Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Utvinning og analyse av taiwanske grønne Propolis

Published: January 7, 2019 doi: 10.3791/58743
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Department of Biotechnology and Animal Science, National Ilan University

Summary

Vi presenterer en protokoll for bruk av etanol som et løsemiddel og karakterisere taiwanske grønne propolis som viser antibakteriell aktivitet.

Abstract

Taiwanske grønne propolis er rik på prenylated flavonoider og utstillinger et bredt spekter av biologiske aktiviteter, for eksempel antioksidant, antibakterielle, og anticancer seg. Bioaktive forbindelser av taiwanske grønne propolis er propolins, nemlig C, D, F og G. Konsentrasjonen av propolins i taiwanske grønne propolis varierer avhengig av sesong og geografisk plassering. Derfor er det viktig å etablere en standard og repeterbare prosedyre for å bestemme kvaliteten på taiwanske grønne propolis. Her presenterer vi en protokoll som bruker etanol-baserte utvinning, høy ytelse flytende kromatografi og en antibakteriell aktivitetsanalyse for å karakterisere taiwanske grønne propolis kvalitet. Denne metoden angir at 95% og 99,5% etanol utdrag oppnå maksimal tørr saken avkastningen fra taiwanske grønne propolis, og dermed gir de høyeste konsentrasjonene av propolins som har antibakterielle egenskaper. Ifølge disse funnene som nåværende protokollen pålitelig og repeterbare for å bestemme kvaliteten på taiwanske grønne propolis.

Introduction

Propolis er en naturlig resinous blanding produsert av bee arten APIene mellifera. Propolis har vært mye brukt siden antikken i folk medisiner. En studie nylig rapportert at propolis er gunstig for å forebygge mikrobielle infeksjoner og betennelse1. Mange studier har vist at de viktigste bioaktive forbindelsene i propolis er flavonoider, fenoliske syre estere, prenylated p-coumaric syrer og diterpenic syren2,3. Hittil har 10 prenylated flavanone derivater fra taiwanske grønne propolis identifisert gjennom høy ytelse flytende kromatografi (HPLC)4,5,6,7. Den mest tallrike blant disse er propolins C, D, F og G5,7. Betydelig biologiske effekter av taiwanske grønne propolis er korrelert med dens høye innhold av propolins8.

Konsentrasjonen av bioaktive forbindelser i propolis variere avhengig av sesong og geografisk plassering som propolis er oppnådd. Europeiske propolis inneholder hovedsakelig flavonoid aglycone og fenoliske syrer9. Store bioaktive forbindelser i propolis fra Brasil er prenylated p-coumaric syrer, for eksempel artepillin C10. En studie viste at sesongen er en kritisk faktor for å bestemme det totale propolin innholdet i taiwanske grønne propolis11. Propolin innholdet i taiwanske grønne propolis er høyest i sommer (mai - juli) og lavest i vinter11. Antibakterielle eiendom propolis har blitt kjent som en indikator på biologiske aktivitet. Vanligvis har prøver av propolis fra ulike regioner vist en lignende antibakterielle eiendom; for eksempel det er vanligvis effektiv mot nesten alle gram-positive bakteriene og utstillinger en begrenset antibakteriell effekt mot gram-negative bakterier10,12,13. Synergistisk interaksjoner mellom flavonoider i propolis ble vist for å ha en antibakteriell effekt14. Tilsvarende ble taiwanske grønne propolis rapportert å ha en antimikrobiell effekt mot gram-positive bakteriene15. Videre identifisert en studie også en antimikrobiell effekt fra samspillet av propolins i taiwanske grønne propolis8.

