In Vivo Gerichte expressie van Optogenetic eiwitten met behulp van Silk/AAV Films

Summary

Hier presenteren we een methode voor het leveren van Virale expressievectoren in de hersenen met behulp van zijde fibroin films. Met deze methode kunt gerichte levering van expressievectoren met zijde/AAV gecoate optische vezels, taps toelopende optische vezels en craniale windows.

Abstract

De zoektocht om te begrijpen hoe neurale circuits Procesinformatie in volgorde naar station gedrags-uitvoer sterk door de onlangs ontwikkelde optische methoden geholpen heeft voor het manipuleren van en toezicht op de activiteit van neuronen in vivo. Dit soort experimenten is afhankelijk van twee hoofdcomponenten: 1) de implanteerbare hulpmiddelen die optische toegang bieden tot de hersenen, en 2) lichtgevoelige eiwitten die wijzigen van neuronale prikkelbaarheid of leveren een uitlezing van neuronale activiteit. Er zijn een aantal manieren uitspreken lichtgevoelige eiwitten, maar stereotaxic injectie van virale vectoren is momenteel de meest flexibele benadering omdat expressie kan worden gecontroleerd met genetische, anatomische en temporele precisie. Ondanks het grote nut van virale vectoren, het leveren van het virus naar de site van optische implantaten poses tal van uitdagingen. Stereotaxic virus injecties eisen chirurgie, die chirurgische tijd verhogen, verhogen de kosten van studies, en een risico voor de gezondheid van het dier. Het omliggende weefsel kan fysiek worden beschadigd door de injectiespuit en immunogene ontsteking veroorzaakt door de abrupte levering van een bolus van hoge-titer virus. Uitlijnen van injecties met optische implantaten is vooral moeilijk wanneer de doelcomputer kleine regio's diep in de hersenen. Om deze uitdagingen te overwinnen, beschrijven we een methode voor het aanbrengen van meerdere soorten optische implantaten met films samengesteld van zijde fibroin en Adeno-geassocieerde virale (AAV) vectoren. Fibroin, een polymeer dat is afgeleid van de cocon van Bombyx mori, kunt samenvatten en beschermen van biomoleculen en in vormen variërend van oplosbare films tot keramiek kan worden verwerkt. Wanneer de hersenen ingeplant, laat zijde/AAV coatings virus op het raakvlak tussen optische elementen en de omringende hersenen, rijden expressie precies waar dat nodig is. Deze methode is eenvoudig toe te passen en belooft te sterk vergemakkelijken in vivo onderzoeken van neurale functie.

Introduction

De afgelopen tien jaar heeft geproduceerd een explosie van gemanipuleerde lichtgevoelige eiwitten voor monitoring en manipuleren van neurale activiteit¹. Virussen bieden ongeëvenaarde flexibiliteit voor het uitdrukken van deze hulpmiddelen van de optogenetic in de hersenen. Ten opzichte van transgene dieren, zijn virussen veel gemakkelijker te produceren, transporteren en opslaan, waardoor snelle implementatie van de nieuwste optogenetic hulpmiddelen. Expressie kan op verschillende neuronale populaties genetisch worden gericht, en virussen ontworpen voor de retrograde vervoer kunnen zelfs gebruikt worden om expressie gebaseerd op neuronal connectiviteit².

Virussen komen meestal met stereotaxic injecties, die tijdrovend en uitdagend kunnen. Juist gericht op kleine regio's kunnen moeilijk, terwijl veel injecties expressie rijden over grote gebieden vaak vereist. Bovendien, wanneer een optisch instrument vervolgens geïmplanteerde in de hersenen is te leveren licht in vivo, het implantaat moet correct wordt uitgelijnd met de virale injectie. Hier beschrijven we een gemakkelijk geïmplementeerde methode voor het leveren van virale vectoren aan het weefsel rond een geïmplanteerde apparaat met behulp van zijde fibroin films³. Zijde fibroin is commercieel beschikbaar, goed verdragen door zenuwweefsel, en kan worden gebruikt voor de productie van materialen met diverse eigenschappen. Zijde films kunnen worden toegepast op implantaten met behulp van gemeenschappelijke laboratoriumapparatuur zoals microinjection pipetten of hand pipetten. Zijde/AAV films de eis voor twee chirurgische procedures elimineren en ervoor zorgen dat virus-gemedieerde expressie correct wordt uitgelijnd met het optische implantaat. De resulterende expressie is beperkt tot het puntje van de vezels en resultaten in minder ongewenste expressie langs het spoor van de vezels dan stereotaxic injecties.

