Summary
نقدم سير عمل جديدة للتحقيقات الميكروسكوب الإلكتروني لانسجة المخ. الأسلوب الذي يسمح للمستخدم بدراسة ملامح العصبية بطريقة غير متحيزة. لتحليل عنصري، نقدم أيضا البرنامج نصي الذي أوتوماتيزيس معظم سير العمل لأخذ العينات العشوائية.
Abstract
تحقيقات الميزات ultrastructural من الخلايا العصبية وهذه الاشتباكات العصبية الوحيدة الممكنة مع الميكروسكوب الإلكتروني. خاصة بالنسبة للدراسات المقارنة للتغيرات في كثافة وتوزيع هذه الميزات، على بروتوكول أخذ عينات غير منحازة أمر حيوي لنتائج يمكن الاعتماد عليها. نقدم هنا، سير عمل للحصول على صورة عينات المخ. سير العمل يسمح منهجية موحدة عينة عشوائية داخل منطقة محددة من الدماغ، ويمكن تحليل الصور باستخدام ديسيكتور. هذا الأسلوب هو أسرع بكثير من دراسة مستفيضة لمقاطع المسلسل ولكن لا يزال يقدم نهجاً عمليا لتقدير كثافة وتوزيعات من ميزات أولتراستروكتوري. قبل الدمج، استخدمت أقسام فيبرتوم الملون كمرجع لتحديد منطقة الدماغ قيد التحقيق، الذي ساعد في تسريع إعداد العينة الإجمالية عملية. تم استخدام هذا النهج للدراسات المقارنة للتحقيق في تأثير بيئة الإسكان أثرت على العديد من المعلمات ultrastructural في الدماغ الماوس. استناداً إلى الاستخدام الناجح لسير العمل، يمكننا تكييفه غرض عنصري تحليل العينات الدماغ. نحن الأمثل في البروتوكول من حيث الوقت لتفاعل المستخدم. أتمتة جميع الخطوات التي تستغرق وقتاً طويلاً بترجمة البرنامج نصي لبرمجيات المصدر المفتوح سيرياليم تساعد المستخدم على التركيز على العمل الرئيسي للحصول على خرائط عنصري. كما هو الحال في سير العمل الأصلي، ونحن اهتماما للنهج الذي أخذ العينات غير منحازة لضمان نتائج موثوقة.
Introduction
في المجهر الإلكتروني، أنها غالباً ما تشكل تحديا للعينة المناطق تمثيلاً داخل الأقسام. ونحن، كمراقب، غالباً ما متحيزة لإلقاء نظرة على مناطق محددة يسترعى انتباهنا بميزات واضحة للعينة، منع توزيعها جيدا وغير متحيز لأخذ عينات. أخذ العينات التحيز يمكن فقط تجنب إذا كان كل جزء من المنطقة لمصلحة يحصل على نفس الفرصة لينتهي بهم المطاف في صورة مجهرية إلكترون1. من الممكن تجنب التحيز أخذ العينات دون حل برمجيات، على سبيل المثال، عن طريق دفع trackball المجهر يدوياً دون النظر في الصورة، بغية تحديد مناطق أخذ العينات أينما توقف المرحلة. ولكن المعني الدقيق للكلمة، ويرجع عدم إجراء عشوائي، عمدا أو لا شعوريًا، المستخدم يمكن أن يكون لها تأثير على حركة المسرح، وعلاوة على ذلك، هذه ليست طريقة متطورة لتحديد مناطق أخذ العينات. أخذ عينات عشوائية يصبح أهمية خاصة في حالة استخدام أزواج من المقاطع لتقييم العدد الهياكل في حجم معين، على سبيل المثال، ستيريولوجي1، الأمر الذي يتطلب أزواج من المقاطع، مسافة معروفة وبصرف النظر. من الممكن أيضا ننظر فقط في قسم واحد وتقدير عدد2من هياكل محددة، ولكن مع هذا النهج المحققين يميلون إلى المغالاة في تقدير الكثافة العددية للهياكل الكبيرة، إذا لم تكن الهياكل صغيرة جداً في مقارنة سمك مقطع. هي نهج بديلة لإعادة بناء كميات من الأنسجة من مقاطع المسلسل وهكذا الحصول على البيانات المطلوبة3. ولكن هذا هو المستهلكة للوقت جداً وليس نهجاً عمليا للدراسات المقارنة (أكبر).
للتغلب على هذه المشاكل، قمنا بتطوير سير عمل الذي يسمح للباحث تلقائياً تحديد العينات للحصول على ميكروجرافس إلكترون في المباعدة بين الولادات العادية داخل أقسام رقيقة جداً. وموقف ميكروجرافس الإلكترون عشوائي، مما يتيح أخذ العينات غير متحيزة. والنهج مناسبة سواء بالنسبة لتحديد الكثافة العددية لهياكل (على سبيل المثال، نقاط الاشتباك العصبي داخل بعض نيوروبيل حجم4،5)، والأبعاد للسمات الهيكلية (على سبيل المثال، عرض المشقوق متشابك، أو القطر من4،بوستسينابتيك الكثافة5).
سير العمل يستخدم نقطة عشوائية مصنوعة خصيصا أخذ العينات (RPS) البرمجيات (كتب في جافا سكريبت استخدام البرمجيات البرمجة النصية المتوفرة مع لدينا المجهر) الذي يقوم تلقائياً بحساب مواقع الشبكة داخل منطقة محددة مسبقاً للفائدة في قسم رقيقة جداً. ينقل البرنامج RPS مرحلة المجهر الإلكتروني إلى هذه النقاط المحددة مسبقاً، حتى يمكن إجراء صورة مجهرية الإلكترون في كل نقطة. أولاً، تعريف المستخدم منطقة الاهتمام داخل قسم رقيقة. بعد ذلك، يحسب البرنامج RPS مواقع الشبكة داخل هذه المنطقة. X/y إحداثيات المركز الأول يتم إنشاؤها عشوائياً، ويتم وضع الوظائف المتبقية على فترات منتظمة الشبكة فيما يتعلق بالمركز الأول. لأن كل جزء من المنطقة لمصلحة له نفس الفرصة ليجري بحثها، وهذا ما يسمح جمع الحد الأدنى من البيانات. ويسمى هذا النهج لأخذ العينات أيضا منهجية موحدة عينة عشوائية (انظر مراجع6،7 لمزيد من التفاصيل).
لتحديد الكثافة العددية للهياكل، ونحن نعمل مع أزواج من المقاطع عن بعضها مسافة معروفة. بعد الحصول على صورة مجهرية إلكترون من المقطع الأول في واحدة من مواقف محددة سلفا، "قسم المسلسل تيم" البرمجيات (جزء من المجموعة من البرامج المتوفرة مع المجهر الإلكتروني لدينا) ينتقل إلى النقطة المقابلة في القسم الثاني، ومن أجل الحصول صورة مجهرية إلكترون من موقع المقابلة. ويتكرر هذا لكل موقع في شبكة محددة سلفا. في نهجنا، يستخدم لحساب عدد الجسيمات في كل زوج من الإلكترونات ميكروجرافس8،9ديسيكتور. ديسيكتور يتكون من زوج من الإطارات العد، واحد لكل8،الباب9. تتحدد الكثافة العددية للكائنات فقط عد الكائنات المرئية على القسم الأول (أو قسم المراجع) ولكن ليس على القسم الثاني (أو قسم البحث). وهذا يسمح بتقدير الكثافة العددية للكائنات ب طريقة سريعة وفعالة8،9. بالإضافة إلى ذلك على أبواب واحدة، يمكن قياس السمات الهيكلية ثنائي الأبعاد.
