In Vivo Riktade uttrycket av Optogenetic proteiner med hjälp av Silk/AAV filmer

Summary

Här presenterar vi en metod för att leverera viral uttryck vektorer i hjärnan med hjälp av silk fibroin filmer. Denna metod tillåter riktade leverans av uttrycket vektorer med silke/AAV belagda optiska fibrer, avsmalnande optiska fibrer och kraniala windows.

Abstract

Strävan att förstå hur neurala kretsar bearbeta information för att driva beteendemässiga utgång har varit kraftigt understödda av nyligen utvecklade optiska metoder för att manipulera och övervaka aktiviteten hos nervceller i vivo. Dessa typer av experiment är beroende av två huvudkomponenter: 1) implanterbara produkter som ger optisk åtkomst till hjärnan, och 2) ljuskänsliga proteiner som ändra neuronal excitabilitet eller ge en avläsning av neuronal aktivitet. Det finns ett antal sätt att uttrycka ljuskänsliga proteiner, men stereotaxic injektion av virala vektorer är för närvarande den mest flexibla metoden eftersom uttrycket kan kontrolleras med genetiska, anatomisk och tidsmässig precision. Trots den stora nyttan av virala vektorer, leverera viruset till platsen för optisk implantat innebär många utmaningar. Stereotaxic virus injektioner krävande operationer som öka kirurgisk tid, öka kostnaderna för studier och utgöra en risk för djurets hälsa. Omgivande vävnad skadas fysiskt genom injektionssprutan och immunogent inflammation som orsakas av abrupt leverans av en bolusdos på hög-titer virus. Justera injektioner med optisk implantat är särskilt svårt när inriktning små regioner djupt inne i hjärnan. För att övervinna dessa utmaningar, beskriver vi en metod för beläggning med flera typer av optiska implantat med filmer består av silke fibroin och Adeno-associerade virala (AAV) vektorer. Fibroin, en polymer som härrör från kokongen Bombyx Mori, kan kapsla in och skydda biomolekyler och kan bearbetas till former alltifrån lösliga filmer till keramik. När inopererad i hjärnan, släpper silke/AAV beläggningar virus i gränssnittet mellan optiska element och omgivande hjärnan, körning uttrycket just där det behövs. Denna metod implementeras enkelt och lovar att underlätta in-vivo studier av neural krets funktion.

Introduction

Det senaste decenniet har producerat en explosion av bakåtkompilerade ljuskänsliga proteiner för övervakning och manipulera neural aktivitet¹. Virus ger oöverträffad flexibilitet för att uttrycka dessa optogenetic verktyg i hjärnan. Jämfört med transgena djur, är virus mycket lättare att producera, transportera och lagra, möjliggör snabb implementering av de nyaste optogenetic-verktyg. Uttryck kan riktas genetiskt distinkta neuronala populationer och virus konstruerade för retrograd kan även användas för att rikta uttryck baserat på neuronal anslutning².

Virus introduceras vanligen med stereotaxic injektioner, som kan vara tidskrävande och utmanande. Exakt inriktning små regioner kan vara svårt, medan körning uttrycket över breda områden ofta kräver många injektioner. Dessutom när en optisk enhet är därefter inopererade i hjärnan att leverera ljus i vivo, måste implantatet anpassas med viral injektionen. Här beskriver vi ett enkelt implementerad metod för att leverera virala vektorer till vävnaden runt ett implantat med hjälp av silk fibroin filmer³. Silk fibroin är kommersiellt tillgängliga, tolereras väl av neurala vävnader och kan användas för att producera material med varierande egenskaper. Silk filmer kan tillämpas på implantat använder gemensamma laboratorieutrustning som Mikroskop pipetter eller hand pipetter. Silke/AAV filmer eliminera kravet på två kirurgiska ingrepp och säkerställa att virus-medierade uttryck är korrekt justerad till optiska implantatet. Det resulterande uttrycket är begränsad till spetsen av fibrer, och resulterar i mindre oönskade uttryck längs fiber spåret än stereotaxic injektioner.

