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Biochemistry

Extração e análise de própolis verde de Taiwan

doi: 10.3791/58743 Published: January 7, 2019

Summary

Apresentamos um protocolo para usar etanol como solvente para extrair e caracterizar taiwanesa própolis verde que apresenta atividade antibacteriana.

Abstract

Própolis verde taiwanesa é rico em flavonoides, composição e apresenta uma ampla gama de atividades biológicas, tais como antioxidante, antibacteriano e uns anticâncer. Os compostos bioativos da própolis verde taiwanesa são propolins, ou seja, C, D, F e G. A concentração de propolins em Taiwan própolis verde varia de acordo com a época e a localização geográfica. Assim, é fundamental estabelecer um procedimento padrão e repetível para determinação da qualidade da própolis verde taiwanesa. Aqui, apresentamos um protocolo que usa etanol extração, cromatografia líquida de alto desempenho e uma análise da atividade antibacteriana para caracterizar a qualidade da própolis verde taiwanesa. Esse método indica que as extrações de etanol 95% e 99,5% alcançar o rendimento máximo de matéria seca de própolis verde taiwanesa, produzindo, assim, as concentrações mais elevadas de propolins que têm propriedades antibacterianas. De acordo com esses achados, o presente protocolo é considerado confiável e reproduzível para determinação da qualidade da própolis verde taiwanesa.

Introduction

Própolis é uma mistura de resina natural produzida pela espécie de abelha Apis mellifera. A própolis tem sido amplamente utilizada desde os tempos antigos em medicamentos de folk. Recentemente, um estudo relatou que a Própolis é benéfico para a prevenção de infecções microbianas e inflamação1. Numerosos estudos têm demonstrado que os principais compostos bioativos na própolis são ésteres de ácidos fenólicos, flavonoides, composição p-cumarínico ácidos e ácidos de diterpenic2,3. Até à data, foram identificados 10 derivados de flavanone composição da própolis verde taiwanesa através de cromatografia líquida de alto desempenho (HPLC)4,5,6,7. O mais abundante entre estes é propolins C, D, F e G5,7. Os efeitos biológicos consideráveis da própolis verde taiwaneses estão correlacionados com seu alto teor de propolins8.

As concentrações de compostos bioativos em Própolis variam muito, dependendo da época e a localização geográfica do que a Própolis é obtida. Própolis Europeu contém principalmente os flavonoides agliconas e fenólicos ácidos9. Os principais compostos bioativos em Própolis do Brasil são de composição p-cumarínico ácidos, tais como o artepillin C10. Um estudo demonstrou que a temporada é um fator crítico na determinação do teor total de propolin em Taiwan própolis verde11. O conteúdo de propolin em Taiwan própolis verde é mais alto no verão (maio - julho) e menor no inverno11. A propriedade anti-bacteriana da própolis tem sido amplamente considerada como um indicador de atividade biológica. Geralmente, as amostras de Própolis coletadas de várias regiões têm exibiu uma propriedade antibacteriana semelhante; por exemplo, é geralmente eficaz contra quase todas as bactérias gram-positivas e exibe um efeito antibacteriano limitado contra bactérias Gram-negativas10,12,13. Interações sinérgicas entre os flavonoides na Própolis foram demonstradas para ter um efeito antibacteriano14. Da mesma forma, própolis verde taiwanesa foi relatado para ter um efeito antimicrobiano contra bactérias gram-positivas,15. Além disso, um estudo identificou também um efeito antimicrobiano de interações de propolins em Taiwan própolis verde8.

A caracterização dos compostos bioativos na Própolis é difícil porque sua composição química pode variar de acordo com sua fonte de origem. Portanto, é necessário estabelecer um método viável e repetível para determinação da qualidade da própolis verde taiwanesa. No entanto, nenhum procedimento padrão foi estabelecido para extração de própolis verde taiwanesa e posterior análise funcional. Foram propostos vários métodos que vària aplicam solventes orgânicos e inorgânicos por Própolis extração16,17,18,19,20. Porque a Própolis é uma mistura lipofílica, estudos têm demonstrado que extração orgânica é melhor do que a extração inorgânicos8,18,19. A concentração total de propolin em Taiwan própolis verde e suas propriedades antibacterianas são indicadores da qualidade da própolis verde taiwanesa. Assim, o objetivo deste estudo é apresentar um protocolo para usando o etanol como solvente para extrair e caracterizar as propriedades antibacterianas da própolis verde taiwanesa.

