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Neuroscience

Vivo में रेशम/aav फिल्मों का उपयोग कर optogenetic प्रोटीन की लक्षित अभिव्यक्ति

Published: February 26, 2019 doi: 10.3791/58728
Automatic Translation
1, 2, 2
1Vollum Institute, Oregon Health and Science University, 2Harvard Medical School

Summary

यहां, हम सिल्क फाइब्रोइन फिल्मों का उपयोग कर मस्तिष्क में वायरल अभिव्यक्ति वैक्टर देने के लिए एक विधि प्रस्तुत करते हैं । इस विधि से अभिव्यक्ति वैक्टर के लक्षित वितरण रेशम/aav लेपित ऑप्टिकल फाइबर, पतला ऑप्टिकल फाइबर, और कपाल खिड़कियों का उपयोग करने की अनुमति देता है ।

Abstract

खोज कैसे तंत्रिका सर्किट प्रक्रिया जानकारी के क्रम में व्यवहार उत्पादन ड्राइव करने के लिए काफी हाल ही में विकसित किया गया है से छेड़छाड़ और vivo मेंंयूरॉंस की गतिविधि की निगरानी के लिए ऑप्टिकल तरीके से सहायता प्राप्त है । प्रयोगों के इन प्रकार के दो मुख्य घटकों पर भरोसा करते हैं: 1) implantable उपकरणों है कि मस्तिष्क के लिए ऑप्टिकल पहुँच प्रदान करते हैं, और 2) प्रकाश संवेदनशील प्रोटीन है कि न्यूरोनल उत्तेजना परिवर्तन या न्यूरोनल गतिविधि का एक readout प्रदान. प्रकाश के प्रति संवेदनशील प्रोटीन को व्यक्त करने के लिए कई तरीके हैं, लेकिन वायरल वैक्टर के स्टीरियो टैक्सिक इंजेक्शन वर्तमान में सबसे लचीला दृष्टिकोण है क्योंकि अभिव्यक्ति को आनुवंशिक, शारीरिक और अस्थायी परिशुद्धता के साथ नियंत्रित किया जा सकता है । वायरल वैक्टर की महान उपयोगिता के बावजूद, ऑप्टिकल प्रत्यारोपण की साइट पर वायरस पहुंचाने कई चुनौतियां बन गया है । स्टीरियो टैक्सिक वायरस इंजेक्शन सर्जरी की मांग कर रहे हैं कि शल्य समय में वृद्धि, अध्ययन की लागत में वृद्धि, और पशु के स्वास्थ्य के लिए एक जोखिम मुद्रा. आसपास के ऊतक शारीरिक रूप से इंजेक्शन सिरिंज द्वारा क्षतिग्रस्त किया जा सकता है, और immunogenic उच्च टिटर वायरस के एक बोल्स के अचानक प्रसव के कारण सूजन द्वारा । मस्तिष्क में गहरे छोटे क्षेत्रों को लक्षित करते समय ऑप्टिकल प्रत्यारोपण के साथ इंजेक्शन aligning विशेष रूप से मुश्किल है. इन चुनौतियों को दूर करने के लिए, हम सिल्क फाइब्रोइन और adeno-जुड़े वायरल (aav) वैक्टर से बना फिल्मों के साथ ऑप्टिकल प्रत्यारोपण के कई प्रकार के कोटिंग के लिए एक विधि का वर्णन । फाइब्रोइन, bombyx मोरी के कोकन से व्युत्पंन एक बहुलक, encapsulate और जैव अणुओं की रक्षा कर सकते है और घुलनशील फिल्मों से मिट्टी के बरतन को लेकर रूपों में संसाधित किया जा सकता है । जब मस्तिष्क में प्रत्यारोपित, रेशम/aav कोटिंग्स ऑप्टिकल तत्वों और आसपास के मस्तिष्क के बीच इंटरफेस पर वायरस जारी, अभिव्यक्ति ड्राइविंग ठीक है जहां यह आवश्यक है । इस विधि को आसानी से लागू किया है और बहुत तंत्रिका सर्किट समारोह के vivo अध्ययन में सुविधा का वादा किया है ।

Introduction

पिछले दशक की निगरानी और तंत्रिका गतिविधि1से छेड़छाड़ के लिए इंजीनियर प्रकाश के प्रति संवेदनशील प्रोटीन का एक विस्फोट का उत्पादन किया है । वायरस मस्तिष्क में इन ऑप्टोजेनेटिक उपकरणों को व्यक्त करने के लिए अद्वितीय लचीलापन प्रदान करते हैं । ट्रांसजेनिक जानवरों की तुलना में, वायरस अभी तक उत्पादन करने के लिए आसान कर रहे हैं, परिवहन, और दुकान, नवीनतम optogenetic उपकरणों के तेजी से कार्यान्वयन की अनुमति. अभिव्यक्ति आनुवंशिक रूप से विशिष्ट न्यूरोनल आबादी के लिए लक्षित किया जा सकता है, और वायरस प्रतिगामी परिवहन के लिए डिजाइन भी न्यूरोनल कनेक्टिविटी2के आधार पर अभिव्यक्ति लक्ष्य किया जा सकता है ।

वायरस आमतौर पर stereotaxic इंजेक्शन के साथ शुरू कर रहे हैं, जो समय लेने वाली और चुनौतीपूर्ण हो सकता है. संक्षेप में छोटे क्षेत्रों को लक्षित करना मुश्किल हो सकता है, जबकि व्यापक क्षेत्रों पर अभिव्यक्ति ड्राइविंग अक्सर कई इंजेक्शन की आवश्यकता है । इसके अलावा, जब एक ऑप्टिकल डिवाइस बाद में विवो मेंप्रकाश देने के लिए मस्तिष्क में प्रत्यारोपित किया जाता है, तो प्रत्यारोपण को वायरल इंजेक्शन के साथ ठीक से संरेखित होना चाहिए । यहां, हम एक प्रत्यारोपित डिवाइस के आसपास ऊतक को वायरल वैक्टर पहुंचाने के लिए एक आसानी से लागू विधि का वर्णन रेशम फाइब्रोन फिल्मों3का उपयोग कर । रेशम फाइब्रोइन वाणिज्यिक उपलब्ध है, अच्छी तरह से तंत्रिका ऊतकों द्वारा सहन, और विभिंन गुणों के साथ सामग्री का उत्पादन किया जा सकता है । सिल्क फिल्मों को माइक्रोइंजेक्शन पाइलेट या हैंड पिपेट जैसे आम प्रयोगशाला उपकरणों का उपयोग कर प्रत्यारोपण के लिए लागू किया जा सकता है । सिल्क/aav फिल्मों दो शल्य चिकित्सा प्रक्रियाओं के लिए आवश्यकता को खत्म करने और सुनिश्चित करें कि वायरस-मध्यस्थता अभिव्यक्ति ठीक से ऑप्टिकल प्रत्यारोपण के लिए गठबंधन किया है. परिणामी अभिव्यक्ति फाइबर की नोक करने के लिए विवश है, और स्टीरियो टैक्सिक इंजेक्शन से फाइबर ट्रैक के साथ कम अवांछित अभिव्यक्ति में परिणाम.