Naast het produceren van gerichte expressie op het puntje van kleine vezels, zijde/AAV films kunnen worden gebruikt om grootschalige rijden (> 3 mm doorsnede) corticale expressie onder craniale windows. In vivo 2-foton beeldvorming van fluorescerende activiteit sensoren is uitgegroeid tot een onmisbaar instrument voor de beoordeling van de rol van neuronale activiteit in het rijden van zintuiglijke en cognitieve verwerking. Echter om uniforme uitdrukking over de brede corticale gebieden, onderzoekers vaak uitvoeren meerdere injecties. Deze injecties kunnen zeer tijdrovend en kunnen leiden tot inconsistente expressie het gezichtsveld. Daarentegen zijn zijde/AAV-gecoate craniale ramen zeer eenvoudig te fabriceren, sterk verminderen de tijd die nodig is voor operaties en meest opmerkelijk drive expressie honderden van micron onder de corticale oppervlak.

Protocol

Alle experimenten met dieren werden verricht overeenkomstig de protocollen die zijn goedgekeurd door de Harvard Permanent Comité voor Animal Care volgende richtlijnen in de ons NIH- gids voor de verzorging en het gebruik van proefdieren beschreven. Volwassen C57BL/6 muizen van beide geslachten (6-15 weken oud) werden gebruikt voor alle experimenten.

1. Verkrijg waterige zijde Fibroin

1. Bereiden of koop waterige zijde fibroin (5-7,5% w/v).

2. Meng waterige zijde met AAV expressievectoren

1. Kies een AAV expressie vector om te rijden het optogenetic eiwit of fluorescerende indicator van keuze.
   Opmerking: Om te minimaliseren van de hoeveelheid zijde/AAV die moet worden toegepast op implantaten tijdens het rijden nog steeds robuust expressie, voorraad-titer AAV (stock titers meestal verkregen vector kernen rond ~ 10¹³ gc/mL zijn) wordt aanbevolen.
2. Onmiddellijk voorafgaand aan de coating implantaten, ontdooien van een aliquoot deel van AAV en combineren met 5-7,5% waterige zijde fibroin (dit mengsel zal worden verwezen als zijde/AAV). In een buis van 200 µL-PCR, meng waterige fibroin en AAV in een 1:1 verhouding (voor Cranio windows gebruik 1:4) onmiddellijk voorafgaand aan de toepassing. Zachtjes Pipetteer de oplossing in en uit meerdere keren de fibroin en de AAV grondig door elkaar.
3. Houd zijde/AAV mengsel op ijs voorafgaand aan gebruik.

3. voorbereiden apparatuur fabricage en opslag van zijde/AAV-gecoate apparaten

1. Het aanschaffen van apparatuur voor de coating optische vezels en verloop-Index (grijns) lenzen (figuren 1, 2).
   1. Construeer een stabiele verlengstuk houder. Voor de keramische ferrules, boorgaten 1.25 mm in een blok van ¼" blad acryl. Tik op de gaten als u wilt invoegen van stelschroeven vanaf de zijkant naar ferrules op zijn plaats houden.
      Opmerking: Elke klem kan worden gebruikt voor dit doel.
   2. Plaats een manipulator sub millimeter nauwkeurig verplaatsen van de optische vezels (stereotaxic toestellen of andere precisie-micromanipulator).
   3. Een stabiele houder om de positie van de microinjector te monteren.
   4. Gebruik een stereoscoop te visualiseren van optische vezels en zijde druppels.
   5. Plaats een lichtbron om te verlichten van de optische vezels.
2. Bereiden van apparatuur voor de coating van de craniale windows (Figuur 3).
   1. Kies een pipet P10.
   2. Het verkrijgen van een container met deksel.
      Opmerking: op elk soort recipiënt met een siliconen bodem wordt voorgesteld — de zachte bodem vergemakkelijkt craniale windows opheft.
3. Bereiden van apparatuur voor de opslag van afgewerkte implantaten (Figuur 4).
   1. Het verkrijgen van een vacuuemcel voor kleine (1-5 L).
   2. Zorg ervoor dat er ruimte voor het opslaan van implantaten in een koelkast 4 ° C.