Karakterisering av bioaktive forbindelser i propolis er vanskelig fordi dens kjemiske sammensetning kan variere avhengig av kilden opprinnelsesland. Derfor er det nødvendig å etablere en mulig og repeterbare metode for å bestemme kvaliteten på den Taiwanske grønne propolis. Men er ingen standard prosedyre etablert for taiwanske grønne propolis utvinning og påfølgende funksjonell analyse. Flere metoder som blant annet bruker organiske og uorganiske løsemidler foreslått for propolis utvinning16,17,18,19,20. Propolis er en lipofile blanding, har studier vist at organisk utvinning er bedre enn uorganiske utvinning8,18,19. Den totale propolin konsentrasjonen i taiwanske grønne propolis og antibakterielle egenskaper er viktige indikatorer for kvaliteten på taiwanske grønne propolis. Dermed er formålet med denne studien å presentere en protokoll for bruk av etanol som et løsemiddel og prege det antibacterial eiendom av taiwanske grønne propolis.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. forberedelse av etanol-utpakkede forbindelser

  1. Veie 10 g frosne taiwanske grønne propolis, som ble samlet inn fra bikuber i Taiwan fra mai til juli, og male det med krydder jeksel. Bekreft at hele biter av taiwanske grønne propolis er bakken til et fint pulver uten noen store partikler.
  2. Legge til 100 mL ulike konsentrasjoner av etanol (60%, 70%, 80%, 95% og 99,5%) og vann til å skille flasker og bland hver konsentrasjon med 10 g av bakken propolis.
  3. Inkuber ved 25 ° C og riste flasken 250 RPM for 48 timer.
  4. Filtrere etanol ekstrakter gjennom filter papir 25 μm pore størrelse.
  5. Rekonstituer filtratet til deres opprinnelige volum (100 mL) med 95% etanol bruker en volumetriske kolbe.
  6. Lagre etanol ekstrakter på 20 ° C.
    Merk: Protokollen kan pauses her.

2. forberedelse av etanol ekstrakter til HPLC

  1. Konsentrere seg 10 mL av etanol ekstrakter av vakuum fordampning ved 40 ° C i 15 min.
  2. Stek tørr saken ved 45 ° C i 24 timer.
  3. Rekonstituer tørr saken med 10 mL av 95% etanol.
  4. Filteret 1 mL av etanol trekker ut bruker filtere sterile sprøyter 0,45 µm pore størrelse.
  5. Filtrere nytt etanol ekstrakter bruke filtere sterile sprøyter 0.22 µm pore størrelse. Filtratet hentes og kan analyseres direkte bruker mye HPLC.

3. analyse av Propolin innhold med HPLC

  1. Etablering av standard kurver av propolins
    1. Forberede 1 L av mobile fase av 88.8:11.2 (v/v) metanol: vann løsning.
    2. Klargjør fortsettelsene fortynninger av propolin standard (C, D, F og G) konsentrasjoner (15.625 mg/mL, 31.25 mg/mL, 62.5 mg/mL og 125 mg/mL, henholdsvis) bruker den mobile fase løsningen som et løsemiddel.
    3. Injisere 20 µL av propolin standard konsentrasjoner i kolonnen omvendt-fase sekvensielt fra lav konsentrasjon til den høye konsentrasjonen.
    4. Angi kolonnen HPLC på 30 ° C og flyt til 1 mL/min.
    5. Angi Bølgelengden av UV-detektor til 280 nm og opptaker tid til 20 min.
    6. Analysere standarder minst 3 x.
    7. Tegne målingen svaret (y-aksen) mot konsentrasjonen (x-aksen) bruker beregning ark programvare, og lage en standard kurve med ligningen og R-kvadrat verdi.
  2. Analyse av etanol pakke s
    1. Injisere 20 µL av etanol ekstrakter fra trinn 2.5 i kolonnen omvendt-fase.
    2. Angi kolonnen HPLC på 30 ° C og flyt til 1 mL/min.
    3. Angi Bølgelengden av UV-detektor til 280 nm og opptaker tid til 20 min.
    4. Analysere standarder minst 3 x.
    5. Beregn konsentrasjonen av propolin i etanol utdrag, ved hjelp av formelen for standardkurven hentet i trinn 3.1.7 som bruker peak området for hver propolin.

4. minste inhibitoriske konsentrasjon og Minimum bakteriedrepende konsentrasjon analyse

Merk: Metoden microdilution brukes til å evaluere antibakterielle effekten av etanol-utdraget propolins fra taiwanske grønne propolis.