छोटे फाइबर की नोक पर लक्षित अभिव्यक्ति के उत्पादन के अलावा, रेशम/aav फिल्मों के लिए व्यापक ड्राइव (> 3 मिमी व्यास) कपाल खिड़कियों के नीचे cortical अभिव्यक्ति इस्तेमाल किया जा सकता है । में vivo 2-फ्लोरोसेंट गतिविधि सेंसर की photon इमेजिंग संवेदी और संज्ञानात्मक प्रसंस्करण ड्राइविंग में न्यूरोनल गतिविधि की भूमिका का मूल्यांकन करने के लिए एक अनिवार्य उपकरण बन गया है. हालांकि, व्यापक cortical क्षेत्रों पर वर्दी अभिव्यक्ति ड्राइव करने के लिए, experimenters अक्सर कई इंजेक्शन प्रदर्शन करते हैं । ये इंजेक्शन बहुत समय लेने वाला हो सकता है और दृश्य के क्षेत्र में असंगत अभिव्यक्ति के लिए नेतृत्व कर सकते हैं । इसके विपरीत, रेशम/aav-लेपित कपाल खिड़कियों का निर्माण करने के लिए बहुत आसान कर रहे हैं, बहुत सर्जरी के लिए आवश्यक समय को कम, और सबसे उल्लेखनीय cortical सतह के नीचे माइक्रोन के अभिव्यक्ति सैकड़ों ड्राइव ।

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Protocol

जानवरों से जुड़े सभी प्रयोगों की देखभाल और प्रयोगशाला जानवरों के उपयोग के लिएअमेरिका nih गाइड में वर्णित दिशानिर्देश निम्नलिखित पशु देखभाल पर हार्वर्ड स्थायी समिति द्वारा अनुमोदित प्रोटोकॉल के अनुसार प्रदर्शन किया गया. वयस्क C57BL/6 या तो सेक्स के चूहों (6-15 आयु के सप्ताह) सभी प्रयोगों के लिए इस्तेमाल किया गया.

1. प्राप्त जलीय रेशम फाइब्रोइन

  1. तैयार या खरीद जलीय रेशम फाइब्रोइन (5-7.5% w/

2. aav अभिव्यक्ति वैक्टर के साथ जलीय रेशम मिक्स

  1. optogenetic प्रोटीन या पसंद के फ्लोरोसेंट सूचक ड्राइव करने के लिए एक aav अभिव्यक्ति वेक्टर चुनें ।
    ध्यान दें: सिल्क की मात्रा को कम करने के लिए/aav कि प्रत्यारोपण के लिए लागू किया जाना चाहिए, जबकि अभी भी मजबूत अभिव्यक्ति ड्राइविंग, शेयर titer aav (आमतौर पर वेक्टर कोर से प्राप्त स्टॉक titer ~ 1013 gc/
  2. तुरंत कोटिंग प्रत्यारोपण करने से पहले, गल aav के एक aliquot और साथ गठबंधन 5-7.5% जलीय रेशम फाइब्रोइन (इस मिश्रण रेशम के रूप में संदर्भित किया जाएगा/aav). एक २०० μl पीसीआर ट्यूब में, एक 1:1 अनुपात में जलीय फाइब्रोइन और aav मिश्रण (कपाल खिड़कियों का उपयोग 1:4 के लिए) तुरंत आवेदन करने से पहले. धीरे से समाधान में और बाहर कई बार पिपेट फाइब्रोइन और aav मिश्रण करने के लिए अच्छी तरह से ।
  3. उपयोग करने से पूर्व बर्फ पर रेशम/

3. रेशम/aav-लेपित उपकरणों के निर्माण और भंडारण के लिए उपकरण तैयार करें

  1. ऑप्टिकल फाइबर और ढाल-सूचकांक (grin) लेंस (आंकड़े 1, 2) कोटिंग के लिए खरीद उपकरण ।
    1. एक स्थिर फेरूल धारक का निर्माण । करने के लिए सिरेमिक ferrules, ड्रिल १.२५ mm छेद 1/4 "शीट एक्रिलिक के एक ब्लॉक में पकड़ो । जगह में ferrules पकड़ करने के लिए पक्ष से सेट शिकंजा डालने के लिए छेद टैप करें ।
      नोट: किसी भी दबाना इस प्रयोजन के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है ।
    2. ऑप्टिकल फाइबर को स्थानांतरित करने के लिए उप-मिलीमीटर परिशुद्धता के साथ एक जोड़तोड़ की स्थिति (stereotaxic उपकरण या अन्य परिशुद्धता सूक्ष्मनिपुलेटर).
    3. microinjection की स्थिति के लिए एक स्थिर धारक को इकट्ठा करें ।
    4. ऑप्टिकल फाइबर और रेशम की छोटी बूंद कल्पना करने के लिए एक त्रिविमदर्शी का प्रयोग करें ।
    5. ऑप्टिकल फाइबर को रोशन करने के लिए एक प्रकाश स्रोत की स्थिति ।
  2. कोटिंग कपाल खिड़कियों के लिए उपकरण तैयार (चित्रा 3) ।
    1. किसी भी P10 पाइप्टर चुनें ।
    2. ढक्कन के साथ एक कंटेनर प्राप्त करें ।
      नोट: एक सिलिकॉन नीचे के साथ किसी भी कंटेनर का सुझाव दिया है-नरम नीचे कपाल खिड़कियों को उठाने की सुविधा ।
  3. तैयार प्रत्यारोपण स्टोर करने के लिए उपकरणों की तैयारी (चित्रा 4) ।
    1. एक छोटे (1-5 एल) वैक्यूम चैंबर प्राप्त करें ।
    2. सुनिश्चित करें कि एक 4 डिग्री सेल्सियस रेफ्रिजरेटर में प्रत्यारोपण स्टोर करने के लिए जगह है ।

