Summary
Vi indføre en roman arbejdsproces for elektronmikroskopi undersøgelser af hjernevæv. Metoden tillader bruger hen til undersøge neuronal funktioner i en fordomsfri måde. For elementært analyse præsenterer vi også et script, der automatisk de fleste af arbejdsgangen for randomiserede prøveudtagning.
Abstract
Undersøgelser af de ultrastrukturelle funktioner af neuroner og deres synapser er kun muligt med Elektron Mikroskopi. Især for sammenlignende undersøgelser af ændringer i tætheder og fordelinger af sådanne funktioner er en fordomsfri prøvetagningsprotokol afgørende for pålidelige resultater. Her præsenterer vi en arbejdsgang til billede erhvervelse af hjernen prøver. Arbejdsprocessen giver mulighed for systematiske ensartede tilfældige stikprøver inden for et defineret hjernen regionen, og billederne kan analyseres ved hjælp af en disector. Denne teknik er meget hurtigere end omfattende undersøgelse af seriel afsnit men stadig præsenterer en realistisk tilgang til at vurdere de tætheder og fordelinger af ultrastruktur funktioner. Før indlejring, blev bejdset vibratome sektioner brugt som reference til at identificere området af hjernen under undersøgelsen, som hjalp fremskynde den overordnede prøvepræparation proces. Denne tilgang blev anvendt for komparative studier undersøger effekten af en beriget boliger miljø på flere ultrastrukturelle parametre i hjernen, mus. Baseret på den vellykkede anvendelse af arbejdsprocessen, tilpasset vi det til elementært analyse af hjernen prøver. Vi optimeret protokol med hensyn til tidspunktet for bruger-interaktion. Automatisere tidskrævende trin ved at indsamle et script for open source-software SerialEM hjælper brugeren med at fokusere på det vigtigste arbejde for at erhverve elementært kortene. Som i den oprindelige arbejdsproces lagde vi vægt på upartiske prøveudtagning tilgang til at sikre pålidelige resultater.
Introduction
Elektronmikroskopi er det ofte udfordrende at prøve repræsentative regioner inden for afsnittene. Vi, er som observatør, ofte partiske for at kigge på specifikke regioner udarbejdet til vores opmærksomhed ved iøjnefaldende træk af prøven, forhindrer en godt fordelt, uvildig stikprøvekontrol. Prøveudtagning bias kan kun undgås, hvis hver del af det pågældende område, får den samme chance for ender i en elektron Mikrograf1. Det er muligt at undgå prøveudtagning bias uden en softwareløsning, for eksempel ved at skubbe trackball af mikroskopet manuelt uden at kigge på billedet, for at vælge prøveudtagning regioner, hvor scenen stopper. Men dette er strengt taget ikke en vilkårlig procedure, fordi bevidst eller ubevidst, brugeren kan have en indflydelse på flytning af scenen, og desuden, dette er ikke en sofistikeret måde at vælge prøveudtagning regioner. Stikprøvekontrol bliver især vigtigt hvis par sektioner bruges til at vurdere antallet af strukturer i et bestemt rumfang, for eksempel for Stereologi1, som kræver par af sektioner, en kendt afstand fra hinanden. Det ville også være muligt at se kun på et enkelt afsnit og estimere antallet af specifikke strukturer2, men med denne tilgang efterforskere tendens til at overvurdere den numeriske tæthed af større strukturer, medmindre strukturerne er meget lille i sammenligning til snittykkelsen. Alternative tilgange er at genopbygge bind af væv fra seriel sektioner og dermed få de ønskede data3. Men det er meget tidskrævende og ikke en realistisk tilgang til (større) sammenlignende undersøgelser.
For at overvinde disse problemer, har vi udviklet en arbejdsproces, som gør det muligt for forskeren at automatisk vælge prøver for at opnå elektron micrographs på regelmæssig afstand inden for ultra-tynde sektioner. Placeringen af elektron micrographs er tilfældigt, at tillade uvildig prøveudtagning. Metoden er velegnet både til bestemmelse af numeriske tætheder af strukturer (f.eks synapser inden for en bestemt neuropil bind4,5) og dimensioner af strukturelle elementer (for eksempel bredden i den synaptiske kløft, eller diameter af postsynaptiske tæthed4,5).
Arbejdsgangen bruger en skræddersyet tilfældig punkt prøveudtagning (RPS) software (skrevet i Java script ved hjælp af Scripting software leveres med vores mikroskop), der automatisk beregner grid positioner inden for en foruddefineret område af interesse i en ultra-tynd sektion. RPS software flytter fase af elektron mikroskop til disse foruddefinerede punkter, således at en elektron Mikrograf kan foretages på hvert punkt. Først skal definerer brugeren en region af interesse inden for afsnittet tynd. Derefter beregner programmet RPS grid positioner inden for denne region. X / y-koordinater af den første position er skabt tilfældigt, og de resterende stillinger er placeret på regelmæssigt gitter intervaller i henseende til den første position. Fordi hver del af det pågældende område, har den samme chance for at blive undersøgt, giver dette minimal dataindsamling. Denne tilgang af prøveudtagning kaldes også systematisk ensartet stikprøvekontrol (Se referencer6,7 for flere detaljer).
Til bestemmelse af de numeriske tætheder af strukturer, arbejder vi med par sektioner, der er en kendt afstand fra hinanden. Efter at have indhentet en elektron Mikrograf fra den første sektion i en forudbestemt positioner, flytter TEM seriel afsnit software (del af software-pakke leveret med vores elektronmikroskop) til det tilsvarende punkt i det andet afsnit, for at opnå en elektron Mikrograf af den tilsvarende placering. Dette gentages for hver placering i gitteret forudbestemt. I vores tilgang, der en disector bruges til at tælle antallet af partikler i hvert par af elektron micrographs8,9. En disector består af et par optælling rammer, en for hver sektion8,9. Den numeriske tæthed af objekter er bestemt af kun tælle objekter synligt på den første (eller afsnittet reference) men ikke på den anden afsnit (eller opslag). Dette gør det muligt for at anslå de numeriske tætheder af objekter i en hurtig og effektiv måde8,9. Desuden på enkelt dele, kan to-dimensionelle strukturelle træk måles.
