Summary
Aqui, apresentamos um método de distribuição de vetores de expressão viral no cérebro usando filmes de seda da fibroína. Esse método permite que o alvo entrega de vetores de expressão usando windows cranianas, cônico de fibras ópticas e fibras ópticas revestidas de seda/AAV.
Abstract
A busca da compreensão de circuitos neurais como informações do processo em ordem à saída comportamental de unidade tem sido grandemente ajudadas pela recentemente desenvolvidos métodos ópticos para manipular e monitorar a atividade de neurônios em vivo. Esses tipos de experiências dependem de dois componentes principais: 1) implantáveis dispositivos que fornecem acesso óptico para o cérebro e proteínas 2) sensíveis à luz que fornecem uma leitura da atividade neuronal ou alterar a excitabilidade neuronal. Há um número de maneiras de expressar proteínas sensíveis à luz, mas injeção estereotáxica de vetores virais é atualmente a abordagem mais flexível, porque a expressão pode ser controlado com precisão temporal, genética e anatômica. Apesar da grande utilidade de vetores virais, entregando o vírus para o site de implantes óptico poses inúmeros desafios. Injeções de vírus estereotáxica exigem cirurgias que aumentam o tempo cirúrgico, aumentam o custo dos estudos e representam um risco para a saúde do animal. O tecido circundante pode ser fisicamente danificado pela seringa de injeção e por imunogênica inflamação causada pela entrega abrupta de uma cápsula de alta concentração de vírus. Alinhar as injeções com implantes ópticos é especialmente difícil quando o direcionamento de pequenas regiões profundas no cérebro. Para superar estes desafios, nós descrevemos um método para revestir vários tipos de implantes ópticos com filmes compostos de seda da fibroína e Adeno-associado vetores virais de (AAV). Fibroin, um polímero derivado de Bombyx mori, o casulo pode encapsular e proteger biomoléculas e podem ser transformadas em formas que variam de filmes solúveis a cerâmica. Quando implantado no cérebro, revestimentos de seda/AAV liberar o vírus na interface entre os elementos de óptica e o cérebro circundante, dirigindo a expressão precisamente onde é necessário. Este método é facilmente implementado e promete facilitar grandemente na vivo estudos da função do circuito neural.
Introduction
Na última década tem produzido uma explosão de engenharia proteínas sensíveis à luz para monitoramento e manipulação neural atividade1. Vírus para oferecer incomparável flexibilidade para expressar essas ferramentas optogenetic no cérebro. Em comparação com animais transgénicos, vírus são muito mais fáceis de produzir, transportar e armazenar, permitindo a rápida implementação das ferramentas do mais novos optogenetic. Expressão pode ser alvo geneticamente distintas populações neuronal, e vírus projetados para o transporte retrógrado ainda podem ser usados para direcionar a expressão baseada na conectividade neuronal2.
Vírus são normalmente introduzidas com injeções estereotáxicos, que podem ser demorado e desafiador. Precisamente como alvo pequenas regiões pode ser difícil, enquanto expressão de condução sobre grandes áreas muitas vezes requer muitas injeções. Além disso, quando um dispositivo óptico é posteriormente implantado no cérebro para fornecer luz na vivo, o implante deve ser alinhado com a injeção de viral. Aqui, descrevemos um método facilmente implementados para a entrega de vetores virais para o tecido em torno de um dispositivo implantado usando seda da fibroína filmes3. Fibroin seda é bem tolerado pelos tecidos neurais, comercialmente disponível e pode ser usado para produzir materiais com propriedades variadas. Filmes de seda podem ser aplicadas aos implantes utilizando equipamentos comuns de laboratório como pipetas microinjeção ou pipetas de mão. Filmes de seda/AAV eliminam a exigência de dois procedimentos cirúrgicos e garantir que a expressão mediada por vírus está corretamente alinhado ao implante óptico. A expressão resultante é restrito à ponta das fibras e resulta em menos expressão indesejado ao longo da trilha de fibra do que injeções estereotáxicos.
Além de produzir alvo expressão na ponta de pequenas fibras, filmes de seda/AAV podem ser usados para conduzir generalizada (> 3 mm de diâmetro) expressão cortical sob windows cranianas. Na vivo imagem 2-fóton de sensores fluorescente atividade tornou-se uma ferramenta indispensável para avaliar o papel da atividade neuronal na condução do processamento sensorial e cognitivo. No entanto, para conduzir uniforme expressão sobre as áreas corticais amplas, experimentadores frequentemente executar múltiplas injeções. Essas injeções podem ser extremamente demoradas e podem levar a expressão inconsistente do outro lado do campo de visão. Em contraste, seda/AAV-revestido cranianas windows são extremamente fáceis de fabricar, reduzir significativamente o tempo necessário para cirurgias e dirigir mais notavelmente a expressão centenas de micra abaixo da superfície cortical.