Förutom att producera riktad uttryck på spetsen av små fibrer, silke/AAV filmer kan användas för att köra utbredd (> 3 mm diameter) kortikala uttryck under kraniala windows. In vivo 2-photon avbildning av fluorescerande aktivitetssensorer har blivit ett oumbärligt verktyg för att utvärdera rollen av neuronal aktivitet i körning sensoriska och kognitiv bearbetning. Däremot för att köra enhetligt uttryck över de breda kortikala områdena, praktiker ofta utföra flera injektioner. Dessa injektioner kan vara mycket tidskrävande och kan leda till inkonsekvent uttryck över synfältet. Däremot är silke/AAV-belagda kraniala windows extremt lätt att tillverka, kraftigt minska den tid som krävs för operationer och mest anmärkningsvärt drive uttryck hundratals mikrometer under kortikala ytan.

Protocol

Alla experiment med djur utfördes i enlighet med protokoll som godkänts av Harvard ständiga kommittén för djur hand följande riktlinjer beskrivs i oss NIH Guide för skötsel och användning av försöksdjur. Vuxna C57BL/6 möss oavsett kön (6-15 veckors ålder) användes för alla experiment.

1. skaffa Aqueous Silk Fibroin

1. Laga eller köpa aqueous silk fibroin (5-7,5% w/v).

2. blanda Aqueous siden med AAV uttryck vektorer

1. Välja en AAV uttryck vektor att köra den optogenetic protein eller fluorescerande indikator val.
   Obs: För att minimera volymen av silke/AAV som måste tillämpas på implantat medan du fortfarande kör robust uttryck, rekommenderas lager-titer AAV (lager titrar som normalt erhålls från vector kärnor är runt ~ 10¹³ gc/mL).
2. Omedelbart före beläggning implantat, Tina en alikvot av AAV och kombinera med 5-7,5% vattenlösning silk fibroin (denna blandning kommer att betecknas som silke/AAV). I en 200 µL PCR-röret, blanda aqueous fibroin och AAV i förhållandet 1:1 (för kraniala windows 1:4) omedelbart före ansökan. Försiktigt Pipettera lösningen in och ut flera gånger att noggrant blanda fibroin och AAV.
3. Hålla silke/AAV blandning på is före användning.

3. Förbered utrustning för tillverkning och lagring av silke/AAV-belagd enheter

1. Anskaffa utrustning för beläggning optiska fibrer och Gradient-Index (GRIN) objektiv (siffrorna 1, 2).
   1. Konstruera en stabil bleck hållare. För att hålla keramiska ferrules, borra 1,25 mm hål i ett block av ¼ ”ark akryl. Tryck hål om du vill infoga ställskruvar från sida att hålla skoningar på plats.
      Obs: Varje klämma kan användas för detta ändamål.
   2. Placera en manipulator med sub millimeter precision till flytta de optiska fibrerna (stereotaxic apparater eller andra precision micromanipulator).
   3. Montera en stabil hållare för att placera microinjector.
   4. Använd ett Stereoskop för att visualisera optiska fibrer och silk droplet.
   5. Placera en ljuskälla för att lysa upp de optiska fibrerna.
2. Förbereda utrustning för beläggning kraniala windows (figur 3).
   1. Välja någon P10 vi rekommenderar.
   2. Skaffa en behållare med lock.
      Obs: Alla behållare med silikon botten föreslås — mjuk botten underlättar lyft upp kraniala windows.
3. Förbered utrustningen att lagra färdiga implantat (figur 4).
   1. Skaffa en liten vakuumkammare (1-5 L).
   2. Kontrollera att det finns utrymme för att lagra implantat i kylskåp 4 ° C.