Vi har anvendt denne arbejdsproces med succes for at vurdere forskelle i synapse numre i hippocampus af mus udsættes for beriget miljø (EE) boligforhold i forhold til standard miljø (SE) boliger betingelser4,5, og også for at evaluere de ultrastrukturelle forskelle mellem vildtype (WT) mus og neuropeptid Y (NPY) KO mus holdes under SE og EE5. Vores mål var at se specifikt på strukturelle egenskaber af neuroner, som de numeriske synaptic tæthed, længder af det aktive område i tværsnit og den postsynaptiske tæthed, bredden af den synaptiske kløft, og antallet af synaptiske vesikler, for at vurdere ændringer i neuronal connectivity og aktivering mellem de forskellige eksperimentelle betingelser. Derudover var vi interesserede i den numeriske tæthed af tætte-core vesikler (DCV) i neuroner til at bestemme mængden af lagrede neuropeptider i et bestemt område, hjernen.
Baseret på succesen med vores tilgang til de undersøgelser, der er beskrevet ovenfor, i vores næste skridt, har vi tilpasset vores arbejdsproces for at vælge områder for uvildig elementære analyser inden for menneskelige hjerne prøver. Dette blev gjort til billedet jern, der er lagret i ferritin molekyler i neuroner og gliaceller. For dette samlet vi et script, der tillod os at automatisere de fleste af operationer for en tilfældig screeningsproces af hjernen sektioner i et afgrænset område.
Protocol
Alle eksperimenter blev godkendt af en etisk komité på det føderale ministerium for videnskab og forskning af Republikken Østrig (BMWF-80.104/2-BrGT/2007 og BMWF-66.010/0037-II/3b/2013) eller etik Kommissionen af det medicinske universitet i Graz, nummer 28-549 ex 15/16, og gennemførte direktiv af de europæiske Fællesskaber Rådet af 24 November 1986 (86/609/EØF) og Europa-Parlamentet og Rådet af 22 September2010 direktiv (2010/63/EU). De dyreforsøg blev designet og udført på en sådan måde, at antallet af anvendte dyr blev minimeret.
1. dissektion og fiksering af væv
- Aflive mus (21 uger gamle, kvindelige C57BL/6J mus og C57BL/6N mus; mandlige WT og NPY KO mus på en blandet C57BL / 6:129 / SvJ (1:1) baggrund henholdsvis) ved at indsprøjte 150 mg/kg pentobarbital intraperitoneal.
- Fjern hjerner fra kraniet og straks skær dem i halve (adskille venstre fra højre hjernehalvdel) - ved hjælp af en skalpel.
- Umiddelbart placerer halvdele i glasbeholdere med 2% formaldehyd og 2,5% glutaraldehyd i 0,1 M cacodylate buffer (CH3)2AsO2Na·3H2O, pH justeret til 7.4 med 1 M NaCl), pH 7,4 ved 4 ° C.
Forsigtig: Fikseringsmidler er giftigt og skal håndteres med stor omhu. Brug kun med beskyttelseshandsker og under stinkskab. - Løse hjerne-halvdele i 2 dage ved 4 ° C og skyl i den samme buffer i mindst 24 timer, også ved 4 ° C. Mængden af bufferen bør være på omkring tifold modellen volumen.
2. identificere det pågældende område i hjernen ved at sammenligne Vibratome sektioner med Reference sektioner fra musen hjerne Atlas10
- Sted eksemplet hjernen på en vibratome. Sikre, at orienteringen af hjernen er korrekt (i dette tilfælde en koronale orientering blev valgt til hippocampus).
- Trim indtil region af interesse (ROI) i hjernen er nået. Skær sektioner på en stor tykkelse (fx., 100 µm) indtil del af hjernen med det pågældende område er nået og smide væk hver sektion.
- Begynde at skære vibratome sektioner med 20 µm tykkelse i begyndelsen af den hjerne del med ROI og placere vibratome sektioner på et glas dias. Pletten dem (Nissl pletten) ved at anbringe sektionerne i 0,05% thionine acetat i natrium acetat buffer, pH 4.2 for 1 min (figur 1Ai).
- Sammenlign de farvede dele med musen hjernen atlas ved hjælp af et lysmikroskop og fortsætte klipning og farvning indtil de ønskede hjernen koordinater er nået.
3. at opnå en stikprøve Region for indlejring
- Så snart det rigtige område er identificeret, begynde opskæring én sektion på 150 µm tykkelse med vibratome.
- Microdissect dette vibratome afsnit med et barberblad under stereo-mikroskop. Skåret væk dele omkring ROI. Afsnittet skal have en passende størrelse for de følgende forberedelsestrin for transmissions Elektron Mikroskopi (TEM) (ikke større end 1 x 1 mm2).
4. TEM præparat - indlejring, ultra-tynde skæring og farvning
- Indlejring
- Efter rettelse til 2 h i 2% osmium dinitrogentetraoxid ved stuetemperatur (RT). Bruge en diskenhed til at dække prøve med mindst 10 gange sample volumen, men undgå at bruge overskydende fiksativ for at forhindre unødvendige giftigt affald.
Forsigtig: Osmium dinitrogentetraoxid er yderst giftigt og skal håndteres med stor omhu. Brug kun med beskyttelseshandsker og under stinkskab. - Dehydrere bruger EM Grade alkoholer i trin på 20 min. Brug en større volumen end i det foregående trin (50%, 70%, 80%, 96% og 100% ethanol).
- Sted i propylenoxid i 40 min. på RT. sted i en blanding af propylen oxid/embedding harpiks (1:2) for 2 h i RT og 1:3 natten over ved 4 ° C.