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Protocol
Todos os experimentos envolvendo animais foram realizados em conformidade com os protocolos aprovados pela Harvard Comité permanente Cuidado Animal, seguir as orientações descritas no NIH nos guia para o cuidado e o uso de animais de laboratório. Ratos de C57BL/6 adultos de ambos os sexos (6-15 semanas de idade) foram usados para todos os experimentos.
1. obter aquosa da fibroína de seda
- Preparar ou comprar aquosa da fibroína de seda (5-7,5% p/v).
2. mistura aquosa seda com vetores de expressão de AAV
- Escolha um vetor de expressão de AAV para conduzir a proteína optogenetic ou fluorescente indicador de escolha.
Nota: Para minimizar o volume de seda/AAV que devem ser aplicada aos implantes durante a condução ainda expressão robusto, estoque-título AAV (ações títulos normalmente obtidos de núcleos de vetor são em torno de 10 ~13 gc/mL) é recomendado. - Imediatamente antes do revestimento de implantes, descongelar uma alíquota de AAV e combinar com 5-7,5% aquosa seda da fibroína (esta mistura será referida como seda/AAV). Em um tubo PCR 200 µ l, misture fibroin aquosa e vírus adeno-associados na proporção de 1:1 (para uso de windows craniana 1:4) imediatamente antes da aplicação. Pipete suavemente a solução dentro e para fora várias vezes para homogeneizar completamente o fibroin e AAV.
- Manter a mistura de seda/AAV no gelo antes de usar.
3. preparar o equipamento para fabricação e armazenamento de dispositivos de seda/AAV-revestido
- Adquirir equipamentos para fibras ópticas de revestimento e lentes degradê-índice (sorriso) (figuras 1, 2).
- Construa um suporte estável virola. Para segurar a cerâmicas virolas, furos 1,25 milímetros em um bloco de acrílico de folha ¼". Toque em buracos para inserir os parafusos do lado para prender virolas no lugar.
Nota: Qualquer braçadeira pode ser usada para essa finalidade. - Posicione o manipulador com precisão de milímetros sub para mover as fibras ópticas (aparelho estereotáxica ou outro micromanipulador de precisão).
- Monte um suporte estável para posicionar o microinjector.
- Use um estereoscópio, para visualizar as fibras ópticas e gotículas de seda.
- Coloque uma fonte de luz para iluminar as fibras ópticas.
- Construa um suporte estável virola. Para segurar a cerâmicas virolas, furos 1,25 milímetros em um bloco de acrílico de folha ¼". Toque em buracos para inserir os parafusos do lado para prender virolas no lugar.
- Prepare o equipamento para revestimento de janelas cranianas (Figura 3).
- Escolha qualquer pipeta P10.
- Obter um recipiente com tampa.
Nota: Qualquer recipiente com uma parte inferior do silicone é sugerido — fundo macio facilita levantando windows cranianas.
- Prepare o equipamento para armazenar acabados implantes (Figura 4).
- Obter uma pequena câmara de vácuo (L. 1-5).
- Certifique-se de que não há espaço para armazenar implantes em um frigorífico de 4 ° C.
4. aplicar filme de seda/AAV aos dispositivos
- Fibras ópticas de revestimento a expressão focal de unidade na ponta de fibra
- Prepare a fibra crônica implantes como descrito anteriormente,4.
- Antes do uso, enxágue implantes com etanol e, em seguida, com água ultrapura para garantir que as fibras ópticas são limpas.
Nota: Filmes de seda aderirem mais confiável para limpar as superfícies de vidro. - Prepare um dispositivo para segurar virolas de fibra. Para virolas de diâmetro típico de 1,25 mm, uso um bloco de acrílico transparente, com ~1.3 ¼ de polegada mm furos e aproveitado parafusos inserindo do lado para implantes de buraco firmemente no lugar (figura 1A).
- Monte o suporte do terminal um aparato estereotáxica (ou qualquer solução de manipulação com precisão submillimeter) equipado com um microinjector. Coloque o suporte de virola acima o microinjector e aplique a mistura de seda/AAV de baixo.
Nota: Isto é porque a aplicações de grandes volumes de cima resultaram em seda/AAV que não se limitava à ponta. No entanto, a aplicação de muitos pequenos volumes sequenciais de acima ou abaixo pode produzir depósitos AAV/seda que estão confinados à ponta (embora nós preferimos aplicar por baixo). - Puxe uma pipeta de injeção intracraniana padrão de vidro de borosilicato capilar.
- Para facilitar a
- Para produzir uma ponta de injeção com uma ponta limpa lisa do diâmetro desejado, segure uma pipeta em cada mão e usar a parte mais grossa da conicidade em uma pipeta para marcar outra pipeta no local desejado descanso.
- Esfrega suavemente para a frente e para trás em um movimento de serragem (o método de Pontuação de vidro sobre vidro).
- Depois de marcar a pipeta, aplique uma pressão suave até a ponta da pipeta marcou com o corpo da outra pipeta para obter um corte limpo.
- Posicione um estereoscópio para obter uma visão clara das faces da fibra óptica.
Nota: A ampliação deve ser suficiente para precisão a posição da pipeta de injeção sobre a face de fibras ópticas. - Inserir os implantes de fibra titular com o lado do cérebro da fibra óptica voltada para baixo.
- Carrega a pipeta de injeção com solução de seda/AAV, quanto a qualquer injeção intracraniana padrão5. Carrega a quantidade necessária para o número de implantes, sendo feitas, mais extra para acomodar as perdas devido ao entupimento de pipetas de ~ 30%. Por exemplo, se 10 implantes estão sendo feitos, em seguida, carregar com 100 nL depósitos e retirar ~1.3 µ l.
Nota: Seda/AAV pode secar a ponta da pipeta entre as ejeções, que pode obstruir a pipeta. Pipetas de grande diâmetro (50-100 µm) são menos susceptíveis de obstruir. Tamancos podem ser desalojados por escovação suave para baixo a ponta da pipeta com um cotonete de limpeza ou álcool de papel molhado. - Manobre a pipeta de injeção até que está tocando ou quase tocando o centro da superfície da fibra óptica. Ejete nL 10-20 da solução de seda/AAV. Retire a pipeta.
Nota: A taxa de entrega não é crítica, mas as taxas típicas são 5-20 nL/s. - Observar o bólus de seda/AAV a superfície plana que aparece como uma cúpula de líquido que seca para uma película plana dentro de min ~ 1 (figura 1B).
- Repita etapas 4.1.9-4.1.10 até a quantidade desejada de seda/AAV é depositado (um total de 20-200 nL, a maioria dos aplicativos). Ao preparar vários implantes, aplicar seda/vírus adeno-associados a um implante e em seguida, passar para revestir outros implantes antes de retornar ao primeiro.
- Permitir que 1 h para secar antes de passar os implantes.
- Vácuo ressecam pernoite no ~ 125 Torr (-25 em. Hg), 4 ° C. Fazer isso, colocando o titular virola inteira em uma câmara de vácuo.
- Avalie a forma e a posição do filme seda resultante sob um microscópio de alta potência. Certifique-se de que filmes estão confinados à ponta da superfície da fibra óptica, ser relativamente fina (> 100 µm) e simétrica (Figura 1).
Nota: Filmes de seda/AAV grandes ou assimétricas podem desalojar da fibra durante o implante (Figura 1). A causa mais comum de problemas surge a partir da aplicação do único grandes volumes ao invés da aplicação sequencial de muitos pequenos volumes.
- Revestimento cônicos de fibras ópticas para expressão de unidade ao longo do eixo da fibra
- Obter os implantes cônicos de fibra óptica e executar etapas 4.1.2-4.1.8, exceto que a fibra cônica é posicionada lateralmente, tal que é perpendicular do injector (Figura 2A). Posição o injetor acima a fibra cônico.
Nota: Carregar as gotas líquidas em poses de fibras afiladas adicionado desafios, porque a tensão superficial tende a causar as gotas saltar sobre a pipeta de injeção ou migrar até a fibra cônica. Pipetas de injeção menores (30-50 µm de diâmetro) ajudam a superar esse problema, mas aumentam o risco de que a pipeta de injeção vai entupir. Devido à tensão superficial, as gotas tendem a aderir à área de superfície maior, então a ideal injeção Pipetar tamanho é dependente do tamanho da fibra cônica e a tolerância para a obstrução ocasional. - Posição da pipeta de injeção de seda/AAV contra o lado da fibra óptica no início da conicidade. Certifique-se que a pipeta de injeção é tocando a fibra óptica.
- Ejetar 20 nL de seda/AAV para iniciar o processo de revestimento. Certifique-se que a gota adere à fibra óptica e permanece na interface de fibra/pipeta. Pavio suavemente a gota no final da ponta da fibra, como a seda/AAV seca (~ 45 s). Manter a pipeta injetando em contacto com a secagem da gota para evitar entupimento a ponta da pipeta.
Nota: Cada depósito deve revestir aproximadamente 400 µm da fibra afilada (Figura 2B). - Quando o primeiro bolo secou quase completamente, ejetar mais 20 nL e continuar a absorção da gota ao longo do atarraxamento.
Nota: A seda líquida irá aderir a seda seca, ancoragem uma ponta de gota como a pipeta se move ao longo da conicidade. - Repita a etapa 4.2.4 ejetando quantidades pequenas de seda/AAV, e gradualmente, desenho da solução até o lado da conicidade. 5-6 ejeções são suficientes para atravessar a superfície de um cone de 2,5 mm.
- Para conduzir mais expressão uniforme por todos os lados da fibra, girar a fibra e repita etapas 4.2.2-4.2.5 até a quantidade desejada de seda/AAV tenha sido depositada.
- Se um enforcamento vertente de seda/AAV seca se estende para além da ponta de fibra, cuidadosamente, cortar o fio com tesoura, ou usar a pipeta de ejeção para dobrar o fio volta e observem a conicidade da fibra.
- Permitir que 1 h para secar antes de passar os implantes.
- Vácuo ressecam pernoite em 4 ° C. O titular de virola inteira pode ser colocado em uma câmara de vácuo.
- Avalie a forma e a posição do filme seda resultante sob um microscópio de alta potência.
Nota: Filmes não precisam ser inteiramente uniformes, mas não devem ter saliências que se estendem a mais de 100 µm para além da superfície da fibra para minimizar os danos ao tecido circundante durante o implante (Figura 3). Para minimizar o tamanho do filme, é fundamental que cada gota está completamente seca antes dos depósitos posteriores são feitos.
- Obter os implantes cônicos de fibra óptica e executar etapas 4.1.2-4.1.8, exceto que a fibra cônica é posicionada lateralmente, tal que é perpendicular do injector (Figura 2A). Posição o injetor acima a fibra cônico.
- Implantes de lentes de sorriso de revestimento
- Obter o sorriso lentes6,7 e repita etapas 4.1.2-4.1.8. O injetor pode ser montado acima.
- Depósito de seda/AAV em uma única ejeção (1 µ l para uma lente de diâmetro de 1,0 mm).
Nota: Isto irá produzir uma cúpula de líquido que adere à face da lente e seca para produzir um filme uniforme (100-200 µm de espessura). No entanto, no caso em que um única grande ejeção seca desigualmente e produz um filme que é mais grosso perto das bordas da lente GRIN, tente depositar várias gotículas menores (100-200 nL) no centro da superfície da lente (permitindo que cada gota secar antes de depositar o próximo) para garantir que o filme irá conduzir a expressão no centro do campo de visão. - Permitir que 1 h para secar antes de passar os implantes.
- Avalie a forma e a posição do filme seda resultante sob um microscópio de alta potência para garantir que o filme cobre a superfície da lente.
- Revestimento de vidro windows craniana
- Prepare o vidro windows cranianas por aderente dois de 3 mm de diâmetro redondo lamelas (espessura do n º 1) para uma janela de diâmetro de 5 mm com adesivo óptico (para obter detalhes, consulte Goldey et al . 20148).
- Misture seda: vírus em uma relação de 1:4 para reduzir a quantidade total de seda no filme. Quantidades excessivas de seda não se dissolve sob windows cranianas após o implante. Experimentos de titulação podem ser necessária para determinar a relação e o volume que dá o perfil de expressão desejada.
- Mão Pipetar uma gotícula de 5 µ l para a superfície da lamela 3 mm (face do cérebro). A gota deve espalhar para cobrir a superfície inteira de vidro (Figura 3).
- Permitir que 2-3 h para secar antes de se mudar de windows.
5. armazenamento de implantes de seda/AAV-revestido
- Loja de seda/AAV-revestido de fibras ópticas num exsicador de vácuo refrigerado (~ 125 Torr, 4 ° C) antes da sua utilização (Figura 4A).
- Não armazene windows cranianas e sorriso lentes sob vácuo, como grandes filmes seda armazenados sob vácuo deixam dissolver-se totalmente após o implante. Implante o windows cranianas e sorriso lentes imediatamente após a secagem, ou dentro de um dia de fabricação, se armazenado a pressão atmosférica e a 4 ° C.
6. implantação de dispositivos de
- Prepare os animais para cirurgia de implante como descrito anteriormente4.
- Brevemente, anestesiar os ratos com a injeção intraperitoneal de cetamina/xilazina (100/10 mg/kg) e verifique a profundidade da anestesia, usando uma dedo do pé-pitada suave. Raspar a cabeça na área do implante e limpar o couro cabeludo com iodo e álcool.
- Montagem de animais em um dispositivo estereotáxica e anestesia suplemento usando uma mistura de oxigênio e isoflurano (1-2%). Fazer uma incisão no couro cabeludo, sobre a área de interesse e executar uma craniotomia suficientemente grande para acomodar o implante.
- Implante de fibras ópticas9 e microendoscope lentes10 de acordo com os procedimentos anteriormente publicados. Identificador de implantes com cuidado, como o depósito de seda/AAV pode ser derrubado por uma craniotomia imperfeita ou o implante pegando na borda do crânio. Abaixe o implante no cérebro lentamente (~ 2 mm/min).
- Implante o windows craniano como descrever anteriormente8. Não toque o lado revestido da janela e evitar lavagem a janela com fluido se realizando gavagem, como isto pode lavar o vírus. Para alcançar a máxima expressão, realize um durotomy.
7. avaliar a expressão e solução de problemas
- Para avaliar a expressão de proteínas expressas Viralmente, permitir ~ 2-3 semanas para o vírus dirigir a expressão e, em seguida, executar a perfusão intracardíaca com paraformaldeído 4% em fosfato tamponado tecido de cérebro11 e processo de solução salina para fluorescente microscopia de12.
- Avalie a expressão usando microscopia fluorescente para o padrão de expressão de proteínas optogenetic fluoróforo-com a tag de imagem.
- Se o nível de expressão for insuficiente, aumente a quantidade de vírus em revestimentos, aumentando o volume total do revestimento de seda/AAV, ou, preferencialmente, usando um vírus de título superior.
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Representative Results
Para avaliar o sucesso dos filmes de seda/AAV na condução de expressão, nós perfundidos animais 2-3 semanas após o implante e preparado com fatias de cérebro da região de interesse. Imagens de fluorescência das proteínas fluoróforo-tag optogenetic (YFP-ChR2) forneceu uma medida da extensão da expressão (Figura 1). Fibras ópticas típicas (230 µm de diâmetro) pode facilmente acomodar 200 nL de seda/AAV. Com a prática, experimentadores podem alcançar expressão altamente confiável ao redor da ponta das fibras implantadas (Figura 5).
Para avaliar a expressão conduzido pelo windows craneal seda/AAV-revestido, começa a imagem a partir de 7-10 dias após o implante. Nós usamos dois fotões imagem para visualização, mas também podem ser utilizados outros métodos tais como fluorescência de imagem com um CCD. Dois possíveis problemas com windows cranianas revestidos são expressão insuficiente e seda filmes que não se dissolvem e obscurecer o campo de visão. Para aumentar a expressão, sugerimos realizar uma durectomy antes da implantação da janela, e/ou aumentando a quantidade de vírus no filme. Atingimos a melhor expressão usando uma mistura de 1:4 de seda e estoque-título AAV, respectivamente. Enquanto isso representa um número substancialmente maior de partículas virais que são geralmente usados em injeções estereotáxicos, a diminuição do tempo cirúrgico contadores o custo marginal adicional do vírus. Entretanto, se seda filmes não dissolver debaixo da janela, reduza ainda mais a quantidade de seda usada para revestir a janela. A quantidade total de seda no windows revestidos é 10 - 100 vezes mais do que em implantes de fibra, e o filme é menos incorporado no tecido e, portanto, não podem ser exposto aos mesmos níveis de atividade proteolítica do que pode dissolver seda filmes13. No entanto, a presença de alguns seda é essencial para alcançar expressão sob windows3, provavelmente porque um filme feito de vírus sozinho é lavado pela líquido intersticial durante a cirurgia.