4. Applicera Silk/AAV Film till enheter

1. Beläggning optiska fibrer till drive fokal uttryck vid fiber spets
   1. Förbereda kronisk fiber implantat som tidigare beskrivits⁴.
   2. Före användning, skölj implantat med etanol, och sedan med ultrarent vatten att säkerställa att de optiska fibrerna är rena.
      Obs: Silk filmer följer mer tillförlitligt för att rengöra glasytor.
   3. Förbereda en enhet att hålla fiber Doppskor. För typiska 1,25 mm diameter ferrules, använda ett block ¼ tum klar akryl, med ~1.3 mm hål, och knackade ställskruvar som kommer in från sidan till hål implantat ordentligt på plats (figur 1A).
   4. Montera bleck innehavaren in en stereotaxic apparat (eller någon manipulation lösning med submillimeter precision) utrustad med en microinjector. Placera hållaren bleck ovanför microinjector och applicera silke/AAV blandningen underifrån.
      Obs: Detta är eftersom tillämpningar av stora volymer från ovan resulterade i silke/AAV som inte var begränsade till spetsen. Dock kan tillämpningen av många små sekventiell volymer från ovan eller nedan producera AAV/silke insättningar som är begränsade till spetsen (även om vi föredrar att applicera underifrån).
   5. Dra en standard intrakraniell injektion pipett från borosilikatglas kapillär.
      1. Att göra det lättare att
      2. Att producera en injektion spets med en ren platt spets av önskad diameter, håll en pipett i varje hand och Använd den tjocka delen av koniska på en pipett för att poäng andra pipetten på önskad rast plats.
      3. Försiktigt gnugga fram och tillbaka i en sågning rörelse (glas-på-glas scoringmetod).
      4. Applicera lätt tryck till spetsen av skårade pipetten med kroppen av andra pipetten att uppnå en clean break efter scoring pipetten.
   6. Placera ett Stereoskop för att ge en klar bild av optisk fiber ansikten.
      Obs: Förstoring bör vara tillräcklig för att exakt Placera injektion pipetten ovanför ansiktet av optiska fibrer.
   7. Sätt in fiber implantat i hållare med hjärnan-sidan av den optiska fibern nedåt.
   8. Ladda injektion pipetten med silke/AAV lösning, när det gäller någon standard intrakraniell injektion⁵. Ladda det belopp som krävs för antalet implantat som görs, plus ~ 30% extra att rymma förluster på grund av pipetter igensättning. Till exempel om 10 implantat görs, då med 100 nL insättningar och uttag ~1.3 µL.
      Obs: Silke/AAV får torka på pipettspetsen mellan avkastad, vilket kan täppa till pipetten. Stor diameter pipetter (50-100 µm) är mindre benägna att täppa. Träskor kan rubbas av skonsam borstning ner spetsen på pipetten med ett vått papper torka eller alkohol.
   9. Manövrera injektion pipetten tills den vidrör eller nästan vidrör mitten av optisk fiber ytan. Mata ut 10-20 nL silke/AAV lösning. Dra tillbaka pipetten.
      Obs: Från leverans är inte kritisk, men typiska priser är 5-20 nL/s.
   10. Iaktta bolus av silke/AAV på den plana ytan som visas som en flytande kupol som torkar till en platt film inom ~ 1 min (figur 1B).
   11. Upprepa steg 4.1.9-4.1.10 tills den önskade mängden silke/AAV är deponeras (totalt 20-200 nL för de flesta tillämpningar). När du förbereder flera implantat, gäller silke/AAV för ett implantat och sedan gå vidare till bestryka andra implantat innan han återvände till först.
   12. Låt 1 h för torkning innan du flyttar implantat.
   13. Vakuum desiccate övernattning på ~ 125 Torr (-25 i. Hg), 4 ° C. Gör detta genom att placera hållaren för hela bleck i en vakuumkammare.
   14. Utvärdera form och placering av resulterande silk filmen under en högeffekts Mikroskop. Säkerställa att filmer är begränsade till spetsen av optisk fiber ytan, blir relativt tunn (> 100 µm), och symmetrisk (figur 1 c).
       Obs: Stora eller asymmetriska silke/AAV filmer kan rubba från fibern under implantation (figur 1 d). Den vanligaste orsaken till problem uppstår från tillämpningen av enstaka stora volymer i stället för sekventiell tillämpningen av många små volymer.
2. Beläggning avsmalnande optiska fibrer bilresa uttrycket längs fiber axeln
   1. Få avsmalnande optisk fiber implantat och utför steg 4.1.2-4.1.8, förutom att den avsmalnande fibern är placerad sidled så att det är vinkelrät mot injektorn (figur 2A). Placera injektorn ovan avsmalnande fibern.
