Summary
We introduceren een nieuwe workflow voor elektronenmicroscopie onderzoek van hersenweefsel. De methode kan de gebruiker te onderzoeken van neuronale functies op onpartijdige wijze. Voor elementair-analyse presenteren wij ook een script dat de meeste van de workflow voor gerandomiseerde steekproeven automatizes.
Abstract
Onderzoeken van de ultrastructurele kenmerken van neuronen en hun synapsen zijn alleen mogelijk met elektronenmicroscopie. Vooral voor vergelijkende studies van de veranderingen in dichtheid en distributies van dergelijke functies is een onbevooroordeelde bemonstering protocol essentieel voor betrouwbare resultaten. Hier presenteren we een workflow voor het image aquisition van monsters van de hersenen. De werkstroom kunt systematische uniforme steekproeven binnen een gedefinieerde hersenen-regio, en de beelden kunnen worden geanalyseerd met behulp van een disector. Deze techniek is veel sneller dan uitgebreid onderzoek van seriële secties, maar nog steeds presenteert een haalbare aanpak voor het inschatten van de dichtheden en distributies van ultrastructuur functies. Voor het insluiten, werden gekleurd vibratome secties gebruikt als een verwijzing te identificeren van de regio van de hersenen onderzocht, welke geholpen versnellen de algehele specimen voorbereiding verwerken. Deze aanpak werd gebruikt voor vergelijkende studies onderzoeken van het effect van een verrijkt-huisvesting-omgeving op verschillende ultrastructurele parameters in de hersenen van de muis. Op basis van het succesvolle gebruik van de werkstroom, wij het aangepast met het oog op elementaire analyse van monsters van de hersenen. We geoptimaliseerd het protocol in termen van de tijd van de interactie van de gebruiker. Alle tijdrovende stappen automatiseren door het opstellen van een script voor de open sourcesoftware SerialEM helpt de gebruiker om zich te concentreren op het hoofdwerk van het verwerven van de elemental kaarten. Net als in de oorspronkelijke workflow besteed we aandacht aan de onbevooroordeelde bemonstering aanpak garanderen van betrouwbare resultaten.
Introduction
In elektronenmicroscopie is het vaak uitdagend om te proeven van de representatieve regio's binnen de secties. Wij, zijn als waarnemer vaak bevooroordeeld om te kijken naar specifieke regio's die onder onze aandacht gebracht door opvallende kenmerken van het monster, een goed gedistribueerd, onbevooroordeelde bemonstering voorkomen. Bemonstering van vooringenomenheid kan alleen voorkomen worden als elk deel van de regio van belang dezelfde kans krijgt terecht te komen in een elektron opname1. Het is mogelijk om te voorkomen dat bemonstering bias zonder een softwareoplossing, bijvoorbeeld door te drukken op de trackball van de Microscoop handmatig zonder te kijken naar de afbeelding, zodat het selecteren van bemonstering regio's waar de fase stopt. Maar strikt genomen is dit niet een willekeurige procedure, omdat, bewust of onbewust, de gebruiker kan een invloed hebben op het verkeer van het podium, en, bovendien, dit is niet een verfijnde manier van de selectie van de bemonstering regio's. Aselecte steekproef wordt met name belangrijk als paren van secties worden gebruikt voor het beoordelen van het aantal structuren in een bepaald volume, bijvoorbeeld voor stereology1, waarvoor paren van secties, een bekende afstand van elkaar. Het zou ook mogelijk alleen kijken met een enkele sectie en het aantal specifieke structuren2schatten, maar met deze aanpak onderzoekers hebben de neiging te overschatten van de numerieke dichtheid van grotere structuren, tenzij de structuren zeer klein zijn vergelijking met de dikte van de sectie. Alternatieve benaderingen zijn het reconstrueren van de volumes van weefsel van seriële secties en dus krijgt de gewenste gegevens3. Maar dit is zeer tijdrovend en niet een haalbare aanpak voor (grotere) vergelijkende studies.