4. toepassing zijde/AAV Film op apparaten

1. Coating van optische vezels naar station focal expressie op het puntje van de vezel
   1. Bereiden chronische vezel implantaten als eerder beschreven⁴.
   2. Vóór gebruik spoelen implantaten met ethanol, dan met ultrazuiver water om ervoor te zorgen dat de optische vezels zijn schoon.
      Opmerking: Silk films houden betrouwbaarder om glazen oppervlakken schoon te maken.
   3. Een apparaat te houden van de vezel ferrules voor te bereiden. Voor typische 1.25 mm diameter ferrules, gebruik een blok ¼ inch heldere acryl, met ~1.3 mm gaten en tikte stelschroeven vanaf de zijkant naar gat implantaten stevig op zijn plaats (figuur 1A) in te voeren.
   4. Mount het verlengstuk houder in een stereotaxic apparaat (of een oplossing van de manipulatie met submillimeter precisie) met een microinjector uitgerust. Plaats de houder verlengstuk boven de microinjector en breng de zijde/AAV-mengsel van onderen.
      Opmerking: Dit is omdat toepassingen van grote volumes van bovenaf resulteerde in zijde/AAV dat niet beperkt is tot aan de vingertop. Echter kunt de toepassing van vele kleine sequentiële volumes van boven of onder produceren AAV/zijde deposito's die zijn beperkt tot de tip (hoewel we liever toe te passen uit de onderstaande lijst).
   5. Trek een pipet standaard intracraniële injectie van borosilicaatglas capillaire.
      1. Om het gemakkelijker te
      2. De tip van een injectie met een schone platte tip van de gewenste diameter produceren, één pipet Houd in elke hand en gebruiken het dikkere deel van de conus op één pipet te scoren de andere pipet op de locatie van de gewenste pauze.
      3. Wrijf zachtjes heen en weer in een zaagmachines beweging (de glas-op-glas scoren methode).
      4. Na het scoren van de pipet, zachte druk van toepassing op het puntje van de scoorde pipet met het lichaam van de andere pipet om een clean break.
   6. Plaats een stereoscoop geven een duidelijk beeld van de optische vezel gezichten.
      Opmerking: Vergroting moet voldoende nauwkeurig de positie van de Pipet van de injectie boven het gezicht van optische vezels.
   7. Vezel implantaten invoegen houder met de hersenen-zijde van de optische vezel naar beneden.
   8. De injectie pipet met zijde/AAV oplossing, wat standaard intracraniële injectie⁵laden. Het laden van het bedrag dat vereist is voor het aantal implantaten worden aangebracht, plus ~ 30% extra voor verliezen als gevolg van pipetten verstopping. Bijvoorbeeld als 10 implantaten worden aangebracht, dan laden met 100 nL-deposito's en ~1.3 µL trekken.
      Opmerking: Silk/AAV kan aan het uiteinde van de pipet tussen Ejecties, die de pipet verstoppen kunnen droog. Grote diameter pipetten (50-100 µm) zijn minder waarschijnlijk te verstoppen. Klompen kunnen worden verdreven door zachte borstelen beneden het uiteinde van de pipet met een natte papieren doekje of alcohol doekje.
   9. Manoeuvreren de injectie pipet totdat het is aan te raken of bijna aanraken van het midden van het oppervlak van de optische vezel. Uitwerpen van 10-20 nL van zijde/AAV oplossing. Intrekken van de pipet.
      Opmerking: De snelheid van levering is niet kritisch, maar typisch tarieven zijn 5-20 nL/s.
   10. Observeren van de bolus van zijde/AAV op de vlakke ondergrond die wordt weergegeven als een vloeibare koepel die naar een platte film binnen ~ 1 min droogt (figuur 1B).
   11. Herhaal stappen 4.1.9-4.1.10 totdat de gewenste hoeveelheid zijde/AAV is gestort (20-200 nL voor de meeste toepassingen). Bij de voorbereiding van meerdere implantaten, zijde/AAV toepassen op één implantaat en verplaats vervolgens op jas andere implantaten voordat hij terugkeerde naar de eerste.
   12. Voorzien in 1 uur drogen alvorens implantaten.
   13. Vacuüm desiccate overnachting in ~ 125 Torr (-25 in. Hg), 4 ° C. Doe dit door het plaatsen van de hele verlengstuk houder in een vacuuemcel.
   14. Evalueren van de vorm en positie van de resulterende zijde film onder een high-power Microscoop. Zorgen ervoor dat de films zijn beperkt tot het uiteinde van de optische vezel oppervlak, worden relatief dunne (> 100 µm), en symmetrisch (Figuur 1 c).
       Opmerking: Grote of asymmetrische zijde/AAV films kunnen verjagen uit de vezel tijdens implantatie (Figuur 1 d). De meest voorkomende oorzaak van problemen komt voort uit de toepassing van enkele grote hoeveelheden in plaats van de sequentiële toepassing van vele kleine volumes.
2. Coating tapered optische vezels op station expressie langs de as van de vezel
   1. Verkrijgen van taps toelopende optische vezel implantaten en het uitvoeren van de stappen 4.1.2-4.1.8, behalve dat de taps toelopende vezel lateraal ligt zodanig dat het loodrecht op de injector (figuur 2A). Plaats de injector boven de taps toelopende vezel.