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Protocol

1. preparação de compostos extraídos de etanol

  1. Pesar 10 g de própolis verde taiwanesa congelado, que foi recolhida de colmeias em Taiwan, de maio a julho, e triturá-lo usando o moedor de especiarias. Confirme que pedaços inteiros da própolis verde de Taiwan são moídas em um pó fino sem quaisquer partículas grandes.
  2. Adicione 100 mL de diferentes concentrações de etanol (60%, 70%, 80%, 95% e 99,5%) e água para separar os frascos e misturar cada concentração com 10 g de própolis de chão.
  3. Incubar a 25 ° C e agitar o frasco a 250 rpm por 48 h.
  4. Filtre os extratos de etanol por papel de filtro com um tamanho de poro de 25 μm.
  5. Reconstitua os filtrados para seu volume original (100 mL) com etanol a 95% usando um balão volumétrico.
  6. Armazenar os extratos de etanol a-20 ° C.
    Nota: O protocolo pode ser pausado aqui.

2. preparação dos extratos de etanol para HPLC

  1. Concentre-se 10 mL de etanol extractos por evaporação a vácuo a 40 ° C por 15 min.
  2. Asse a matéria seca a 45 ° C por 24 h.
  3. Reconstitua a matéria seca com 10 mL de etanol a 95%.
  4. Filtro de 1 mL de etanol extrai usando um filtro de seringa estéril com um tamanho de poro de 0,45 µm.
  5. Filtrar novamente os extratos de etanol usando um filtro de seringa estéril com um tamanho de poros de 0,22 µm. O filtrado é coletado e pode ser analisado diretamente usando HPLC.

3. análise de conteúdo Propolin usando HPLC

  1. Estabelecimento de curvas padrão de propolins
    1. Prepare 1 L de fase móvel de solução de metanol: água 88.8:11.2 (v/v).
    2. Preparar diluições em série de propolin padrão concentrações (C, D, F e G) (15,625 mg/mL, 31,25 mg/mL, 62,5 mg/mL e 125 mg/mL, respectivamente) usando a solução de fase móvel como solvente.
    3. Injete 20 µ l de propolin concentrações padrão na coluna de fase reversa, sequencialmente, resultantes da concentração baixa para a alta concentração.
    4. Defina a coluna HPLC a 30 ° C e a taxa de fluxo de 1 mL/min.
    5. Definir o comprimento de onda do detector UV para 280 nm e o tempo de gravador para 20 min.
    6. Analisar os padrões de pelo menos 3 x.
    7. Plotar a resposta de medição (eixo y) contra a (eixo x) concentração usando cálculo folha software e criar uma curva padrão com a equação e o valor de R-quadrado.
  2. Análise de extrato em etanol s
    1. Injete 20 µ l de etanol extratos obtidos da etapa 2.5 na coluna de fase reversa.
    2. Defina a coluna HPLC a 30 ° C e a taxa de fluxo de 1 mL/min.
    3. Definir o comprimento de onda do detector UV para 280 nm e o tempo de gravador para 20 min.
    4. Analisar os padrões de pelo menos 3 x.
    5. Calcule a concentração de propolin no extrato etanol, usando a equação para a curva padrão obtida passo 3.1.7 que usa a área do pico para cada propolin.

4. mínima concentração inibitória mínima análise concentração bactericida

Nota: O método de como é usado para avaliar a eficácia antibacteriana de propolins etanol-extraído da própolis verde taiwanesa.

  1. Preparação de organismos de teste
    1. Descongelar as cepas bacterianas, Staphylococcus aureus e Escherichia coli e em seguida, a cultura-los em caldo tryptic soy e caldo nutriente, respectivamente, a 37 ° C por 24 h.
    2. Passagem do S. aureus usando caldo tryptic soy e Escherichia coli usando caldo nutriente para duas gerações e, em seguida, calcular unidades formadoras de colônia por contagem de colónias individuais em uma placa de ágar.
  2. Preparação de etanol extratos para testes de atividade antibacteriana
    1. Concentre-se os extratos de etanol obtidos passo 1.5 por evaporação a vácuo a 40 ° C por 15 min.
    2. Reconstituir a matéria seca com dimetilsulfóxido (DMSO) e ajustar a concentração do extrato de 12,8 mg/mL.
    3. Fazer uma diluição serial (concentrações: 5, 10, 20, 40, 80, 160, 320 e 640 µ g/mL) de etanol extrai usando o caldo.
  3. Testes de concentração inibitória mínima
    1. Adicione 10 µ l de etanol diluído extratos desde 0.156 até 640.0 µ g/mL em uma placa de 96 poços.
    2. Usando caldo, ajustar o volume a 100 µ l e manter 5% DMSO em todas as diluições.
    3. Inocule a 100 µ l de cultura bacteriana (1 x 106/mL) na placa de 96 poços.
    4. Inóculo de cultura contendo diferentes concentrações de etanol extrai a 37 ° C por 48 h.
    5. Analisar o crescimento bacteriano, de acordo com a turbidez e usando a densidade óptica (leitor de microplacas) em 590 nm para determinar a concentração inibitória mínima (CIM).
  4. Concentração bactericida mínima testes de
    1. Semear 10 µ l de cultura líquida de cada poço de teste de MIC que não exibiu nenhum crescimento em uma placa de ágar.
    2. Incube a 37 ° C por 24 h.
    3. Determine a atividade bactericida, identificando a menor concentração que revelou não visível crescimento bacteriano. A concentração que elimina completamente o crescimento celular é considerada a concentração bacteriana mínima (MBC).