4. उपकरणों के लिए सिल्क/aav फिल्म लागू करें

  1. फाइबर टिप पर फोकल अभिव्यक्ति ड्राइव करने के लिए ऑप्टिकल फाइबर कोटिंग
    1. पहले वर्णित के रूप में जीर्ण फाइबर प्रत्यारोपण तैयार4.
    2. उपयोग करने से पहले, इथेनॉल के साथ प्रत्यारोपण कुल्ला, तो ultrapure पानी के साथ सुनिश्चित करने के लिए कि ऑप्टिकल फाइबर साफ कर रहे हैं ।
      नोट: सिल्क फिल्मों कांच सतहों साफ करने के लिए अधिक मज़बूती से पालन करें ।
    3. फाइबर फेरनियम रखने के लिए एक डिवाइस तैयार करें. ठेठ १.२५ मिमी व्यास ferrules के लिए, एक ब्लॉक का उपयोग करें 1/4 इंच स्पष्ट एक्रिलिक, के साथ ~ १.३ मिमी छेद, और टेप सेट शिकंजा पक्ष से छेद प्रत्यारोपण करने के लिए दृढ़ता से जगह (चित्रा 1a) में प्रवेश.
    4. माउंट एक stereotaxic उपकरण में फेरूल धारक (या subमिलीमीटर परिशुद्धता के साथ किसी भी हेरफेर समाधान) एक microinjector के साथ सुसज्जित । सूक्ष्मक्षेपक के ऊपर फेरूल होल्डर लगाएं और नीचे से सिल्क/aav मिश्रण को लागू करें ।
      नोट: यह है क्योंकि ऊपर से बड़ी मात्रा के अनुप्रयोगों के परिणामस्वरूप रेशम/aav कि टिप करने के लिए प्रतिबंधित नहीं था । हालांकि, ऊपर या नीचे से कई छोटे अनुक्रमिक संस्करणों के आवेदन aav/रेशम जमा है कि टिप करने के लिए सीमित कर रहे हैं का उत्पादन कर सकते हैं (हालांकि हम नीचे से लागू करने के लिए पसंद करते हैं) ।
    5. बोरोसिलिकेट कांच केशिका से एक मानक इंट्राक्रैनियल इंजेक्शन पिपेट खींचो ।
      1. को आसान बनाने के लिए
      2. वांछित व्यास के एक स्वच्छ फ्लैट टिप के साथ एक इंजेक्शन टिप का उत्पादन करने के लिए, प्रत्येक हाथ में एक पिपेट पकड़ और वांछित तोड़ने के स्थान पर अन्य पिपेट स्कोर करने के लिए एक पिपेट पर टेपर के मोटा हिस्सा का उपयोग करें ।
      3. धीरे से एक काटने का यंत्र गति (कांच पर कांच स्कोरिंग विधि) में आगे पीछे रगड़ना ।
      4. पिपेट स्कोरिंग के बाद, एक साफ तोड़ने को प्राप्त करने के लिए अन्य पिपेट के शरीर के साथ बनाए गए पिपेट की नोक पर कोमल दबाव लागू होते हैं ।
    6. ऑप्टिकल फाइबर चेहरे की एक स्पष्ट दृश्य देने के लिए एक त्रिविमदर्शी की स्थिति ।
      नोट: आवर्धन ऑप्टिकल फाइबर के चेहरे के ऊपर इंजेक्शन पिपेट को सही स्थिति के लिए पर्याप्त होना चाहिए ।
    7. मस्तिष्क के साथ धारक में फाइबर प्रत्यारोपण डालें नीचे का सामना करना पड़ ऑप्टिकल फाइबर की ओर.
    8. किसी भी मानक इंट्राक्रैनियल इंजेक्शन5के रूप में रेशम/aav समाधान के साथ इंजेक्शन पिपेट लोड करें । लोड किया जा रहा प्रत्यारोपण की संख्या के लिए आवश्यक राशि, प्लस ~ 30% अतिरिक्त पिपेट clogging के कारण घाटे को समायोजित करने के लिए । उदाहरण के लिए, यदि 10 प्रत्यारोपण किया जा रहा है, तो १०० nL जमा के साथ लोड और ~ १.३ μl वापस लेने ।
      नोट: रेशम/aav इजेक्शनों के बीच में पिपेट टिप पर सूख सकता है, जो पिपेट को रोकना कर सकता है । बड़े व्यास के पिसेटों (50-100 μm) को रोकना कम होने की संभावना है । clogs कोमल एक गीला कागज पोंछ या शराब झाड़ू के साथ पिपेट की नोक नीचे brushing द्वारा उखाड़ फेंकना किया जा सकता है ।
    9. इंजेक्शन पिपेट पैंतरेबाज़ी जब तक यह छू रहा है या लगभग ऑप्टिकल फाइबर सतह के केंद्र को छूने. रेशम/aav समाधान के 10-20 nL को बाहर निकालें । पिपेट को वापस लें ।
      नोट: डिलिवरी की दर गंभीर नहीं है, लेकिन ठेठ दरें हैं 5-20 nL/
    10. समतल सतह पर रेशम के बोल्स को देखें जो एक तरल गुंबद के रूप में दिखाई देता है जो ~ 1 मिनट (चित्र 1b) के भीतर एक सपाट फिल्म में dries ।
    11. (अधिकांश अनुप्रयोगों के लिए 20-200 nL की कुल) रेशम/aav की वांछित राशि जमा है जब तक चरण 4.1.9-4.1.10 दोहराएं । जब एकाधिक प्रत्यारोपण की तैयारी, एक प्रत्यारोपण करने के लिए रेशम/aav लागू करें और फिर पहले करने के लिए लौटने से पहले कोट अन्य प्रत्यारोपण पर चलते हैं ।
    12. प्रत्यारोपण चलती से पहले सुखाने के लिए 1 ज की अनुमति दें ।
    13. निर्वात में रात भर desiccate ~ १२५ torr (-25 में । एचजी), 4 ° c. पूरे फेरूल होल्डर को वैक्यूम चैंबर में रखकर ऐसा करें ।
    14. एक उच्च शक्ति माइक्रोस्कोप के तहत परिणामी सिल्क फिल्म के आकार और स्थिति का मूल्यांकन करें । सुनिश्चित करें कि फिल्में ऑप्टिकल फाइबर सतह की नोक तक ही सीमित हैं, अपेक्षाकृत पतली (> 100 μm), और सममित (चित्रा 1 सी) ।
      नोट: बड़े या विषम रेशम/aav फिल्मों प्रत्यारोपण के दौरान फाइबर से बेदखल कर सकते हैं (चित्रा 1d). समस्याओं का सबसे आम कारण कई छोटे संस्करणों के अनुक्रमिक आवेदन के बजाय एकल बड़ी मात्रा के आवेदन से उठता है ।
  2. कोटिंग पतला ऑप्टिकल फाइबर फाइबर अक्ष के साथ अभिव्यक्ति ड्राइव करने के लिए
    1. पतला ऑप्टिकल फाइबर प्रत्यारोपण प्राप्त करें और चरण 4.1.2-4.1.8, सिवाय इसके कि पतला फाइबर laterally ऐसी है कि यह सुई लगानेवाला (चित्रा 2a) के लिए सीधा है तैनात है । पतला फाइबर के ऊपर सुई लगानेवाला स्थिति ।
