hullet implantater på plass (figur 1A).
   4. Montere ferrule abonnenten i en stereotaxic apparater (eller manipulasjon løsning med submillimeter presisjon) utstyrt med en microinjector. Plassholder ferrule over på microinjector og bruke silke/AAV blanding nedenfor.
      Merk: Dette er fordi anvendelser av store mengder ovenfra resulterte i silke/AAV som ikke var begrenset til spissen. Men kan anvendelsen av mange små sekvensiell volumer fra over eller under produsere AAV/silke innskudd som er begrenset til spissen (selv om vi foretrekker å bruke nedenfor).
   5. Dra en standard intrakranielt injeksjon pipette fra Borosilikatglass kapillær.
      1. Å gjøre det enklere å
      2. Å produsere et injeksjon tips med en ren flat spissen av ønsket diameter, holde en pipette i hver hånd og bruke den tykke delen av taper på en pipette for å score til andre pipette på ønsket pause sted.
      3. Forsiktig gni frem og tilbake i en BT2508RC bevegelse (glass på glass scoring metoden).
      4. Etter scoring av pipette, bruke lett trykk spissen av de scoret pipette med liket av den andre pipette å oppnå en ren pause.
   6. Plasser en stereoscope for å gi en klar visning av optisk fiber ansikter.
      Merk: Forstørrelse bør være tilstrekkelig nøyaktig posisjon injeksjon pipette over ansiktet av optiske fibre.
   7. Sett inn fiber implantater i holderen med hjernen-side av vender nedover.
   8. Last injeksjon pipette med silke/AAV løsning for alle standard intrakranielt injeksjon⁵. Laste inn beløpet som kreves av implantater blir gjort, pluss ~ 30% ekstra å imøtekomme grunn Pipetter tilstopping. For eksempel hvis 10 implantater blir gjort, så belaste med 100 nL innskudd og trekke ~1.3 µL.
      Merk: Silke/AAV kan tørke på pipette spissen mellom bortvisninger gjelder, som kan tette pipette. Stor diameter Pipetter (50-100 µm) er mindre sannsynlig å tette. Tresko kan forskyves av mild penselen ned spissen av pipette med en våt paper tørke eller alkohol vattpinne.
   9. Manøvrere injeksjon Pipetter til det berøre eller nesten berører sentrum av optisk fiber overflaten. Løse ut 10-20 nL silke/AAV løsning. Ta ut pipette.
      Merk: Antall levering er ikke kritisk, men typisk priser er 5-20 nL/s.
   10. Observere bolusen av silke/AAV på flate overflaten som vises som en flytende kuppel som tørker til en flat film innen ~ 1 min (figur 1B).
   11. Gjenta trinn 4.1.9-4.1.10 til ønsket antall silke/AAV er avsatt (totalt 20-200 nL for de fleste programmer). Når du forbereder flere implantater, silke/AAV gjelder ett implantat og deretter gå videre til coat andre implantater før første.
   12. Tillate 1t tørke før implantater.
   13. Vakuum desiccate overnatting på ~ 125 Torr (-25 i. HG), 4 ° C. Gjør dette ved å plassere hele ferrule abonnenten i et vakuum kammer.
   14. Evaluere form og stilling av resulterende silke filmen gjennom et kraftig mikroskop. Sikre at filmene er begrenset til spissen av optisk fiber overflaten, være relativt spinkle (> 100 µm), og symmetrisk (figur 1 c).
       Merk: Stor eller asymmetrisk silke/AAV filmer kan dislodge fra fiber under implantasjon (figur 1 d). Den vanligste årsaken til problemer oppstår fra programmet enkelt større volumer i stedet for sekvensiell bruk av mange små volumer.
2. Belegg konisk optiske fibre til stasjonen uttrykk langs fiber aksen
   1. Få konisk optisk fiber implantater og utføre skritt 4.1.2-4.1.8, bortsett fra at konisk fiber ligger lateralt slik at den er vinkelrett injektoren (figur 2A). Plasser injektoren over konisk fiber.