Om deze problemen te overwinnen, hebben wij een workflow waarmee de onderzoeker om automatisch te selecteren monsters voor het verkrijgen van electron microfoto op regelmatige afstand binnen uiterst dunne secties ontwikkeld. De positie van de electron microfoto is willekeurig, waardoor onbevooroordeelde bemonstering. De aanpak is geschikt zowel voor het bepalen van de numerieke dichtheden van structuren (bijvoorbeeld synapsen binnen een bepaalde neuropil volume4,5), en de afmetingen van structurele kenmerken (bijvoorbeeld de breedte van de synaptische gespleten, of de diameter van het postsynaptisch dichtheid4,-5).
De werkstroom gebruikt een op maat gemaakte willekeurig punt bemonstering (RPS) software (geschreven in de Java-script met behulp van Scripting software geleverd met onze Microscoop) die automatisch grid posities binnen een vooraf gedefinieerde regio van belang in een ultra-dunne sectie berekent. De RPS-software wordt het stadium van de elektronenmicroscoop verplaatst naar deze vooraf gedefinieerde punten, zodat een elektron opname kan worden gemaakt op elk punt. De gebruiker definieert eerst, een regio van belang binnen de dunne sectie. Vervolgens berekent de RPS software grid posities binnen deze regio. De x / y-coördinaten van het eerste standpunt willekeurig worden gemaakt, en de resterende posities worden aan regelmatige raster intervallen met betrekking tot de eerste positie geplaatst. Omdat elk deel van de regio van belang dezelfde kans heeft van onderzocht, hierdoor minimale gegevensverzameling. Deze aanpak van de bemonstering heet ook systematische uniforme aselecte steekproef (zie referenties6,,7 voor meer details).
Voor het bepalen van de numerieke dichtheden van structuren, werken wij met paren van secties die een bekende afstand van elkaar. Na het verkrijgen van de opname van een elektron uit het eerste gedeelte in een van de vooraf bepaalde posities, verhuist TEM seriële sectie software (onderdeel van het softwarepakket geleverd met onze elektronenmicroscoop) naar de overeenkomstige punt in de tweede sectie, ter de opname van een elektron van de bijbehorende locatie te verkrijgen. Dit wordt herhaald voor elke locatie in het vooraf vastgestelde rooster. In onze aanpak, wordt een disector gebruikt om het aantal deeltjes in elk paar van electron microfoto8,9te tellen. Een disector bestaat uit een paar counting frames, één voor elke sectie8,9. De numerieke dichtheid van objecten wordt bepaald door alleen tellen objecten zichtbaar op de eerste sectie (of naslaggedeelte) maar niet op de tweede sectie (of opzoeken sectie). Hierdoor te schatten van de numerieke dichtheden van objecten in een snelle en efficiënte manier8,9. Bovendien op enkele secties, kunnen twee-dimensionale structurele kenmerken worden gemeten.
Wij hebben deze werkstroom met succes om te beoordelen van de verschillen in aantallen van de synaps in de hippocampus van muizen blootgesteld aan verrijkte omgeving (EE) woonomstandigheden in vergelijking met standaard omgeving (SE) huisvesting voorwaarden4,5, toegepast en ook om te evalueren van de ultrastructurele verschillen tussen wild type (WT) muizen en neuropeptide Y (NPY) KO muizen onder SE en EE5gehouden. Ons doel was om te kijken specifiek structurele kenmerken van neuronen, zoals de numerieke synaptic dichtheid, de lengtes van de actieve zone in dwarsdoorsneden en het postsynaptisch dichtheid, de breedte van de synaptische gespleten, en het aantal synaptische vesikels, teneinde veranderingen in neuronal connectiviteit en activering tussen de verschillende experimentele omstandigheden. Bovendien, waren we geïnteresseerd in de numerieke dichtheid van dichte-core blaasjes (DCV) in neuronen te bepalen van de hoeveelheid opgeslagen neuropeptides in een bepaald gebied van de hersenen.