      Opmerking: Vloeibare druppeltjes op tapse vezels poses laden uitdagingen, toegevoegd omdat oppervlaktespanning neiging tot druppels Spring terug op de injectie pipet of migreren van de taps toelopende vezel. Kleinere injectie pipetten (30-50 µm diameter) helpen om dit probleem te verhelpen maar verhogen het risico dat de injectie pipet zal verstoppen. Als gevolg van oppervlaktespanning, druppels de neiging vast te houden aan het gebied van grootste oppervlak, zodat de optimale injectie Pipetteer grootte is afhankelijk van de grootte van de taps toelopende vezel en iemands tolerantie voor de occasionele klomp.
   2. Plaats de pipet zijde/AAV injectie tegen de zijkant van de optische vezel aan het begin van de conus. Zorg ervoor dat de injectie Pipet is het aanraken van de optische vezel.
   3. Uitwerpen van 20 nL van zijde/AAV de coatingproces te starten. Ervoor zorgen dat de druppel houdt zich aan de optische vezel en op het raakvlak van de vezel/pipet blijft. De druppel aan het einde van het uiteinde van de vezel zachtjes pit zoals de zijde/AAV droogt (~ 45 s). Houd de injecterende pipet in contact met de drogen druppel om te voorkomen dat verstopping van het uiteinde van de pipet.
      Opmerking: Elke storting moet jas ongeveer 400 µm van de taps toelopende vezel (figuur 2B).
   4. Wanneer de eerste bolus is bijna volledig opgedroogd, uitwerpen nog eens 20 nL en blijven de druppel langs de conus wicking.
      Opmerking: De vloeibare zijde zal voldoen aan de gedroogde zijde, verankerende één uiteinde van de druppel als de pipet langs de conus beweegt.
   5. Herhaal stap 4.2.4 door kleine hoeveelheden zijde/AAV uitwerpen, en geleidelijk aan de oplossing van de kant van de conus. 5-6 ejecties volstaan om te doorkruisen van het oppervlak van een 2.5 mm conus.
   6. Als u wilt rijden meer uniforme expressie rond alle zijden van de vezel, draaien de vezel en herhaal stappen 4.2.2-4.2.5 totdat de gewenste hoeveelheid zijde/AAV is nedergelegd.
   7. Als een hangende onderdeel van gedroogde zijde/AAV verder reikt dan de tip van de vezel, zorgvuldig het onderdeel knippen met een schaar of gebruik de pipet uitwerpen om te buigen van het strand terug en het voldoen aan de conus van de vezel.
   8. Voorzien in 1 uur drogen alvorens implantaten.
   9. Vacuüm desiccate overnachting in 4 ° C. De gehele verlengstuk houder kan worden geplaatst in een vacuuemcel.
   10. Evalueren van de vorm en positie van de resulterende zijde film onder een high-power Microscoop.
       Opmerking: Films hoeft niet volledig uniforme maar moeten geen bultjes die meer dan 100 µm voorbij de oppervlakte van de vezel tot een minimum beperken van schade aan het omliggende weefsel tijdens implantatie (Figuur 3 c) uit te breiden. Om te minimaliseren van de grootte van de film, is het essentieel dat elke druppel volledig droog is voordat daaropvolgende deposito's zijn gemaakt.
3. Coating grijns lens implantaten
   1. GRIJNS lenzen^6,7 te verkrijgen en herhaalt u stappen 4.1.2-4.1.8. De injector kan boven worden gemonteerd.
   2. Zijde/AAV storten in een enkele uitwerpen (1 µL voor een 1,0 mm diameter lens).
      Opmerking: Dit zal een koepel van vloeistof die voldoet aan het gezicht van de lens, en droogt om te produceren een uniforme film (100-200 µm dik) opleveren. Echter, in het geval dat een enkele grote uitwerpen ongelijk droogt en produceert een film die is dikker in de buurt van de randen van het objectief grijns, probeer te storten meerdere kleinere druppels (100-200 nL) in het midden van het oppervlak van de lens (waardoor elke druppel drogen voordat het storten de volgende) om ervoor te zorgen dat de film expressie in het midden van het gezichtsveld rijden zal.
   3. Voorzien in 1 uur drogen alvorens implantaten.
   4. Evalueren van de vorm en positie van de resulterende zijde film onder een high-power Microscoop om ervoor te zorgen dat de film de oppervlakte van de lens beslaat.
4. Cranial loodramen coating
   1. Bereiden van glas craniale windows door daaraan vastzittende twee 3 mm diameter ronde coverslips (nr. 1 dikte) naar een 5 mm diameter venster met optische lijm (voor meer informatie, zie Goldey et al. 2014⁸).
   2. Meng zijde: virus in een verhouding van 1:4 tot vermindering van het totale bedrag van zijde in de film. Buitensporig veel zijde lossen niet op onder craniale windows na implantatie. Titratie experimenten mogelijk moet bepalen de verhouding en het volume waarmee het profiel van de gewenste expressie.
   3. Hand Pipetteer een druppel 5 µL op het oppervlak van de 3 mm (hersenen gerichte) dekglaasje aan. De druppel moet verspreid ter dekking van het hele glasoppervlak (Figuur 3).
   4. Mogelijk 2-3 uur drogen voordat u windows.