      Obs: Lastning flytande droppar på avsmalnande fibrer poser till utmaningar, eftersom ytspänning tenderar att orsaka droppar att hoppa tillbaka på injektion pipetten eller migrera upp avsmalnande fibern. Mindre injektion pipetter (30-50 µm diameter) bidra till att lösa detta problem men ökar risken för att injektion pipetten kommer att täppa till. På grund av ytspänningen, droppar tenderar att följa området i största yta, så optimal injektionen Pipettera storlek är beroende av storleken på den koniska fibern och en tolerans för enstaka täppa.
   2. Placera silke/AAV injektion pipetten mot sidan av optisk fiber i början av koniska. Kontrollera injektionsstället pipetten är rörande den optiska fibern.
   3. Mata ut 20 nL av silke/AAV att starta beläggningsprocessen. Säkerställa att droplet-programmet följer den optiska fibern och förblir på gränssnittet för fiber/pipetten. Försiktigt veken droplet-programmet mot slutet av fiber spetsen som den silk/AAV torkar (~ 45 s). Hålla injicera pipetten kommer i kontakt med snabbtorkande droplet-programmet att undvika igensättning pipettspetsen.
      Obs: Varje insättning bör pälsen cirka 400 µm av avsmalnande fiber (figur 2B).
   4. När den första bolusinjektionen torkat nästan helt, mata ut ytterligare 20 nL och fortsätta fuktspridande droplet-programmet längs koniska.
      Obs: Det flytande silket kommer följa torkade silke, förankra ena änden av droplet-programmet som pipetten flyttar längs koniska.
   5. Upprepa steg 4.2.4 genom att mata ut små mängder av silke/AAV och gradvis ritning lösningen upp för koniska. 5-6 avkastad är tillräckliga för att korsa ytan av en 2,5 mm Kona.
   6. För att driva mer enhetliga uttryck runt alla sidor av fiber, rotera fibern och upprepa steg 4.2.2-4.2.5 tills den önskade mängden silke/AAV har deponerats.
   7. Om en hängande strand av torkade silke/AAV sträcker sig bortom fiber tipset, försiktigt skära strand med sax, eller använda utskjutningen pipetten att böja strand tillbaka och följa det koniska av fiber.
   8. Låt 1 h för torkning innan du flyttar implantat.
   9. Vakuum desiccate övernattning i 4 ° C. Hela bussningen hållaren kan placeras in i en vakuumkammare.
   10. Utvärdera form och placering av resulterande silk filmen under en högeffekts Mikroskop.
       Obs: Filmer behöver inte vara helt enhetliga men ska inte ha knölar som sträcker sig mer än 100 µm bortom ytan av fibern för att minimera skador på omgivande vävnad under implantation (figur 3 c). För att minimera filmen storlek, är det viktigt att varje droppe är helt torr innan efterföljande insättningar görs.
3. Beläggning linsimplantat GRIN
   1. Erhålla GRIN linser^6,7 och upprepa steg 4.1.2-4.1.8. Injektorn kan monteras ovan.
   2. Deponera silke/AAV i en enda utmatning (1 µL för en lins med 1,0 mm i diameter).
      Obs: Detta kommer att ge en kupol av vätska som följer ansiktet av linsen och torkar för att producera en enhetlig film (100-200 µm tjock). I händelse av att en enda stor utmatning torkar ojämnt och producerar en film som är tjockare nära kanterna på GRIN linsen, försök dock sätta in flera mindre droppar (100-200 nL) i mitten av objektivets yta (så att varje droppe torka innan du sätter in Nästa) att säkerställa att filmen kommer att driva uttryck i mitten av synfältet.
   3. Låt 1 h för torkning innan du flyttar implantat.
   4. Utvärdera form och placering av resulterande silk filmen under en högeffekts Mikroskop för att se till att filmen täcker ytan av linsen.
4. Beläggning kraniala glasfönster
   1. Förbereda glas kraniala windows genom att följa två 3 mm diameter runda coverslips (nr 1 tjocklek) till ett 5 mm diameter fönster med optisk lim (för detaljer, se Goldey et al. 2014⁸).
   2. Blanda silke: virus i förhållandet 1:4 att minska den totala mängden silke i filmen. Alltför stora mängder silk löser sig inte under kraniala windows efter implantationen. Titrering experiment kan krävas att bestämma baserat och volym som ger önskat uttryck profilen.
   3. Hand en pipett en 5 µL droplet på ytan av de 3 mm (hjärnan inför) täckglaset. Droplet-programmet bör sprida ut för att täcka hela glasytan (figur 3).
   4. Låt 2-3 h för torkning innan du flyttar windows.