  1. Utarbeidelse av testen organismer
    1. Tine bakteriell påkjenninger, Staphylococcus aureus og Escherichia coli og deretter kultur dem i tryptic soya buljong og næringsrik buljong, henholdsvis på 37 ° C i 24 timer.
    2. Passasje S. aureus tryptic soya buljong og E. coli bruker næringsrik buljong for to generasjoner, og deretter beregne colony-forming enheter ved å telle personlige kolonier på en agar plate.
  2. Utarbeidelse av etanol utdrag for antibakteriell aktivitet testing
    1. Konsentrere etanol ekstrakter fra trinn 1.5 av vakuum fordampning på 40 ° C i 15 min.
    2. Rekonstituer tørr saken med dimethyl sulfoxide (DMSO) og justere konsentrasjonen av pakke til 12,8 mg/mL.
    3. Gjøre en seriell fortynning (konsentrasjoner: 5, 10, 20, 40, 80, 160, 320 og 640 µg/mL) av etanol ekstrakter med kjøttkraft.
  3. Minimum inhibitoriske konsentrasjon tester
    1. Legge til 10 µL av utvannet etanol ekstrakter alt fra 0.156 til 640.0 µg/mL i en 96-brønns plate.
    2. Bruker kjøttkraft, Juster volumet til 100 µL og vedlikeholde 5% DMSO i alle fortynninger.
    3. Vaksinere 100 µL av bakteriell kultur (1 x 106/mL) inn i 96-brønnen plate.
    4. Kultur inoculum som inneholder ulike konsentrasjoner av etanol trekker ut ved 37 ° C i 48 timer.
    5. Analysere bakterievekst turbiditet og bruker optisk tetthet (microplate leser) på 590 nm å bestemme de minste inhibitoriske konsentrasjonen (MIC).
  4. Minimum bakteriedrepende konsentrasjon tester
    1. Vaksinere 10 µL av flytende kultur fra hver brønn av mikrofon test som ikke fungerte ingen vekst på en agar plate.
    2. Inkuber ved 37 ° C i 24 timer.
    3. Bestemme bakteriedrepende aktiviteten ved å identifisere den laveste konsentrasjonen som avdekket ingen synlige bakterievekst. Konsentrasjonen som helt eliminerer cellevekst anses å være den minste bakterielle konsentrasjonen (MBC).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Positiv representant dataene for etanol utvinning er presentert i tabell 1. Tørket avkastningen fra taiwanske grønne propolis var positivt assosiert med konsentrasjonen av etanol. 95% og 99,5% etanol ekstrakter hadde høyest tørr saken gi fra taiwanske grønne propolis. Laveste tørrstoff avkastningen fra taiwanske grønne propolis oppstod under vann ble brukt som utvinning løsemiddelet. Disse resultatene indikerer at en organisk løsemiddel, som etanol, fungerer best for taiwanske grønne propolis utvinning. Signalet fra standard propolins C, D, F og G ble identifisert og kvantifisert bruker mye HPLC (figur 1a). Signalet fra propolins i etanol ekstrakter ble karakterisert ved hjelp av individuelle propolin standarder og HPLC (figur 1b). Normalt er konsentrasjonen av propolins (C, D, F og G) i taiwanske grønne propolis positivt assosiert med etanol konsentrasjonen under utvinning (tabell 1). Høyest avkastning av propolins i taiwanske grønne propolis ble produsert i 95% og 99,5% etanol ekstrakter.

Positiv representant dataene for antibakteriell effekt av etanol ekstrakter er presentert i tabell 2. Antibakteriell aktivitet mot S. aureus og E. coli i etanol ekstrakter ble undersøkt. Gjennomsnittlig Mikrofonen og MBC av etanol ekstrakter for S. aureus var 10-20 µg/mL og 20 µg/mL, henholdsvis (tabell 2). Vann ekstrakter hadde ikke antibakteriell effekt mot S. aureus (tabell 2). Ingen antibakteriell effekt på E. coli ble observert med enten etanol eller vann ekstrakter (tabell 2).