5. opslaan van zijde/AAV-gecoate implantaten

1. Zijde/AAV-gecoate optische vezels in een gekoelde vacuüm exsiccator (~ 125 Torr, 4 ° C) worden opgeslagen vóór gebruik (figuur 4A).
2. Bewaar niet craniale windows en grijns lenzen onder vacuüm, zoals grote zijde films opgeslagen onder vacuüm niet volledig los na implantatie. Cranial windows en grijns lenzen implantaat onmiddellijk na het drogen, of binnen een dag na bereiding als opgeslagen bij atmosferische druk en 4 ° C.

6. het implanteren van de apparaten

1. Dieren voorbereiden door implantaatchirurgie als eerder beschreven⁴.
   1. Kort, anesthetize van muizen met een intraperitoneale injectie van ketamine/xylazine (100/10 mg/kg) en controleert u de diepte van de verdoving met behulp van een zachte teen-snuifje. Scheren van de schedel op het gebied van het implantaat en het reinigen van de hoofdhuid met jodium en alcohol.
   2. Dieren in een stereotaxic apparaat koppelen en aan te vullen anesthesie met behulp van een mengsel van zuurstof en Isofluraan (1-2%). Maak een incisie in de hoofdhuid over het gebied van belang, en het uitvoeren van een craniotomy die groot genoeg is voor het implantaat.
2. Implantaat optische vezels⁹ en microendoscope lenzen¹⁰ volgens eerder gepubliceerde procedures. Handvat implantaten met zorg, zoals de zijde/AAV storting kan worden geklopt door een onvolmaakte craniotomy of door het implantaat vangen aan de rand van de schedel. Lagere het implantaat in de hersenen langzaam (~ 2 mm/min).
3. Implantaat craniale windows zoals eerder⁸beschrijven. Raak de gecoate kant van het venster en te voorkomen dat het venster met vloeistof spoelen als het uitvoeren van de maagsonde, zoals dit het virus wegspoelen kan. Om te bereiken maximale expressie, een durotomy uit te voeren.

7. de expressie wordt geëvalueerd en probleemoplossing

1. Om te beoordelen uiting van viraal uitgedrukt eiwitten, mogelijk ~ 2-3 weken voor het virus te rijden van expressie, dan intracardial perfusie met 4% paraformaldehyde uitvoeren in fosfaat gebufferde zoutoplossing¹¹ en proces hersenweefsel voor tl microscopie¹².
2. De expressie wordt geëvalueerd met behulp van fluorescentie microscopie om het imago van het expressiepatroon van optogenetic fluorophore-gelabelde proteïnen.
3. Als het niveau van meningsuiting onvoldoende is, verhogen de hoeveelheid virus in coatings ofwel het verhogen van het totale volume van de zijde/AAV-coating, of bij voorkeur met een hogere titer-virus.

Representative Results

Om te beoordelen van het succes van zijde/AAV films in expressie rijden, we geperfundeerd dieren 2-3 weken na implantatie en bereid hersenen segmenten uit de regio van belang. Fluorescentie beelden van optogenetic fluorophore-gelabelde proteïnen (ChR2-YFP) verstrekt een maatregel van de mate van expressie (Figuur 1 d). Typische optische vezels (230 µm diameter) kunnen gemakkelijk 200 nL van zijde/AAV. Met praktijk kunnen onderzoekers zeer betrouwbare expressie rond de tip van geïmplanteerde vezels (Figuur 5).

Om te beoordelen expressie gedreven door craniale windows zijde/AAV-gecoat, beginnen imaging begin van 7-10 dagen na implantatie. We hebben twee-foton imaging gebruikt voor visualisatie, maar kunnen ook andere methoden zoals fluorescentie imaging met een CCD worden gebruikt. Twee mogelijke problemen met gecoate craniale windows zijn onvoldoende expressie en zijde films die niet te ontbinden en het gezichtsveld niet meer zichtbaar. Het vergroten van expressie, wij stellen voor het uitvoeren van een durectomy voorafgaand aan het inplanteren van het venster, en/of het verhogen van de hoeveelheid virus in de film. We bereikt de beste expressie met behulp van een 1:4 mengsel van zijde en voorraad-titer AAV, respectievelijk. Terwijl dit een aanzienlijk groter aantal virale deeltjes vertegenwoordigt dan worden meestal gebruikt in stereotaxic injecties, tellers de verminderde chirurgische tijd de marginale extra kosten van virus. Ondertussen, als zijde films niet te ontbinden onder het venster, verdere verlaging van de hoeveelheid zijde gebruikt jas van het venster. Het totale bedrag van zijde in gecoate windows is 10 - 100 keer meer dan op fiber implantaten, en de film is minder ingebed in weefsel en dus kan niet worden blootgesteld aan dezelfde niveaus van proteolytic activiteit dan zijde films¹³kan ontbinden. De aanwezigheid van bepaalde zijde is echter essentieel voor het bewerkstelligen van expressie onder windows³, waarschijnlijk omdat een film gemaakt van het virus alleen is weggespoeld door de interstitiële vloeistof tijdens de operatie.