5. förvaring av silke/AAV-belagda implantat

1. Lagra silke/AAV-belagda optiska fibrer i kylda vakuum exsickator (~ 125 Torr, 4 ° C) före användning (figur 4A).
2. Förvara inte kraniala windows och GRIN linser under vakuum, som stora silk filmer lagras under vakuum misslyckas att helt upplösa efter implantationen. Implantatet kraniala windows och GRIN linser omedelbart efter torkning, eller inom en dag av tillverkning om lagras vid atmosfärstryck och 4 ° C.

6. implantera enheterna

1. Inför implantatkirurgi djur som tidigare beskrivits⁴.
   1. Kortfattat, söva möss med en intraperitoneal injektion med Ketamin/xylazin (100/10 mg/kg) och kontrollera djup anestesi med en mild tå-nypa. Raka skallen i området i implantatet och rengör hårbotten med jod och alkohol.
   2. Montera djur i en stereotaxic enhet och komplettera anestesi med en blandning av syre och isofluran (1-2%). Gör ett snitt i hårbotten över området av intresse, och utföra en kraniotomi som är stor nog att rymma implantatet.
2. Implantatet optiska fibrer⁹ och microendoscope linser¹⁰ enligt tidigare publicerade förfaranden. Handtag implantat med omsorg, som silke/AAV insättningen kan vara knackade bort genom en ofullkomlig kraniotomi eller implantatet att fånga i utkanten av skallen. Sänka implantatet i hjärnan långsamt (~ 2 mm/min).
3. Implantatet kraniala windows som beskriver tidigare⁸. Inte röra den bestrukna sidan av fönstret och undvika sköljning fönstret med vätska om utför sondmatning, eftersom detta kan tvätta bort viruset. För att uppnå maximal uttryck, utföra en durotomy.

7. uttrycket utvärderas och felsökning

1. För att utvärdera uttrycket av viralt uttryckta proteiner, tillåta ~ 2-3 veckor för viruset att köra uttrycket och sedan utföra intracardial perfusion med 4% paraformaldehyd fosfat buffrad koksaltlösning¹¹ och processen hjärnvävnad för lysrör mikroskopi¹².
2. Utvärdera uttrycket med hjälp av fluorescerande mikroskopi till bild uttrycksmönstret av fluorophore-taggade optogenetic proteiner.
3. Om yttrandefrihet är otillräcklig, öka mängden virus i beläggningar genom att antingen öka den totala volymen av silke/AAV beläggningen eller helst genom att använda en högre titer virus.

Representative Results

För att bedöma framgången av silke/AAV filmer i körning uttrycket, vi perfusion djur 2-3 veckor efter implantationen och förberett hjärnan skivor från regionen av intresse. Fluorescens bilder av fluorophore-taggade optogenetic proteiner (ChR2-YFP) som ett mått på omfattningen av uttrycket (figur 1 d). Typiska optiska fibrer (230 µm diameter) kan lätt rymma 200 nL av silke/AAV. Med praktiken kan praktiker uppnå mycket tillförlitlig uttryck runt spetsen av implanterade fibrer (figur 5).

För att bedöma uttryck som drivs av silke/AAV-belagda kraniala windows, börja imaging början 7-10 dagar efter implantationen. Vi har använt två-photon imaging för visualisering, men andra metoder såsom fluorescens imaging med en CCD kan också användas. Två möjliga problem med belagda kraniala windows är otillräckligt uttryck och silk filmer som inte löses upp och skymma synfältet. För att öka uttryck, föreslår vi att utföra en durectomy före implantation fönstret, eller öka mängden virus i filmen. Vi uppnått det bästa uttrycket med en 1:4 blandning av siden och lager-titer AAV, respektive. Medan detta representerar ett betydligt större antal viruspartiklar än används vanligen i stereotaxic injektioner, kontrar minskad kirurgiska tiden ytterligare marginalkostnaden för virus. Under tiden, om silk filmer inte lös under fönstret, ytterligare minska mängden silke används för att bestryka fönstret. Det totala beloppet av silke i belagda windows är 10 - 100 gånger mer än på fiber implantat, och filmen är mindre inbäddade i vävnad och kan således inte utsättas för samma nivåer av proteolytiska aktivitet än kan upplösa silk filmar¹³. Förekomsten av vissa silk är dock nödvändigt för att uppnå uttryck under windows³, sannolikt eftersom en film gjord av virus ensam sköljs bort av interstitiell vätska under operation.