      Merk: Lasting væskedråper på konisk fiber positurer lagt utfordringer, fordi overflatespenning tendens til å føre til dråper hoppe tilbake på injeksjon pipette eller overføre opp konisk fiber. Mindre injeksjon Pipetter (30-50 µm diameter) bidra til å løse dette problemet, men øker risikoen for at injeksjon pipette vil tette. På grunn av overflatespenningen, dråper gjerne overholde området største areal, så optimal injeksjon Pipetter størrelse er avhengig av størrelsen på konisk fiber og en toleranse for sporadisk tresko.
   2. Plasser silke/AAV injeksjon pipette mot siden av begynnelsen av taper. Kontroller at injeksjon pipette berører optisk fiber.
   3. Løs ut 20 nL av silke/AAV systemfeilkoden belegg. Kontroller at slippverktøyet overholder optisk fiber og forblir på grensesnittet av fiber/pipette. Forsiktig veken slippverktøyet mot slutten av fiber spissen som silke/AAV tørker (~ 45 s). Hold den sprøytebruk Pipetter i kontakt med tørking slippverktøyet å unngå tilstopping pipette spissen.
      Merk: Hvert innskudd skal coat ca 400 µm av konisk fiber (figur 2B).
   4. Når første bolusen har tørket nesten helt, kaste ut en annen 20 nL og fortsette wicking slippverktøyet langs taper.
      Merk: Den flytende silke vil følge med tørket silke, forankring en ende av slippverktøyet som pipette beveger seg langs taper.
   5. Gjenta trinn 4.2.4 av mate små mengder silke/AAV, og gradvis trekke løsningen opp på siden av taper. 5-6 bortvisninger gjelder er tilstrekkelig til å krysse overflaten av en 2,5 mm taper.
   6. For å kjøre mer ensartet uttrykk rundt alle sidene for fiber, rotere fiber og gjenta trinn 4.2.2-4.2.5 til ønsket antall silke/AAV har blitt avsatt.
   7. Hvis en hengende tråd av tørket silke/AAV strekker seg utover fiber spissen, kutt forsiktig stranden med saks, eller bruke utstøting pipette å bøye stranden tilbake og følge den taperen av fiber.
   8. Tillate 1t tørke før implantater.
   9. Vakuum desiccate overnatting i 4 ° C. Hele ferrule innehaveren kan plasseres i et vakuum kammer.
   10. Evaluere form og stilling av resulterende silke filmen gjennom et kraftig mikroskop.
       Merk: Filmer trenger ikke være helt jevn, men bør ikke ha støt som strekker seg mer enn 100 µm utover overflaten av fiber for å minimere omkringliggende vev under implantasjon (Figur 3 c). For å minimere filmen størrelse, er det viktig at hver dråpe er helt tørt før etterfølgende innskudd er gjort.
3. Belegg GLISE linse implantater
   1. Gjenta trinn 4.1.2-4.1.8 få GLISE linser^6,7 . Injektoren kan monteres over.
   2. Innskudd silke/AAV i en enkelt utstøting (1 µL for en 1.0 mm diameter linse).
      Merk: Dette vil gi en kuppel av væske som overholder ansiktet av objektivet og tørker for å produsere en ensartet film (100-200 µm tykk). Men i tilfelle av at en enkelt stor utstøting tørker ujevnt og produserer en film som er tykkere nær GLISE linsen, prøv innskudds flere mindre dråper (100-200 nL) i midten av linsens overflate (tillater hver dråpe tørke før innskudds neste) slik at filmen vil drive uttrykk i sentrum av synsfeltet.
   3. Tillate 1t tørke før implantater.
   4. Evaluere form og stilling av resulterende silke filmen gjennom et kraftig mikroskop slik at filmen dekker overflaten av linsen.
4. Cranial-glassvinduer i belegg
   1. Forberede glass skallen windows ved å overholde to 3 mm diameter runde coverslips (nr. 1 tykkelse) til en 5 mm diameter vindu med optisk lim (for detaljer, se Goldey et al. 2014⁸).
   2. Bland silke: virus i forholdet 1:4 å redusere den totale mengden silke i filmen. Store mengder av silke ikke løses under skallen windows etter implantasjon. Titrering eksperimenter kan være nødvendig å finne forhold og volum som gir den ønskede uttrykk profilen.
   3. Hånd Pipetter et 5 µL slippverktøy på overflaten av 3 mm (hjernen mot) dekkglassvæske. Slippverktøyet bør spredt for å dekke hele glassoverflaten (Figur 3).
   4. Gir 2-3 h tørke før windows.