      ध्यान दें: पतला फाइबर पर तरल बूंदों लोड हो रहा है चुनौतियों जोड़ा गया है, क्योंकि सतह तनाव बूंदों के कारण वापस इंजेक्शन पिपेट पर कूद या पतला फाइबर माइग्रेट करने के लिए जाता है । छोटे इंजेक्शन पिपेट (30-50 μm व्यास) इस समस्या से उबरने के लिए मदद लेकिन जोखिम है कि इंजेक्शन पिपेट रोकना होगा वृद्धि हुई है । सतह तनाव के कारण, बूंदों के सबसे बड़े सतह क्षेत्र के क्षेत्र का पालन करते हैं, तो इष्टतम इंजेक्शन पिपेट का आकार पतला फाइबर के आकार और सामयिक clog के लिए एक सहिष्णुता पर निर्भर है ।
    2. टेपर की शुरुआत में ऑप्टिकल फाइबर के पक्ष के खिलाफ रेशम/aav इंजेक्शन पिपेट की स्थिति । सुनिश्चित करें कि इंजेक्शन पिपेट ऑप्टिकल फाइबर को छू रहा है ।
    3. कोटिंग प्रक्रिया शुरू करने के लिए रेशम/aav के 20 nL को बाहर निकालें । सुनिश्चित करें कि छोटी बूंद ऑप्टिकल फाइबर का पालन करती है और फाइबर के इंटरफेस पर रहता है/ रेशम/aav dries (~ ४५ s) के रूप में फाइबर टिप के अंत की ओर धीरे से बाती बाती । पाइपेट टिप को कॉलेस्ट्रॉल से बचने के लिए सुखाने की छोटी बूंद के साथ संपर्क में इंजेक्शन पिपेट रखें ।
      नोट: प्रत्येक जमा पतला फाइबर (चित्रा 2b) के लगभग ४०० μm कोट चाहिए ।
    4. जब पहली बोल्स लगभग पूरी तरह से सूख गया है, एक और 20 nL बाहर निकालें और टेपर के साथ छोटी बूंद बाती जारी है ।
      नोट: तरल रेशम सूख रेशम का पालन करेंगे, छोटी बूंद के एक छोर लंगर के रूप में पिपेट के टेपर के साथ चलता है ।
    5. 4.2.4. aav की छोटी मात्रा को बाहर निकाल कर, और धीरे से हल को टेपर की ओर खींच कर, फिर से चरण में दोहराएं । 5-6 ejections एक २.५ मिमी टेपर की सतह को पार करने के लिए पर्याप्त हैं ।
    6. फाइबर के सभी पक्षों के आसपास और अधिक समान अभिव्यक्ति ड्राइव करने के लिए, फाइबर घुमाएँ और कदम 4.2.2-4.2.5 जब तक रेशम की वांछित राशि/
    7. अगर सूखे रेशम के एक फांसी का किनारा/aav फाइबर टिप से परे फैली हुई है, ध्यान से कैंची के साथ कतरा काट, या बेदखल पिपेट का उपयोग करने के लिए कतरा मोड़ वापस और यह फाइबर के टेपर का पालन करें ।
    8. प्रत्यारोपण चलती से पहले सुखाने के लिए 1 ज की अनुमति दें ।
    9. वैक्यूम 4 डिग्री सेल्सियस में रातोंरात desiccate । पूरे फेरूल होल्डर को वैक्यूम चैंबर में रखा जा सकता है ।
    10. एक उच्च शक्ति माइक्रोस्कोप के तहत परिणामी सिल्क फिल्म के आकार और स्थिति का मूल्यांकन करें ।
      नोट: फिल्मों पूरी तरह से वर्दी की जरूरत नहीं है, लेकिन समान नहीं होना चाहिए कि (चित्रा 3c) प्रत्यारोपण के दौरान आसपास के ऊतकों को नुकसान को कम करने के लिए फाइबर की सतह से परे अधिक से अधिक १०० μm का विस्तार करना चाहिए । फिल्म के आकार को कम करने के लिए, यह महत्वपूर्ण है कि प्रत्येक छोटी बूंद के बाद जमा किया जाता है पहले पूरी तरह से सूखा है ।
  3. कोटिंग मुस्कराते हुए लेन्स प्रत्यारोपण
    1. grin लेंस6,7 प्राप्त करें और चरण 4.1.2-4.1.8 दोहराएं । सुई लगानेवाला ऊपर रखा जा सकता है ।
    2. aav में एक एकल इजेक्शन (एक १.० मिमी व्यास लेंस के लिए 1 μl) जमा रेशम ।
      नोट: यह तरल का एक गुंबद निकलेगा जो लेंस के चेहरे का पालन करता है, और एक समान फिल्म (100-200 μm मोटी) का उत्पादन करने के लिए dries । हालांकि, घटना में है कि एक एकल बड़े इजेक्शन असमान dries और एक फिल्म है कि grin लेंस के किनारों के पास मोटा है पैदा करता है, कई छोटे बूंदों (100-200 nL) लेंस की सतह के केंद्र में जमा करने की कोशिश (प्रत्येक बूंद जमा करने से पहले सूखी करने की अनुमति अगले) यह सुनिश्चित करने के लिए कि फिल्म देखने के क्षेत्र के केंद्र में अभिव्यक्ति ड्राइव करेंगे ।
    3. प्रत्यारोपण चलती से पहले सुखाने के लिए 1 ज की अनुमति दें ।
    4. एक उच्च-शक्ति सूक्ष्मदर्शी के तहत परिणामी सिल्क फिल्म के आकार और स्थिति का मूल्यांकन यह सुनिश्चित करने के लिए कि फिल्म लेंस की सतह को कवर करती है ।
  4. कोटिंग ग्लास कपाल खिड़कियां
    1. दो 3 मिमी व्यास दौर coverslips (नंबर 1 मोटाई) के लिए एक 5 मिमी व्यास खिड़की के साथ ऑप्टिकल चिपकने वाला (विवरण के लिए, goldey एट अल. २०१४8) का पालन करके कांच कपाल खिड़कियां तैयार करें ।
    2. मिक्स सिल्क: 1:4 के अनुपात में वायरस फिल्म में सिल्क की कुल मात्रा को कम करने के लिए । रेशम की अत्यधिक मात्रा प्रत्यारोपण के बाद कपाल खिड़कियों के नीचे भंग नहीं करते हैं । अनुमापन प्रयोगों अनुपात और वांछित अभिव्यक्ति प्रोफ़ाइल देता है कि मात्रा निर्धारित करने के लिए आवश्यक हो सकता है.
    3. हाथ पिपेट एक 5 μl छोटी बूंद 3 मिमी (मस्तिष्क का सामना करना पड़) coverslip की सतह पर । पूरी कांच की सतह को ढकने के लिए छोटी बूंद को फैलाना चाहिए (चित्र 3) ।
    4. windows ले जाने से पहले सुखाने के लिए 2-3 h की अनुमति दें ।