Figure 1
Figur 1: Identifikasjon av propolins i taiwanske grønne propolis. Disse skjermbildene viser standarder (en) propolins og (b) måling av propolins i taiwanske grønne propolis bruker mye HPLC. Dette tallet har blitt endret fra Chen et al. 8. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Løsemiddel * Avkastning (%) Propolin (C + D + F + G)
(mg/mL)
99,5% EtOH 66.75 ± 0,5en** 36.73 ± 0,80en
95% EtOH 66.25 ± 0,50en 37.55 ± 1,29en
80% EtOH 64.75 ± 0.96b 34.25 ± 0.71b
70% EtOH 63.25 ± 0.96c 31.53 ± 0.31c
60% EtOH 59.00 ± 1,41d 29.34 ± 1,59d
Vann 7.00 ± 0,82e ND ***

Tabell 1: tørr saken avkastning (%) og propolin innhold (mg/mL) i taiwanske grønne propolis utdraget benytter ulike løsemidler. * 10 g av propolis var utdraget benytter 100 mL løsemiddel, og ekstrakter ble endelig rekonstituert til 100 mL. ** Verdiene er de gjennomsnittlig ± standardavviket (SD). a-e I en kolonne som har ingen felles hevet er signifikant forskjellig (P < 0,05). ND = ikke oppdaget. Denne tabellen er endret fra Chen et al. 8.

Trekke ut Gule stafylokokker Escherichia coli
MIC (µg/mL) MBC (µg/mL) MIC (µg/mL)
99,5% EtOH 10 20 > 640
95% EtOH 10 20 > 640
80% EtOH 20 20 > 640
70% EtOH 10 20 > 640
60% EtOH 20 20 > 640
Vann ND ND ND

Tabell 2: MIC og MBC (µg/mL) av ulike ekstrakter mot S. aureus og E. coli. Denne tabellen er endret fra Chen et al. 8.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

En studie rapportert at maserasjon, bruker ulike konsentrasjoner av etanol, kan brukes for brasilianske propolis utvinning17; prosessen var imidlertid tidkrevende17. Det tok minst 10 dager å trekke bioaktive forbindelser, for eksempel fenoliske innhold, fra brasilianske propolis17. Alternativt har etanol utvinning i kombinasjon med ved 37 ° C, 50 ° C eller 70 ° C i 30 min blitt foreslått for utpakking brasilianske propolis19,21,22. Det ble besluttet at bioaktive forbindelser i brasilianske propolis kan pakkes ulikt avhengig av andelen etanol19. Utvinning effektiviteten av bioaktive forbindelser i propolis kan variere på grunn av ulike kjemiske komposisjonene til brasilianske propolis og taiwanske grønne propolis. Her gir vi en pålitelig og repeterbare protokoll for utpakking taiwanske grønne propolis. Bioaktive forbindelser i taiwanske grønne propolis kan høstes innen 2 dager, med etanol som et løsemiddel. En lignende finne også støtter protokollen presenteres her og besluttet at propolins (C, D, F og G) fra taiwanske grønne propolis kan pakkes med 95% etanol i kombinasjon med en 3 dagers utvinning23. En annen studie viste at 95% etanol i kombinasjon med en 21 h utvinning kunne høste propolins fra taiwanske grønne propolis24. Men må nøyaktig konsentrasjonen av propolins etter 21 h etanol utvinning bekreftes. Forskere har foreslått at varme-prosessen øker utvinning effektiviteten til brasiliansk propolis19,21,22. Om propolins fra taiwanske grønne propolis kan trekkes ut ved oppvarming må undersøkes.

Etanol ekstrakter fra taiwanske grønne propolis har antibakteriell effekt mot gram-positive patogener. Propolis er hydrofobe, har studier vist at en organisk løsemiddel som etanol er et egnet løsningsmiddel for propolis utvinning8,16,17,18,19, 20. Studier har også vist at en økt etanol konsentrasjon fører til mer utdraget bioaktive forbindelser8,17,18,20. I stede protokollen, maksimal tørr saken avkastning av taiwanske grønne propolis er observert i 95% og 99,5% etanol ekstrakter, og den høyeste konsentrasjonen av propolins og antibakteriell aktivitet.