وقد طبقنا سير العمل هذا بنجاح لتقييم الاختلافات في الأرقام المشبك في الحصين الفئران المعرضة إلى بيئة المخصب (EE) مقارنة ببيئة القياسية (SE) الإسكان شروط4،5، ظروف السكن وأيضا تقييم الاختلافات ultrastructural بين نوع البرية (WT) الفئران والفئران neuropeptide Y (نبي) كو أبقى تحت سراج الدين وهه5. وكان هدفنا إلقاء نظرة على وجه التحديد على السمات الهيكلية للخلايا العصبية، مثل الكثافة العددية متشابك، الأطوال من منطقة نشطة في المقاطع العرضية وكثافة بوستسينابتيك، وعرض المشقوق متشابك، والعدد من الحويصلات متشابك، من أجل تقييم التغييرات في اتصال الخلايا العصبية وتنشيط بين ظروف تجريبية مختلفة. بالإضافة إلى ذلك، نحن مهتمون في الكثافة العددية من حويصلات كثيفة الأساسية (DCV) في الخلايا العصبية لتحديد مقدار neuropeptides المخزنة في منطقة معينة في الدماغ.
استناداً إلى نجاح النهج الذي نتبعه للدراسات المذكورة أعلاه، في خطوتنا القادمة، أننا قد تكيفت لدينا سير العمل لتحديد مجالات لإجراء تحاليل عنصري غير متحيز داخل عينات المخ البشري. وقد تم ذلك بصورة الحديد، التي يتم تخزينها في جزيئات فيريتين في كل من الخلايا العصبية والخلايا الدبقية. لهذا، نحن ترجمة البرنامج نصي الذي يسمح لنا بأتمتة معظم العمليات لعملية فحص عشوائي لأقسام الدماغ في منطقة محددة.
Protocol
جميع التجارب التي أقرتها لجنة أخلاقية في "الوزارة الاتحادية للعلوم" والبحوث في جمهورية النمسا (BMWF-80.104/2-BrGT/2007 و BMWF-66.010/0037-II/3b/2013)، أو لجنة الأخلاقيات في "جامعة غراتس الطبية"، العدد 28-549 السابقين 15/16، وتجري وفقا للتوجيه الصادر عن "مجلس الجماعات الأوروبية" في 24 نوفمبر 1986 (86/609/EEC) والتوجيه من "البرلمان الأوروبي" ومجلس September2010 22 (2010/63/الاتحاد الأوروبي). وصممت التجارب على الحيوانات وأداؤها في مثل هذه طريقة إلى أدنى حد عدد الحيوانات المستخدمة.
1-التشريح والتثبيت من الأنسجة
- Euthanize الفئران (21 أسبوعا القديمة والفئران C57BL/6J C57BL/6N الإناث الفئران؛ ذكور الفئران WT ونبي كو في C57BL مختلطة/6:129/صفي الخلفية (1:1) على التوالي) عن طريق حقن بينتوباربيتال 150 مغ/كغ إينترابيريتونيلي.
- إزالة المخ من الجمجمة وقطع منها فورا في نصف (فصل اليسار من نصف الكرة الأيمن)-استخدام مشرط.
- ضع فورا النصفين في حاويات زجاجية مع 2% فورمالدهايد و glutaraldehyde 2.5% في كاكوديلاتي م 0.1 المخزن المؤقت (الفصل3)2أسو2Na·3H2س، الأس الهيدروجيني تعديلها إلى 7.4 مع 1 م كلوريد الصوديوم)، الرقم الهيدروجيني 7.4 في 4 درجات مئوية.
تنبيه: المصفف سامة وينبغي التعامل معها بعناية فائقة. استخدام فقط مع قفازات واقية وتحت غطاء الدخان. - إصلاح نصفي الدماغ لمدة يومين في 4 درجات مئوية والشطف في نفس المخزن المؤقت لمالا يقل عن 24 ساعة، أيضا في 4 درجات مئوية. ينبغي أن يكون حجم المخزن المؤقت في حول عشرة إضعاف حجم العينة.
2-تحديد منطقة الاهتمام داخل المخ بمقارنة المقاطع فيبرتوم مع الإشارة بمقاطع من الماوس الدماغ أطلس10
- ضع العينة الدماغ على فيبرتوم. تأكد من صحة اتجاه الدماغ (في هذه الحالة، تم اختيار اتجاه الاكليلية الحصين).
- تقليم حتى يتم التوصل إلى المنطقة للفائدة (ROI) في الدماغ. قطع المقاطع في سمك كبير (على سبيل المثال-، 100 ميكرومتر) حتى يتم التوصل إلى الجزء من الدماغ بمنطقة اهتمام ونرمي كل قسم.
- ابدأ بقطع المقاطع فيبرتوم مع 20 ميكرون سمك في بداية الجزء الدماغ مع العائد على الاستثمار ووضع المقاطع فيبرتوم على شريحة زجاج. وصمة عار لهم (نسل وصمة عار) بوضع المقاطع إلى 0.05% ثيونيني خلات في خلات الصوديوم العازلة، pH 4.2 لمدة 1 دقيقة (الشكل 1منظمة العفو الدولية).
- مقارنة المقاطع ملطخة بأطلس الدماغ الماوس استخدام مجهر ضوء ومواصلة خفض وتلطيخ حتى يتم التوصل إلى إحداثيات الدماغ المرجوة.
3-الحصول على منطقة نموذج للدمج
- حالما يتم تحديد مجال الحق، تبدأ قطع مقطع واحد في 150 ميكرون سمك فيبرتوم.
- ميكروديسيكت هذا القسم فيبرتوم مع شفرة حلاقة تحت المجهر ستيريو. قص بعيداً في الأجزاء حول العائد على الاستثمار. يجب أن يكون المقطع بحجم مناسب لإعداد الخطوات التالية مجهر إلكتروني (TEM) (ليس أكبر من 1 × 1 مم2).
4-إعداد تيم-التضمين، رقيقة جداً تمزيقها وتلطيخ
- التضمين
- بعد إصلاح ح 2 في 2% أكسيد الاوزميوم في درجة حرارة الغرفة (RT). استخدام وحدة تخزين لتغطية العينة على الأقل 10 مرات حجم العينة، ولكن تجنب استخدام مثبت الزائدة لمنع النفايات السامة لا لزوم لها.
تنبيه: أكسيد الاوزميوم عالية السمية، وينبغي التعامل معها بعناية فائقة. استخدام فقط مع قفازات واقية وتحت غطاء الدخان. - يذوي استخدام الكحول الرتب EM في الخطوات من 20 دقيقة استخدام حجم أكبر من ذلك في الخطوة السابقة (الإيثانول 50%، 70%، 80%، 96% و 100%).