5. रेशम/aav-लेपित प्रत्यारोपण भंडारण

  1. एक ठंडा वैक्यूम desiccator (~ १२५ torr, 4 डिग्री सेल्सियस) का उपयोग करने से पहले (चित्रा 4a) में सिल्क/aav-लेपित ऑप्टिकल फाइबर स्टोर ।
  2. वैक्यूम के तहत कपाल खिड़कियां और ग्रिन लेंस को स्टोर न करें, क्योंकि वैक्यूम के तहत संग्रहित बड़ी सिल्क फिल्में प्रत्यारोपण के बाद पूरी तरह से भंग करने में विफल हो जाती हैं । प्रत्यारोपण कपाल खिड़कियां और grin लेंस तुरंत सुखाने के बाद, या निर्माण के एक दिन के भीतर अगर वायुमंडलीय दबाव और 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत ।

6. उपकरणों का रोपण

  1. पहले वर्णित के रूप में प्रत्यारोपण सर्जरी के लिए जानवरों को तैयार4.
    1. संक्षेप में, ketamine के एक intraperitoneal इंजेक्शन के साथ चूहों एनेस्थेटिज/xylazine (100/10 मिलीग्राम/किग्रा) और एक सौंय पैर की अंगुली चुटकी का उपयोग संज्ञाहरण की गहराई की जांच करें । प्रत्यारोपण के क्षेत्र में खोपड़ी दाढ़ी और आयोडीन और शराब के साथ खोपड़ी साफ ।
    2. एक stereotaxic डिवाइस में माउंट जानवरों और ऑक्सीजन और आइसोफ्लूरेन (1-2%) के मिश्रण का उपयोग संज्ञाहरण पूरक । ब्याज के क्षेत्र में खोपड़ी में एक चीरा बनाओ, और एक craniotomy प्रदर्शन काफी बड़ी प्रत्यारोपण को समायोजित करने के लिए ।
  2. प्रत्यारोपण ऑप्टिकल फाइबर9 और microendoscope लेंस पहले प्रकाशित प्रक्रियाओं के अनुसार10 . देखभाल के साथ प्रत्यारोपण संभाल, के रूप में रेशम/aav जमा एक अपूर्ण craniotomy द्वारा खटखटाया जा सकता है, या खोपड़ी के किनारे पर पकड़ने प्रत्यारोपण द्वारा । मस्तिष्क में प्रत्यारोपण कम धीरे (~ 2 मिमी/।
  3. प्रत्यारोपण कपाल खिड़कियों के रूप में पहले से8का वर्णन । खिड़की के लेपित पक्ष को स्पर्श न करें और यदि गैवेज का प्रदर्शन कर रहे हैं, तो खिड़की को तरल पदार्थ के साथ धोने से बचें, क्योंकि यह वायरस को धो सकता है । अधिकतम अभिव्यक्ति प्राप्त करने के लिए, एक durotomy प्रदर्शन.

7. अभिव्यक्ति का मूल्यांकन और समस्या निवारण

  1. वायरल व्यक्त प्रोटीन की अभिव्यक्ति का मूल्यांकन करने के लिए, ~ 2-3 सप्ताह वायरस अभिव्यक्ति ड्राइव करने के लिए अनुमति देते हैं, तो 4% पैराफॉर्मेल्डिहाइड फॉस्फेट buffered खारा समाधान11 और प्रक्रिया मस्तिष्क ऊतक के साथ intracardial छिड़काव फ्लोरोसेंट के लिए प्रदर्शन माइक्रोस्कोपी12.
  2. प्रतिदीप्त माइक्रोस्कोपी का उपयोग कर छवि को फ्लोरोफोरे-टैग किए गए ऑप्टोजेनेटिक प्रोटीन की अभिव्यक्ति पैटर्न का मूल्यांकन करें ।
  3. यदि अभिव्यक्ति का स्तर अपर्याप्त है, तो या तो रेशम/aav कोटिंग की कुल मात्रा में वृद्धि, या अधिमानतः एक उच्च अनुमापांक वायरस का उपयोग करके कोटिंग्स में वायरस की मात्रा में वृद्धि ।

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Representative Results

अभिव्यक्ति ड्राइविंग में रेशम/aav फिल्मों की सफलता का आकलन करने के लिए, हम रोपण और ब्याज के क्षेत्र से तैयार मस्तिष्क स्लाइस के बाद जानवरों 2-3 सप्ताह perfused । फ्लोरोफोरे-टैग किए गए ऑप्टोजेनेटिक प्रोटीन (ChR2-yfp) की प्रतिदीप्ति छवियां अभिव्यक्ति की सीमा (चित्र 1d) का एक माप प्रदान करते हैं । विशिष्ट ऑप्टिकल फाइबर (२३० μm व्यास) आसानी से कर सकते हैं समायोजित २०० nL of रेशम/aav. अभ्यास के साथ, experimenters प्रत्यारोपित फाइबर की नोक के आसपास अत्यधिक विश्वसनीय अभिव्यक्ति प्राप्त कर सकते हैं (चित्रा 5).

रेशम/aav-लेपित कपाल खिड़कियों से प्रेरित अभिव्यक्ति का आकलन करने के लिए, इमेजिंग शुरू 7-10 दिन प्रत्यारोपण के बाद शुरुआत । हम दृश्य के लिए दो photon इमेजिंग का इस्तेमाल किया है, लेकिन अन्य तरीकों जैसे एक सीसीडी के साथ प्रतिदीप्ति इमेजिंग भी इस्तेमाल किया जा सकता है. लेपित कपाल खिड़कियों के साथ दो संभावित मुद्दों अपर्याप्त अभिव्यक्ति, और रेशम फिल्मों को भंग करने और देखने के क्षेत्र अस्पष्ट विफल रहे हैं । अभिव्यक्ति को बढ़ाने के लिए, हम एक durectomy प्रदर्शन करने से पहले खिड़की प्रत्यारोपित करने का सुझाव है, और/या फिल्म में वायरस की मात्रा में वृद्धि । हमने क्रमशः रेशम और स्टॉक-टिटर आव के 1:4 मिश्रण का उपयोग करते हुए सर्वश्रेष्ठ अभिव्यक्ति हासिल की । हालांकि यह एक काफी बड़ी संख्या में वायरल कणों की तुलना में आमतौर पर stereotaxic इंजेक्शन में उपयोग किया जाता है का प्रतिनिधित्व करता है, कम शल्य समय वायरस की सीमांत अतिरिक्त लागत काउंटर । इस बीच, अगर सिल्क फिल्मों खिड़की के नीचे भंग करने में विफल, आगे की मात्रा को कम करने के लिए खिड़की कोट के लिए इस्तेमाल किया । लेपित खिड़कियों में रेशम की कुल राशि फाइबर प्रत्यारोपण पर की तुलना में 10-100 गुना अधिक है, और फिल्म कम ऊतक में एम्बेडेड है और इस प्रकार की तुलना में रेशम फिल्मों को भंग कर सकते हैं proteolytic गतिविधि के एक ही स्तर को उजागर नहीं किया जा सकता है13. हालांकि, कुछ रेशम की उपस्थिति विंडोज3के नीचे अभिव्यक्ति प्राप्त करने के लिए आवश्यक है, क्योंकि अकेले वायरस से बनी एक फिल्म सर्जरी के दौरान अंतरालीय द्रव से दूर धोया जाता है ।

Figure 1
चित्रा 1: ऑप्टिकल फाइबर के लिए रेशम/aav फिल्मों लागू करने । (क) जीर्ण फाइबर प्रत्यारोपण एक धारक (इनसेट) एक XYZ अनुवादक पर चढ़कर में फाइबर साइड नीचे रखा जाता है । फाइबर के नीचे एक निश्चित माइक्रोइंसेक्टर रेशम को वितरित करता है/ एक त्रिविमदर्शी प्रक्रिया के दृश्य की अनुमति देता है । (ख) छोटे खंडों (10-20 nL) में फाइबर युक्तियों के लिए रेशम/aav लागू करें । एक बोल्स बाहर निकालने के बाद, पिपेट वापस लेना और एक फ्लैट फिल्म के लिए सूखी छोटी बूंद के लिए ~ ६० एस की अनुमति दें । प्रक्रिया को दोहराएं जब तक आवश्यक मात्रा फाइबर टिप करने के लिए लागू किया गया है । (ग) रेशम कोटिंग्स का निरीक्षण करें । इष्टतम कोटिंग्स फाइबर टिप पर केंद्रित किया जाना चाहिए (बाएं), जबकि अनुचित कोटिंग्स फाइबर चेहरे से बाहर का विस्तार उन्हें अधिक फाइबर से बेदखल करने के लिए प्रवण बनाने (दाएँ). (घ) प्रतिनिधि फाइबर के २०० nL के साथ लेपित रेशम/aav, और परिणामस्वरूप aav संचालित ChR2-yfp अभिव्यक्ति 2 सप्ताह प्रत्यारोपण के बाद । बाईं ओर कॉम्पैक्ट रेशम/aav कोटिंग मजबूत अभिव्यक्ति के परिणामस्वरूप, जबकि सही पर कोटिंग फाइबर का सामना पिछले protruded और लगभग कोई अभिव्यक्ति की संभावना है, क्योंकि रेशम/aav का पालन नहीं किया ऑप्टिकल फाइबर प्रत्यारोपण के दौरान । स्केल पट्टियां ०.२ मिमी (फाइबर) और १.० मिमी (मस्तिष्क स्लाइस) । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए ।