Figur 1: tillämpa silke/AAV filmer till optiska fibrer. (A) kronisk fiber implantat placeras fiber-ner in i en hållare (infälld) monterad på en XYZ-översättare. En fast microinjector nedanför fibrerna doserar silke/AAV på fiber tips. Ett Stereoskop tillåter visualisering av processen. (B) gäller silke/AAV fiber tips i små volymer (10-20 nL). Efter Utkastande en bolus, tillbaka pipetten och tillåta ~ 60 s för droplet-programmet att torka till en platt film. Upprepa processen tills önskad volym har tillämpats till fiber spetsen. (C) inspektera silk beläggningar. Optimal beläggningar ska centreras på fiber spets (vänster), medan felaktig beläggningar sträcker sig utåt från fiber ansiktet vilket gör dem mer benägna att få bort från fiber (höger). (D) representativa fibrer belagd med 200 nL av silke/AAV, och den resulterande AAV-driven ChR2-YFP uttryck 2 veckor efter implantationen. Den kompakta silke/AAV beläggningen på vänster resulterade i robust uttryck, medan beläggningen på rätt stack förbi ansiktet på fibern och resulterade nästan inget uttryck, sannolikt eftersom den silk/AAV inte klibbade till den optiska fibern under implantation. Skala barer 0.2 mm (fibrer) och 1,0 mm (hjärnan skivor). Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 2: konfigurationen av beläggning avsmalnande fiber implantat. (A) microinjector monteras ovanför avsmalnande fiber innehavaren och avsmalnande fibrer är placerade vinkelrätt på utmatning sprutan. (B) börja på den bredaste punkt (infälld) och mata ut små volymer medan du flyttar utmatning sprutan mot peka av koniska. Detta resulterar i en kontinuerlig beläggning längs längden av koniska. (C) representativa avsmalnande fiber belagd med siden blandat med snabbt grönt till stöd i visualisering. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 3: beläggning kraniala windows. Silke/AAV kan vara tillämpad kraniala windows med hand pipett. Ett fönster med standard 3 mm i diameter kan vara belagd med en 5 µL droplet, som torkar långsamt till en platt film. Infällt: GCaMP6f uttryck som härrör från silke/AAV-belagda kraniala windows implanteras med och utan durectomies. Denna siffra har anpassats från Jackman o.a. (2018) ³. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.

Figur 4: lagra silke/AAV belagda implantat. (A) för att ta bort kvarvarande fukt och bibehålla viral effekt, implantat bör förvaras under vakuum vid 4 ° C tills används. Implantat som lagras på detta sätt förblir lönsamt för minst 7 dagar. (B) uttryck som härrör från 4 silke/AAV belagd fibrer implanteras efter 7 dagars lagring. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 5: silke/AAV-GFP belagda optiska fibrer tillförlitligt köra uttrycket. Fluorescerande bilder av skivor från 24 på varandra följande striatum implantat. Varje implantat var belagda med 100-400 nL 1:1 silke/AAV-GFP. Denna kohort av implantat anger silk förmåga att begränsa uttrycket till implantatstället (i detta fall dorsala striatum). GFP fluorescens indikeras i grönt; DAPI färgning visas i blått. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Discussion

Användning av silke/AAV att rikta uttrycket av optogentic proteiner övervinner begränsningar av metoder som för närvarande används. Även om många studier använder framgångsrikt AAV injektioner för att uttrycka optogenetic proteiner, är det utmanande att anpassa uttrycket till spetsen av optiska fibrer, till regioner runt längden på avsmalnande fibrer och till regionen visning av ett FLIN objektiv. Stereotaxic injektioner kan vara otillförlitliga på grund av förskjutning mellan optiska komponenter och optogenetic uttryck, och många experiment misslyckas. Den silke/AAV märkning metod som vi beskriver här löser detta problem. Det förenklar också förfarandet genom att eliminera ett andra kirurgiska steg och i vissa fall eliminerar behovet av en andra operation. Det kan också vara svårt att använda virus för att få utbredd uttryck under kraniala windows och försöksledaren utför vanligtvis långa operationer för att injicera viruset på flera platser. Förmågan att erhålla utbredd uttryck över stora kortikala regioner av enkelt beläggning kraniala fönster med silke/AAV är en förenkling som eliminerar behovet av många invasiva injektionerna.

En annan potentiell fördel av silke/AAV metoden är att det kan framkalla mindre inflammation i neurala vävnader jämfört med viral injektioner. Injicera hög-titer AAV i hjärnan kan orsaka inflammatoriska svar såsom reaktiva astrocytosis som har potential att ändra cellular och krets boenden^14,15 (även om sådana komplikationer är vanligtvis ignoreras). Silk filmer framkalla lite immunogent svar på sina egna¹³ och silke/AAV filmer är väntat till frige virus under loppet av många timmar eller dagar¹⁶, som kan sänka virusbelastningen i den omgivande vävnaden och minska immunogena Svaren. Med konventionella metoder där implantation av en enhet föregås av en AAV injektion, kan inflammatoriskt svar uppkomma både implantation och injektion. I framtiden kommer det vara önskvärt att systematiskt jämföra konventionella metoder och silke/AAV metod för att bestämma huruvida silke/AAV filmer minskar den totala inflammatoriskt svar.