5. lagre silke/AAV-belagt implantater

1. Lagre silke/AAV-belagt optiske fibre i et avkjølt vakuum desiccator (~ 125 Torr, 4 ° C) før bruk (figur 4A).
2. Ikke Oppbevar skallen windows og GLISE linser under vakuum, som store silke filmer lagret under vakuum ikke klarer å fullstendig løse opp etter implantasjon. Implantat skallen windows og GLISE linser umiddelbart etter tørking, eller en dag med produksjon hvis lagret på lufttrykk og 4 ° C.

6. implanting enhetene

1. Forberede dyr implantat kirurgi som beskrevet tidligere⁴.
   1. Kort, bedøve mus med en intraperitoneal injeksjon av ketamin/xylazine (100/10 mg/kg) og sjekk dybden av anestesi med en mild tå-knipe. Barbere skallen i området av implantatet og rense hodebunnen med jod og alkohol.
   2. Montere dyr i en stereotaxic enhet og supplere anestesi bruker en blanding av oksygen og isoflurane (1-2%). Gjøre et snitt i hodebunnen over området av interesse, og utfør en craniotomy stor nok til implantatet.
2. Implantatet optiske fibre⁹ og microendoscope objektiver¹⁰ i henhold til tidligere publiserte prosedyrer. Håndtaket implantater med forsiktighet, som silke/AAV innskudd kan bli slått en imperfektum craniotomy eller implantatet fanger på kanten av skallen. Lavere implantatet i hjernen sakte (~ 2 mm/min).
3. Implantater kraniale windows som beskriver tidligere⁸. Ikke berører belagt siden av vinduet og unngå skylling vinduet med væske hvis utfører gavage, så dette kan vaske bort viruset. For å oppnå maksimal uttrykk, kan du utføre en durotomy.

7. uttrykket evalueres og feilsøking

1. For å evaluere uttrykk for virally uttrykt proteiner, tillate ~ 2-3 uker for viruset å kjøre uttrykket, og deretter utføre intracardial perfusjon med 4% paraformaldehyde i fosfat bufret saltvann¹¹ og prosessen hjernevev for lysstoffrør mikroskopi¹².
2. Evaluere uttrykket med fluorescerende mikroskopi for å image uttrykksmønster av fluorophore-merket optogenetic proteiner.
3. Hvis uttrykk er ikke nok, øke mengden av virus i belegg ved enten øke det totale volumet av silke/AAV belegget, eller helst med høyere titer virus.

Representative Results

For å vurdere suksessen til silke/AAV filmer i kjøring uttrykk, vi perfused dyr 2-3 uker etter implantasjon og forberedt hjernen skiver fra regionen rundt. Fluorescens bilder av fluorophore-merket optogenetic proteiner (ChR2-YFP) gitt et mål på omfanget av uttrykk (figur 1 d). Typisk optiske fibre (230 µm diameter) kan lett romme 200 nL av silke/AAV. Med praksis, kan forskere oppnå pålitelig uttrykket rundt spissen av implantert fiber (figur 5).

For å vurdere uttrykk drevet av silke/AAV-belagt skallen windows, starte bildebehandling begynner 7-10 dager etter implantasjon. Vi har brukt to-fotonet bildebehandling for visualisering, men andre metoder som fluorescens tenkelig med en CCD kan også brukes. To mulige problemer med belagt skallen windows er utilstrekkelig uttrykk og silke filmer som ikke klarer å oppløse og skjule synsfelt. For å øke uttrykk, foreslår vi at du utfører en durectomy før implanting vinduet, og/eller økende mengden av virus i filmen. Vi oppnådd det beste uttrykket med en 1:4 blanding av silke og lager-titer AAV, henholdsvis. Mens dette representerer et betydelig større antall virus partikler enn brukes vanligvis i stereotaxic injeksjoner, tellere redusert kirurgisk tiden marginale ekstra kostnadene av virus. I mellomtiden hvis silke filmer ikke oppløse under vinduet, redusere mengden av silke brukes til coat vinduet. Den totale mengden silke i belagt windows er 10 - 100 ganger mer enn på fiber implantater, og filmen er mindre innebygd i vev og dermed ikke utsettes for samme nivå av proteolytiske enn kan oppløse silke filmer¹³. Men er tilstedeværelsen av silke noen avgjørende for å oppnå uttrykk under windows³, sannsynligvis fordi en film laget av virus alene er vasket bort av interstitiell væske under operasjonen.