- وضع في أكسيد البروبيلين لمدة 40 دقيقة في مكان الرايت إلى خليط من البروبيلين التضمين/أكسيد الراتنج (1:2) ح 2 في الرايت وبين عشية وضحاها 1:3 في 4 درجات مئوية.
تنبيه: أكسيد البروبيلين عالية السمية، وينبغي التعامل معها بعناية فائقة. استخدام فقط مع قفازات واقية وتحت غطاء الدخان. - تضمين العينات في الراتنج 100% عن طريق تغيير الراتنج 2 مرات بعد 60 دقيقة ومرة بعد 90 دقيقة (كل عند 45 درجة مئوية).
- وأخيراً، وضع العينات في قوالب مناسبة واسمحوا الراتنج بلمرة عند 90 درجة مئوية لمدة 3 أيام (أخيمنالشكل 1).
- بعد إصلاح ح 2 في 2% أكسيد الاوزميوم في درجة حرارة الغرفة (RT). استخدام وحدة تخزين لتغطية العينة على الأقل 10 مرات حجم العينة، ولكن تجنب استخدام مثبت الزائدة لمنع النفايات السامة لا لزوم لها.
- التشذيب وسيكتيونينج في أولتراميكروتومي.
- تقليم الكتلة، التأكد من أن الجانبين سلسة قدر الإمكان للمقاطع على التمسك ببعضها البعض (الشكل 1أيي).
- باستخدام مقاطع المنتجات 55 المسلسل رقيقة جداً نانومتر (يجب أن تكون فضية اللون الرمادي) أولتراميكروتومي. استخدم شبكة فتحه (فتحه العرض مم 1 × 2) مغطاة بطبقة بيولوفورم (الشكل 1Aiv).
- كونتيرستاين مقاطع رقيقة جداً في الشبكات فتحه باستخدام خلات اليورانيل 2% 30 دقيقة وسترات الرصاص لمدة 30 ثانية في الرايت (هذا هو الأسلوب القياسي الميكروسكوب الإلكتروني11).
تنبيه: خلات اليورانيل شديدة السمية وينبغي تجنب أي اتصال مباشر. التعامل فقط مع قفازات واقية. نترات الرصاص سامة إذا ابتلع أو استنشق وينبغي التعامل معها بعناية فائقة.
5-التصوير رويس المقابلة على الإشارة وأقسام البحث عن تيم مع حزم البرمجيات
- دراسة المقاطع على الشبكة مع تيم استخدام تكبير منخفض (تبعاً لحجم الأقسام) لتوجيه وتقييم نوعية المقاطع.
- بدء تشغيل البرنامج (حزمة "برمجيات تحليل الصورة تيم"، أو الشفافية في مجال التسلح، المتوفرة مع المجهر) لتوليد الصور الافتراضية من المقاطع عن طريق تخزين نقاط الزوايا من المقاطع. أن يسمح للبرامج بإيجاد مواقف المقابلة من العائد على الاستثمار في كل قسم.
- انتقل إلى القسم واختر إدراج لإضافة نقاط الزوايا لقسم المراجع والبحث. اتبع الإرشادات التي تظهر نافذة منبثقة. تبدأ بالمقطع مرجع وثم المتابعة مع قسم البحث. تأكد من أن يتم إدخال حواف المقطع التي موازية للمقطع التالي النقطتين 1 و 2 (الشكل 1Bi).
- تصور المقطع مرجع تحت تكبير منخفضة لتحديد منطقة اهتمام ونقل مجهر مرحلة استخدام الشفافية في مجال التسلح في القسم الإشارة إلى عدة نقاط الزوايا من العائد على الاستثمار لإنشاء مخطط تفصيلي من العائد على الاستثمار.
- تسجيل إحداثيات مضلع الناتجة عن استخدام البرمجيات RPS . لهذا، اضغط إحداثيات إضافة في مربع الحوار البرامج RPS عند كل نقطة من المضلع أن هناك حاجة لتحديد العائد على الاستثمار في المقطع (الشكل 1Bii).
- تعريف وقم بإدخال حجم مناسب لمناطق أخذ العينات والمسافات بين المناطق في برامج RPS (في الدراسة المقدمة، وحجم المناطق أخذ العينات هو 7 ميكرون والمسافة بينهما 20 ميكرومتر، أسفر عن مناطق أخذ العينات على الأقل 20 داخل العائد على الاستثمار). الصحافة النقطية حساب، ثم البرنامج يولد إحداثيات المنطقة أخذ العينات بطريقة عشوائية منهجية موحدة لشغل مناصب في صورة مجهرية داخل المضلع (الشكل 1بيي).
ملاحظة: لاتجاه الأفضل، المضلع ومناطق أخذ العينات داخل المضلع يمكن عرضها بالبرمجيات RPS (الشكل 1Biv).
- تخزين نقاط أخذ العينات على المقطع المرجعية والبحث باستخدام البرمجيات RPS وبرامج قسم المسلسل تيم . وهذه هي إحداثيات المونتاج التي يتم تسجيلها بعد ذلك11.
- في البرنامج RPS، اضغط على الانتقال إلى الموضع التالي للانتقال من مرحلة مجهر إلى x/y إحداثيات كل العينات المجال في المقطع مرجع. انتقل إلى الموقع و إدراج لاستيراد هذه الإحداثيات في البرنامج في قسم المراجع. كرر هذه العملية لجميع الإحداثيات.
- مرآة الإحداثيات من قسم الإشارة إلى المقطع البحث، انتقل إلى القسم واضغط على الانتقال إلى القسم. أدخل عدد المقطع البحث (عادة '2') في إطار الحوار.
- لتسجيل المونتاج (انظر الخطوة التالية)، التبديل بين قسم المراجع والبحث كما هو موضح من قبل، وتغيير موضع على المقطع مرجع مع الموقع و الانتقال إلى رقم. اختر تنسيق القادم في إطار الحوار.
- للمونتاج سيرياليم في كل العينات تنسيق، انتقل إلى الملف واختر المونتاج الجديد من القائمة المنسدلة. تحديد العدد الصحيح من البلاط والنسبة المئوية للتداخل في إطار الحوار. في الوقت الحاضر دراسة، وبير 5000 X كافية للتعرف على ميزات متشابك قيد الدراسة، ولكن مجال الرؤية محدودة كاميرا CCD المطلوب إجراء المونتاج للصور 2 × 2. مصنوعة المونتاج مع سيرياليم.
- قبل تسجيل كل المونتاج، إعادة ضبط التركيز (أو، إذا كان ذلك ممكناً، تنشيط خيار ضبط تلقائي للصورة في برنامج التسجيل). اختر مجلداً لحفظ الملف المونتاج وبدء التسجيل المونتاج عن طريق الضغط على البدء في القائمة الفرعية المونتاج على اليسار في سيرياليم.
6-تحليل الصور تيم مع "ميزات Ultrastructural إلى" إيماجيج الوثيقة.
ملاحظة: لهذا، من المهم إنشاء رصة صور تمت محاذاته من قسم المراجع والبحث.