Nåværende protokollen er utformet for taiwanske grønne propolis utvinning bruker etanol og kvalitet vurderingen er gjort basert på innholdet av propolins. Men noen etanol-uløselig bioaktive forbindelser i taiwanske grønne propolis ikke riktig isolere benytter stede protokollen.

Den mest avgjørende aspekten av metoden med hensyn til eksisterende metoder er at denne metoden sparer tid i forhold til metoder foreslått i andre studier17,23. Videre utstilt 95% og 99,5% etanol ekstrakter av taiwanske grønne propolis en høy konsentrasjon av propolins og antibakteriell aktivitet.

Denne tilnærmingen har direkte programmer for å karakterisere andre ukjente etanol-løselig bioaktive forbindelser i taiwanske grønne propolis. I tillegg kan etanol ekstrakter som inneholder propolins brukes for å avgjøre andre bioactivities.

En av de sentrale eksperimentelle prosedyrene er å sikre ensartethet av den Taiwanske grønne propolis under sliping (protokollen trinn 1.1). Upassende sliping av taiwanske grønne propolis kan føre til lav tørrstoff gir og propolin innhold. Det er viktig å bruke en riktig sliping apparater, krydder jeksel, vev jeksel eller homogenizer, og pass på at propolis blir et fint pulver uten noen store partikler igjen etter sliping.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingenting å fortolle.

Acknowledgments

Dette manuskriptet ble redigert av Wallace akademiske redigering.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
ethanol Sigma-Aldrich E7023
Whatman no. 4 filter paper Sigma-Aldrich WHA1004125
methanol Sigma-Aldrich 34860
reverse phase RP-18 column Phenomenex Inc. 00G-0234-E0
Staphylococcus aureus ATCC BCRC 10780
Escherichia coli ATCC BCRC 10675
tryptic soy broth Sigma-Aldrich 22092
nutrient broth Sigma-Aldrich 70122
dimethyl sulfoxide Sigma-Aldrich D2650
spice grinder Waring WSG60K
microplate Reader Molecular Devices EMAX PLUS
HPLC system Agilent 1200 Series
vacuum evaporation BÜCHI Rotavapor R-215