Figur 1: bruke silke/AAV filmer på optiske fibre. (A) kronisk fiber implantater plasseres fiber side-ned i en holder (innfelt) montert på XYZ oversetter. En fast microinjector under fibrene dispenses silke/AAV på fiber tips. En stereoscope kan visualisering av prosessen. (B) bruke silke/AAV fiber tips i små volumer (10-20 nL). Etter utkasting bolus, trekke pipette og tillate ~ 60 s slippverktøyet tørke en flat film. Gjenta prosessen til et bestemt volum brukes på fiber spissen. (C) inspisere silke belegg. Optimal belegg bør være midtstilt på fiber tipset (venstre), mens uriktig belegg utvide utover fiber ansiktet gjør dem mer utsatt å dislodge fra fiber (høyre). (D) representant fiber belagt med 200 nL av silke/AAV, og den resulterende AAV-drevet ChR2-YFP uttrykket 2 uker etter implantasjon. Kompakt silke/AAV belegget på venstre resulterte i robust uttrykk, mens belegget på høyre utsparinger stakk forbi forsiden av fiber og førte nesten ingen uttrykk, sannsynligvis fordi silke/AAV ikke overholder fiberoptiske under implantasjon. Skala barer 0.2 mm (fiber) og 1.0 mm (hjernen skiver). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 2: oppsett for belegg konisk fiber implantater. (A) microinjector er montert over konisk fiber holderen og konisk fiber er plassert ortogonalt utstøting sprøyten. (B) begynner på det bredeste punkt (innfelt) og løs ut små volumer under flytting utstøting sprøyten til spissen av taper. Dette resulterer i en kontinuerlig belegg langs taper. (C) representant konisk fiber belagt med silke blandet med Fast Green å hjelpe til med visualisering. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 3: belegg skallen windows. Silke/AAV kan anvendt skallen windows ved hjelp av en hånd pipette. Et standard 3 mm diameter vindu kan være belagt med en 5 µL dråpe, som langsomt tørker til en flat film. Innfelt: GCaMP6f uttrykk som følge av silke/AAV-belagt skallen windows implantert med og uten durectomies. Dette tallet er tilpasset fra Jackman et al. (2018) ³. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 4: lagre silke/AAV belagt implantater. (A) å fjerne gjenværende fuktighet og bevare viral effekt, implantater skal lagres under vakuum ved 4 ° C til brukes. Implantater lagret denne måten være levedyktig i minst 7 dager. (B) uttrykk fra 4 silke/AAV belagt fiber implantert etter 7 dager lagringsplass. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 5: silke/AAV-GFP belagt optiske fibre pålitelig kjøre uttrykk. Fluorescerende bilder av stykker fra 24 påfølgende striatal implantater. Hver implantat var belagt med 100-400 nL på 1:1 silke/AAV-GFP. Denne kohorten av implantater angir evne til silke å begrense uttrykk til implantatet området (i dette tilfellet det dorsal striatum). GFP fluorescens angis i grønne; DAPI flekk vises i blått. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Discussion

Bruk av silke/AAV målrette uttrykk for optogentic proteiner overvinner begrensninger av tilnærminger som er i bruk. Selv om mange studier bruke AAV injeksjoner for å uttrykke optogenetic proteiner, er det utfordrende å justere uttrykk til spissen av optiske fibre, regionene rundt lengden på konisk fiber og til visning regionen en GLISE-linse. På grunn av avvik mellom optisk komponenter og optogenetic uttrykk, stereotaxic injeksjoner kan være upålitelig, og mange forsøk mislykkes. Silke/AAV merking metoden som beskrives her løser dette problemet. Det forenkler også prosedyren ved å fjerne andre kirurgiske trinnet og i noen tilfeller eliminere behovet for en andre kirurgi. Det kan også være vanskelig å bruke virus for å få omfattende uttrykk under skallen windows og eksperimentator utfører vanligvis lange operasjoner å injisere virus på flere steder. Muligheten til å få omfattende uttrykk over store kortikale områder ved bare belegg skallen Vinduer med silke/AAV er en forenkling som eliminerer behovet for mange invasiv injeksjoner.