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Representative Results

Positivos dados representativos para a extração de etanol são apresentados na tabela 1. O rendimento de matéria seca de própolis verde taiwanesa foi positivamente associado com a concentração de etanol. Os extratos de etanol 95% e 99,5% tinham matéria seca mais elevada rendimento de própolis verde de Taiwan. O rendimento de matéria seca mais baixo de própolis verde taiwanesa ocorreu quando a água foi usada como o solvente de extração. Estes resultados indicam que um solvente orgânico, como o etanol, executa melhor para extração de própolis verde de Taiwan. O sinal do padrão propolins, C, D, F e G foi identificado e quantificado usando HPLC (Figura 1a). O sinal de propolins nos extratos de etanol foi caracterizado usando padrões individuais propolin e HPLC (Figura 1b). Normalmente, a concentração de propolins (C, D, F e G) em Taiwan própolis verde é positivamente associada com a concentração de etanol durante a extração (tabela 1). O maior rendimento de propolins em Taiwan própolis verde foi produzido em extratos de etanol a 95% e 99,5%.

Positivos dados representativos para o efeito antibacteriano de etanol extractos são apresentados na tabela 2. Atividade antibacteriana contra S. aureus e e. coli em extratos de etanol foram examinados. O médio MIC e MBC de extratos de etanol para S. aureus foram 10-20 µ g/mL e 20 µ g/mL, respectivamente (tabela 2). Extratos de água não apresentaram efeitos antibacterianos contra S. aureus (tabela 2). Nenhum efeito antibacteriano sobre Escherichia coli observou-se com também o etanol ou água extrai (tabela 2).

Figure 1
Figura 1: identificação de propolins em Taiwan própolis verde. Estes painéis mostram (um) padrões de propolins e (b) a medida do propolins em Taiwan própolis verde usando HPLC. Esta figura foi modificada de Chen et al . 8. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Solvente * Rendimento (%) Propolin (C + D + F + G)
(mg/mL)
99.5% EtOH 66.75 ± 0.5um* * 36.73 ± 0,80um
95% EtOH 66.25 ± 0,50um 37.55 ± 1,29um
80% EtOH 64.75 ± 0,96b 34.25 ± 0,71b
70% EtOH 63.25 ± 0,96c 31.53 ± 0,31c
60% EtOH 59,00 ± 1,41d 29.34 ± 1,59d
Água 7,00 ± 0,82e ND * * *

Tabela 1: secar a questão de rendimento (%) e teor de propolin (mg/mL) em Taiwan própolis verde extraído usando vários solventes. * 10 g de Própolis foi extraído usando 100 mL de solvente, e extratos foram finalmente reconstituídos a 100ml. * * Os valores são a média ± o desvio padrão (SD). a-e Significa dentro de uma coluna que não tem nenhum sobrescrito comuns é significativamente diferentes (P < 0,05). ND = não detectado. Esta tabela foi modificada de Chen et al . 8.

Extrato Staphylococcus aureus Escherichia coli
MIC (µ g/mL) MBC (µ g/mL) MIC (µ g/mL)
99.5% EtOH 10 20 > 640
95% EtOH 10 20 > 640
80% EtOH 20 20 > 640
70% EtOH 10 20 > 640
60% EtOH 20 20 > 640
Água ND ND ND

Tabela 2: MIC e MBC (µ g/mL) de vários extratos contra S. aureus e Escherichia coli. Esta tabela foi modificada de Chen et al . 8.

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Discussion

Um estudo relatou que a maceração, utilizando diferentes concentrações de etanol, poderia ser usada para extração de Própolis brasileira17; no entanto, o processo foi demorado17. Demorou pelo menos 10 dias para extrair os compostos bioativos, tais como conteúdo fenólico, de Própolis brasileira17. Alternativamente, extração de etanol em combinação com aquecimento a 37 ° C, 50 ° C ou 70 ° C durante 30 min foi proposta para a extração de Própolis brasileira19,21,22. Determinou-se que compostos bioativos na Própolis brasileira poderiam ser extraídos diferencialmente consoante a percentagem de etanol19. A eficiência de extração de compostos bioativos em Própolis pode variar devido as diferentes composições químicas da própolis brasileira e própolis verde taiwanesa. Aqui, nós fornecemos um protocolo confiável e reproduzível para extração de própolis verde de Taiwan. Os compostos bioativos em Taiwan própolis verde poderiam ser colhidos dentro de 2 dias, utilizando etanol como solvente. Uma conclusão semelhante também suporta o protocolo aqui apresentada e determinou que os propolins (C, D, F e G) da própolis verde taiwanesa pode ser extraído usando etanol a 95% em combinação com uma extração de 3 dia23. Outro estudo demonstrou que 95% de etanol em combinação com 21 h extração era capaz de colheita propolins de própolis verde taiwanesa24. No entanto, deve ser verificada a concentração exacta de propolins após a extração de etanol 21 h. Os pesquisadores propuseram que o processo de aquecimento aumenta a eficiência da extração de Própolis brasileira19,21,22. Se propolins de própolis verde de Taiwan pode ser extraído por aquecimento deve ser investigado.

Os extratos de etanol da própolis verde taiwanesa têm efeitos anti-bacterianos contra patógenos gram-positivos. Porque a Própolis é hidrofóbico, estudos têm demonstrado que um solvente orgânico como o etanol é um solvente adequado para Própolis extração8,16,17,18,19, 20. Estudos também têm demonstrado que uma concentração maior de etanol leva a mais compostos bioativos extraídos de8,17,18,20. No presente protocolo, extrai o máximo de matéria seca rendimentos da própolis verde de Taiwan são observados em etanol a 95% e 99,5%, bem como a maior concentração de propolins e atividade antibacteriana.

O presente protocolo destina-se a extração de própolis verde de Taiwan usando etanol, e a avaliação da qualidade é feita com base no conteúdo do propolins. No entanto, alguns compostos bioativos insolúvel em etanol em Taiwan própolis verde corretamente não podem ser isolados usando o presente protocolo.

O aspecto mais crucial do método em relação a métodos existentes é que esse método economiza tempo em relação a métodos propostos em outros estudos17,23. Além disso, os extratos de etanol 95% e 99,5% da própolis verde taiwanesa exibiram uma alta concentração de atividade propolins e antibacteriano.

Esta abordagem tem aplicações diretas para caracterizar outras substâncias bioativas na própolis verde taiwanesa desconhecidas solúvel em etanol. Além disso, extratos de etanol contendo propolins poderiam ser usados para a determinação de outros bioactivities.

Um dos principais procedimentos experimentais é garantir a uniformidade da própolis verde taiwanesa durante a moagem (etapa 1.1 do protocolo). Inadequado de moedura da própolis verde taiwanesa pode levar a rendimentos de matéria seca baixo e conteúdo de propolin. É essencial usar um aparelho de moagem adequado, como um moedor de especiarias, moedor de tecido ou homogenizador e cuidar que a própolis torna-se um pó fino sem quaisquer partículas grandes remanescentes após a moagem.

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Disclosures

Os autores não têm nada a declarar.

Acknowledgments

Este manuscrito foi editado por Wallace edição académica.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
ethanol Sigma-Aldrich E7023
Whatman no. 4 filter paper Sigma-Aldrich WHA1004125
methanol Sigma-Aldrich 34860
reverse phase RP-18 column Phenomenex Inc. 00G-0234-E0
Staphylococcus aureus ATCC BCRC 10780
Escherichia coli ATCC BCRC 10675
tryptic soy broth Sigma-Aldrich 22092
nutrient broth Sigma-Aldrich 70122
dimethyl sulfoxide Sigma-Aldrich D2650
spice grinder Waring WSG60K
microplate Reader Molecular Devices EMAX PLUS
HPLC system Agilent 1200 Series
vacuum evaporation BÜCHI Rotavapor R-215

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