Forsigtig: Propylenoxid er yderst giftigt og skal håndteres med stor omhu. Brug kun med beskyttelseshandsker og under stinkskab. - Integrere prøverne i 100% resin ved at ændre harpiksen 2 gange efter 60 min og en gang efter 90 min (alle ved 45 ° C).
- Endelig, Placer prøverne i de passende forme og lad harpiks polymerisere ved 90 ° C i 3 dage (figur 1Aii).
- Efter rettelse til 2 h i 2% osmium dinitrogentetraoxid ved stuetemperatur (RT). Bruge en diskenhed til at dække prøve med mindst 10 gange sample volumen, men undgå at bruge overskydende fiksativ for at forhindre unødvendige giftigt affald.
- Trimning og Sectioning på en ultramicrotome.
- Trim blok, sikre, at siderne er så glat som muligt for sektioner til at overholde hinanden (figur 1Aiii).
- Producere 55 nm ultra-tynde serielle sektioner (bør være sølv grå) ved hjælp af en ultramicrotome. Bruge et slot gitter (slot bredde 1 x 2 mm) belagt med pioloform (figur 1Aiv).
- Kontrastfarve ultra-tynde sektioner på slot gitrene ved hjælp af 2% uranyl acetat for 30 min og bly citrat til 30 s i RT (dette er standard elektronmikroskopi metode11).
Forsigtig: Uranyl acetat er yderst giftigt og enhver direkte kontakt bør undgås. Håndtere kun med beskyttende handsker. Bly nitrat er giftigt ved indtagelse eller indåndes og skal håndteres med stor omhu.
5. billeddannelse af tilsvarende ROIs på henvisningen og Look-Up sektioner på TEM med Software-pakker
- Undersøge afsnittene på nettet med TEM ved hjælp af en lav forstørrelse (afhængigt af størrelsen af sektionerne) til orientering og til at evaluere kvaliteten af sektionerne.
- Starte softwaren (en pakke af TEM billede analyse Software eller TIA, leveres med mikroskop) til at generere virtuelle billeder af sektionerne ved at gemme hjørnepunkter af sektionerne. Der tillader software til at finde de tilsvarende ROI på hvert afsnit.
- Gå til sektionen og vælg Indsæt tilføje hjørnepunkter til afsnittet reference og look-up. Følg instruktionerne i pop-up-vinduet. Starte med afsnittet reference og derefter fortsætte med afsnittet look-up. Kontroller, at afsnittet kanter, som er parallelle til næste afsnit som punkt 1 og 2 (figur 1Bi) er angivet.
- Visualisere afsnittet reference under lav forstørrelse til at identificere det pågældende område, og flytte mikroskop scene ved hjælp af TIA på afsnittet reference til flere hjørnepunkter af Investeringsafkastet til at oprette en skitse af ROI.
- Registrere koordinaterne for den resulterende polygon bruger RPS software. For dette, skal du trykke på Tilføj koordinater i dialogboksen RPS software på hvert punkt i en polygon, der er nødvendige for at skitsere ROI i afsnittet (figur 1Bii).
- Definere og angive en passende størrelse for prøveudtagning områder og afstande mellem områder i RPS software (i den præsenterede undersøgelse, størrelsen af prøveudtagning områder er 7 µm og afstanden mellem dem er 20 µm, resulterer i mindst 20 prøveudtagning områder inden for den ROI). Tryk på Beregne Raster, derefter software genererer prøveudtagning område koordinater i en systematisk ensartede tilfældige mode for den Mikrograf positioner indenfor polygon (figur 1Biii).
Bemærk: For bedre orientering, polygonen og prøveudtagning områder inden for polygonen kan vises af RPS software (figur 1Biv).
- Gemme prøveudtagningsstederne på afsnittet reference og look-up ved hjælp af RPS software og TEM seriel afsnit software. Disse er montager koordinater som er indspillet bagefter11.
- I RPS-softwaren, skal du trykke på gå til næste position at flytte stadiet mikroskop til x / y koordinaterne for hver prøvetagning område i afsnittet reference. Gå til placering og Indsæt for at importere disse koordinater i softwaren i afsnittet reference. Gentag dette for alle koordinater.
- Hvis du vil spejle koordinater fra afsnittet reference til afsnittet look-up, gå til afsnit og tryk på gå til sektionen. Angiv antallet af afsnittet look-up (normalt ' 2') i dialogvinduet.
- Til optagelse af montager (se næste trin), skifte mellem afsnittet reference og look-up som beskrevet før og ændre holdning på afsnittet reference med placering og gå til nummer. Vælg den næste koordinat i dialogvinduet.
- SerialEM montager på hver prøveudtagning koordinere, gå til fil og vælge Ny Montage fra drop-down menuen. Vælg det rigtige antal fliser og procent i overlap i dialogvinduet. Nuværende undersøgelse, 5000 X forstørrelse er tilstrækkelig til at genkende de synaptiske funktioner under undersøgelsen, men begrænsede synsfeltet CCD kamera kræves, gør montager med 2 x 2 billeder. Montager er lavet med SerialEM.
- Før optagelse hvert montage, justere fokus (eller, hvis det er muligt aktivere indstillingen autofokus i optagelse software). Vælg mappe til at gemme filen montage og starte optagelsen af montage ved at trykke på Start i undermenuen montage til venstre i SerialEM.
6. analysere TEM billeder med ImageJ til dokument ultrastrukturelle funktioner.
Bemærk: For dette, det er vigtigt at oprette en tilpasset billedstak fra afsnittet reference og opslag.
- Konvertere billedet-par med ImageJ billeder til stak i en stak fil og tilpasse billeder med StackReg (har at blive installeret fra BIG-EPFL http://sites.imagej.net/BIG-EPFL/; i den foreliggende sag, den algoritme Affine var brugt). For at opnå de numeriske tætheder af cellulære strukturelle træk, genererer custom-made ImageJ makroen Disector en optælling ramme med en størrelse på 5,5 x 5,5 µm placeret tilfældigt over billedet med en tilfældig vinkel.
- Start makroen Disector (placering i menuen ImageJ afhænger af den mappe, hvor det er gemt), og Definer parametrene (størrelse af rammen optælling, antallet af segmenter) som nødvendige (figur 1Cii).
- Tæl antallet af synapser/µm2 ved hjælp af Disector. Tæl hver synapse inden for rammen optælling, der er synlige i afsnittet reference, men ikke synlig i afsnittet opslag. Udelad de synapser, der gennemskærer med de to 'forbudt linjer' af disector; men tæller synapser på den modsatte 'accept linjer". Til dette, Brug Multipoint værktøj er placeret i Toolsbar i ImageJ (figur 2A, figur 2B).
- Til måling af synapse parametre, skal du vælge kun synapserne med en synaptiske kløft orienteret i tværsnit (på afsnittet reference, i de samme billedrammer anvendes til disector).
- Starte plugin ObjectJ i ImageJ fra drop-down menu (fig. 2A) via Plugins | Analysere. Åbn et nyt projekt fra ObjectJ dropdown-dialogboksen. Dette vil åbne et vindue, der tillader brugeren at dispositionen og mark strukturer med Markør værktøj (figur 2B, rød cirkel). Synaptic parametrene bruges til eksperimenterne præsenteret her er beskrevet i de følgende trin.
- Måle længden af den præsynaptiske membran og postsynaptiske tæthed længde ved at tegne en streg langs den struktur ved hjælp af Markør værktøj (figur 2B, rød cirkel).
- Opnå den gennemsnitlige bredde af den synaptiske kløft ved at tegne en polygon, der dækker både præ- og postsynaptiske membran, med lige parallelle sider og en segmenteret linje midway, samme afstand til begge membraner.
- For fastsættelsen af antallet af forankret vesikler, Tæl alle blærer, der har en maksimal afstand fra den præsynaptiske membran på en vesikel diameter eller derunder.
- For fastsættelsen af antallet af undocked vesikler, Tæl disse vesikler med en maksimal afstand af en vesikel diameter fra dockede eller andre undocked vesikler på den samme synapse.
7. producerer semi-tynde sektioner til lys mikroskopi til makroskopisk dokumentfunktioner (i det foreliggende tilfælde celle nummer) inden for den samme ROI som valgt for TEM-undersøgelsen.
- Umiddelbart efter opskæring de ultra-tynde sektioner for TEM, skåret to semi-tynde sektioner, 0,5 µm tykt og umiddelbart støder op til hinanden. Placer på et glas dias og bejdse dem ved hjælp af 0,5% toluidin blå løsning. Placer en cover slip på afsnittene (med DPX montering medium, bestående af distyrene, blødgører (tricresyl fosfat) og xylol). Disse to afsnit bruges til at tælle celle tal.
- Fotografere de semi-tynde sektioner på lav forstørrelse ved hjælp af et lysmikroskop.
Bemærk: Strukturer under undersøgelsen skal kunne identificeres i billederne. I den foreliggende undersøgelse, blev 20 X forstørrelse brugt til at identificere celle organer. Hvis det er nødvendigt, kan flere billeder syet sammen med en billedbehandling software. - Juster par af to på hinanden følgende semi-tynde sektioner med en billedbehandling software (fx., ImageJ).
Bemærk: Forskelle i rotation og størrelse (kan opstå på grund af komprimering artefakter indført af skæreprocessen) bør justeres for en perfekt overlejring af de to afsnit. - Marker kanten af ROI på det lette mikroskopi billede. ROI skal svare til ROI til TEM billeder. Til dette formål, indlæse billederne i ImageJ og vælg polygon Udvalget fra Toolsbar (figur 2A).
- Generere et gitter over hele billedet ved hjælp af ImageJ ved at åbne analyser | Værktøjer | Grid og indstille parametre efter behov.
- Beregne areal og bind af polygon fra antallet af grid-points inden for området af interesse og afsnit tykkelse (volumen = NCS * enGS * hST ; NCS = tælles Cross sektioner; EnGS = gitterstørrelse; hST = snittykkelsen).
- Tæl antallet af kerner fra neuronal celle organer inden for Investeringsafkastet, hvis de er kun til stede på én sektion. Vælg Multipoint værktøj i ImageJ fra Toolsbar og markere cellerne. Efter tælle celler på hver sektion, beregne antallet af celler pr. volumen (
; Cdensitet = massefylde af celle; CCount = celletal). - Registrer alle målinger i vinduet ObjectJ resultater (figur 2C). Eksportere og gemme dem til senere brug.
; Cdensitet = massefylde af celle; CCount = celletal).8. brug af SerialEM Script til at optimere elementært analyse i hjernen prøver i kombination med DigitalMicrograph (DM, leveres med afbildningsfilteret).
- Tuning af Imaging Filter (GIF).
- Læg prøven i TEM og gå til et hul i stikprøven for GIF tuning bruger trackball eller joystick af mikroskopet.
- Skifte til Energi filtreret TEM (EFTEM) i DM software/eller DM og vælg CCD kamera i DM.
- Vælg forstørrelse til elementære analyse (forstørrelsen afhænger af struktur/område af interesse, i det foreliggende tilfælde forstørrelsen er angivet fra 76 k op til 125 k). Sæt eksponeringstid på 0,001 s og begynde at Se.
- Fokusere strålen omhyggeligt, indtil kanterne kan ses og center stråle i billedet. Reducere C2/den objektive blænde, indtil kanterne af blænden er synlig og center stråle med trackball for bjælken.
- Defocus bjælken (omkring C2 46,2%, eksponeringstid for tuning skal være omkring 0,05 s) og finde den nul tab højdepunkt (ZLP) ved at trykke på knappen ZLP . Starte tuning proceduren ved at trykke på knappen fuld tune .
- Få tilfældige point for erhvervelsen.
- Skifte tilbage til TEM imaging tilstand og vælge Camera og Find ud af fokus på forstørrelse 10 k (Juster z-aksen og sætte defocus til nul).
- Vælg LM 75 X Forstørrelse og check, hvis kameraet ikke er isat (ellers det kan ikke være kontrolleret af SerialEM software).
- Start SerialEM og åbne et nyt projekt.
- Åbne navigatoren. Kontroller indstillingerne for kameraet i kamera & Script kontrol (for visning og post) og starte visning (kamera er indsat automatisk).
- At gøre et hjørne kort af den ultra-tynde sektion, skal du vælge Tilføj punkter i Navigator-vinduet.
- Sæt hjørnepunkter på kanterne af en ultra-tynd sektion. Flytte scenen til et hjørnepunkt ved at holde højre-mus-tasten nede. Når et hjørne af afsnittet er nået, tilføje et hjørnepunkt med venstre museklik. Gentag proceduren for at tilføje 3 flere hjørnepunkter. Sørg for, at feltet C for hjørnepunkter i navigator-vinduet er markeret for de lagrede point.
- For at starte hjørne montage (at foretrække på forstørrelse LM 75), gå til Navigator i SerialEM-menulinjen og vælge Montaging & gitre og Setup hjørne Montage fra drop-down menuen.
Bemærk: De bedste montering indstillinger for de valgte post parametre vises. Skift dem hvis det er nødvendigt. I den foreliggende sag, blev kun overlapningsprocentdelen ændret til 20%.
- Skitsere afsnit/ROI på montage billede. Vælg Tilføj Polygon i navigator-vinduet og skitsere afsnittet med flere højre-museklik. Vælg Tilføj gitter af punkter i rullemenuen navigator og definere en afstand mellem de punkter (afstanden afhænger af det eksperimentelle spørgsmål; fx., 10 µm, figur 3).
- Følg scriptkommandoerne. Indtast antallet af point, grid som vist i navigator og indtast antallet af point, erhvervelse (fx., 20).
- Angive belysning tærskel, så scriptet kan undgå gitter barer. Følg scriptkommandoerne og flytte fase manuelt til at dække synsfeltet med en fjerdedel med en gitter-bar. Ifølge den viste værdi, Angiv en tærskelværdi for belysning (bør være højere end den viste værdi).
- Vent indtil point for erhvervelse er valgt og rutinen madlavning er færdig.
Bemærk: Det tager lang tid og kan være natten; scriptet sender mikroskop i standby efter endt madlavning rutine; rutinen madlavning er vigtigt at stabilisere sektioner i elektronstrålen.
- Energi filtreret TEM (EFTEM) elementært analyse
- Vælg EFTEM tilstand i TIA/DM og CCD kamera i DM.
- Centrere strålen og følge de scriptkommandoer, der vil flytte scenen til hver prøveudtagning koordinat.
Bemærk: Brugeren vil blive bedt om scenen skal flyttes til den næste koordinat. - Justere det nul tab højdepunkt (ZLP) og sæt C2 til ~ 46,2%.
- Fastsættes 60 eV energi (i dette tilfælde værdien er angivet til påvisning af Fe M-edge), spalteformede til 10 eV og eksponering tid på 0,4 s. Indsæt spalten og sæt C2 til ~ 43,9%.
- Starte visning og fokusere billedet.
- Indstille C2 til 46,2%, justere ZLP og indstille C2 tilbage til 43,9%.
- Erhverve elementært kort med elementært specifikke indstillinger.
Bemærk: Standardindstillingerne kan bruges i dialogen erhvervelse, men det anbefales at teste disse på forhånd, hvis det er muligt; eksempel filtreret billeder er vist i figur 4. - Sæt C2 til 46,2% og erhverve tykkelse kort.
- Gentag for alle beslutsomt erhvervelse point (trin 8.3.2-8.3.12).
- Følg vejledningen i scriptet og få enkelt elektron micrographs eller montager af punkterne erhvervelse. Vælg forstørrelsen, så alle (ultra-) strukturelle oplysninger er synlige/identificerbare.
- Gem LOG filen, navigator og resultatvinduet og fjerne spalten.
- Lukke ventilen, fjerne prøven og nedlægge TEM.
Representative Results
Her beskriver vi en arbejdsgang for at markere områderne til TEM i en automatisk og saglig måde. Brugeren vælger området af interesse inden for en ultra-tynd afsnit under TEM, og bruger flere softwareløsninger for den arbejdsproces, herunder vores RPS software, der automatisk beregner koordinaterne for 20 prøveudtagning områder inden for interesse. Derefter, TEM scenen er flyttet til hver prøveudtagning område for fotografering. Dette er muligt, både til at analysere enkelt sektioner og til at analysere par af sektioner, en kendt afstand fra hinanden, hvilket giver mulighed for at vælge områder for tænkelig uden fordomme af investigator.
Denne arbejdsproces vist sig værdifulde, når dokumenterer ultrastrukturelle funktioner i musen hjernen afsnit4,5. I disse undersøgelser undersøgtes polymorph cellelag af den dentate gyrus (DGpl) som et område af interesse. Vores metode vist sig velegnede til at undersøge GD, fordi en koronale del af den dorsale GD (Bregma −1.3) passer ind i en ultra-tynd sektion og dens konturer genkendes let på lav forstørrelse. Hvis andre områder af hjernen skulle undersøges, ville det være vigtigt at tjekke deres størrelse og kendetegn før planlægningen eksperimenter.
Anvende arbejdsprocessen beskrevet her viste at EE boliger øger bredden i den synaptiske kløft betydeligt i DGpl4, i henseende til standard boligforhold. Derudover blev antallet af tæt kerne vesikler faldt betydeligt i EE opstaldede dyr4, der angiver ændringer i neuropeptider husholdning. Når WT og NPY knockout mus blev holdt EE betingelser, steg antallet af neuroner/µm³ i DGpl mens tætheden af DCV faldt i henseende til SE-bolig5. Derimod resulterede NPY knockout i en signifikant stigning i synaptiske vesikler i reserve pool (undocked synaptiske vesikler) uafhængigt af bolig forhold5. Effekten af EE på bredden af den synaptiske kløft blev vendt i gruppen NPY KO resulterer i en betydelig forskel mellem EE-opstaldet WT og NPY KO mus5. Taget sammen med adfærdsmæssige undersøgelser af WT og NPY holdes knockout dyr under begge typer af boligforhold, dette indikerer en afgørende rolle for NPY for de neurobiologiske effekter af EE5.
Visualisere jern lagres i den menneskelige hjerne, blev et script kompileret til SerialEM software til at tilfældigt vælge punkter af købet fra inden for en hel ultratynde afsnit, med henblik på at opnå en energi filtreret elektron Mikrograf på hvert af disse punkter . Efter Ilægning af afsnittet i elektron mikroskop, scriptet udføres stabilisering af afsnittet (dvs., 'modellen-madlavning' rutine) natten over. Scriptet så udvalgt tilfældigt en række punkter foruddefineret af brugeren fra dem, der er markeret med en rist i figur 3. Ved at producere en test Mikrograf og kontrollere dens grå niveauer, tjekket scriptet, hvis de valgte punkter var placeret på en synlig del af afsnittet, afviser de punkter, der landede på gitteret barer. De fleste af arbejdsprocessen blev håndteret af scriptet med minimal interaktion med brugeren. Men det var ikke muligt at automatisk optage energi filtreret micrographs (med dette setup), som der var for lidt lys til autofokus rutine i SerialEM. Derfor skiftede vi til DM software så snart scriptet havde flyttet scenen til hvert punkt, justeret fokus i hånden, og lavet et EFTEM billede af jern. Et eksempel på et EFTEM jern billede fra post mortem menneskelige hjerne er vist i figur 4.
Figur 1. Illustration af arbejdsprocessen. (A) de vigtigste trin i forberedelsen af prøver er vist (i retning af pilen): vibratome sektioner (i), embedding(ii), skære semi-tynd og ultra-tynde sektioner (iii), og fange par af ultra-tynde sektioner på kobber gitre (iv). (B) brugen af både mikroskop leverandørens software og skræddersyede RPS software at skabe prøveudtagning område koordinater, der bestemmer optagelsen websteder. Hjørnepunkter af sektionerne er gemt i mikroskopi software og ROI er skitseret (identificeret ved hjælp af de semi-tynde sektioner) (i); et gitter af prøveudtagning områder er genereret over ROI, en tilfældig Skift (rød pil) er indført i x og y. Skiftet er mindre end afstanden mellem prøveudtagning områder, (sorte pile), så i stedet for de sorte firkanter, som har ingen Skift, de blå firkanter, som er flyttet tilfældigt, bruges til at bestemme optagelse websteder (ii); kun stikprøver områder inden for grænserne af ROI (tegnet som sort og blå firkanter) bruges til optagelse. Micrographs er lavet både i afsnittet reference (sorte firkanter) og tilsvarende steder i afsnittet opslag (blå firkanter) (iii). (C) en Mikrograf er lavet på hver prøveudtagning område på en tilstrækkelig forstørrelse; en montage bestående af flere flettede billeder foretages hvis nødvendigt (i dette tilfælde, 2 x 2 billeder blev sammenlagt) (i); en optælling ramme genereret og vist som en overlejring i billedet, strukturer inden for rammen og på 'accept linjer' (stiplet ramme linjer) vil blive optalt, men ikke dem på den "forbudte linjer" (solid ramme linjer) (ii). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2 . Måling ultrastrukturelle parametre på et par af ultra-tynde sektioner med en uvildig optælling ramme. (A) oversigt over vinduerne ImageJ anvendes til optælling og analysere cellulære strukturer. Venstre side viser elektron Mikrograf med optælling ramme som en overlejring. Til højre: ImageJ brugergrænseflade (blå rektangel) med drop-down menu (øverst) og værktøjslinjen (nedenfor); ObjectJ Objekteditor (grøn rektangel); vinduet ObjectJ værktøjer (orange rektangel) hvor værktøjer til måling kan vælges og ObjectJ resultater vindue (sort rektangel) hvor alle målinger er dokumenteret. (B) detaljer fra en viser de markerede synapser på electron Mikrograf (synapser på begge sektioner - pile; synapse kun på opslag sektion-pilespidser). Dem, der er markeret med Multipoint-værktøjet (rød cirkel) på værktøjslinjen i ImageJ. (C) navne og måle parametre af funktionerne synaptic er defineret ved hjælp af ObjectJ værktøjer. Mærke-værktøj og funktionen af interesse er valgt og skitse udarbejdet i billedet af venstre-museklik langs struktur. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3. Valg prøveudtagning områder for elementært kortlægning i en ROI for energi filtreret transmissions Elektron Mikroskopi. SerialEM bruges til at vælge et område af interesse og foreslå et højt antal stikprøver områder på en regelmæssig afstand (pink Kors i billeder A og B). Et script derefter vælger tilfældigt prøveudtagning områder (fra disse foruddefinerede koordinater) for erhvervelse. Prøveudtagning områder med dårlig belysning er afvist for at undgå gitter barer og scriptet stopper, så snart 20 godt belyste prøveudtagning områder er udvalgt inden for ROI. (A) oversigt over hele området med interesse, skitseret af en polygon, med et stort antal mulige prøveudtagning områder markeret med X. (B) detaljer af A viser områderne prøveudtagning før tilfældig udvælgelse. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4. Eksempel på elementært kort (EFTEM) Køb. (A) lysfelt TEM Mikrograf af området omkring erhvervelse punkt. Et tilfældigt valgte område blev brugt til at opnå en elementært kort og er præget af et sort rektangel. (B) EFTEM pre kant vindue billede lavet i det tilfældigt valgte område. (C) EFTEM efter kant vindue billede lavet på samme område. (D) elementært kort af jern af det samme område (M-kant). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Discussion
Arbejdsprocessen præsenteres her tillader forsker at få data på ultrastrukturelle funktioner i en fordomsfri måde. Dette er langt mindre tidskrævende end volumen undersøgelser fra seriel sektioner. Flere forskellige programmer bruges til at nå dette mål. I første omgang vores skræddersyede RPS software bruges (for nærmere oplysninger om tilgængelighed, kontakt venligst de tilsvarende forfatteren) til at indføre en tilfældig fase-Skift for at vælge prøveudtagning område koordinater. Dette giver mulighed for en systematisk ensartet stikprøvekontrol af ROI. Dernæst til optælling af specifikke strukturer, vi tilpasset den disector metode, hvor 2 på hinanden følgende sektioner med kendt afstand sammenlignes, på en ny måde i forhold til tidligere undersøgelser13,14,15 , som vi har brugt vores skræddersyede RPS software til systematisk ensartede tilfældige stikprøver. Dette sparer tid i forhold til 3D-rekonstruere hele diskenheder fra seriel sektioner. Den skræddersyede RPS software er specielt udviklet til én type af mikroskop, som er en begrænsende faktor for gengivelse af arbejdsprocessen. Et alternativ fra denne specifikke software ville være et program, der giver mulighed for scripting og er kompatibel med andre mikroskop modeller.
Vi har med held brugt denne tilgang til vores sammenlignende undersøgelser4,5. Ultra-tynde sektioner af neuronal væv, område af interesse blev skitseret og billeder er taget af systematisk ensartede tilfældige stikprøver inden for dette område. Det skal bemærkes at området af interesse, polymorph lag af den dentate gyrus, er et forholdsvis lille område at undersøge, som kan være til gavn for vores tilgang. Inden for en tilfældigt placerede disector, vi har vurderet antallet DCV og flere ultrastrukturelle træk af synapser i DGpl af voksen mus til huse i SE og EE samt voksen WT mus kontra voksne NPY knockout mus. Brug vores fremgangsmåde, de indsamlede data viste ændringer i nogle af de undersøgte parametre. Disse resultater bekræftes dem fra andre lignende undersøgelser i juvenile dyr2.
En ulempe ved det eksperimenterende brug af denne arbejdsproces kan være, at denne multi-application-tilgang ikke er ideel med hensyn til brugervenlighed, som brugere har brug at blive fortrolig med forskellige brugergrænseflader (i vores tilfælde, brugergrænseflade, TEM seriel afsnit RPS software og SerialEM software). Lære at håndtere alle programmer på en effektiv måde er tidskrævende og bør tages i betragtning. Investere tid i at lære at bruge denne arbejdsproces er dog stadig klart positiv over den tid, der er nødvendige for at analysere hele diskenheder med seriel afsnit TEM. Metode til at bruge en disector placeret ved systematisk ensartede tilfældige stikprøver i området af interesse er tilstrækkelig til at fremlægge pålidelige data1 uden behovet for at undersøge en stor mængde af afsnit/volumen.
For at maksimere resultaterne i vores studier, var det afgørende at tage god pleje under prøveforberedelse, som bevarelsen af vævet og strukturerne ikke er kun afgørende for at vurdere strukturelle træk, men også for at identificere området af interesse utvetydigt. En afgørende faktor, og måske en anden ulempe ved denne metode, er der kræves en høj kvalitet af de ultra-tynde sektioner par: der skal ingen huller eller rynker, der dækker området under undersøgelse i et af afsnittene, og snittykkelsen skal være vedligeholdes homogene. Forskeren må være veluddannet i ultramikrotomi. Pleje har også skal tages ved imaging sektioner i TEM, da sektionerne er følsomme over for elektron beam skader og kan nemt rive fra hinanden. Derudover er det vigtigt at vælge det rigtige antal stikprøver områder i ROI. Afhængigt af den eksperimentelle formål har forstørrelse af elektron micrographs indstilles omhyggeligt. For vores eksperimenter konkret er optælling synapser i centralnervesystemet, 20 regioner af interesse på en sektion med området af 30.25 µm2 optimale. Det tilrådes at uddanne personale i erkendelse af de pågældende (i vores tilfælde synapser, synaptic funktioner og DCV) funktioner at få pålidelige resultater. For at identificere synapser, de synaptiske vesikler skal identificeres og dette kræver en opløsning på mindst 10 nm. 5000 X forstørrelse var optimal for dette, men det må bemærkes, at forstørrelsen afhænger af hardware parametre såsom type og position af kameraer og vil skulle tilpasses til andre mikroskop og/eller kamera typer. Det har også bemærkes, at protokollen bruger programmer specifikt for en TEM og at brugere med andre modeller skal overveje forskelle i opsætningen.
Vi mener, at vores arbejdsproces kan tilpasses til mange andre programmer, ikke kun i neurovidenskab, men i et bredt felt af biologisk videnskab og også materiallære (når den høj opløsning af en TEM er nødvendigt) når forskningsspørgsmål kræver en systematisk ensartet stikprøvekontrol og mængden af prøverne skal undersøges beder om en tid effektiv måde til analyse. For eksempel, er vi i øjeblikket interesseret i lokalisering jern butikker i den menneskelige hjerne. For dette, har vi for nylig tilpasset vores arbejdsproces, hvis du vil aktivere elementært analyse på ultra-tynde sektioner i tilfældigt valgte områder. For at minimere antallet af ansøgninger, der er nødvendige for arbejdsprocessen, vi sigter mod at anvende ved hjælp af SerialEM software kun, fordi det kan programmeres til at flytte scenen til at pre-sæt punkter, der kan vælges i en tilfældig måde. Vi lavet brugerdefinerede scripts til at styre TEM, med henblik på automatisering arbejdsprocessen helt. Dette viste sig muligt undtagen autofokus i filtreret tænkelig tilstand, som ikke giver tilfredsstillende resultater. Vi brugte således DM software til at fokusere og for at opnå de energi-filtreret billeder.
I sammendrag præsenterer vi softwareløsninger, der hjælper med at opnå elektron micrographs på en saglig måde.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at oplyse.
Acknowledgments
Finansieret af det østrigske videnskab fond, FWF, projektnummer P 29370 B27
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Pentobarbital | SigmaAldrich | P3761 | |
| Formaldehyde | Merck | 1040051000 | 1kg |
| Glutardialdehyde | Science Services | E 16210 | 25%; 100ml; EM grade |
| cacodylate buffer | Merck | C4945 | 250g; Dimethylarsinic acid sodium trihydrate |
| Thionine acetate/Ceristain | Merck | 861340 | |
| acetic acid | Merck | 1000631000 | 1 L |
| Sodium hydroxide | Merck | 1064951000 | 1 kg, pellets |
| osmium tetraoxide | Science Services | E 19110 | 10x1g |
| TAAB embedding resin | Science Services | TAT001 | 500g |
| DMP-30 | Science Services | TAD024 | 100g |
| DDSA | Science Services | TAD025 | 500g |
| Uranyl acetate dihydrate | Plano GmbH | 19481 | depleted, 25g |
| Ultrastain 2 | Leica | 16707235 | Lead citrate |
| Toluidine blue solution | Agar Scientific | AGR1727 | 10g |
| Pioloform | Plano GmbH | R1275 | 10g Powder |
| Proylenoxide | SigmaAldrich | 82320-1L | 1L |
| DPX embedding medium | Plano GmbH | R1320 | embedding medium for semi-thin sections on glass slide, 50 ml |
| Vibratome, Leica VT 1000 | Leica Microsystems, Vienna, Austria | ||
| Leica Ultracut UCT, ultramicrotom | Leica Microsystems, Wetzlar, Germany | ||
| Tecnai G2 20 | FEI,Eindhoven, Netherlands | ||
| Megaview wide angle camera | Olympus Soft Imaging Solution, Münster, Germany | ||
| US 1000 digital camera | Gatan, Pleasanton, USA | ||
| TEM Imaging Analysis Software | FEI,Eindhoven, Netherlands | ||
| FEI Serial Section Software | FEI,Eindhoven, Netherlands | ||
| Fiji, ImageJ 1.52e | National Institute of Health, USA | ||
| SPSS 20.0 | SPSS Inc., Chicago, IL, USA | ||
| SerialEM | Regents of the University of Colorado | ||
| RPS (random point sampling) software 0.9a | custom-made | ||
| Disector v1.0.2 (ImageJ macro) | custom-made | ||
| EFTEMSerialEM (SerialEM script) | custom-made |
References
- Howard, V., Reed, M. Unbiased Stereology: Three-Dimensional Measurement in Microscopy. , BIOS Scientific Publishers. Oxford. (1998).
- Nakamura, H., Kobayashi, S., Ohashi, Y., Ando, S. Age-changes of brain synapses and synaptic plasticity in response to an enriched environment. Journal of Neuroscience Research. 56 (3), 307-315 (1999).
- Landers, M. S., Knott, G. W., Lipp, H. P., Poletaeva, I., Welker, E. Synapse formation in adult barrel cortex following naturalistic environmental enrichment. Neuroscience. 199, 143-152 (2011).
- Reichmann, F., et al. A novel unbiased counting method for the quantification of synapses in the mouse brain. Journal of Neuroscience Methods. 240, 13-21 (2015).
- Reichmann, F., et al. Environmental enrichment induces behavioural disturbances in neuropeptide Y knockout mice. Scientific Report. 6, 28182 (2016).
- Mayhew, T. M. Taking Tissue Samples from the Placenta: An Illustration of Principles and Strategies. Placenta. 29, 1-14 (2008).
- Ferguson, S., Steyer, A. M., Mayhew, T. M., Schwab, Y., Lucocq, J. M. Quantifying Golgi structure using EM: combing volume-SEM and stereology for higher throughput. Histochemistry and Cell Biology. 147, 653-669 (2017).
- Sterio, D. C. The unbiased estimation of number and sizes of arbitrary particles using the disector. Journal of Microscopy. 134 (2), 127-136 (1984).
- Gundersen, H. J., et al. The new stereological tools: disector, fractionator, nucleator and point sampled intercepts and their use in pathological research and diagnosis. APMIS. 96 (10), 857-881 (1988).
- Franklin, K. B. J., Paxinos, G. The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates. , Elsevier/Academic Press. (2008).
- Lewis, P. R., Knight, D. P. Staining Methods for Sectioned Material. , Elsevier/North-Holland Biomedical Press. (1988).
- Mastronarde, D. N. Automated electron microscope tomography using robust prediction of specimen movements. J Struct Biol. 152 (1), can be downloaded from http://bio3d.colorado.edu/SerialEM 36-51 (2005).
- Rampon, C., Tang, Y. P., Goodhouse, J., Shimizu, E., Kyin, M., Tsien, J. Z. Enrichment induces structural changes and recovery from nonspatial memory deficits in CA1 NMDAR1-knockout mice. Nature Neuroscience. 3 (3), 238-244 (2000).
- Xu, X., Ye, L., Ruan, Q. Environmental enrichment induces synaptic structural modification after transient focal cerebral ischemia in rats. Experimental Biology and Medicine. 234 (3), 296-305 (2009).
- Lonetti, G., et al. Early environmental enrichment moderates the behavioral and synaptic phenotype of MeCP2 null mice. Biological Psychiatry. 67 (7), 657-665 (2010).