- تحويل أزواج الصورة مع إيماجيج الصور إلى المكدس في ملف مكدس ومحاذاة الصور مع ستاكريج (لدى ليتم تثبيتها من الكبير-لوزان http://sites.imagej.net/BIG-EPFL/; في هذه القضية، الخوارزمية كان أفني المستخدمة). للحصول على الكثافة العددية للسمات الهيكلية الخلوية، ينشئ الماكرو ImageJ مصنوعة خصيصا ديسيكتور إطار العد مع حجم 5.5 x 5.5 ميكرون وضعت بشكل عشوائي على الصورة بزاوية عشوائية.
- بدء تشغيل الماكرو ديسيكتور (يعتمد الموقع في القائمة إيماجيج في الدليل حيث يتم حفظه) وتعريف المعلمات (حجم الإطار العد، عدد القطع) حسب الحاجة (الشكل 1الاتحاد).
- حساب عدد المشبك/ميكرون2 استخدام في ديسيكتور. عد كل المشبك في إطار العد التي تظهر في مقطع المراجع، لكنه غير ظاهر في المقطع البحث. تجاهل تلك الاشتباكات العصبية التي تتقاطع مع هما 'يحظر خطوط' من ديسيكتور؛ ولكن عد نقاط الاشتباك العصبي في المقابل 'قبول خطوط'. لهذا، استخدم أداة متعددة تقع في تولسبار في إيماجيج (الشكل 2أ، الشكل 2ب).
- لقياس البارامترات المشبك، حدد فقط في نهايات مع المشقوق متشابك الموجهة في المقطع العرضي (في المقطع مرجع؛ داخل إطارات الصورة نفسها المستخدمة ديسيكتور).
- بدء تشغيل البرنامج المساعد أوبجيكتج في إيماجيج من القائمة المنسدلة (الشكل 2أ) عن طريق الإضافات | تحليل. افتح مشروع جديد من مربع القائمة المنسدلة أوبجيكتج. سيؤدي هذا إلى فتح إطار الذي يسمح للمستخدم بهياكل المخطط التفصيلي ومارك مع أداة علامة (الشكل 2ب، دائرة حمراء). ويرد متشابك المعلمات المستخدمة للتجارب التي عرضت هنا في الخطوات التالية.
- قياس طول الغشاء presynaptic وطول كثافة بوستسينابتيك برسم خط على طول الهيكل باستخدام أداة علامة (الشكل 2ب، دائرة حمراء).
- الحصول على عرض المشقوق متشابك يعني برسم مضلع تغطي كل الغشاء قبل وبوستسينابتيك، مع الجانبين مستقيم مواز ومنتصف الطريق خط مجزأة، مسافة واحدة لكلا الأغشية.
- لتحديد العدد الحويصلات الرأسية، عد جميع الحويصلات التي تحتوي على مسافة الحد أقصى من الغشاء presynaptic قطر حويصلة واحدة أو أقل.
- لتحديد العدد الحويصلات undocked، عد هذه الحويصلات بمسافة قطرها حويصلة واحدة من حويصلات undocked الرأسية أو غيرها في المشبك نفس الحد أقصى.
7-إنتاج مقاطع رقيقة شبه "مجهرية الضوء" على "ميزات المستند العيانية" (في هذه الحالة عدد الخلايا) داخل "نفس العائد على الاستثمار" كالمختار "التحقيق تيم".
- فورا بعد قطع المقاطع رقيقة جداً لل، قص قسمين شبه رقيقة، 0.5 ميكرومتر سميكة ومتاخم لبعضها البعض. وضع على شريحة زجاجية ووصمة عار لهم استخدام الحل تولويدين الأزرق 0.5%. مكان بكشف الغطاء على الأقسام (مع DPX تصاعد المتوسطة، تتألف من ديستيريني، الملدنات (فوسفات تريكريسيل)، وزيلين نفط). يتم استخدام هذين الفرعين لعد الأرقام الخلية.
- تصوير المقاطع شبه رقيقة تكبير منخفضة باستخدام مجهر ضوء.
ملاحظة: يجب أن تكون الهياكل تحت التحقيق يمكن تحديدها في الصور. في هذه الدراسة، استخدمت 20 X التكبير لتحديد الأجهزة المحمولة. إذا لزم الأمر، يمكن مخيط صور متعددة جنبا إلى جنب مع برامج معالجة صور. - محاذاة أزواج قسمين شبه رقيقة متتالية مع برامج معالجة صور (على سبيل المثال., إيماجيج).
ملاحظة: ينبغي أن تعدل الاختلافات للتناوب، والحجم (يمكن أن يحدث بسبب ضغط التحف الأخذ بعملية تقطيع) لإنشاء تراكب مثالية للقسمين. - وضع علامة على الحدود من العائد على الاستثمار في صورة مجهرية الخفيفة. يجب أن تتوافق مع دوروا دوروا المستخدمة للصور ال. ولهذا الغرض، تحميل الصور إلى إيماجيج واختر التحديد المضلع من تولسبار (الشكل 2أ).
- إنشاء شبكة على الصورة بأكملها باستخدام إيماجيج عن طريق فتح تحليل | أدوات | شبكة وتعيين المعلمات حسب الحاجة.
- حساب المساحة والحجم المضلع من عدد نقاط الشبكة ضمن مجال الاهتمام وقسم سمك (حجم = NCS * ع * حش ؛ NCS = "عد عبر" الأقسام؛ ع = حجم الشبكة؛ حش = سمك الفرع).
- حساب عدد الأنوية من الهيئات الخلايا العصبية داخل العائد على الاستثمار إذا لم تكن فقط موجودة في مقطع واحد. اختر أداة متعددة في إيماجيج من تولسبار ومارك الخلايا. بعد عد الخلايا في كل قسم، بحساب عدد الخلايا في الحجم (
؛ جكثافة = كثافة الخلية؛ جعد = عدد الخلايا). - تسجيل جميع القياسات في إطار نتائج أوبجيكتج (الشكل 2-ج). تصدير وحفظها لاستخدامها مرة أخرى.
؛ جكثافة = كثافة الخلية؛ جعد = عدد الخلايا).8-استخدام البرنامج النصي سيرياليم "تحسين تحليل عنصري" في "عينات الدماغ" في تركيبة مع ديجيتالميكروجراف (مارك ألماني، المتوفرة مع تصفية التصوير).
- ضبط التصوير عامل تصفية (GIF).
- تحميل العينة في تيم والذهاب إلى حفرة في العينة لضبط GIF باستخدام trackball أو الجويستيك للمجهر.
- قم بالتبديل إلى الطاقة التي تمت تصفيتها تيم (افتيم) في البرمجيات مارك ألماني أو ألماني وحدد الكاميرا CCD في مارك ألماني.
- اختر التكبير لتحليل عنصري (التكبير يعتمد على الهيكل/مجال الاهتمام؛ وفي هذه الحالة، يتم تعيين التكبير من ك 76 تصل إلى 125 ك). تعيين وقت التعرض إلى 0.001 s وابدأ الرأي.
- وتركز الشعاع بعناية حتى يمكن رؤية الحواف ومركز الشعاع في الصورة. خفض الفتحة C2/موضوعية حتى تظهر حواف الفتحة ومركز الشعاع مع trackball للشعاع.
- يزيل التباؤر الشعاع (حول C2 46.2 في المائة، ينبغي أن يكون وقت التعرض لضبط حوالي 0.05 s) وتجد ذروة الخسارة صفر (زلب) عن طريق الضغط على زر زلب . بدء إجراء ضبط بالضغط على زر لحن كامل .
- الحصول على نقاط عشوائية من اقتناء.
- التبديل إلى تيم تصوير الوضع وتحديد الكاميرا والتحقق من التركيز في التكبير 10 ك (ضبط محور ع وتعيين يزيل التباؤر إلى الصفر).
- حدد LM 75 X التكبير والاختيار إذا لم يتم إدراج الكاميرا (إلا أنه لا يمكن التحكم ببرامج سيرياليم).
- بدء تشغيل سيرياليم وفتح مشروع جديد.
- فتح المستكشف. التحقق من إعدادات الكاميرا في تصوير عناصر البرنامج النصي ( عرض السجل) والبدء في عرض (كاميرا يتم إدراجها تلقائياً).
- جعل زاوية خريطة قسم رقيقة جداً، اختر إضافة النقاط في نافذة المستكشف.
- تعيين نقاط الزاوية عند حواف قسم رقيقة جداً. نقل المرحلة إلى نقطة زاوية بالضغط باستمرار على المفتاح الحق الماوس. عندما يتم التوصل إلى زاوية من المقطع، إضافة نقطة زاوية مع اليسار--النقر بالماوس. كرر الإجراء لإضافة 3 نقاط الزوايا أكثر. تأكد من أن مربع ج لنقطة الزاوية هو علامة في نافذة المستكشف للنقاط المخزنة.
- لبدء المونتاج الزاوية (الأفضل في التكبير LM 75)، انتقل إلى المستكشف في شريط القوائم سيرياليم واختيار مونتاجينج والشبكات و المونتاج ركن الإعداد من القائمة المنسدلة.
ملاحظة: يتم عرض أفضل احتواء إعدادات لمعلمات السجل الذي تم اختياره. تغيير لهم إذا لزم الأمر. في هذه الحالة، تم تغيير نسبة التداخل فقط إلى 20%.
- مخطط القسم/دوروا على الصورة المونتاج. اختر إضافة مضلع في نافذة المستكشف ومخطط القسم مع حق متعددة-نقرات الماوس. اختر الشبكة إضافة النقاط في القائمة المنسدلة المستكشف، وتحديد مسافة بين النقاط (المسافة تعتمد على مسألة تجريبية؛ على سبيل المثال-، 10 ميكرومتر، الشكل 3).
- اتبع أوامر البرنامج النصي. أدخل عدد نقاط الشبكة كما هو موضح في المستكشف، وأدخل عدد النقاط اقتناء (على سبيل المثال-، 20).
- تعيين العتبة الإضاءة بحيث البرنامج النصي يمكن تجنب البارات الشبكة. اتبع أوامر البرنامج النصي ونقل المرحلة يدوياً لتغطية مجال الرؤية بمقدار الربع مع شبكة--بار. طبقاً للقيمة المعروضة، قم بإدخال قيمة إضاءة عتبة (يجب أن تكون أعلى من القيمة المعروضة).
- انتظر حتى يتم تحديد النقاط لاقتناء والانتهاء من الطهي الروتينية.
ملاحظة: هذا يستغرق وقتاً طويلاً ويمكن أن يكون بين عشية وضحاها؛ يرسل البرنامج النصي المجهر إلى وضع الاستعداد بعد الانتهاء من الطهي الروتينية؛ روتين الطبخ مهم لتحقيق الاستقرار في المقاطع في شعاع الإلكترون.
- الطاقة التي تمت تصفيتها تحليل عنصري تيم (افتيم)
- اختر الوضع افتيم في الشفافية في مجال التسلح/مارك ألماني وحدد الكاميرا CCD المارك الألماني.
- مركز الشعاع واتباع أوامر البرنامج النصي الذي سينتقل المرحلة لكل تنسيق أخذ العينات.
ملاحظة: سوف يطلب المستخدم إذا كان المرحلة التي ينبغي أن تنقل إلى التنسيق التالي. - قم بمحاذاة ذروة الخسارة صفر (زلب) وتعيين C2 ~ 46.2 في المائة.
- تعيين الطاقة في 60 eV (في هذه الحالة، القيمة تعيين للكشف عن الحافة م Fe)، شق في وقت إدراج s. 0.4 10 eV والتعرض للشق وتعيين C2 ~ 43.9 في المائة.
- بدء العرض والتركيز الصورة.
- تعيين C2 إلى 46.2 في المائة، ومحاذاة زلب وتعيين C2 إلى 43.9 في المائة.
- الحصول على مخطط عنصري مع عنصري إعدادات محددة.
ملاحظة: يمكن استخدام الإعدادات الافتراضية في مربع الحوار الحصول على، ولكن من المستحسن اختبار هذه مسبقاً، إذا كان ذلك ممكناً؛ مثال تصفية الصور تظهر في الشكل 4. - تعيين C2 إلى 46.2 في المائة والحصول على خريطة سمك.
- كرر لكل نقاط اكتساب العزم (الخطوة 8.3.2-8.3.12).
- اتبع الإرشادات التي تظهر في البرنامج النصي والحصول على واحد إلكترون ميكروجرافس أو المونتاج لاكتساب النقاط. اختر التكبير حيث يكون كل (الترا-) هيكلية المعلومات مرئية/شخصية.
- حفظ ملف السجل والملاح وإطار النتائج وإزالة الشق.
- إغلاق الصمام وإزالة العينة وإيقاف ال.
Representative Results
هنا، يمكننا وصف سير عمل لتحديد المجالات لل بطريقة تلقائية وغير متحيزة. المستخدم يقوم بتحديد مجال الاهتمام داخل قسم رقيقة جداً تحت ال، ويستخدم عدة حلول البرمجيات الخاصة بسير العمل بما في ذلك برنامجنا RPS تلقائياً بحساب إحداثيات مناطق أخذ العينات 20 داخل منطقة الفائدة. ثم، يتم نقل المرحلة تيم لكل مجال أخذ العينات للتصوير الفوتوغرافي. وهذا ممكن لتحليل المقاطع واحد ولتحليل أزواج من المقاطع، مسافة معروفة عن بعضها البعض، مما يسمح لتحديد مجالات للتصوير بدون التحيز للمحقق.
يقوم سير العمل هذا أثبتت قيمتها عند توثيق ملامح ultrastructural في الماوس الدماغ المقاطع4،5. في هذه الدراسات، تم بحث طبقة الخلية polymorph المغزلي المسنن (دجبل) كمجال يحظى باهتمام. لدينا طريقة أثبتت أنها مناسبة لدراسة الإدارة العامة، لأنه يناسب قسم الاكليلية من المديرية العامة الظهرية (بريجما −1.3) في قسم رقيقة جداً وسهولة يعترف الخطوط العريضة في تضخم منخفض. إذا كانت مناطق الدماغ الأخرى التي سينظر فيها، سيكون من المهم للتأكد من حجمها ومميزات قبل التخطيط للتجارب.
تطبيق سير العمل الموضحة هنا أظهرت أن الإسكان هة يزيد عرض المشقوق متشابك إلى حد كبير في دجبل4، فيما يتعلق بظروف السكن القياسية. وعلاوة على ذلك، انخفض عدد الحويصلات الأساسية كثيفة كان إلى حد كبير في إيواء هة الحيوانات4، مما يشير إلى أن التغيرات في الأسرة معيشية neuropeptides. عند الفئران خروج المغلوب WT ونبي أبقى تحت ظروف هة، زاد عدد الخلايا العصبية/µm³ في دجبل بينما انخفضت كثافة DCV فيما يتعلق بالإسكان SE5. على النقيض من ذلك، أدت إلى خروج المغلوب نبي زيادة كبيرة من حويصلات متشابك في تجمع الاحتياطي (حويصلات متشابك undocked) مستقلة للإسكان شروط5. وانعكس أثر هة على عرض المشقوق متشابك في المجموعة "نبي كو" أدى إلى اختلاف كبير بين إيواء هة WT ونبي كو الفئران5. وهذا يدل دور حاسم لنبي لآثار العصبية الحيوية هة5الحيوانات خروج المغلوب عقدت تحت كلا النوعين من ظروف السكن، جنبا إلى جنب مع الدراسات السلوكية WT ونبي.
لتصور الحديد المخزنة في الدماغ البشري، تم تصنيف البرنامج نصي لبرنامج سيرياليم لاختيار عشوائي النقاط لاقتناء من داخل مقطع كله سامسونج، بهدف الحصول على طاقة التي تمت تصفيتها صورة مجهرية الإلكترون في كل نقطة من هذه النقاط . بعد تحميل المقطع في المجهر الإلكتروني، يقوم البرنامج النصي تثبيت المقطع (أي.، روتين 'العينة الطبخ') بين عشية وضحاها. البرنامج النصي ثم عشوائياً على عدد من النقاط المحددة مسبقاً من قبل المستخدم من تلك التي تحمل [غرتينغ] في الشكل 3. المنتجة صورة مجهرية اختبار والتحقق من مستويات الرمادي، فحص البرنامج النصي إذا النقاط المختارة التي كانت تقع على هي جزء واضح من المقطع، رفض النقاط التي سقطت على قضبان الشبكة. كان معالجة معظم سير العمل بواسطة البرنامج النصي مع الحد الأدنى من التفاعل للمستخدم. بيد أنه لم يتسن تلقائياً تسجيل ميكروجرافس الطاقة التي تمت تصفيتها (مع هذا الإعداد)، كما كان هناك أيضا القليل من الضوء لروتين اوتوفوكس من سيرياليم. ولذلك، نحن تحولت إلى البرمجيات مارك ألماني أقرب البرنامج النصي انتقلت المرحلة لكل نقطة، وضبط التركيز من جهة، وقدمت صورة افتيم من الحديد. ويرد مثال لصورة حديد افتيم من تشريح الدماغ البشري في الشكل 4.
الشكل 1. التوضيح لسير العمل. (أ) تظهر الخطوات الرئيسية لإعداد نموذج (في اتجاه السهم): أقسام فيبرتوم (ط)، embedding(ii)، قطع المقاطع شبه رقيقة ورقيقة جداً (ثالثا)، واصطياد أزواج من المقاطع رقيقة جداً على شبكات النحاس (رابعا). (ب) استخدام مجهر المورد البرمجيات والبرمجيات RPS مصنوعة خصيصا لإنشاء إحداثيات المنطقة أخذ العينات التي تحدد مواقع التسجيل. يتم تخزين نقاط الزاوية من المقاطع في برنامج الفحص المجهري والعائد على الاستثمار هو مبين (المحددة بمساعدة الأقسام شبه رقيقة) (ط)؛ يتم إنشاء شبكة لأخذ عينات من المناطق عبر العائد على الاستثمار، وهو عرض تحولاً عشوائية (السهم الأحمر) في العاشر و y. وهذا التحول أصغر من المسافة بين مناطق أخذ العينات، (الأسهم السوداء)، حيث أنه بدلاً من المربعات السوداء، التي لا تحول، تستخدم مربعات زرقاء، الذي ينقل عشوائياً، لتحديد مواقع التسجيل (الثاني)؛ وتستخدم فقط أخذ العينات في المناطق داخل حدود العائد على الاستثمار (رسمها كمربعات الأسود والأزرق) للتسجيل. ميكروجرافس مصنوعة في المقطع مرجع (المربعات السوداء)، وفي المواقع المقابلة في المقطع البحث (المربعات الزرقاء) (ثالثا). (ج) تتم صورة مجهرية في كل مجال أخذ العينات في تكبير كافية؛ يتم إجراء مونتاج تتكون من العديد من الصور المدمجة إذا لزم الأمر (في هذه الحالة، تم دمج الصور معا 2 × 2) (ط)؛ إنشاء إطار العد وسيظهر كتراكب في الصورة، يتم حساب هياكل داخل الإطار، وعلى 'قبول خطوط' (خطوط الإطار متقطع)، لكن هؤلاء لا على 'خطوط المحرمة' (خطوط الإطار الصلبة) (ii). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 2 . قياس البارامترات ultrastructural على زوج من مقاطع رقيقة جداً مع إطار العد غير متحيزة. (أ) نظرة عامة على ويندوز إيماجيج المستخدمة لفرز وتحليل الهياكل الخلوية. يظهر الجانب الأيسر صورة مجهرية إلكترون مع الإطار عد كتراكب. في الجانب الأيسر: واجهة المستخدم إيماجيج (المستطيل الأزرق) من القائمة المنسدلة (أعلى) وشريط (أدناه)؛ محرر كائن أوبجيكتج (المستطيل الأخضر)؛ نافذة الأدوات أوبجيكتج (المستطيل البرتقالي) حيث يمكن تحديد الأدوات اللازمة لقياس وإطار النتائج أوبجيكتج (مستطيل أسود) حيث يتم توثيق جميع القياسات. (ب) التفاصيل من تظهر نهايات ملحوظة صورة مجهرية الإلكترون (نقاط الاشتباك العصبي في كلا القسمين-الأسهم؛ المشبك فقط في القسم البحث-رؤوس الأسهم). تلك التي تم وضع علامة عليها باستخدام الأداة متعددة (دائرة حمراء) من شريط الأدوات في إيماجيج. (ج) أسماء والمعلمات قياس السمات متشابك تم تعريفها باستخدام أدوات أوبجيكتج. اختيار أداة علامة والميزة من الفائدة ورسمها في الصورة اليسرى نقرات الماوس على طول البنية المخطط التفصيلي. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 3. اختيار العينات المناطق للتعيين عنصري داخل عائد للطاقة التي تمت تصفيتها مجهر إلكتروني. يتم استخدام سيرياليم لتحديد طقة فائدة وتشير إلى عدد كبير من المناطق أخذ العينات في مسافة عادية (الصلبان الوردي في الصور A و B). البرنامج نصي ثم عشوائياً تحديد مناطق أخذ العينات (من هذه الإحداثيات المحددة مسبقاً) لاقتناء. يتم رفض مناطق أخذ العينات مع سوء الإضاءة لتجنب البارات الشبكة وتوقف البرنامج النصي حالما تم اختيار 20 أخذ العينات مضاءة جيدا المناطق داخل العائد على الاستثمار. (أ) نظرة عامة على منطقة بأكملها من الفائدة، حددها مضلع، مع عدد كبير من مناطق أخذ العينات الممكنة وضع علامة X. التفصيل A (ب) تبين مناطق أخذ العينات قبل اختيار عشوائي. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 4. مثال للحصول على خريطة عنصري (افتيم). (أ) مجال مشرق تيم صورة مجهرية من المنطقة المحيطة بالحصول على نقطة. منطقة تم اختيارها عشوائياً واستخدمت للحصول على مخطط عنصري ويتسم بمستطيل أسود. (ب) افتيم قبل حافة نافذة الصورة في منطقة تم اختيارها عشوائياً. (ج) افتيم ما بعد حافة نافذة الصورة في نفس المنطقة. (د) مخطط عنصري الحديد من نفس المنطقة (م-حافة). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
Discussion
سير العمل المقدمة هنا يسمح للباحث للحصول على البيانات على ميزات ultrastructural بطريقة غير متحيزة. وهذا وقتاً أقل بكثير من حجم التحقيقات من مقاطع المسلسل. وتستخدم العديد من التطبيقات المختلفة لتحقيق هذا الهدف. في البداية، برنامجنا RPS مصنوعة خصيصا (للاطلاع على تفاصيل بشأن توافر، الرجاء الاتصال بكاتب المقابلة) ويستخدم لإدخال تحولاً مرحلة عشوائية لتحديد إحداثيات المنطقة أخذ العينات. وهذا ما يسمح عينة عشوائية منهجية موحدة للعائد على الاستثمار. المقبل، لعد هياكل محددة، نحن تكييف طريقة ديسيكتور، حيث مقارنة المقاطع على التوالي 2 مع المسافة المعروفة، بطريقة رواية مقارنة بالدراسات السابقة13،،من1415 كما كنا نحن البرمجيات RPS مصنوعة خصيصا لمنهجية موحدة عينة عشوائية. وهذا يوفر الوقت بالمقارنة مع 3D تعمير وحدات تخزين كاملة من مقاطع المسلسل. على وجه التحديد هو تطوير هذا البرنامج RPS مصنوعة خصيصا لنوع واحد من المجهر الذي يعتبر عاملاً مقيداً لاستنساخ سير العمل. بديل من هذا البرنامج محددة سيكون تطبيق الذي يسمح البرمجة النصية وهو متوافق مع نماذج أخرى المجهر.
أننا استخدمت بنجاح هذا النهج لأن الدراسات المقارنة4،5. في أقسام رقيقة جداً من الأنسجة العصبية، كان مجال الاهتمام والصور التي اتخذتها المنتظمة عينة عشوائية موحدة في هذا المجال. قد تجدر الإشارة إلى أن مجال الاهتمام، طبقة polymorph المغزلي المسنن، منطقة صغيرة بدلاً من ذلك التحقيق الذي قد يكون مفيداً للنهج الذي نتبعه. داخل ديسيكتور موضوعة عشوائياً، يمكننا تقييم عدد DCV والعديد من الميزات ultrastructural من نقاط الاشتباك العصبي في دجبل الفئران الكبار يوجد في سراج الدين وهه فضلا عن وزن البالغين الفئران مقابل الفئران خروج المغلوب نبي الكبار. باستخدام النهج الذي نتبعه، أظهرت البيانات التي تم جمعها تغييرات في بعض المعلمات التحقيق. وأكدت هذه النتائج تلك من دراسات أخرى مماثلة في الحيوانات الأحداث2.
عيوب استخدام تجريبي لسير العمل هذا قد يكون أن هذا المتعددة application النهج ليس مثاليا من حيث سهولة الاستخدام، المستخدمين بحاجة للحصول على راحة مع واجهات المستخدم مختلفة (في حالتنا، واجهة المستخدم، و "قسم المسلسل تيم" ، RPS البرمجيات، والبرمجيات سيرياليم). تعلم كيفية التعامل مع جميع الطلبات بطريقة فعالة هو مضيعة للوقت وينبغي أن تؤخذ في الاعتبار. ومع ذلك، استثمار الوقت في تعلم كيفية استخدام سير العمل هذا لا تزال وضوح مواتية مع مرور الوقت اللازم لتحليل وحدات التخزين كله مع قسم المسلسل تيم. طريقة استخدام ديسيكتور بمنهجية أخذ العينات العشوائية موحدة في مجال الاهتمام كافية لتقديم بيانات موثوقة1 دون الحاجة إلى التحقيق على كمية عالية من الأقسام/وحدة التخزين.
لتحقيق أقصى قدر من النتائج في دراساتنا، من الضروري اتخاذ الرعاية الجيدة أثناء إعداد عينة، كالحفاظ على الأنسجة والهياكل ليست فقط أمرا حاسما لتقييم السمات الهيكلية، بل أيضا لتحديد مجال الاهتمام لا لبس فيه. عاملاً محوريا، وعيب آخر ربما كان هذا الأسلوب، أن جودة عالية لأزواج مقاطع رقيقة جداً مطلوب: يجب أن يكون هناك لا ثقوب أو التجاعيد التي تغطي المنطقة الخاضعة للتحقيق في أي من الأقسام، ويجب أن يكون سمك الفرع تحتفظ متجانسة. الباحث يجب أن يكون المدربين تدريبا جيدا في أولتراميكروتومي. أيضا الرعاية التي يجب اتخاذها عند تصوير المقاطع في ال، كما المقاطع حساسة لأضرار شعاع الإلكترون ويمكن أن تمزق بسهولة. وعلاوة على ذلك، من المهم أن تختار العدد الصحيح من مناطق أخذ العينات في العائد على الاستثمار. وقد تكبير ميكروجرافس إلكترون تبعاً لهدف التجريبية، يحدد بدقة. لتجاربنا على وجه التحديد، عد نقاط الاشتباك العصبي في الجهاز العصبي المركزي، 20 المناطق ذات الاهتمام في مقطع واحد مع مجال 30.25 ميكرومتر2 الأمثل. فإنه ينصح تدريب جيد في الاعتراف بالميزات المذكورة (في حالة الاشتباكات العصبية وميزات متشابك و DCV) للحصول على نتائج يمكن الاعتماد عليها. الحويصلات متشابك بغية تحديد نقاط الاشتباك العصبي، يجب أن تكون قابلة للتحديد، وهذا يتطلب قرارا من مالا يقل عن 10 نانومتر. لهذا، بير 5000 X الأمثل، ولكن يمكن ملاحظة أن التكبير يعتمد على معلمات الأجهزة مثل النوع والموقف من الكاميرات، وسيكون من الضروري تكييف أنواع المجهر و/أو كاميرا أخرى. كما أنه تجدر الإشارة إلى أن البروتوكول يستخدم تطبيقات محددة لل واحد وأن يكون لدى المستخدمين مع نماذج أخرى للنظر في الاختلافات في برنامج الإعداد.