Op basis van het succes van onze aanpak voor de studies die hierboven beschreven, in onze volgende stap, we hebben het aangepast van onze workflow Schakel gebieden voor onbevooroordeelde elemental analyses binnen de menselijke hersenen monsters. Dit werd gedaan om de afbeelding ijzer, dat is opgeslagen in de Ferritine moleculen in zowel zenuwcellen en gliacellen. Hiervoor samengesteld we een script dat ons voor het automatiseren van de meeste bewerkingen voor een willekeurige screening van hersenen secties in een bepaald gebied toegestaan.
Protocol
Alle experimenten werden goedgekeurd door een ethisch comité op het federale ministerie van wetenschap en onderzoek van de Republiek Oostenrijk (BMWF-80.104/2-BrGT/2007 en BMWF-66.010/0037-II/3b/2013), of de ethische commissie van de medische universiteit van Graz, nummer 28-549 ex 15/16, en uitgevoerd volgens de richtlijn van de Raad van de Europese Gemeenschappen van 24 November 1986 (86/609/EEG) en de richtlijn van het EuropeesParlement en de Raad van 22 September2010 (2010/63/EU). De dierproeven werden ontworpen en uitgevoerd op een zodanige wijze dat het aantal gebruikte dieren werd geminimaliseerd.
1. dissectie en fixatie van het weefsel
- Euthanaseren van muizen (21 weken oude vrouwelijke C57BL/6N en C57BL/6J muizen muizen; mannelijke WT en NPY KO muizen op een gemengde C57BL / 6:129 / SvJ (1:1) achtergrond respectievelijk) door het injecteren van 150 mg/kg pentobarbital intraperitoneally.
- Verwijderen van de hersenen van de schedel en onmiddellijk snij ze doormidden (het scheiden van de linkerkant van de rechter hersenhelft) - met behulp van een scalpel.
- Onmiddellijk plaats de helften in glazen containers met 2% formaldehyde en 2,5% Glutaaraldehyde in 0,1 M cacodylate buffer (CH3)2AsO2Na·3H2O, pH aangepast aan 7.4 met 1 M NaCl), pH 7.4 bij 4 ° C.
Let op: De fixatives zijn giftig en moeten met grote zorgvuldigheid worden behandeld. Gebruik alleen met beschermende handschoenen en onder de zuurkast. - Bevestigen van de hersenen helften voor 2 dagen bij 4 ° C en spoelen in de dezelfde buffer gedurende ten minste 24 uur, ook bij 4 ° C. Het volume van de buffer moet over vertienvoudigd het volume van het specimen.
2. Identificeer de regio van belang binnen de hersenen door het vergelijken van Vibratome secties met referentie secties van de muis Brain Atlas10
- Leg het monster van de hersenen op een vibratome. Zorgen dat de oriëntatie van de hersenen correct is (in dit geval, de stand van een coronale werd gekozen voor de hippocampus).
- Trim tot de regio van belang (ROI) in de hersenen is bereikt. De secties op een grote dikte snijden (bv., 100 µm) tot het deel van de hersenen met de regio van belang is bereikt en weggooien van elke sectie.
- Beginnen te snijden van de vibratome-secties met 20 µm dikte aan het begin van het gedeelte van de hersenen met de ROI en plaats van de vibratome-secties op een glasplaatje. Vlek hen (Nissl vlek) door het plaatsen van de secties in 0.05% thionine acetaat in natrium acetaat buffer, pH 4.2 voor 1 min (Figuur 1Ai).
- De gekleurde secties te vergelijken met de muis hersenen atlas met behulp van een lichte Microscoop en blijven snijden en kleuring totdat de gewenste hersenen coördinaten zijn bereikt.
3. het verkrijgen van een monster regio voor het insluiten van
- Zodra het juiste gebied wordt geïdentificeerd, beginnen snijden één sectie bij 150 µm dikte met de vibratome.