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Zabaiou, N., et al. Biological properties of propolis extracts: Something new from an ancient product. Chemistry and Physics of Lipids. 207 (Pt B), 214-222 (2017).
  2. Bankova, V. B., De Castro, S. L., Marcucci, M. C. Propolis: Recent advances in chemistry and plant origin. Apidologie. 31 (1), 3-15 (2000).
  3. Park, Y. K., Alencar, S. M., Aguiar, C. L. Botanical origin and chemical composition of Brazilian propolis. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 50 (9), 2502-2506 (2002).
  4. Chen, C. N., Wu, C. L., Shy, H. S., Lin, J. K. Cytotoxic prenylflavanones from Taiwanese propolis. Journal of Natural Products. 66 (4), 503-506 (2003).
  5. Chen, C. N., Weng, M. S., Wu, C. L., Lin, J. K. Comparison of radical scavenging activity, cytotoxic effects and apoptosis induction in human melanoma cells by Taiwanese propolis from different sources. Evidence-Based Complementary and Alternative. 1 (2), 175-185 (2004).
  6. Chen, C. N., Wu, C. L., Lin, J. K. Apoptosis of human melanoma cells induced by the novel compounds propolin A and propolin B from Taiwanese propolis. Cancer Letters. 24 (1-2), 218-231 (2007).
  7. Huang, W. J., et al. Propolin G, a prenylflavanone, isolated from Taiwanese propolis, induces caspase-dependent apoptosis in brain cancer cells. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 55 (18), 7366-7376 (2007).
  8. Chen, Y. W., Ye, S. R., Ting, C., Yu, Y. H. Antibacterial activity of propolins from Taiwanese green propolis. Journal of Food and Drug Analysis. 26 (2), 761-768 (2018).
  9. Hegazi, A. G., Abd El Hady, F. K., Abd Allah, F. A. M. Chemical composition and antimicrobial activity of European propolis. Zeitschrift für Naturforschung. 55 (1-2), 70-75 (2000).
  10. Sforcin, J. M., Fernandes, A., Lopes, C. A. M., Bankova, V., Funari, S. R. C. Seasonal effect on Brazilian propolis antibacterial activity. Journal of Ethnopharmacology. 73 (1-2), 243-249 (2000).
  11. Chen, Y. W., et al. Characterization of Taiwanese propolis collected from different locations and seasons. Journal of the Science of Food and Agriculture. 88 (3), 412-419 (2008).
  12. Grange, J. M., Davey, R. W. Antibacterial properties of propolis (bee glue). Journal of the Royal Society of Medicine. 83 (3), 159-160 (1990).
  13. Kujumgiev, A., et al. Antibacterial, antifungal and antiviral activity of propolis from different geographic origins. Journal of Ethnopharmacology. 64 (3), 235-240 (1999).
  14. Krol, W., Scheller, S., Shani, J., Pietsz, G., Czuba, Z. Synergistic effect of ethanol extract of propolis and antibiotics in the growth of Staphylococcus aureus. Drug Research. 43 (5), 607-609 (1993).
  15. Lu, L. C., Chen, Y. W., Chou, C. C. Antibacterial and DPPH free radical-scavenging activities of the ethanol extract of propolis collected in Taiwan. Journal of Food and Drug Analysis. 11 (4), 277-282 (2003).
  16. Tosi, B., Donini, A., Romagnoli, C., Bruni, A. Antimicrobial activity of some commercial extracts of propolis prepared with different solvents. Phytotherapy Research. 10 (4), 335-336 (1996).
  17. Cunha, I. B. S., et al. Factors that influence the yield and composition of Brazilian propolis extracts. Journal of the Brazilian Chemical Society. 15 (6), 964-970 (2004).
  18. Woo, S. O., Hong, I. P., Han, S. M. Extraction properties of propolis with ethanol concentration. Journal of Apicultural Research. 30 (3), 211-216 (2015).
  19. Park, Y. K., Ikegaki, M. Preparation of water and ethanolic extracts of propolis and evaluation of the preparations. Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry. 62 (11), 2230-2232 (1998).
  20. Ramanauskienė, K., Inkėnienė, A. M. Propolis oil extract: quality analysis and evaluation of its antimicrobial activity. Natural Product Research. 25 (15), 1463-1468 (2011).
  21. Machado, B. A., et al. Chemical composition and biological activity of extracts obtained by supercritical extraction and ethanolic extraction of brown, green and red propolis derived from different geographic regions in brazil. PLoS One. 11 (1), e0145954 (2016).
  22. Monroy, Y. M., et al. Brazilian green propolis extracts obtained by conventional processes and by processes at high pressure with supercritical carbon dioxide, ethanol and water. The Journal of Supercritical Fluids. 130, 189-197 (2017).
  23. Popova, M., Chen, C. N., Chen, P. Y., Huang, C. Y., Bankova, V. A validated spectrophotometric method for quantification of prenylated flavanones in pacific propolis from Taiwan. Phytochemical Analysis. 21 (2), 186-191 (2010).
  24. Chen, L. H., et al. Taiwanese green propolis ethanol extract delays the progression of type 2 diabetes mellitus in rats treated with streptozotocin/high-fat diet. Nutrients. 10 (4), e503 (2018).

Tags

Biokjemi problemet 143 antibakteriell aktivitet etanol utvinning propolins Taiwan grønne propolis
Utvinning og analyse av taiwanske grønne Propolis
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Chen, C. T., Chien, Y. H., Yu, Y.… More

Chen, C. T., Chien, Y. H., Yu, Y. H., Chen, Y. W. Extraction and Analysis of Taiwanese Green Propolis. J. Vis. Exp. (143), e58743, doi:10.3791/58743 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter