En Vivo Específica la expresión de proteínas de Optogenetic usando películas de seda/AAV

Summary

Aquí, presentamos un método de distribución de vectores de la expresión viral en el cerebro utilizando películas de fibroína de seda. Este método permite entrega dirigida de vectores de expresión utilizando fibras ópticas recubiertas de seda/AAV, ahusado de las fibras ópticas y ventanas craneales.

Abstract

La búsqueda para entender cómo neuronales circuitos de información del proceso en orden de salida del variador comportamiento ha sido grandemente ayudado por métodos ópticos recientemente desarrollado para la manipulación y seguimiento de la actividad de las neuronas in vivo. Estos tipos de experimentos se basan en dos componentes principales: 1) los implantables que proporcionan acceso óptico hacia el cerebro y las proteínas 2) sensible a la luz que cambian la excitabilidad neuronal o proporcionan una lectura de la actividad neuronal. Hay un número de maneras de expresar proteínas sensibles a la luz, pero la inyección estereotáctica de vectores virales es actualmente el enfoque más flexible porque la expresión puede ser controlada con precisión genética, anatómica y temporal. A pesar de la gran utilidad de vectores virales, entregando el virus en el sitio de implantes ópticos plantea numerosos retos. Las inyecciones estereotáxicas virus exigen cirugías que aumentan el tiempo quirúrgico, aumentan el costo de los estudios y suponen un riesgo para la salud del animal. El tejido circundante puede ser físicamente dañado por la jeringuilla de inyección y por inmunogénica inflamación causada por la abrupta entrega de un bolo de virus de alto título. Alineando las inyecciones con implantes ópticas es especialmente difícil cuando pequeñas regiones en el cerebro. Para superar estos retos, se describe un método para el revestimiento de varios tipos de implantes ópticos con películas compuestas de fibroína de seda y vectores (AAV) virales Adeno-asociado. La fibroína, un polímero derivado del capullo del Bombyx mori, puede encapsular y proteger biomoléculas y se puede procesar en formas que van desde películas solubles a la cerámica. Cuando se implanta en el cerebro, capas de seda/AAV liberan virus en la interfase entre elementos ópticos y el cerebro circundante, conduce expresión precisamente donde se necesita. Este método se implementa fácilmente y se compromete a facilitar mucho en vivo los estudios de la función neuronal del circuito.

Introduction

La última década ha producido una explosión de ingeniería proteínas sensibles a la luz para el monitoreo y manipulación de la actividad neural¹. Virus ofrecen una flexibilidad sin precedentes para expresar estas herramientas de optogenetic en el cerebro. En comparación con animales transgénicos, los virus son mucho más fáciles de producir, transportar y almacenar, permitiendo la rápida implementación de las nuevas herramientas de optogenetic. Expresión puede ser dirigida genéticamente a distintas poblaciones neuronales y virus diseñados para el transporte retrógrado incluso pueden ser utilizados para orientar la expresión basada en la conectividad neuronal².

Virus se introducen generalmente con inyecciones estereotáxicas, que pueden ser largo y difícil. Dirigidos precisamente a pequeñas regiones puede ser difícil, mientras que la expresión que conduce sobre grandes áreas a menudo requiere muchas inyecciones. Por otra parte, cuando un dispositivo óptico es posteriormente implantado en el cerebro para entregar luz en vivo, el implante debe estar correctamente alineado con la inyección viral. Aquí, describimos un método fácilmente implementados para la entrega de vectores virales en el tejido alrededor de un dispositivo implantado con fibroína seda películas³. Fibroína de seda está disponible en el mercado, bien tolerado por los tejidos neuronales y puede ser utilizada para producir materiales con propiedades variadas. Películas seda pueden aplicarse a implantes usando equipo de laboratorio común como microinyección pipetas o pipetas de la mano. Películas de seda/AAV eliminan el requisito de dos procedimientos quirúrgicos y aseguran de que la expresión mediada por virus es correctamente alineada al implante óptico. La expresión resultante está limitada a la punta de las fibras y los resultados en menos expresión no deseado a lo largo de la pista de fibra que las inyecciones estereotáxicas.