Flera steg är avgörande för en framgångsrik användning av silke/AAV filmer. Viktigast av allt, beläggning av optiska fibrer måste göras noggrant som beskrivs i metoderna och placeringen av de torkade filmerna bör bedömas noggrant genom okulärbesiktning i Mikroskop för att se till att filmerna är kompakt, på rätt plats, och följer ansiktet av optisk fiber. Någon silke/AAV på sidorna av optisk fiber kommer att leda till intresseanmälan utanför regionen och misshaped filmer som sticker ut utanför ansiktet av fiber kan lossna under implantation och leda till otillförlitliga eller inget uttryck. De tekniker som vi beskriver för gäller silke/AAV för implanterbara produkter kan anpassas till användning av material är som är lättillgängliga och tillåter exakt nedfall av små volymer av silke/AAV.

Att uppnå korrekt, reproducerbara resultat krävs lite övning. Om uttrycket observeras längs spåret av fiber, är det troligt att siden filmen torkat på sidan av fiber i stället för fiber ansiktet. Upprepa tillverkningsprocessen och noga inspektera torkade implantat för tecken på att filmer torkning på sidan av fibern. Eftersom silke/AAV filmer är optiskt transparent, kan det hjälpa att praktiken tillämpa siden blandat med färgämne (snabbt grön eller ett liknande färgämne) för att bättre visualisera formen av resulterande filmer (figur 2 c). Om det finns inget uttryck, är det sannolikt att siden filmen lossnar från fiber spets under implantation. Vi föreslår användning av lager-titer virus när du gör implantat. För optiska fibrer minskar detta den totala volym som måste tillämpas för liten diameter fibrer. Om storleken på beläggningen är en oro överväga att vänta längre mellan varje 10 nL-program för att tillåta fullständig torkning av deponerade droplet-programmet. Silke/AAV droppar torkar snabbare under en varm lampa. För kraniala windows, kan hög-titer virus vara nödvändigt att tillhandahålla adekvat virusmängd över pia eller dura. Vissa typer av implantat kan upplösa silke och släppa AAV lättare än andra. Vi har funnit att kraniala windows implanteras över ytan av hjärnan kräver en lägre andel av silke/virus att uppnå tillförlitlig uttryck, kanske på grund av olika cerebral spinal fluiddynamik eller proteas aktivitet. Om uttrycket inte kan ökas genom att öka effektiva AAV koncentrationer, är minskar volymen av vattenfasen silk ett möjligt alternativ.

Slutligen är det viktigt att lagra de optiska komponenterna korrekt och implantera dem ganska snart efter att de är beredda. Vi har visat att belagda fibrer som är kyld under vakuum kan lagras för många dagar före användning. Vakuum förvaring tar bort kvarvarande fukt¹⁷ vilket kan minska lösligheten av silke filmer, och även bidra till att upprätthålla viral effekt. Optiska fibrer skall helst implanteras inom 24 timmar efter tillverkning. Dock finner vi att silke/AAV-belagda fibrer lagras under vakuum enhet liknande nivåer av uttryck när implanteras 7 dagar efter tillverkning (figur 4B). Däremot körde belagda kraniala windows och GRIN linser mest tillförlitliga uttrycket när de torkas vid rumstemperatur och används inom timmar efter beredning. Anledningen till denna skillnad är fortfarande oklart. Ytterligare kan studier behövas för att förfina beredning och förvaring villkor att ytterligare utvidga lagringstiden.