Figuur 1: zijde/AAV films op optische vezels toe te passen. (A) chronische vezel implantaten vezel kant-down in een houder (inzet) gemonteerd op een XYZ vertaler worden geplaatst. Een vaste microinjector onder de vezels opleidingscyclus zijde/AAV op de vezel-tips. Een stereoscoop kunt visualisatie van het proces. (B) toepassing zijde/AAV vezel tips in kleine hoeveelheden (10-20 nL). Na het uitwerpen van een bolus, het intrekken van de pipet en laat ~ 60 s voor de druppel om te drogen op een vlakke film. Herhaal dit proces totdat het vereiste volume is toegepast op het uiteinde van de vezel. (C) inspecteren zijde coatings. Optimale coatings moeten worden gecentreerd op de vezel tip (links), terwijl de onjuiste coatings verlengen naar buiten van het gezicht van de vezels waardoor ze meer vatbaar voor het verjagen van de vezel (rechts). (D) vertegenwoordiger vezels bedekt met 200 nL van zijde/AAV en de resulterende AAV-gedreven ChR2-YFP expressie 2 weken na implantatie. De compacte zijde/AAV-coating aan de linkerkant resulteerde in robuuste expressie, terwijl de coating aan de rechterkant voorbij het gezicht van de vezel staken en bijna geen expressie, waarschijnlijk resulteerde omdat de zijde/AAV niet aan de optische vezel tijdens implantatie houden. Schaal bars 0.2 mm (vezels) en 1,0 mm (hersenen segmenten). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figuur 2: opstelling voor coating van taps toelopende vezel implantaten. (A) de microinjector is boven de taps toelopende vezel houder gemonteerd en taps toelopende vezels orthogonaal zijn gepositioneerd om de ejectie spuit. (B) Begin op het breedste punt (inzet) en uitwerpen van kleine volumes tijdens het verplaatsen van de spuit ejectie richting de punt van de conus. Dit resulteert in een continue coating dwars op de lengterichting van de conus. (C) vertegenwoordiger taps toelopende vezel bekleed met zijde gemengd met snel groen tot hulp in visualisatie. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figuur 3: Coating craniale windows. Zijde/AAV kunnen toegepaste craniale windows met behulp van een precisiepipet hand. Een standaard 3 mm diameter venster kan worden bekleed met een 5 µL droplet, die zal langzaam drogen op een vlakke film. Inzet: GCaMP6f expressie als gevolg van zijde/AAV-gecoate craniale windows geïmplanteerd met en zonder durectomies. Dit percentage is aangepast van Jackman et al. (2018) ³. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figuur 4: opslaan van zijde/AAV gecoate implantaten. (A) te verwijderen van de resterende vocht en behouden van virale werkzaamheid, implantaten onder vacuüm bij 4 ° C tot gebruikt moeten worden opgeslagen. Implantaten die zijn opgeslagen op deze manier blijven levensvatbaar gedurende ten minste 7 dagen. (B) expressie die voortvloeien uit 4 zijde/AAV omhulde vezels geïmplanteerd na 7 dagen van de opslag. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figuur 5: Silk/AAV-GFP gecoat optische vezels betrouwbaar rijden expressie. Fluorescerende beelden van segmenten van 24 opeenvolgende striatale implantaten. Elk implantaat was bedekt met 100-400 nL van 1:1 zijde/AAV-GFP. Dit cohort van implantaten geeft de mogelijkheid om van zijde te beperken uitdrukking aan de implantatieplaats (in dit geval de dorsale striatum). GFP fluorescentie wordt aangegeven in het groen; DAPI kleuring wordt in blauw weergegeven. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Discussion

Het gebruik van zijde/AAV te richten op de expressie van optogentic eiwitten overwint beperkingen van benaderingen die momenteel in gebruik. Hoewel vele studies succesvol AAV injecties gebruiken uitspreken optogenetic eiwitten, is het uitdagend expressie naar het uiteinde van de optische vezels, regio's rond de lengte van taps toelopende vezels, en de regio bekijken van een grijns lens worden uitgelijnd. Vanwege de afwijking tussen optische componenten en optogenetic expressie, stereotaxic injecties kunnen onbetrouwbaar en veel experimenten mislukken. De zijde/AAV etikettering methode we hier beschrijven is dit probleem opgelost. Het vereenvoudigt ook de procedure door het elimineren van een tweede chirurgische stap en in sommige gevallen eliminerend de behoefte aan een tweede operatie. Het kan ook moeilijk zijn om virussen te verkrijgen van wijdverbreide expressie onder craniale windows gebruiken, en experimentator uitvoeren meestal lange chirurgie te injecteren virus op meerdere locaties. De mogelijkheid om het verkrijgen van wijdverbreide expressie over grote corticale gebieden door gewoon coating craniale windows met zijde/AAV is een vereenvoudiging die de noodzaak voor de vele invasieve injecties elimineert.