Además de producir la expresión específica en la punta de pequeñas fibras, películas de seda/AAV pueden utilizarse para conducir generalizada (> 3 mm de diámetro) expresión cortical bajo ventanas craneales. En vivo 2-fotón proyección de imagen de sensores fluorescentes de la actividad se ha convertido en una herramienta indispensable para evaluar el papel de la actividad neuronal en la conducción de procesamiento sensorial y cognitivo. Sin embargo, para conducir uniforme expresión sobre las grandes áreas corticales, experimentadores a menudo realizar inyecciones múltiples. Estas inyecciones pueden ser extremadamente desperdiciador de tiempo y pueden llevar a la expresión incoherente en el campo de visión. En cambio, seda/AAV-revestimiento ventanas craneales son extremadamente fáciles de fabricar, reducir considerablemente el tiempo necesario para las cirugías y conducir más notable expresión cientos de micras por debajo de la superficie cortical.

Protocol

Todos los experimentos con animales se realizaron según los protocolos aprobados por el Comité permanente de la Harvard de Animal Care siguientes pautas descritas en la NIH nos Guía para el cuidado y uso de animales de laboratorio. Se utilizaron ratones C57BL/6 adultos de ambos sexos (6-15 semanas de edad) para todos los experimentos.

1. obtener la fibroína de seda acuosa

1. Preparar o comprar la fibroína seda acuosa (5-7.5% w/v).

2. mezcla seda acuosa con vectores AAV de la expresión

1. Elegir un vector de expresión de AAV para conducir las proteínas optogenetic o indicador fluorescente de elección.
   Nota: Para minimizar el volumen de seda/AAV que deben aplicarse a los implantes durante la conducción aún robusta expresión, AAV título de stock (stock títulos obtenidos típicamente de corazones vector son alrededor de 10 ~¹³ gc/mL) se recomienda.
2. Inmediatamente antes de recubrimiento de implantes, descongele una alícuota del AAV y combinan con la fibroína de seda acuosa 5-7.5% (esta mezcla se hará referencia a como seda/AAV). En un tubo PCR μl 200, la mezcla acuosa fibroína y AAV en una proporción de 1:1 (para uso de windows craneal 1:4) inmediatamente antes de la aplicación. Pipetee suavemente la solución en y hacia fuera varias veces para mezclar bien la fibroína y AAV.
3. Mantener la mezcla de seda/AAV en el hielo antes de usarlo.

3. preparar equipo para la fabricación y almacenamiento de los dispositivos de seda/AAV-revestido

1. Adquirir equipo para fibras ópticas de la capa y lentes de gradiente de índice (GRIN) (figuras 1, 2).
   1. Construir un soporte estable de la virola. Para virolas de cerámica, taladre agujeros de 1.25 mm en un bloque de acrílico de la hoja de ¼". Orificios para insertar los tornillos de los laterales para sujetar férulas en posición de toque.
      Nota: Cualquier abrazadera puede utilizarse para este propósito.
   2. Posición de un manipulador con precisión submilimétrica para mover las fibras ópticas (aparato estereotáctica u otro instrumental quirúrgico de precisión).
   3. Montar un soporte estable para colocar el microinyector.
   4. Utilizar un estereoscopio para visualizar las fibras ópticas y gotitas de seda.
   5. Coloque una fuente de luz para iluminar las fibras ópticas.
2. Preparar el equipo para el recubrimiento de ventanas craneales (figura 3).
   1. Elija cualquier pipeta P10.
   2. Obtener un recipiente con tapa.
      Nota: Se sugiere cualquier recipiente con un fondo de silicona — el fondo suave facilita levantar windows craneales.
3. Preparar el equipo para almacenar acabados implantes (figura 4).
   1. Obtener una pequeña cámara de vacío (1-5 L).
   2. Asegúrese de que hay espacio para almacenar los implantes en un refrigerador de 4 ° C.

4. película de seda/AAV se aplican a dispositivos

1. Capa de fibras ópticas a la expresión focal de unidad en la punta de la fibra
   1. Preparar fibra crónica implantes como se describió anteriormente⁴.
   2. Antes de su uso, enjuague implantes con etanol y, a continuación, con agua ultrapura para asegurarse de que las fibras ópticas están limpias.
      Nota: Películas de seda se adhieren más confiablemente para limpiar superficies de vidrio.
   3. Prepara un dispositivo para sujetar férulas de fibra. Virolas de típico 1,25 mm de diámetro, uso un bloque de acrílico transparente, con ~1.3 1/4 pulgada mm agujeros y roscados tornillos entrando desde el lado del agujero implantes firmemente en su lugar (figura 1A).
   4. Monte el soporte del casquillo en un aparato estereotáctica (o cualquier solución de manipulación con precisión submilimétrica) equipado con un microinyector. Coloque el soporte de la virola sobre el microinyector y aplique la mezcla de seda/AAV desde abajo.
      Nota: Esto es debido a aplicaciones de grandes volúmenes desde arriba dio lugar a la seda/AAV que no fue restringida a la punta. Sin embargo, la aplicación de muchos pequeños volúmenes secuenciales desde arriba o abajo puede producir depósitos AAV seda que están confinados a la punta (aunque preferimos aplicar desde abajo).
   5. Tire de una pipeta estándar inyección intracraneal del vidrio de borosilicate capilar.
      1. Para facilitar la
      2. Para producir una punta de inyección con una punta limpia y plana del diámetro deseado, mantenga una pipeta en cada mano y use la parte más gruesa de la forma cónica en una pipeta para anotar la otra pipeta en el lugar de descanso deseado.
      3. Frote suavemente hacia adelante y hacia atrás en un movimiento de sierra (el método de puntuación en el vidrio).
      4. Después de anotar la pipeta, aplique presión suave a la punta de la pipeta anotó con el cuerpo de la pipeta de otros para lograr una ruptura.
   6. Coloque un estereoscopio para dar una visión clara de las caras de la fibra óptica.
      Nota: Ampliación debería ser suficiente para posicionar con precisión la pipeta de inyección sobre la cara de fibras ópticas.
   7. Insertar implantes de fibra en el soporte con el lado del cerebro de la fibra óptica hacia abajo.
   8. Cargar la pipeta de inyección con solución de seda/AAV, en cuanto a cualquier inyección intracraneal estándar⁵. Cargar la cantidad requerida para el número de implantes realizados, más el ~ 30% adicional para las pérdidas debido a la obstrucción de pipetas. Por ejemplo, si se hacen 10 implantes, luego cargar con 100 nL depósitos y retirar ~1.3 μl.
      Nota: Seda/AAV puede secar en la punta de la pipeta entre eyecciones, que puede obstruir la pipeta. Pipetas de diámetro grande (50-100 μm) son menos propensas a obstruir. Zuecos de retirar por un cepillado suave a la punta de la pipeta con un hisopo de trapo o alcohol de papel mojado.
   9. Maniobra de la pipeta de inyección hasta que está tocando o casi tocando el centro de la superficie de la fibra óptica. Extraer 10-20 nL de seda/AAV solución. Retirar la pipeta.
      Nota: La tasa de entrega no es crítica, pero las tasas típicas son 5-20 nL/s.
   10. Observar el bolo de seda/AAV en la superficie plana que aparece como una cúpula líquida que seca formando una película plana dentro de ~ 1 min (Figura 1B).
   11. Repita los pasos 4.1.9-4.1.10 hasta la cantidad deseada de seda/AAV es depositado (un total de 20-200 nL para la mayoría de las aplicaciones). Durante la preparación de múltiples implantes, seda/AAV se aplican a un implante y luego pasar a cubrir otros implantes antes de regresar a la primera.
   12. Permitir 1 h de secado antes de pasar a los implantes.
   13. Vacío noche secan en Torr ~ 125 (-25 en. Hectogramo), 4 ° C. Para ello, colocar el soporte de toda férula en una cámara de vacío.
   14. Evaluar la forma y posición de la película seda resultante bajo un microscopio de alta potencia. Asegurar que las películas se limitan a la punta de la superficie de la fibra óptica, ser relativamente delgada (> 100 μm) y simétrica (figura 1).
       Nota: Asimétricas o grandes películas de seda/AAV pueden desalojar de la fibra durante la implantación (figura 1). La causa más común de problemas surge de la aplicación de grandes volúmenes individuales en lugar de la aplicación secuencial de muchos pequeños volúmenes.
2. Afilado de capa de fibras ópticas a la expresión de unidad en el eje de la fibra
   1. Obtener implantes cónicos de fibra óptica y realizar pasos 4.1.2-4.1.8, excepto que la fibra cónica se coloca lateralmente, que es perpendicular al del inyector (figura 2A). Coloque el inyector sobre la fibra cónico.
      Nota: Carga de gotitas líquidas en poses de fibras cónicas añadido retos, porque la tensión superficial tiende a causar gotas saltar en la pipeta de inyección o migrar hasta la fibra afilada. Pipetas de inyección más pequeñas (30-50 μm de diámetro) ayudan a superar este problema pero aumentan el riesgo de que la pipeta de inyección se obstruirá. Debido a la tensión de superficie, las gotas tienden a adherirse a la zona de mayor superficie, para pipeta de inyección óptimo tamaño es dependiente en el tamaño de la fibra afilada y la tolerancia para la obstrucción ocasional.
   2. Coloque la pipeta de inyección de seda/AAV contra el lado de la fibra óptica al principio de la forma cónica. Asegúrese de que la pipeta de inyección es tocar la fibra óptica.
   3. Expulsión de 20 nL de seda/AAV para iniciar el proceso de recubrimiento. Asegúrese de que la gota se adhiere a la fibra óptica y que la interfaz de la pipeta de fibra. Mecha suavemente la gota hacia el final de la punta de la fibra como la seda/AAV se seca (~ 45 s). Mantenga la pipeta de inyección en contacto con la gota de secado para evitar la obstrucción de la punta de la pipeta.
      Nota: Cada depósito debe cubrir aproximadamente 400 μm de la fibra cónica (figura 2B).
   4. Cuando el primer bolo se ha secado casi por completo, expulsar otro 20 nL y absorbe la gota a lo largo de la forma cónica.
      Nota: La seda líquida se adhiere a la seda seca, anclaje a un extremo de la gota de la pipeta se desplaza a lo largo de la forma cónica.
   5. Repita el paso 4.2.4 por expulsar pequeñas cantidades de seda/AAV y poco a poco dibujando la solución por el lado de la forma cónica. 5-6 eyecciones son suficientes para recorrer la superficie de un cono de 2,5 mm.
   6. Para impulsar más la expresión uniforme en todos los lados de la fibra, girar la fibra y repita pasos 4.2.2-4.2.5 hasta la cantidad deseada de seda/AAV ha sido depositada.
   7. Si un colgante del filamento de seda seco/AAV se extiende más allá de la punta de la fibra, cuidadosamente corte el hilo con unas tijeras o utilizar la pipeta de expulsión la hebra detrás de la curva y adherirse a la forma cónica de la fibra.
   8. Permitir 1 h de secado antes de pasar a los implantes.
   9. Vacío secan durante la noche a 4 ° C. El titular de toda férula puede colocarse en una cámara de vacío.
   10. Evaluar la forma y posición de la película seda resultante bajo un microscopio de alta potencia.
       Nota: Las películas no necesitan ser totalmente uniformes pero no deben tener protuberancias que se extienden más de 100 μm más allá de la superficie de la fibra para minimizar el daño al tejido circundante durante la implantación (figura 3). Para minimizar el tamaño de la película, es fundamental que cada gotita esté completamente seco antes de depósitos posteriores.
3. Implantes de lente GRIN de capa
   1. Obtener sonrisa lentes^6,7 y repita los pasos 4.1.2-4.1.8. El inyector puede montarse encima.
   2. Depósito de seda/AAV en una sola eyección (1 μL para una lente de diámetro de 1,0 mm).
      Nota: Esto producirá una cúpula de líquido que se adhiere a la cara de la lente y se seca para producir una película uniforme (100-200 μm de espesor). Sin embargo, en caso de que una sola eyección grande seca irregularmente y produce una película que es más gruesa cerca de los bordes de la lente GRIN, trate de depositar múltiples gotitas más pequeñas (100-200 nL) en el centro de la superficie de la lente (permitiendo que cada gota se seque antes de depositar el siguiente) para asegurarse de que la película conducirá la expresión en el centro del campo de visión.
   3. Permitir 1 h de secado antes de pasar a los implantes.
   4. Evaluar la forma y posición de la película seda resultante bajo un microscopio de alta potencia para asegurar que la película cubre la superficie de la lente.
4. Recubrimiento de ventanas craneales
   1. Preparar vidrio ventanas craneales por adherir dos de 3 mm de diámetro redondo cubreobjetos (no. 1 de espesor) para una ventana de 5 mm de diámetro con pegamento óptico (para más detalles, véase Goldey et al 2014⁸).
   2. Mezcla de seda: virus en una proporción de 1:4 para reducir la cantidad total de seda en la película. Cantidades excesivas de la seda no se disuelven bajo ventanas craneales después de la implantación. Experimentos de titulación se requiera para determinar la proporción y el volumen que da el perfil de la expresión deseada.
   3. Mano tomar con pipeta una gota de 5 μl sobre la superficie del cubreobjetos 3 mm (revestimiento del cerebro). La gota debe extiende para cubrir la superficie entera (figura 3).
   4. Permitir 2-3 h de secado antes de pasar a windows.

5. almacenamiento de seda/AAV-implantes recubiertos con

1. Tienda de seda/AAV-revestimiento de las fibras ópticas en un desecador de vacío refrigerado (Torr ~ 125, 4 ° C) antes de su uso (Figura 4A).
2. No guarde windows craneales y lentes GRIN bajo vacío, como grandes películas seda almacenadas al vacío no se disuelven completamente después de la implantación. Implante lentes GRIN y windows craneales inmediatamente después del secado, o dentro de un día de fabricación si se almacenan a presión atmosférica y 4 ° C.

6. implantación de los dispositivos

1. Preparar los animales para cirugía de implantes como se describió anteriormente⁴.
   1. Brevemente, anestesiar ratones con una inyección intraperitoneal de ketamina/xilacina (100/10 mg/kg) y verificar la profundidad de la anestesia con una pizca de punta suave. Afeitarse el cráneo en la zona del implante y limpiar el cuero cabelludo con yodo y alcohol.
   2. Animales de Monte en un dispositivo estereotáxicas y suplemento anestesia utilizando una mezcla de oxígeno y el isoflurano (1-2%). Hacer una incisión en el cuero cabelludo sobre el área de interés y realizar una craneotomía lo suficientemente grande para acomodar el implante.
2. Implantar fibras ópticas⁹ y del microendoscope del lentes¹⁰ según los procedimientos previamente publicados. Manija de implantes con cuidado, como el depósito de seda/AAV puede caer por una craneotomía imperfecta, o por el implante en el borde del cráneo. Baje lentamente el implante en el cerebro (~ 2 mm/min).
3. Implante craneales windows como describen previamente⁸. No toque la cubierta de la ventana y evitar enjuagarse la ventana con el líquido en caso de sonda nasogástrica, como esto puede eliminar el virus. Para lograr la máxima expresión, realizar una durotomía.

7. evaluación de la expresión y solución de problemas

1. Para evaluar la expresión de proteínas expresadas de forma viral, permite ~ 2-3 semanas el virus de la unidad de expresión, luego realizar perfusión intracardial con paraformaldehído al 4% en fosfato tampón salino¹¹ y proceso cerebro tejido para fluorescente la microscopia¹².
2. Evaluar la expresión a través de microscopia fluorescente a la imagen del patrón de expresión de proteínas optogenetic etiquetadas con el fluoróforo.
3. Si el nivel de expresión es insuficiente, aumentar la cantidad de virus en los revestimientos incrementando el volumen total de la capa de seda/AAV, o preferiblemente mediante el uso de un virus de título superior.

Representative Results

Para evaluar el éxito de las películas de seda/AAV en la expresión que conduce, había inundada de animales 2-3 semanas después de la implantación y preparó rebanadas del cerebro de la región de interés. Imágenes de fluorescencia de proteínas optogenetic tagged fluoróforo (ChR2-YFP) proporcionan una medida del grado de expresión (figura 1). Fibras ópticas típicas (230 μm de diámetro) puede fácilmente acomodar 200 nL de seda/AAV. Con la práctica, los experimentadores pueden alcanzar expresión altamente confiable alrededor de la punta de las fibras implantadas (figura 5).

Evaluar expresión impulsado por windows craneales seda/AAV-revestido, comienzan la proyección de imagen empezando 7-10 días después de la implantación. Hemos utilizado proyección de imagen de dos fotones para la visualización, pero también podrían utilizar otros métodos tales como de fluorescencia con un CCD de imagen. Dos posibles problemas con cubierta ventanas craneales son expresión insuficiente y seda películas que no se disuelva y oscurecer el campo de visión. Para aumentar la expresión, le sugerimos realizar un durectomy antes de la implantación de la ventana, o aumentando la cantidad de virus en la película. Logramos la mejor expresión usando una mezcla de 1:4 de seda y stock título AAV, respectivamente. Si bien esto representa un número sustancialmente mayor de partículas virales que generalmente se utilizan en las inyecciones estereotáxicas, el menor tiempo quirúrgico contra el costo marginal adicional del virus. Mientras tanto, si seda películas no disolver debajo de la ventana, reducir la cantidad de seda usado para cubrir la ventana. La cantidad total de la seda en windows revestidos es 10 - 100 veces más en implantes de fibra, y la película es menos incrustado en el tejido y por lo tanto no puede estar expuesto a los mismos niveles de actividad proteolítica que puede disolver películas seda¹³. Sin embargo, la presencia de algunos de seda es esencial para lograr la expresión bajo windows³, probablemente porque una película hecha de virus solo es arrastrada por el líquido intersticial durante la cirugía.

Figura 1: aplicación de películas de seda/AAV a fibras ópticas. (A) fibra crónica implantes se colocan fibras hacia abajo en un soporte (recuadro) montado en un traductor XYZ. Un microinyector fijo debajo de las fibras dispensa seda/AAV en las puntas de fibra. Un estereoscopio permite la visualización del proceso. (B) aplique seda/AAV puntas de fibra en volúmenes pequeños (10-20 nL). Después de expulsar un bolo, retraiga la pipeta y ~ 60 s para la gota se seque a una película plana. Repita el proceso hasta el volumen requerido se ha aplicado a la punta de la fibra. (C) inspeccionar capas de seda. Recubrimientos óptima deben estar centrados en la punta de la fibra (izquierda), mientras que capas inadecuados extienden hacia afuera desde la cara de fibra lo que los hace más propensos a desprenderse de la fibra (derecha). (D) fibras representante recubierta 200 nL de seda/AAV y el resultante de AAV-conducido ChR2-YFP expresión 2 semanas después de la implantación. La compacta capa de seda/AAV en la izquierda dio lugar a la expresión robusta, mientras que la capa de la derecha asomaba más allá de la cara de la fibra y no resultó casi expresión, probablemente porque la seda/AAV no adhirió a la fibra óptica durante la implantación. Escala bares 0,2 mm (fibras) y 1.0 mm (rebanadas de cerebro). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2: configuración para implantes de capa cónica fibra. (A) la microinyectora se monta sobre el soporte de fibra cónica y cónicas fibras están colocadas ortogonalmente a la jeringa de eyección. (B) en la parte más ancha (recuadro) el punto y expulsar pequeños volúmenes mientras se mueve la jeringa de eyección hacia el punto de la forma cónica. Esto resulta en una capa continua a lo largo de la longitud de la forma cónica. (C) representante fibra cónica recubierta de seda mezclado con verde Fast Green para ayudar en la visualización. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3: capa craneales windows. Seda/AAV puede ser aplicados windows craneales con una pipeta de mano. Una ventana estándar de 3 mm de diámetro puede ser recubierta con una gota de 5 μl, que se seca lentamente a una película plana. Inserción: Expresión GCaMP6f resultante de seda/AAV-revestido craneales windows implantados con y sin durectomies. Esta figura ha sido adaptada de Jackman et al. (2018) ³. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4: almacenamiento de seda/AAV cubrió implantes. (A) para eliminar la humedad residual y preservar la eficacia vírica, los implantes deben almacenarse bajo vacío a 4 ° C hasta su uso. Almacenado de este modo los implantes permanecen viables durante al menos 7 días. (B) expresión resultante de 4 fibras recubiertas de seda/AAV implantadas después de 7 días de almacenamiento. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 5: las fibras ópticas recubierta de seda/AAV-GFP conducir confiablemente expresión. Imágenes fluorescentes de rebanadas de estriado consecutivos 24 implantes. Cada implante fue cubierto con nL 100-400 de 1:1 seda/AAV-GFP. Esta cohorte de implantes indica la capacidad de seda para restringir la expresión para el sitio del implante (en este caso el estriado dorsal). La fluorescencia de GFP se indica en verde; En azul se muestra tinción DAPI. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Discussion

El uso de la seda/AAV a la expresión de proteínas optogentic supera limitaciones de los enfoques que están actualmente en uso. Aunque muchos estudios utilizan inyecciones de AAV para expresar proteínas de optogenetic, es un reto para alinear la expresión hasta la punta de las fibras ópticas, a regiones alrededor de la longitud de las fibras cónicas y a la región de la visión de una lente GRIN. Debido a desalineamiento entre componentes ópticos y optogenetic expresión, inyecciones estereotáxicas pueden ser no fiables, y no de muchos experimentos. La seda/AAV etiquetado método que Describimos aquí soluciona este problema. También simplifica el procedimiento mediante la eliminación de una segunda etapa quirúrgica y en algunos casos eliminando la necesidad de una segunda cirugía. También puede ser difícil de utilizar virus para lograr expresión generalizada bajo ventanas craneales y experimentador realiza normalmente largas cirugías para inyectar el virus en varias ubicaciones. La capacidad para obtener la expresión generalizada sobre grandes regiones corticales por simplemente capa craneal ventanas seda/AAV es una simplificación que elimina la necesidad de las muchas inyecciones invasivas.

Otra ventaja potencial del método de seda/AAV es que puede inducir menos inflamación en los tejidos neuronales en comparación con las inyecciones virales. Inyección de alto-título AAV en el cerebro puede causar respuestas inflamatorias como astrocytosis reactivo que tienen el potencial para alterar celular y circuito propiedades^14,15 (aunque estas complicaciones potenciales son generalmente ignora). Películas de seda inducen poca respuesta inmunogénica en sus¹³ y seda/AAV películas esperan a liberar virus a lo largo de muchas horas o días,¹⁶, que puede reducir la carga viral en el tejido circundante y respuestas inmunogénicas. Con los enfoques convencionales en los que la implantación de un dispositivo es precedida por una inyección de AAV, respuestas inflamatorias pueden surgir de la implantación y la inyección. En el futuro será conveniente comparar sistemáticamente enfoques convencionales y el método de seda/AAV determinar si seda/AAV películas reduce en general las respuestas inflamatorias.

Varios pasos son esenciales para el uso exitoso de seda/AAV. Lo más importante, la capa de fibras ópticas debe hacerse con cuidado como se describe en los métodos y la ubicación de las películas secas debe ser evaluada cuidadosamente por inspección visual bajo un microscopio para asegurarse de que las películas son compactas, en el lugar correcto, y se adhieren a la cara de la fibra óptica. Cualquier seda/AAV en los lados de la fibra óptica dará lugar a la expresión fuera de la región de interés, y misshaped películas que sobresalen de la cara de la fibra pueden romperse durante la implantación y llevar a poco fiables o no expresión. Las técnicas que describimos para aplicación de seda/AAV a dispositivos implantables se pueden adaptar al uso de cualquier material son que están disponibles y permiten la deposición exacta de volúmenes pequeños de seda/AAV.

Un poco de práctica es necesaria para lograr resultados precisos y reproducibles. Si la expresión es observada a lo largo de la pista de la fibra, es probable que la película seda secos en el lado de la fibra en lugar de la cara de la fibra. Repita el proceso de fabricación e inspeccione de cerca implantes secados para las muestras que películas se están secando en el lado de la fibra. Porque películas de seda/AAV son ópticamente transparentes, puede ayudar a la práctica aplicación de seda mezclada con tinte verde Fast Green o un tinte similar a visualizar mejor la forma de las películas resultantes (figura 2). Si no hay ninguna expresión, es probable que la película seda desalojar de la punta de la fibra durante la implantación. Sugerimos el uso de virus stock título al hacer implantes. Para fibras ópticas, esto reduce el volumen total que se debe aplicar a las fibras de pequeño diámetro. Si el tamaño de la capa es una preocupación considerar ya la espera entre cada aplicación de nL 10 para permitir el secado completo de la gota depositada. Gotas de seda/AAV sequen más rápido bajo una lámpara caliente. Para windows craneales, virus de alto título puede ser necesario suministrar suficiente carga viral a través de la pia o dura. Ciertos tipos de implantes pueden disolver seda y lanzar AAV más fácilmente que otros. Hemos encontrado que windows craneales implantados sobre la superficie del cerebro requieren una relación más baja de virus de seda para lograr la expresión confiable, tal vez debido a diferentes dinámicas de fluido espinal cerebral o actividad de la proteasa. Si la expresión no se puede aumentar mediante el aumento de las concentraciones efectivas de AAV, disminuyendo el volumen de seda acuosa es una alternativa plausible.

Por último, es importante almacenar los componentes ópticos correctamente y muy pronto los implantes después de que están preparados. Hemos demostrado que fibras recubiertas que son refrigeradas en vacío pueden conservarse durante muchos días antes de usar. Almacenaje del vacío elimina la humedad residual¹⁷ que puede reducir la solubilidad de las películas de seda y también ayuda a mantener la eficacia vírica. Idealmente, debería ser implantadas fibras ópticas dentro de las 24 horas de fabricación. Sin embargo, nos encontramos con que las fibras de seda/AAV-revestido almacenan bajo niveles similares de coche vacío de expresión cuando se implantan 7 días después de la fabricación (Figura 4B). En cambio, windows craneales revestidos y lentes GRIN condujeron la expresión más confiable cuando fueron secados a temperatura ambiente y utilizarse dentro de horas de preparación. La razón de esta disparidad sigue siendo confusa. Necesitan estudios adicionales pueden ser para perfeccionar las condiciones de preparación y almacenamiento de información para extender el tiempo de almacenamiento.

Seda/AAV-cubrió las ventanas craneales tienen un potencial considerable porque ellos drásticamente acortan los tiempos quirúrgicos y son muy fáciles de fabricar, pero en la actualidad este método tiene limitaciones. Windows craneales revestidos uniformemente grandes áreas de la corteza de la etiqueta y conducen suficiente expresión en capa 2/3 de GCaMP proyección de imagen, con algo menos expresión en capas más profundas. Sin embargo, las inyecciones estereotáxicas unidad expresión más robusta y proporcionan más control sobre las capas destinados a la expresión. Expresión confiable sólo se logró cuando se retiró la dura. Aunque la dura se quita a menudo para que muchos experimentos de proyección de imagen de 2 fotones mejorar la calidad de imagen⁸, para muchos experimentos es deseable obtener el etiquetado de una manera menos invasiva. Por lo tanto hemos explorado nuestra capacidad para usar seda/AAV a regiones corticales de la etiqueta sin quitar la dura. Obtuvimos algunos etiquetado, pero es posible que esto era una consecuencia de dañar la duramadre en el proceso de preparación de la craneotomía. Estudio adicional es necesario para que windows craneales revestidos para confiablemente la corteza de la etiqueta sin quitar la dura.

La preparación de fibroína de seda acuosa de capullos de Bombyx Mori se describe detalladamente en Rockwood et al. (2011) ¹⁸. fibroína de seda acuosa está ahora disponible en el mercado (5% w/v). Aunque la mayoría de nuestros experimentos se realizaron utilizando las poblaciones de fibroína de seda acuosa preparadas en nuestro laboratorio (5-7.5% w/v), hemos obtenido resultados similares utilizando la fibroína acuosa comercial. Fibroína acuosa es estable a 4 ° C hasta 3 meses, después de que transiciones espontáneamente líquido a hidrogel¹⁸. Recomendamos que la fibroína se divide en parte alícuota ~ 1 mL y almacenados a-80 ° C. Una alícuota de trabajo 1 mL (suficiente para cubrir cientos de implantes) puede ser almacenada a 4 ° C y utilizada hasta que empiece a gelificarse. Tenga cuidado de no agitar, vortex, agitar o pipeta agresivamente fibroína acuosa, las fuerzas de corte pueden llevar a congelación^19,20.

Seda/AAV películas permiten una amplia gama de patrones de expresión, de la expresión cortical generalizada bajo windows craneales, precisa expresión subcortical en la punta de una fibra óptica de pequeño diámetro. Estas técnicas fueron desarrolladas para tomar ventaja de los vectores de expresión de AAV común pero es probable que podían ser usadas para dispersar a otros vectores de expresión como lentivirus o virus de la rabia en el cerebro. Películas de seda también podrían ser fabricadas en formas tridimensionales para mejorar la liberación viral en tejido. Por ejemplo, en orden a la expresión fuerte de disco bajo windows corticales sin el uso de una durotomía, windows craneales podrían ser cubiertos con arreglos de seda microneedles que atravesaría el virus dura y liberación en capas corticales más profundas²¹. Refinamiento adicional probablemente dará lugar a propiedades mejoradas de liberación del virus y nuevas aplicaciones para las películas de seda/AAV.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Aqueous silk fibroin	Sigma	5154-20ML	Aqueous Silk Fibroin (5% w/v) for making films
Microinjector to deposit silk/AAV	Drummond	3-000-207	Nanoject III nanoliter injector
Manipulator to hold implants	Narashige	MM-33	Micromanipulator
Stereoscope to visualize silk deposits	AmScope	SM-6TX-FRL	3.5X-45X Trinocular articulating zoom microscope with ring light
Vacuum chamber to store implants	Ablaze	N/A	3.5 Quart Vacuum Vac Degassing Chamber
Optional, implant holder for storage	N/A	N/A	To store premade optical fibers, drill a grid of ~4 mm-deep holes with a diameter just larger than the ferrule diameter into a plastic block.
Optical fiber	Thorlabs	FT200EMT	Ø200 µm Core Multimode Optical Fiber for fiber implants
Ferrules	Kientec	FZI-LC-230	LC Zirconia Ferrule for fiber implants
Various materials for manufacturing chronic fiber implants	Various	N/A	For detailed procedure, see Ung K, Arenkiel BR. Fiber-optic implantation for chronic optogenetic stimulation of brain tissue. Journal of visualized experiments: JoVE. 2012(68).
Tapered fiber implants	Optogenix	Lambda-B	Tapered fiber implants
GRIN lenses	GoFoton	CLH-100-WD002-002-SSI-GF3	GRIN lenses
Small glass cranial windows	Warner	64-0726 (CS-3R-0)	Small round cover glass, #0 thickness
Large glass cranial windows	Warner	64-0731 (CS-5R-0)	Small round cover glass, #0 thickness
Various materials for manufacturing cranial windows	Various	N/A	For detailed procedure, see Goldey GJ et al. Removable cranial windows for long-term imaging in awake mice. Nature protocols. 2014 Nov;9(11):2515.