Figure 2
चित्रा 2: कोटिंग पतला फाइबर प्रत्यारोपण के लिए सेटअप. (क) सूक्ष्म सुई लगानेवाला फाइबर धारक के ऊपर घुड़सवार है, और पतला फाइबर इजेक्शन सिरिंज के लिए orthogonally तैनात हैं । (ख) व्यापक बिंदु पर शुरू (इनसेट) और छोटे खंड बाहर निकलें, जबकि टेपर के बिंदु की ओर इजेक्शन सिरिंज चलती । यह तापर की लंबाई के साथ एक सतत कोटिंग में परिणाम है । (ग) प्रतिनिधि पतला रेशम के साथ लेपित फाइबर के साथ मिश्रित तेजी से हरे दृश्य में सहायता करने के लिए । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए ।

Figure 3
चित्रा 3: कोटिंग कपाल खिड़कियां । aav एक हाथ pipette का उपयोग कर कपाल खिड़कियों लागू किया जा सकता है । एक मानक 3 मिमी व्यास खिड़की एक 5 μl छोटी बूंद के साथ लेपित किया जा सकता है, जो धीरे से एक फ्लैट फिल्म के लिए सूख जाएगा । इनसेट: GCaMP6f की अभिव्यक्ति जिसके परिणामस्वरूप रेशम/aav-लेपित कपाल खिड़कियों के साथ और बिना durectomies प्रत्यारोपित । यह आंकड़ा jackman एट अल से अनुकूलित किया गया है । (२०१८) 3. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए ।

Figure 4
चित्रा 4: रेशम/aav लेपित प्रत्यारोपण भंडारण । (क) अवशिष्ट नमी को दूर करने और वायरल प्रभावकारिता को संरक्षित करने के लिए, प्रत्यारोपण 4 डिग्री सेल्सियस पर वैक्यूम के तहत संग्रहीत किया जाना चाहिए जब तक इस्तेमाल किया । प्रत्यारोपण इस तरह से संग्रहीत कम 7 दिनों के लिए व्यवहार्य रहते हैं । (इ) 4 रेशम/आव लेपित तंतुओं से उत्पन्न अभिव्यक्ति, भंडारण के 7 दिनों के बाद प्रत्यारोपित की जाती है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए ।

Figure 5
चित्रा 5: सिल्क/aav-gfp लेपित ऑप्टिकल फाइबर मज़बूती से अभिव्यक्ति ड्राइव । लगातार 24 स्ट्राइटल प्रत्यारोपण से स्लाइस की फ्लोरोसेंट छवियों । प्रत्येक प्रत्यारोपण 1:1 रेशम/aav-gfp के 100-400 nL के साथ लेपित किया गया था । प्रत्यारोपण के इस सहगण रेशम की क्षमता प्रत्यारोपण साइट के लिए अभिव्यक्ति को प्रतिबंधित करने के लिए इंगित करता है (इस मामले में पृष्ठीय striatum). gfp प्रतिदीप्ति हरे रंग में दर्शाया गया है; dapi धुंधला नीले रंग में दिखाया गया है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए ।

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Discussion

aav का उपयोग रेशम/optogentic प्रोटीन की अभिव्यक्ति को लक्षित करने के दृष्टिकोण है कि वर्तमान में उपयोग में है की सीमाएं काबू । हालांकि कई अध्ययनों सफलतापूर्वक aav इंजेक्शन का उपयोग करने के लिए optogenetic प्रोटीन व्यक्त, यह ऑप्टिकल फाइबर की नोक करने के लिए अभिव्यक्ति संरेखित करने के लिए चुनौतीपूर्ण है, पतला फाइबर की लंबाई के आसपास क्षेत्रों के लिए, और एक मुस्कराते हुए लेंस के देखने के क्षेत्र के लिए. क्योंकि ऑप्टिकल घटकों और optogenetic अभिव्यक्ति के बीच misalignment के, stereotaxic इंजेक्शन अविश्वसनीय हो सकता है, और कई प्रयोग विफल । सिल्क/aav लेबलिंग विधि हम यहां का वर्णन इस समस्या को हल करती है । यह भी एक दूसरी शल्य चिकित्सा कदम को नष्ट करने और कुछ मामलों में एक दूसरे शल्य चिकित्सा के लिए की जरूरत को नष्ट करने से प्रक्रिया को सरल बनाता है । यह भी मुश्किल हो सकता है कि कपाल खिड़कियों के नीचे व्यापक अभिव्यक्ति प्राप्त करने के लिए वायरस का उपयोग करें, और प्रयोगकर्ता आमतौर पर कई स्थानों में वायरस इंजेक्ट करने के लिए लंबी सर्जरी करते हैं । बस रेशम के साथ कपाल खिड़कियों कोटिंग द्वारा बड़े cortical क्षेत्रों पर व्यापक अभिव्यक्ति प्राप्त करने की क्षमता/aav एक सरलीकरण है कि कई आक्रामक इंजेक्शन के लिए की जरूरत eliminates ।

रेशम/aav विधि का एक और संभावित लाभ यह है कि यह वायरल इंजेक्शन की तुलना में तंत्रिका ऊतकों में कम सूजन पैदा हो सकता है । मस्तिष्क में उच्च टिटर aav इंजेक्शन ऐसे प्रतिक्रियाशील astrocytosis कि सेलुलर और सर्किट गुण14,15 को बदलने की क्षमता है के रूप में भड़काऊ प्रतिक्रियाओं का कारण बन सकता है (हालांकि इस तरह के संभावित जटिलताओं आमतौर पर कर रहे हैं नजरअंदाज कर दिया) । सिल्क फिल्मों के अपने13 और रेशम/aav फिल्मों पर थोड़ा immunogenic प्रतिक्रिया प्रेरित करने के लिए कई घंटे या16दिनों के दौरान वायरस जारी है, जो आसपास के ऊतकों में वायरल लोड कम कर सकते है और immunogenic प्रतिक्रियाओं को कम करने की उंमीद कर रहे हैं । पारंपरिक तरीकों में जो एक डिवाइस के प्रत्यारोपण एक aav इंजेक्शन से पहले है, भड़काऊ प्रतिक्रियाओं दोनों प्रत्यारोपण और इंजेक्शन से उत्पन्न कर सकते हैं. भविष्य में इसे व्यवस्थित रूप से पारंपरिक दृष्टिकोण और रेशम/aav विधि की तुलना करने के लिए निर्धारित करना वांछनीय होगा कि क्या रेशम/aav फिल्मों समग्र भड़काऊ प्रतिक्रियाओं को कम कर देता है ।