En annen potensiell fordel av silke/AAV metoden er at det kan indusere mindre betennelse i nevrale vev sammenlignet med viral injeksjoner. Injisere høy-titer AAV i hjernen kan føre inflammatorisk svar som reaktive astrocytosis som har potensial til å endre mobilnettet og krets egenskaper^14,15 (selv om slike mulige komplikasjoner er vanligvis ignorert). Silke filmer indusere liten immunogenic svar på sine egne¹³ og silke/AAV filmer er ventet å slippe virus i løpet av mange timer eller dager¹⁶, som kan redusere viral belastningen i de omkringliggende vev og redusere immunogenic svar. Med konvensjonelle metoder som implantering av en enhet innledes med en AAV injeksjon, kan inflammatorisk svar oppstå fra både implantation og injeksjon. I fremtiden vil det være ønskelig å systematisk sammenligne konvensjonelle metoder og silke/AAV-metoden for å bestemme om silke/AAV filmer reduserer samlede inflammatorisk svar.

Flere tiltak er avgjørende for vellykket bruk av silke/AAV filmer. Viktigst, belegget av optiske fibre må gjøres nøye som beskrevet i metoder og plasseringen av tørket filmene bør vurderes nøye av visuell inspeksjon under et mikroskop for å sikre at filmene er kompakt, på riktig sted, og overholder ansiktet av. Noen silke/AAV på sidene av vil føre til uttrykket utenfor regionen rundt og misshaped filmer som stikker ut utover fiber kan bryte under implantasjon og føre til upålitelige eller ingen uttrykk. Teknikkene vi beskrive for å bruke silke/AAV implanterbare enheter kan være tilpasset bruk av materialer er som er lett tilgjengelig og tillater presis avsetning av små mengder silke/AAV.

Litt trening er nødvendig for å oppnå nøyaktig, reproduserbare resultater. Hvis uttrykk er observert langs sporet av fiber, er det sannsynlig at silke filmen tørket på siden av fiber i stedet for fiber ansiktet. Gjenta produksjonsprosessen og tett inspisere tørket implantater for tegn som filmer er tørke på siden av fiber. Fordi silke/AAV filmer er optisk gjennomsiktig, kan det hjelpe å praksis bruke silke blandet med fargestoff (Fast Green eller en lignende farge) for å bedre bilde av formen av resulterende filmer (figur 2C). Hvis ingen uttrykk er, er det sannsynlig at silke filmen forskyves fra fiber spissen under implantasjon. Vi foreslår at bruk av lager-titer virus når implantater. For optiske fibre reduserer dette det totale volumet som må brukes på tynne fibre. Hvis belegget er en bekymring vurdere vente lenger mellom hver 10 nL-program for å tillate komplett tørking av avsatt slippverktøyet. Silke/AAV dråper tørker raskere under en varme lampe. For kraniale Vinduer, kan høy-titer virus være nødvendig å levere tilstrekkelig Virusmengden over pia eller dura. Visse typer implantater kan løses silke og slipp AAV lettere enn andre. Vi har funnet at skallen windows implantert over overflaten av hjernen krever en lavere andel av silke/virus å oppnå pålitelig uttrykk, kanskje på grunn av ulike cerebral spinal fluiddynamikk eller protease aktivitet. Hvis uttrykket ikke kan økes ved å øke effektiv AAV konsentrasjoner er reduserer volumet av vandig silke en plausibel alternativ.

Endelig er det viktig å lagre optisk komponentene riktig og implantat dem ganske snart etter at de er forberedt. Vi har vist at belagt fiber som er nedkjølt under vakuum kan lagres i mange dager før bruk. Vakuum lagring fjerner gjenværende fuktighet¹⁷ som kan redusere Løseligheten av silke filmer, og også bidra til å opprettholde viral effekt. Ideelt sett bør optiske fibre implanteres innen 24 timer av fabrikasjon. Men finner vi at silke/AAV-belagt fiber lagret under vakuum stasjonen samme nivå uttrykk når implantert 7 dager etter fabrikasjon (figur 4B). Derimot kjørte belagt skallen windows og GLISE linser mest pålitelige uttrykket da de ble tørket ved romtemperatur og brukt timer med forberedelse. Årsaken til denne forskjellen er fortsatt uklart. Videre kan studier være nødvendig å avgrense utarbeidelse og lagring forhold å fremme forlenge lagringstid.