Een andere mogelijke voordeel van de zijde/AAV-methode is dat het minder ontsteking in het zenuwweefsel in vergelijking met virale injecties kan induceren. Hoge-titer AAV injecteren in de hersenen kan leiden tot inflammatoire reacties zoals reactieve astrocytosis die de potentie hebben om mobiele en circuit eigenschappen^14,15 te wijzigen (hoewel dergelijke mogelijke complicaties meestal zijn genegeerd). Zijde films veroorzaken weinig immunogene reactie op hun eigen¹³ en zijde/AAV films zijn zal naar verwachting vrij virus in de loop van vele uren of dagen¹⁶, die kan verlagen de virale lading in het omliggende weefsel en immunogene reacties te verminderen. Met conventionele benaderingen waarin implantatie van een apparaat wordt voorafgegaan door een injectie van AAV, kunnen inflammatoire reacties voortvloeien uit zowel de inplanting en de injectie. In de toekomst zal het wenselijk zijn om het systematisch vergelijken van conventionele benaderingen en de zijde/AAV-methode om te bepalen of de zijde/AAV films over het algemeen vermindert inflammatoire reacties.

Verschillende stappen zijn cruciaal voor een succesvol gebruik van zijde/AAV films. Bovenal de coating van optische vezels moet zorgvuldig zoals beschreven in de methoden worden gedaan en de locatie van de gedroogde films moet zorgvuldig worden beoordeeld door visueel onderzoek onder een microscoop om ervoor te zorgen dat de films compact, op de juiste locatie zijn, en voldoen aan het gezicht van de optische vezel. Elke zijde/AAV aan de zijkanten van de optische vezel zal leiden tot expressie buiten de regio van belang, en misshaped films die buiten het gezicht van de vezel uitsteken tijdens de implantatie en leiden tot onbetrouwbare of geen uitdrukking kunnen afbreken. De technieken die we beschrijven voor toepassing van zijde/AAV implanteerbare hulpmiddelen aangepast worden kan aan het gebruik van materialen zijn die gemakkelijk beschikbaar zijn en de precieze afzetting van kleine hoeveelheden van zijde/AAV toestaan.

Een beetje praktijk is vereist om nauwkeurige en reproduceerbare resultaten te bereiken. Als de expressie wordt waargenomen langs het spoor van de vezel, is het waarschijnlijk dat de zijde film aan de zijkant van de vezel in plaats van het gezicht van de vezels gedroogd. Herhaal het productieproces en nauw inspecteren gedroogde implantaten voor tekenen dat films aan de zijkant van de vezel drogen. Omdat zijde/AAV films optisch transparant zijn, kan het helpen om de praktijk toepassen van zijde gemengd met kleurstof (snel groen of een soortgelijk kleurstof) aan de vorm van resulterende films (figuur 2C) beter te visualiseren. Als er geen expressie is, is het waarschijnlijk dat de zijde film uit het topje van de vezel tijdens implantatie verdreven. Wij stellen voor het gebruik van materieel-titer virus bij het maken van implantaten. Voor optische vezels vermindert dit het totale volume dat moet worden toegepast op kleine diameter vezels. Als de grootte van de coating is een zorg overwegen meer wachten tussen elke 10 nL toepassing om volledige droging van de gedeponeerde druppel te geven. Zijde/AAV druppels drogen sneller onder een warme lamp. Voor Cranio windows, hoge-titer virus mogelijk moet voldoende virale lading te leveren aan de pia- of dura. Bepaalde soorten implantaten kunnen ontbinden van zijde en laat AAV gemakkelijker dan anderen. We hebben gevonden dat craniale windows geïmplanteerd over het oppervlak van de hersenen een lagere ratio van zijde/virus vereisen om betrouwbare expressie, misschien als gevolg van verschillende cerebrale spinal fluid dynamics of protease-activiteit. Als expressie kan niet worden verhoogd door het verhogen van de effectieve AAV concentraties, is verminderen het volume van waterige zijde een plausibel alternatief.

Tot slot is het belangrijk om te slaan van de optische onderdelen goed en implantaat ze heel snel nadat ze zijn voorbereid. We hebben aangetoond dat omhulde vezels die zijn gekoeld onder drukvermindering voor vele dagen vóór gebruik kunnen worden opgeslagen. Vacuüm opslag verwijdert resterende vocht¹⁷ die kunnen verminderen de oplosbaarheid van zijde films, en ook helpen handhaven van virale werkzaamheid. Optische vezels moet idealiter worden geïmplanteerd binnen 24 uur na fabricage. We vinden echter dat de zijde/AAV-gecoate vezels onder vacuüm station vergelijkbare niveaus van meningsuiting opgeslagen wanneer geïmplanteerd 7 dagen na fabricage (figuur 4B). Daarentegen gecoate craniale windows en grijns lenzen reed de betrouwbaarste uitdrukking toen ze waren gedroogd bij kamertemperatuur en binnen uur na de bereiding gebruikt. De reden voor deze ongelijkheid blijft onduidelijk. Verder kunnen onderzoek nodig verfijnen bereiding en opslag voorwaarden verder uit te breiden de opslagduur.