कई कदम रेशम/aav फिल्मों के सफल उपयोग के लिए महत्वपूर्ण हैं । सबसे महत्वपूर्ण बात, ऑप्टिकल फाइबर की कोटिंग सावधानी के रूप में तरीकों में वर्णित किया जाना चाहिए और सूखे फिल्मों का स्थान ध्यान से एक खुर्दबीन के तहत दृश्य निरीक्षण द्वारा मूल्यांकन किया जाना चाहिए सुनिश्चित करें कि फिल्मों कॉंपैक्ट हैं, सही स्थान में, और ऑप्टिकल फाइबर के चेहरे का पालन करें । ऑप्टिकल फाइबर के किनारों पर किसी भी रेशम/aav ब्याज के क्षेत्र के बाहर अभिव्यक्ति के लिए नेतृत्व करेंगे, और कि फाइबर के चेहरे से परे बाहर का पौधा प्रत्यारोप के दौरान टूट सकता है और अविश्वसनीय या कोई अभिव्यक्ति के लिए नेतृत्व misshaped फिल्मों । जिन तकनीकों का वर्णन हम सिल्क/aav को इम्प्लांटेबल उपकरणों के लिए करते हैं, वे किसी भी सामग्री के उपयोग के लिए अनुकूलित किए जा सकते हैं जो आसानी से उपलब्ध हैं और रेशम की छोटी मात्रा के सटीक जमाव की अनुमति देते हैं ।

अभ्यास के एक बिट के लिए सटीक, पुनरुद्दनीय परिणाम प्राप्त करने की आवश्यकता है । यदि फाइबर के ट्रैक के साथ एक्सप्रेशन मनाया जाता है, तो संभावना है कि सिल्क फिल्म फाइबर चेहरे के बजाय फाइबर की तरफ सूख जाती है । विनिर्माण प्रक्रिया को दोहराएं और बारीकी से संकेत के लिए सूख प्रत्यारोपण का निरीक्षण है कि फिल्मों फाइबर के पक्ष में सूख रहे हैं । क्योंकि रेशम/aav फिल्मों ऑप्टिकली पारदर्शी हैं, यह रंग के साथ मिश्रित रेशम लागू करने के लिए अभ्यास करने में मदद कर सकते हैं (तेजी से हरे या एक समान डाई) बेहतर परिणामी फिल्मों के आकार कल्पना करने के लिए (चित्रा 2c). अगर कोई अभिव्यक्ति है, यह संभव है कि रेशम फिल्म प्रत्यारोपण के दौरान फाइबर टिप से उखाड़ फेंकना । हमारा सुझाव है कि प्रत्यारोपण करते समय स्टॉक-टीटर वायरस का उपयोग करें । ऑप्टिकल फाइबर के लिए, यह छोटे व्यास फाइबर के लिए लागू किया जाना चाहिए कि कुल मात्रा कम कर देता है. यदि कोटिंग का आकार एक चिंता का विषय है एक 10 nL आवेदन के बीच अब इंतज़ार कर जमा छोटी बूंद के पूर्ण सुखाने की अनुमति पर विचार करें । रेशम/aav बूंदों एक गर्म दीपक के तहत तेजी से सूखी । कपाल खिड़कियों के लिए, हाई-टिटर वायरस पिया या बाडी भर में पर्याप्त वायरल लोड की आपूर्ति करने के लिए आवश्यक हो सकता है । प्रत्यारोपण के कुछ प्रकार के रेशम भंग और दूसरों की तुलना में अधिक आसानी से aav जारी कर सकते हैं । हमने पाया है कि कपाल मस्तिष्क की सतह पर प्रत्यारोपित खिड़कियों के एक कम अनुपात की आवश्यकता होती है रेशम/वायरस विश्वसनीय अभिव्यक्ति प्राप्त करने के लिए, शायद विभिन्न सेरेब्रल रीढ़ की हड्डी द्रव गतिशीलता या प्रोटीज गतिविधि के कारण. यदि अभिव्यक्ति प्रभावी aav सांद्रता बढ़ाने के द्वारा नहीं बढ़ाया जा सकता है, जलीय रेशम की मात्रा को कम करने के लिए एक प्रशंसनीय विकल्प है ।

अंत में, यह महत्वपूर्ण है के लिए ऑप्टिकल घटकों को ठीक से स्टोर और उंहें प्रत्यारोपण काफी जल्द ही वे तैयार कर रहे है के बाद । हमें पता चला है कि लेपित फाइबर कि वैक्यूम के तहत फ्रिज कर रहे हैं कई दिनों के लिए उपयोग करने से पहले संग्रहीत किया जा सकता है । वैक्यूम भंडारण अवशिष्ट नमी निकालता है17 जो सिल्क फिल्मों की घुलनशीलता को कम कर सकते हैं, और वायरल प्रभावकारिता को बनाए रखने में भी मदद करते हैं । आदर्श रूप में, ऑप्टिकल फाइबर छलरचना के 24 घंटे के भीतर प्रत्यारोपित किया जाना चाहिए । हालांकि, हम पाते है कि रेशम/aav-लेपित फाइबर के अंतर्गत संग्रहित वैक्यूम ड्राइव अभिव्यक्ति के समान स्तर जब प्रत्यारोपण (चित्रा 4b) के बाद 7 दिन प्रत्यारोपित । इसके विपरीत, लेपित कपाल खिड़कियां और मुस्कराते हुए लेंस ने सबसे विश्वसनीय अभिव्यक्ति चलाई जब वे कमरे के तापमान पर सूख गए और तैयारी के घंटों के भीतर इस्तेमाल किया । इस असमानता का कारण स्पष्ट नहीं है । आगे के अध्ययन के लिए तैयार और भंडारण की स्थिति को परिष्कृत करने के लिए और अधिक भंडारण समय विस्तार की जरूरत हो सकती है ।

रेशम/aav-लेपित कपाल खिड़कियों काफी क्षमता है क्योंकि वे तेजी से शल्य चिकित्सा के समय छोटा है और निर्माण के लिए अत्यंत सरल कर रहे हैं, लेकिन वर्तमान में इस विधि की सीमाएं हैं । लेपित कपाल विंडोज़ समान रूप से प्रांतस्था के बड़े क्षेत्रों लेबल और gcamp इमेजिंग के लिए परत 2/3 में पर्याप्त अभिव्यक्ति ड्राइव, गहरी परतों में कुछ हद तक कम अभिव्यक्ति के साथ । हालांकि, stereotaxic इंजेक्शन और अधिक मजबूत अभिव्यक्ति ड्राइव और अभिव्यक्ति के लिए लक्षित परतों पर अधिक नियंत्रण प्रदान करते हैं । विश्वसनीय अभिव्यक्ति तभी हासिल हुई जब बाडी को हटा दिया गया । हालांकि ड्यूरा अक्सर कई 2-फोटॉन इमेजिंग प्रयोगों के लिए छवि गुणवत्ता8में सुधार करने के लिए हटा दिया जाता है, कई प्रयोगों के लिए यह एक कम आक्रामक तरीके से लेबलिंग प्राप्त करने के लिए वांछनीय है । इसलिए हमने ड्यूरा को हटाने के बिना कॉर्टिकल क्षेत्रों को लेबल करने के लिए रेशम/aav का उपयोग करने की हमारी क्षमता का पता लगाया है । हम कुछ लेबलिंग प्राप्त है, लेकिन यह संभव है कि यह craniotomy तैयार करने की प्रक्रिया में बाडी को नुकसान पहुँचाने का एक परिणाम था. आगे अध्ययन लेपित कपाल खिड़कियों के लिए मज़बूती से ड्यूरा को हटाने के बिना कॉर्टेक्स लेबल के लिए इस्तेमाल किया जा करने के लिए की जरूरत है ।