ونحن نعتقد أن لدينا سير العمل يمكن تكييفها للعديد من التطبيقات الأخرى ليس فقط في علم الأعصاب ولكن في مجال واسع من العلوم البيولوجية والعلوم المادية أيضا (عند الحاجة إلى دقة عالية) كلما كان السؤال البحثي يتطلب منهجية موحدة أخذ عينات عشوائية وكمية العينات لفحصها يسأل عن وسيلة فعالة لوقت للتحليل. على سبيل المثال، نحن مهتمون حاليا في إضفاء الطابع المحلي على مخازن الحديد في الدماغ البشري. لهذا، نحن تكيفت مؤخرا سير العمل لدينا، لتمكين تحليل عنصري على مقاطع رقيقة جداً في المناطق المختارة عشوائياً. من أجل تقليل عدد الطلبات اللازمة لسير العمل، ونحن تهدف إلى تطبيق باستخدام البرمجيات سيرياليم فقط، لأنه يمكن برمجتها للانتقال المرحلة المحددة مسبقاً النقاط التي يمكن تحديدها بطريقة عشوائية. قمنا بإنشاء برامج نصية مخصصة للتحكم ال، بهدف أوتوماتيزينج سير العمل تماما. أثبت ذلك عمليا باستثناء autofocusing في وضع التصوير التي تمت تصفيتها، والتي لم تسفر عن نتائج مرضية. وهكذا كنا البرمجيات مارك ألماني للتركيز، والحصول على الصور التي تمت تصفيتها الطاقة.
وباختصار، نحن نقدم حلول البرمجيات التي تساعد في الحصول على ميكروجرافس الإلكترون بطريقة غير متحيزة.
Disclosures
الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.
Acknowledgments
تمويل من "صندوق العلوم النمساوية"، FWF، المشروع رقم B27 29370 ف
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Pentobarbital | SigmaAldrich | P3761 | |
| Formaldehyde | Merck | 1040051000 | 1kg |
| Glutardialdehyde | Science Services | E 16210 | 25%; 100ml; EM grade |
| cacodylate buffer | Merck | C4945 | 250g; Dimethylarsinic acid sodium trihydrate |
| Thionine acetate/Ceristain | Merck | 861340 | |
| acetic acid | Merck | 1000631000 | 1 L |
| Sodium hydroxide | Merck | 1064951000 | 1 kg, pellets |
| osmium tetraoxide | Science Services | E 19110 | 10x1g |
| TAAB embedding resin | Science Services | TAT001 | 500g |
| DMP-30 | Science Services | TAD024 | 100g |
| DDSA | Science Services | TAD025 | 500g |
| Uranyl acetate dihydrate | Plano GmbH | 19481 | depleted, 25g |
| Ultrastain 2 | Leica | 16707235 | Lead citrate |
| Toluidine blue solution | Agar Scientific | AGR1727 | 10g |
| Pioloform | Plano GmbH | R1275 | 10g Powder |
| Proylenoxide | SigmaAldrich | 82320-1L | 1L |
| DPX embedding medium | Plano GmbH | R1320 | embedding medium for semi-thin sections on glass slide, 50 ml |
| Vibratome, Leica VT 1000 | Leica Microsystems, Vienna, Austria | ||
| Leica Ultracut UCT, ultramicrotom | Leica Microsystems, Wetzlar, Germany | ||
| Tecnai G2 20 | FEI,Eindhoven, Netherlands | ||
| Megaview wide angle camera | Olympus Soft Imaging Solution, Münster, Germany | ||
| US 1000 digital camera | Gatan, Pleasanton, USA | ||
| TEM Imaging Analysis Software | FEI,Eindhoven, Netherlands | ||
| FEI Serial Section Software | FEI,Eindhoven, Netherlands | ||
| Fiji, ImageJ 1.52e | National Institute of Health, USA | ||
| SPSS 20.0 | SPSS Inc., Chicago, IL, USA | ||
| SerialEM | Regents of the University of Colorado | ||
| RPS (random point sampling) software 0.9a | custom-made | ||
| Disector v1.0.2 (ImageJ macro) | custom-made | ||
| EFTEMSerialEM (SerialEM script) | custom-made |
References
- Howard, V., Reed, M. Unbiased Stereology: Three-Dimensional Measurement in Microscopy. , BIOS Scientific Publishers. Oxford. (1998).
- Nakamura, H., Kobayashi, S., Ohashi, Y., Ando, S. Age-changes of brain synapses and synaptic plasticity in response to an enriched environment. Journal of Neuroscience Research. 56 (3), 307-315 (1999).
- Landers, M. S., Knott, G. W., Lipp, H. P., Poletaeva, I., Welker, E. Synapse formation in adult barrel cortex following naturalistic environmental enrichment. Neuroscience. 199, 143-152 (2011).
- Reichmann, F., et al. A novel unbiased counting method for the quantification of synapses in the mouse brain. Journal of Neuroscience Methods. 240, 13-21 (2015).
- Reichmann, F., et al. Environmental enrichment induces behavioural disturbances in neuropeptide Y knockout mice. Scientific Report. 6, 28182 (2016).
- Mayhew, T. M. Taking Tissue Samples from the Placenta: An Illustration of Principles and Strategies. Placenta. 29, 1-14 (2008).
- Ferguson, S., Steyer, A. M., Mayhew, T. M., Schwab, Y., Lucocq, J. M. Quantifying Golgi structure using EM: combing volume-SEM and stereology for higher throughput. Histochemistry and Cell Biology. 147, 653-669 (2017).
- Sterio, D. C. The unbiased estimation of number and sizes of arbitrary particles using the disector. Journal of Microscopy. 134 (2), 127-136 (1984).
- Gundersen, H. J., et al. The new stereological tools: disector, fractionator, nucleator and point sampled intercepts and their use in pathological research and diagnosis. APMIS. 96 (10), 857-881 (1988).
- Franklin, K. B. J., Paxinos, G. The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates. , Elsevier/Academic Press. (2008).
- Lewis, P. R., Knight, D. P. Staining Methods for Sectioned Material. , Elsevier/North-Holland Biomedical Press. (1988).
- Mastronarde, D. N. Automated electron microscope tomography using robust prediction of specimen movements. J Struct Biol. 152 (1), can be downloaded from http://bio3d.colorado.edu/SerialEM 36-51 (2005).
- Rampon, C., Tang, Y. P., Goodhouse, J., Shimizu, E., Kyin, M., Tsien, J. Z. Enrichment induces structural changes and recovery from nonspatial memory deficits in CA1 NMDAR1-knockout mice. Nature Neuroscience. 3 (3), 238-244 (2000).
- Xu, X., Ye, L., Ruan, Q. Environmental enrichment induces synaptic structural modification after transient focal cerebral ischemia in rats. Experimental Biology and Medicine. 234 (3), 296-305 (2009).
- Lonetti, G., et al. Early environmental enrichment moderates the behavioral and synaptic phenotype of MeCP2 null mice. Biological Psychiatry. 67 (7), 657-665 (2010).