Figura 1: aplicação de películas de seda/AAV para fibras ópticas. (A) crônica fibra implantes são colocados fibra lado-para baixo em um suporte (baixo-relevo), montada em um tradutor XYZ. Um microinjector fixo abaixo as fibras dispensa para as pontas de fibra de seda/AAV. Um estereoscópio permite a visualização do processo. (B) aplica seda/AAV dicas de fibra em pequenos volumes (10-20 nL). Após ejetar em bolus, retraia a pipeta e permitir ~ 60 s para a gota secar para um filme liso. Repita o processo até que o volume necessário foi aplicado à ponta de fibra. (C) Inspecione revestimentos de seda. Revestimentos ideais devem ser centralizados na ponta de fibra (à esquerda), enquanto os revestimentos impróprios estendem para fora da face de fibra, tornando-os mais propensos a desalojar da fibra (à direita). (D) representante fibras revestidas com 200 nL de seda/AAV e o resultante orientado a AAV ChR2-YFP expressão 2 semanas após o implante. O revestimento de seda/AAV compacto à esquerda resultou na expressão robusta, enquanto o revestimento da direita se projetavam passado o rosto da fibra e resultou quase sem expressão, provavelmente porque a seda/AAV não se aderiu a fibra óptica durante a implantação. Escala de barras 0,2 mm (fibras) e 1,0 mm (fatias de cérebro). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: instalação de revestimento cônica fibra implantes. (A) a microinjector é montado acima o titular cônico da fibra, e fibras afiladas são posicionadas ortogonalmente à seringa de ejeção. (B) Begin no mais largo ponto (inserção) e ejetar pequenos volumes enquanto se move a seringa de ejeção em direção ao ponto da conicidade. Isso resulta em um revestimento contínuo ao longo do comprimento da conicidade. (C) representante fibra cônica revestida com seda misturada com Fast Green para ajudar na visualização. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: revestimento cranianas windows. Seda/AAV pode ser aplicadas cranianas windows usando uma pipeta de mão. Uma janela de diâmetro padrão 3 mm pode ser revestida com uma gotícula de 5 µ l, que lentamente vai secar a uma película plana. Baixo-relevo: Expressão GCaMP6f resultantes de seda/AAV-revestido cranianas windows implantadas com e sem durectomies. Esta figura foi adaptada da Jackman et al (2018) 3. , por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: armazenar seda/AAV revestido implantes. (A) para remover a umidade residual e preservar a eficácia de viral, os implantes devem ser armazenados sob vácuo a 4 ° C até usado. Implantes armazenados desta forma permanecem viáveis pelo menos 7 dias. (B) expressão resultante de 4 fibras revestidas de seda/AAV implantadas após 7 dias de armazenamento. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: fibras ópticas de seda/AAV-GFP revestido dirigir confiantemente expressão. Implantes de imagens fluorescentes de fatias de 24 striatal consecutivos. Cada implante foi revestido com 100-400 nL de 1:1 seda/AAV-GFP. Nesta coorte de implantes indica a capacidade de seda para restringir a expressão para o local do implante (no caso o striatum dorsal). Fluorescência de GFP é indicada em verde; Coloração de DAPI é mostrado em azul. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
O uso de seda/AAV para atingir a expressão de proteínas optogentic supera as limitações das abordagens que estão atualmente em uso. Embora muitos estudos com sucesso usam injeções de AAV para expressar proteínas optogenetic, é desafiador para alinhar a expressão para a dica de fibras ópticas, para regiões de todo o comprimento das fibras afiladas e à região de visualização de uma lente de sorriso. Por causa do desalinhamento entre componentes ópticos e optogenetic expressão, estereotáxicos injeções podem não ser confiáveis, e muitas experiências falharem. A seda/AAV rotulagem método que descrevemos aqui resolve esse problema. Ele também simplifica o procedimento, eliminando uma segunda etapa cirúrgica e em alguns casos, eliminando a necessidade de uma segunda cirurgia. Pode também ser difícil usar o vírus para obter a expressão generalizada sob windows cranianas e experimentador normalmente realizam cirurgias longas para injetar o vírus em vários locais. A capacidade de obter expressão generalizada sobre grandes regiões corticais por simplesmente windows de revestimento craniana com seda/AAV é uma simplificação que elimina a necessidade para as muitas injeções invasivas.
Outra vantagem potencial de seda/AAV método é que ele pode induzir menos inflamação nos tecidos neurais em comparação com injeções virais. Injetando alta-título AAV no cérebro pode causar respostas inflamatórias, tais como astrocytosis reativa que têm o potencial de alterar celular e circuito propriedades14,15 (embora tais complicações potenciais são geralmente ignorado). Filmes de seda induzem pouca resposta imunogênica em seus próprios13 e seda/AAV filmes são esperados para liberar o vírus ao longo de muitas horas ou dias,16, que pode reduzir a carga viral nos tecidos circundantes e reduzir respostas imunogênicas. Com abordagens convencionais, em que a implantação de um dispositivo é precedida por uma injeção de AAV, respostas inflamatórias podem surgir tanto a implantação e a injeção. No futuro será desejável comparar sistematicamente abordagens convencionais e o método de seda/AAV para determinar se a seda/AAV filmes reduz globalmente respostas inflamatórias.
Vários passos são essenciais para o uso bem sucedido de filmes de seda/AAV. Mais importante ainda, o revestimento das fibras ópticas deve ser feito com cuidado, conforme descrito nos métodos e a localização dos filmes secos deve ser avaliada cuidadosamente por inspeção visual, sob um microscópio para garantir que os filmes são compactos, no local correto, e aderir à face da fibra óptica. Qualquer seda/AAV nas laterais da fibra óptica levará a expressão fora da região de interesse, e filmes estorvadas que ultrapasse a face da fibra podem romper durante a implantação e levam ao não-confiáveis ou sem expressão. As técnicas que descrevemos para aplicação de seda/AAV aos dispositivos implantáveis activos pode ser adaptado para uso de todos os materiais são que estão prontamente disponíveis e permitir a deposição precisa de pequenos volumes de seda/AAV.
Um pouco de prática é necessário para alcançar resultados precisos e reprodutíveis. Se a expressão é observada ao longo da trilha da fibra, é provável que o filme de seda seco do lado da fibra, ao invés do rosto de fibra. Repita o processo de fabricação e estreitamente inspecionar implantes secos por sinais que filmes estão secando do lado da fibra. Porque os filmes de seda/AAV são opticamente transparentes, pode ajudar a prática aplicando seda misturada com corante (Fast Green ou um corante semelhante) para visualizar melhor a forma de filmes resultantes (Figura 2). Se não há nenhuma expressão, é provável que o filme de seda desalojado da ponta de fibra durante a implantação. Sugerimos a utilização de estoque-título vírus ao fazer implantes. Para fibras ópticas, isto reduz o volume total que deve ser aplicado a fibras de pequeno diâmetro. Se o tamanho do revestimento é uma preocupação considere esperar entre cada aplicação nL 10 para permitir a secagem completa da gota depositada. Gotículas de seda/AAV secar mais rápido sob uma lâmpada quente. Para windows cranianas, alta concentração vírus podem ser necessário fornecer carga viral adequada toda a pia ou a dura-máter. Certos tipos de implantes podem dissolver seda e libertar o vírus adeno-associados mais facilmente do que outros. Nós achamos que craniana windows implantados sobre a superfície do cérebro requer uma menor taxa de seda/vírus para alcançar expressão confiável, talvez devido à dinâmica dos fluidos spinal cerebral diferente ou atividade de protease. Se a expressão não pode ser aumentada, aumentando as concentrações de AAV eficazes, diminuir o volume de seda aquosa é uma alternativa plausível.
Finalmente, é importante armazenar componentes ópticos corretamente e implante-os logo depois que eles são preparados. Temos mostrado que as fibras revestidas que são frigoríficos sob vácuo podem ser armazenadas por muitos dias antes de usar. Armazenamento do vácuo remove umidade residual17 que pode reduzir a solubilidade dos filmes de seda e também ajudar a manter a eficácia viral. Idealmente, as fibras ópticas devem ser implantadas dentro de 24 horas da fabricação. No entanto, encontramos que as fibras de seda/AAV-revestido armazenados sob níveis semelhantes de vácuo unidade de expressão quando implantados 7 dias após a fabricação (Figura 4B). Em contraste, revestidos windows cranianas e lentes de sorriso dirigiu a expressão mais confiável quando eles foram secas à temperatura ambiente e usados dentro de horas de preparação. A razão para esta disparidade permanece obscura. Mais estudos podem ser necessários para aperfeiçoar as condições de preparação e armazenamento para ampliar ainda mais o tempo de armazenamento.
Seda/AAV-revestido cranianas janelas têm considerável potencial porque eles drasticamente reduzir os prazos de cirúrgicos e são extremamente simples de fabricar, mas neste momento, este método tem limitações. Windows cranianas revestidos uniformemente rotular grandes áreas do córtex e dirigir a expressão suficiente na camada 2/3 para GCaMP de imagem, com um pouco menos expressão em camadas mais profundas. No entanto, injeções estereotáxicos conduzir a expressão mais robusto e fornecem mais controle sobre as camadas alvejado para expressão. Expressão de confiança só foi conseguida quando a dura-máter foi removida. Embora a dura-máter é removida frequentemente por muitos experimentos de imagem 2-fóton melhorar a qualidade de imagem8, para muitos experimentos é desejável para obter a rotulagem de forma menos invasiva. Portanto, nós exploramos nossa capacidade de usar seda/AAV para rotular as regiões corticais sem remover a dura-máter. Obtivemos uma rotulagem, mas é possível que isto era uma consequência de danificar a dura-máter no processo de preparação a craniotomia. Um estudo mais aprofundado é necessário para windows cranianas revestidos ser usado para rotular confiantemente o córtex sem remover a dura-máter.
A preparação de aquosa da fibroína de seda dos casulos de Bombyx Mori é descrita detalhadamente em Rockwood et al . (2011) 18. fibroin seda aquosa é agora comercialmente disponíveis (5% w/v). Embora a maioria dos nossos experimentos foram realizada com estoques da fibroína seda aquosa preparadas em nosso laboratório (5-7,5% p/v), obtivemos resultados semelhantes usando comercial da fibroína aquosa. Fibroin aquosa é estável a 4 ° C por até 3 meses, depois que ele espontaneamente faz a transição de líquido para hidrogel18. Recomendamos que os estoques da fibroína ser divididos em alíquota ~ 1 mL e armazenados a-80 ° C. Uma alíquota de trabalho de 1 mL (suficiente para centenas de implantes de revestimento) pode ser armazenada a 4 ° C e usada até ao início de gel. Cuidado não agitar, vórtice, agitar ou Pipetar agressivamente da fibroína aquosa, como forças de cisalhamento podem levar a gelificação19,20.
Filmes de seda/AAV permitem uma ampla gama de padrões de expressão, de expressão cortical generalizada sob windows cranianas, exacta expressão subcortical na ponta de uma fibra óptica de pequeno diâmetro. Estas técnicas foram desenvolvidas para tirar proveito de vetores de expressão comuns AAV mas provavelmente poderiam ser usadas para dispersar outros vectores de expressão como lentivírus ou o vírus da raiva no cérebro. Filmes de seda também podem ser fabricados em formas tridimensionais para melhorar a liberação viral no tecido. Por exemplo, em ordem de forte expressão de unidade sob windows corticais sem o uso de um durotomy, windows cranianas podem ser revestidas com matrizes de seda microagulhas que iria penetrar o vírus dura-máter e lançamento no mais profundo de camadas corticais21. Aperfeiçoamento provavelmente causará propriedades melhoradas da liberação de vírus e novas aplicações para filmes de seda/AAV.
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Disclosures
Os autores não têm nada para divulgar.
Acknowledgments
Os autores desejam agradecer J. Vazquez para ilustrações, d. Kaplan e C. Preda para reagentes e orientação útil e os laboratórios de Sabatini B. e C. Harvey para a imagem latente na vivo . A microscopia foi viabilizada pela M. Ocana e do centro de imagiologia de neurobiologia, apoiada em parte pelo centro de imagem Neural como parte de um nacional Instituto de doenças neurológicas e Stroke (NINDS) P30 núcleo centro conceder (NS072030). Este trabalho foi financiado pela Fundação da família de Khodadad GVR, Fundação Nancy Lurie marcas e por concessões do NIH, NINDS R21NS093498, U01NS108177 e R35NS097284 de NINDS para W.G.R e por uma comunhão de pós-doutorado de NIH F32NS101889 para C.H.C.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Aqueous silk fibroin | Sigma | 5154-20ML | Aqueous Silk Fibroin (5% w/v) for making films |
| Microinjector to deposit silk/AAV | Drummond | 3-000-207 | Nanoject III nanoliter injector |
| Manipulator to hold implants | Narashige | MM-33 | Micromanipulator |
| Stereoscope to visualize silk deposits | AmScope | SM-6TX-FRL | 3.5X-45X Trinocular articulating zoom microscope with ring light |
| Vacuum chamber to store implants | Ablaze | N/A | 3.5 Quart Vacuum Vac Degassing Chamber |
| Optional, implant holder for storage | N/A | N/A | To store premade optical fibers, drill a grid of ~4 mm-deep holes with a diameter just larger than the ferrule diameter into a plastic block. |
| Optical fiber | Thorlabs | FT200EMT | Ø200 µm Core Multimode Optical Fiber for fiber implants |
| Ferrules | Kientec | FZI-LC-230 | LC Zirconia Ferrule for fiber implants |
| Various materials for manufacturing chronic fiber implants | Various | N/A | For detailed procedure, see Ung K, Arenkiel BR. Fiber-optic implantation for chronic optogenetic stimulation of brain tissue. Journal of visualized experiments: JoVE. 2012(68). |
| Tapered fiber implants | Optogenix | Lambda-B | Tapered fiber implants |
| GRIN lenses | GoFoton | CLH-100-WD002-002-SSI-GF3 | GRIN lenses |
| Small glass cranial windows | Warner | 64-0726 (CS-3R-0) | Small round cover glass, #0 thickness |
| Large glass cranial windows | Warner | 64-0731 (CS-5R-0) | Small round cover glass, #0 thickness |
| Various materials for manufacturing cranial windows | Various | N/A | For detailed procedure, see Goldey GJ et al. Removable cranial windows for long-term imaging in awake mice. Nature protocols. 2014 Nov;9(11):2515. |
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