bombyx मोरी के कोकून से जलीय रेशम फाइब्रोइन की तैयारी rockwood एट अल में विस्तार से वर्णन किया गया है । (२०११) 18. जलीय रेशम फाइब्रोइन अब व्यावसायिक रूप से उपलब्ध है (5% w/ हालांकि हमारे प्रयोगों के अधिकांश हमारी प्रयोगशाला में तैयार जलीय रेशम फाइब्रोइन स्टॉक का उपयोग कर प्रदर्शन किया गया (5-7.5% w/, हम इसी तरह के परिणाम प्राप्त किया है वाणिज्यिक जलीय फाइब्रोइन का उपयोग कर । जलीय फाइब्रोइन 4 डिग्री सेल्सियस पर 3 महीने के लिए स्थिर है, जिसके बाद यह अनायास तरल से हाइड्रोजेल18के लिए संक्रमण । हम अनुशंसा करते हैं कि फाइब्रोइन स्टॉक्स को ~ 1 मिलीलीटर एलिक्वेट में बांटा जाए और-८० डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जाए । एक 1 मिलीलीटर काम aliquot (प्रत्यारोपण के सैकड़ों कोटिंग के लिए पर्याप्त) 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है और जब तक यह जेल शुरू होता है । सावधान रहो, नहीं हिला भंवर, आंदोलन या आक्रामक पिपेट जलीय फाइब्रोइन, कतरें बलों के रूप में19,20गेलेशन के लिए नेतृत्व कर सकते हैं ।

रेशम/aav फिल्म एक छोटे व्यास ऑप्टिकल फाइबर की नोक पर सटीक subcortical अभिव्यक्ति के लिए, कपाल खिड़कियों के तहत व्यापक cortical अभिव्यक्ति से, अभिव्यक्ति पैटर्न की एक विस्तृत श्रृंखला की अनुमति । इन तकनीकों को आम aav अभिव्यक्ति वैक्टर का लाभ लेने के लिए विकसित किए गए थे, लेकिन संभावना को मस्तिष्क में या रेबीज वायरस की तरह अंय अभिव्यक्ति वैक्टर फैलाने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । रेशम फिल्मों को भी तीन आयामी आकार में निर्मित किया जा सकता है ऊतक में वायरल रिलीज में सुधार होगा । उदाहरण के लिए, आदेश में एक durotomy के उपयोग के बिना cortical खिड़कियों के नीचे मजबूत अभिव्यक्ति ड्राइव करने के लिए, कपाल खिड़कियों रेशम microneedles की सरणियों के साथ लेपित किया जा सकता है कि बाडी और रिहाई के वायरस गहरी cortical परतों में घुसाना होगा21. आगे शोधन की संभावना वायरस रिहाई के गुणों में सुधार के लिए नेतृत्व करेंगे, और रेशम के लिए नए अनुप्रयोगों/

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Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

लेखकों के चित्र के लिए जे vazquez शुक्रिया अदा करना चाहते हैं, डी kaplan और अभिकर्मकों और सहायक मार्गदर्शन के लिए सी. preda, और बी के लिए sabatini और सी. हार्वे के लैब्स में vivo इमेजिंग । माइक्रोस्कोपी को एम. ओकाना और न्यूरोबायोलॉजी इमेजिंग सेंटर द्वारा संभव बनाया गया था, जो न्यूरल इमेजिंग सेंटर द्वारा न्यूरोलॉजिकल विकारों और स्ट्रोक (ninds) P30 कोर सेंटर ग्रांट (NS072030) के एक राष्ट्रीय संस्थान के हिस्से के रूप में समर्थित है । यह काम gvr खोदादाद परिवार फाउंडेशन द्वारा समर्थित किया गया था, नैन्सी lurie मार्क्स फाउंडेशन, और nih अनुदान द्वारा, ninds R21NS093498, U01NS108177 और ninds R35NS097284 डब्ल्यू जी आर करने के लिए, और एक nih postdoctoral फैलोशिप F32NS101889 द्वारा c.h.c.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Aqueous silk fibroin Sigma 5154-20ML Aqueous Silk Fibroin (5% w/v) for making films
Microinjector to deposit silk/AAV Drummond 3-000-207 Nanoject III nanoliter injector
Manipulator to hold implants Narashige MM-33 Micromanipulator
Stereoscope to visualize silk deposits AmScope SM-6TX-FRL 3.5X-45X Trinocular articulating zoom microscope with ring light
Vacuum chamber to store implants Ablaze N/A 3.5 Quart Vacuum Vac Degassing Chamber
Optional, implant holder for storage N/A N/A To store premade optical fibers, drill a grid of ~4 mm-deep holes with a diameter just larger than the ferrule diameter into a plastic block.
Optical fiber Thorlabs FT200EMT Ø200 µm Core Multimode Optical Fiber for fiber implants
Ferrules Kientec FZI-LC-230 LC Zirconia Ferrule for fiber implants
Various materials for manufacturing chronic fiber implants Various N/A For detailed procedure, see Ung K, Arenkiel BR. Fiber-optic implantation for chronic optogenetic stimulation of brain tissue. Journal of visualized experiments: JoVE. 2012(68).
Tapered fiber implants Optogenix Lambda-B Tapered fiber implants
GRIN lenses GoFoton CLH-100-WD002-002-SSI-GF3 GRIN lenses
Small glass cranial windows Warner 64-0726 (CS-3R-0) Small round cover glass, #0 thickness
Large glass cranial windows Warner 64-0731 (CS-5R-0) Small round cover glass, #0 thickness
Various materials for manufacturing cranial windows Various N/A For detailed procedure, see Goldey GJ et al. Removable cranial windows for long-term imaging in awake mice. Nature protocols. 2014 Nov;9(11):2515.

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References

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तंत्रिका विज्ञान अंक १४४ तंत्रिका विज्ञान ऑप्टोजेनेटिक्स stereotaxic सर्जरी रेशम फाइब्रोइन ऑप्टिकल फाइबर कैल्शियम इमेजिंग कपाल खिड़कियां ।
<em>Vivo में</em> रेशम/aav फिल्मों का उपयोग कर optogenetic प्रोटीन की लक्षित अभिव्यक्ति
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Jackman, S. L., Chen, C. H., Regehr, … More

Jackman, S. L., Chen, C. H., Regehr, W. G. In Vivo Targeted Expression of Optogenetic Proteins Using Silk/AAV Films. J. Vis. Exp. (144), e58728, doi:10.3791/58728 (2019).

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