Zijde/AAV-gecoate craniale vensters hebben aanzienlijke mogelijkheden omdat ze drastisch verkorten chirurgische tijden en zijn zeer eenvoudig te produceren, maar deze methode op dit moment beperkingen heeft. Gecoate craniale windows uniform etiket grote gebieden van de cortex en rijden voldoende expressie in laag 2/3 GCaMP imaging, met iets minder expressie in diepere lagen. Echter stereotaxic injecties rijden meer robuuste expressie en bieden meer controle over de lagen die voor de expressie wordt gericht. Betrouwbare expressie werd alleen bereikt toen de dura werd verwijderd. Hoewel de dura wordt vaak verwijderd voor vele 2-photon imaging experimenten ter verbetering van de beeld kwaliteit⁸, voor vele experimenten is het wenselijk om etikettering in een minder invasieve manier. We hebben daarom ons vermogen met zijde/AAV label corticale gebieden zonder het verwijderen van de dura onderzocht. Wij verkregen enkele etikettering, maar het is mogelijk dat dit een gevolg was van beschadiging van de dura bezig met de voorbereiding van de craniotomy. Verder onderzoek is nodig voor gecoate craniale windows moet worden gebruikt voor het betrouwbaar label de cortex zonder het verwijderen van de dura.

De voorbereiding van waterige zijde fibroin van cocons van Bombyx Mori is in detail beschreven in Rockwood et al. (2011) ¹⁸. waterige zijde fibroin is nu verkrijgbare (5% w/v). Hoewel de meeste van onze experimenten werden uitgevoerd met behulp van waterige zijde fibroin voorraden bereid in ons lab (5-7,5% w/v), hebben we bereikt soortgelijke resultaten met behulp van commerciële waterige fibroin. Waterige fibroin is stabiel bij 4 ° C voor maximaal 3 maanden, waarna het spontaan van vloeistof naar hydrogel^{18 overgangen}. We raden fibroin voorraden worden onderverdeeld in ~ 1 mL monster en opgeslagen bij-80 ° C. Een hoeveelheid van 1 mL werken (voldoende voor coating van honderden implantaten) kan worden opgeslagen bij 4 ° C en gebruikt totdat deze begint gel. Wees voorzichtig niet schudden, vortex, doorroeren of agressief Pipetteer waterige fibroin, zoals schuintrekken krachten tot gelering^{19,20 leiden kunnen}.

Zijde/AAV films toegestaan een breed scala aan expressiepatronen, van wijdverbreide corticale expressie onder craniale windows, naar een precieze subcorticale uitdrukking op het puntje van een kleine diameter optische vezels. Deze technieken zijn ontwikkeld om te profiteren van de gemeenschappelijke AAV expressievectoren maar kunnen waarschijnlijk worden gebruikt om andere expressievectoren zoals lentivirussen of rabiës virussen verspreiden in de hersenen. Zijde films kunnen ook worden vervaardigd in driedimensionale vormen om virale introductie in weefsel. Bijvoorbeeld, om de sterke expressie van de schijf onder corticale Vensters zonder het gebruik van een durotomy, kon craniale windows worden bekleed met arrays van zijde microneedles die het virus dura en release in diepere lagen van de corticale²¹zou doorboren. Verdere verfijning zal waarschijnlijk leiden tot verbeterde eigenschappen van de introductie van het virus, en nieuwe toepassingen voor zijde/AAV films.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Aqueous silk fibroin	Sigma	5154-20ML	Aqueous Silk Fibroin (5% w/v) for making films
Microinjector to deposit silk/AAV	Drummond	3-000-207	Nanoject III nanoliter injector
Manipulator to hold implants	Narashige	MM-33	Micromanipulator
Stereoscope to visualize silk deposits	AmScope	SM-6TX-FRL	3.5X-45X Trinocular articulating zoom microscope with ring light
Vacuum chamber to store implants	Ablaze	N/A	3.5 Quart Vacuum Vac Degassing Chamber
Optional, implant holder for storage	N/A	N/A	To store premade optical fibers, drill a grid of ~4 mm-deep holes with a diameter just larger than the ferrule diameter into a plastic block.
Optical fiber	Thorlabs	FT200EMT	Ø200 µm Core Multimode Optical Fiber for fiber implants
Ferrules	Kientec	FZI-LC-230	LC Zirconia Ferrule for fiber implants
Various materials for manufacturing chronic fiber implants	Various	N/A	For detailed procedure, see Ung K, Arenkiel BR. Fiber-optic implantation for chronic optogenetic stimulation of brain tissue. Journal of visualized experiments: JoVE. 2012(68).
Tapered fiber implants	Optogenix	Lambda-B	Tapered fiber implants
GRIN lenses	GoFoton	CLH-100-WD002-002-SSI-GF3	GRIN lenses
Small glass cranial windows	Warner	64-0726 (CS-3R-0)	Small round cover glass, #0 thickness
Large glass cranial windows	Warner	64-0731 (CS-5R-0)	Small round cover glass, #0 thickness
Various materials for manufacturing cranial windows	Various	N/A	For detailed procedure, see Goldey GJ et al. Removable cranial windows for long-term imaging in awake mice. Nature protocols. 2014 Nov;9(11):2515.