Silke/AAV-belagda kraniala windows har stor potential eftersom de drastiskt förkorta kirurgiska gånger och är extremt enkel att tillverka, men i dag denna metod har begränsningar. Belagda kraniala windows enhetligt etikett stora områden i cortex och kör tillräckligt uttryck i layer 2/3 för GCaMP imaging, med något mindre uttryck i djupare lager. Dock stereotaxic injektioner driva mer robust uttryck och ge mer kontroll över lager måltavlan för uttryck. Pålitlig uttryck uppnåddes endast när dura togs bort. Även om dura är ofta bort för många 2-photon imaging experiment att förbättra bild kvalitet⁸, för många experiment är det önskvärt att få märkningen på en mindre invasiv sätt. Vi har därför undersökt vår förmåga att använda silk/AAV för att namnge kortikala regioner utan att ta bort dura. Vi fick några märkning, men det är möjligt att detta var en följd av skada dura håller på att förbereda kraniotomi. Ytterligare studier behövs för bestruket kraniala windows som används för att på ett tillförlitligt sätt etikett cortex utan att ta bort dura.

Beredning av vattenhaltigt silk fibroin från kokonger Bombyx Mori beskrivs i detalj i Rockwood et al. (2011) ¹⁸. aqueous silk fibroin är nu kommersiellt tillgängliga (5% w/v). Även om de flesta av våra experiment utfördes med aqueous silk fibroin bestånd tillagas i vårt labb (5-7,5% w/v), har vi fått liknande resultat med hjälp av kommersiella aqueous fibroin. Vattenhaltiga fibroin är stabil vid 4 ° C i upp till 3 månader, varefter det spontant övergår från flytande till hydrogel¹⁸. Vi rekommenderar att fibroin bestånd vara uppdelad i ~ 1 mL alikvot och lagras vid-80 ° C. En 1 mL arbetande alikvot (tillräckligt för beläggning hundratals implantat) kan lagras vid 4 ° C och används tills den börjar gel. Var noga med att inte skaka, vortex, agitera eller aggressivt Pipettera aqueous fibroin, skeva styrkor kan leda till gelation^19,20.

Silke/AAV filmer möjliggöra ett brett spektrum av uttrycksmönster, från utbredd kortikala uttryck under kraniala windows till exakt subkortikala uttryck på spetsen av en liten diameter optiska fibrer. Dessa tekniker har utvecklats för att utnyttja gemensamma AAV uttryck vektorer men sannolikt skulle kunna användas för att skingra andra uttryck vektorer som Lentiviruses eller rabies virus i hjärnan. Silk filmer kunde också tillverkas i tredimensionella former att förbättra viral utsättning i vävnad. Till exempel för att driva starkt uttryck under kortikala windows utan användning av en durotomy, kunde kraniala windows vara belagd med matriser av silke mikronålar som skulle pierca dura och release viruset i djupare kortikala skikt²¹. Ytterligare förfining kommer sannolikt att leda till förbättrade egenskaper för virus release, och nya applikationer för silke/AAV filmer.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Aqueous silk fibroin	Sigma	5154-20ML	Aqueous Silk Fibroin (5% w/v) for making films
Microinjector to deposit silk/AAV	Drummond	3-000-207	Nanoject III nanoliter injector
Manipulator to hold implants	Narashige	MM-33	Micromanipulator
Stereoscope to visualize silk deposits	AmScope	SM-6TX-FRL	3.5X-45X Trinocular articulating zoom microscope with ring light
Vacuum chamber to store implants	Ablaze	N/A	3.5 Quart Vacuum Vac Degassing Chamber
Optional, implant holder for storage	N/A	N/A	To store premade optical fibers, drill a grid of ~4 mm-deep holes with a diameter just larger than the ferrule diameter into a plastic block.
Optical fiber	Thorlabs	FT200EMT	Ø200 µm Core Multimode Optical Fiber for fiber implants
Ferrules	Kientec	FZI-LC-230	LC Zirconia Ferrule for fiber implants
Various materials for manufacturing chronic fiber implants	Various	N/A	For detailed procedure, see Ung K, Arenkiel BR. Fiber-optic implantation for chronic optogenetic stimulation of brain tissue. Journal of visualized experiments: JoVE. 2012(68).
Tapered fiber implants	Optogenix	Lambda-B	Tapered fiber implants
GRIN lenses	GoFoton	CLH-100-WD002-002-SSI-GF3	GRIN lenses
Small glass cranial windows	Warner	64-0726 (CS-3R-0)	Small round cover glass, #0 thickness
Large glass cranial windows	Warner	64-0731 (CS-5R-0)	Small round cover glass, #0 thickness
Various materials for manufacturing cranial windows	Various	N/A	For detailed procedure, see Goldey GJ et al. Removable cranial windows for long-term imaging in awake mice. Nature protocols. 2014 Nov;9(11):2515.