Silke/AAV-belagt skallen windows har betydelig potensial fordi de drastisk redusere kirurgisk ganger og er svært enkle å produsere, men i dag denne metoden har begrensninger. Bestrøket skallen windows jevnt merke store mengder bark og kjøre tilstrekkelig uttrykk i layer 2/3 for GCaMP imaging, med noe mindre uttrykk i dypere lag. Men stereotaxic injeksjoner kjøre mer robust uttrykk og gir deg mer kontroll over lagene mål for uttrykk. Pålitelig uttrykket ble bare oppnådd når dura ble fjernet. Selv om dura er ofte fjernet for mange 2-fotonet tenkelig eksperimenter å forbedre bildet kvalitet⁸, for mange eksperimenter er det ønskelig å få merking på en mindre invasiv måte. Vi har derfor utforsket vår evne til å bruke silke/AAV merke kortikale områder uten å fjerne dura. Vi fikk noen merking, men det er mulig at dette var en konsekvens av skade dura i ferd med å forberede til craniotomy. Videre studier er nødvendig for å brukes til å pålitelig merke cortex uten å fjerne dura belagt skallen windows.

Utarbeidelse av vandig silke fibroin fra cocoons av Bombyx Mori er beskrevet i detalj i Rockwood et al. (2011) ¹⁸. vandig silke fibroin er nå tilgjengelige (5% w/v). Selv om de fleste av våre eksperimenter som ble utført med vandig silke fibroin aksjer i vår lab (5-7,5% w/v), har vi fått lignende resultater med kommersielle vandig fibroin. Aqueous fibroin er stabilt på 4 ° C for opptil 3 måneder, hvoretter spontant overganger fra væske til hydrogel¹⁸. Fibroin aksjer og bli inndelt ~ 1 mL aliquot lagret på-80 ° C. En 1 mL arbeider aliquot (tilstrekkelig for belegg hundrevis av implantater) kan lagres på 4 ° C og brukt til det begynner å gel. Være forsiktig ikke riste, vortex og agitere aggressivt Pipetter vandig fibroin, da skjær styrker kan føre til gelation^19,20.

Silke/AAV filmer tillater en rekke uttrykk mønstre, fra utbredt kortikale uttrykk under skallen windows til presis subkortikal uttrykk på spissen av en liten diameter optiske fibre. Disse teknikkene ble utviklet for å dra nytte av felles AAV uttrykk vektorer, men kan sikkert brukes til å spre andre uttrykk vektorer som Lentiviruses eller rabiat virus i hjernen. Silke filmer kan også produseres i tredimensjonale figurer å forbedre viral utgivelsen i vev. For eksempel for å kjøre sterkt uttrykk under kortikale windows uten bruk av en durotomy, kan skallen windows være belagt med matriser av silke microneedles som ville pierce dura og slipp viruset i dypere kortikale lag²¹. Ytterligere avgrensning vil trolig føre til forbedret egenskaper for virus release, og nye applikasjoner for silke/AAV filmer.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Aqueous silk fibroin	Sigma	5154-20ML	Aqueous Silk Fibroin (5% w/v) for making films
Microinjector to deposit silk/AAV	Drummond	3-000-207	Nanoject III nanoliter injector
Manipulator to hold implants	Narashige	MM-33	Micromanipulator
Stereoscope to visualize silk deposits	AmScope	SM-6TX-FRL	3.5X-45X Trinocular articulating zoom microscope with ring light
Vacuum chamber to store implants	Ablaze	N/A	3.5 Quart Vacuum Vac Degassing Chamber
Optional, implant holder for storage	N/A	N/A	To store premade optical fibers, drill a grid of ~4 mm-deep holes with a diameter just larger than the ferrule diameter into a plastic block.
Optical fiber	Thorlabs	FT200EMT	Ø200 µm Core Multimode Optical Fiber for fiber implants
Ferrules	Kientec	FZI-LC-230	LC Zirconia Ferrule for fiber implants
Various materials for manufacturing chronic fiber implants	Various	N/A	For detailed procedure, see Ung K, Arenkiel BR. Fiber-optic implantation for chronic optogenetic stimulation of brain tissue. Journal of visualized experiments: JoVE. 2012(68).
Tapered fiber implants	Optogenix	Lambda-B	Tapered fiber implants
GRIN lenses	GoFoton	CLH-100-WD002-002-SSI-GF3	GRIN lenses
Small glass cranial windows	Warner	64-0726 (CS-3R-0)	Small round cover glass, #0 thickness
Large glass cranial windows	Warner	64-0731 (CS-5R-0)	Small round cover glass, #0 thickness
Various materials for manufacturing cranial windows	Various	N/A	For detailed procedure, see Goldey GJ et al. Removable cranial windows for long-term imaging in awake mice. Nature protocols. 2014 Nov;9(11):2515.