- Microdissect in dit gedeelte van de vibratome met een scheermesje onder de stereomicroscoop. Snijd weg de delen rond de ROI. De sectie moet een geschikte grootte voor de volgende stappen van de voorbereiding voor Transmissie Electronenmicroscopie (TEM) (niet groter dan 1 x 1 mm2).
4. TEM voorbereiding - insluiten, ultradunne segmenteren en kleuring
- Insluiten
- Na correctie voor 2 h in 2% osmium tetroxide bij kamer-temperatuur (RT). Gebruik een volume te dekken van het monster met ten minste 10 keer het monstervolume, maar vermijd het gebruik van overtollige fixatief om te voorkomen dat geen onnodige giftig afval.
Let op: Osmium tetroxide is zeer giftig en moeten met grote zorgvuldigheid worden behandeld. Gebruik alleen met beschermende handschoenen en onder de zuurkast. - Drogen met behulp van EM Grade alcoholen in stappen van 20 min. gebruik een groter volume dan dat in de vorige stap (50%, 70%, 80%, 96% en 100% ethanol).
- Plaats in propyleenoxide voor 40 min op RT. plaats in een mengsel van propyleen oxide/inbedding hars (1:2) voor 2 h bij RT en 1:3 overnachting bij 4 ° C.
Let op: Propyleenoxide is zeer giftig en moet met grote zorgvuldigheid worden behandeld. Gebruik alleen met beschermende handschoenen en onder de zuurkast. - Het insluiten van de monsters in 100% hars door het veranderen van de hars 2 keer na 60 min en eenmaal na 90 min (alle bij 45 ° C).
- Tot slot leg van de monsters in de juiste mallen en laat de hars polymeriseren bij 90 ° C gedurende 3 dagen (Figuur 1Aii).
- Na correctie voor 2 h in 2% osmium tetroxide bij kamer-temperatuur (RT). Gebruik een volume te dekken van het monster met ten minste 10 keer het monstervolume, maar vermijd het gebruik van overtollige fixatief om te voorkomen dat geen onnodige giftig afval.
- Trimmen en Sectioning op een ultramicrotome.
- Trim het blok, ervoor te zorgen dat de zijkanten zo glad mogelijk te zijn voor de secties aan elkaar (Figuur 1Aiii) te houden.
- Produceren 55 nm ultra-dunne seriële secties (moet zilver grijs) met behulp van een ultramicrotome. Een raster slot gebruiken (breedte sleuf 1 x 2 mm) bekleed met pioloform (Figuur 1Aiv).
- Counterstain ultra-dunne secties op de roosters van de sleuf met behulp van 2% uranyl acetaat voor 30 min en lood citraat voor 30 s bij RT (dit is standaard elektronenmicroscopie methode11).
Let op: Uranyl acetaat is zeer giftig en ieder rechtstreeks contact moet worden vermeden. Omgaan met alleen met beschermende handschoenen. Lead nitraat is giftig als ingeslikt of ingeademd en moeten worden behandeld met grote zorg.
5. beeldvorming van overeenkomstige ROIs op de verwijzing en Look-Up secties op TEM met Softwarepakketten
- De secties op de grid met de TEM met behulp van een lage vergroting (afhankelijk van de grootte van de secties) onderzoeken voor oriëntatie en voor de beoordeling van de kwaliteit van de secties.
- Start de software (een pakket of Software van de analyse van de afbeelding van TEM, TIA, meegeleverd met Microscoop) genereren van virtuele beelden van de secties met de hoekpunten van de secties op te slaan. Waarmee de software om de overeenkomende posities van de ROI van elke sectie.
- Ga naar de sectie en kies Invoegen toe te voegen van de hoekpunten voor de referentie- en look-up sectie. Volg de instructies van het pop-upvenster. Begin met de sectie verwijzingen en gaat u verder met de sectie look-up. Ervoor te zorgen dat de randen van de sectie die parallel aan de volgende sectie als de punten 1 en 2 (Figuur 1Bi) worden ingevoerd.
- Visualiseren van de sectie van de reference onder lage vergroting te identificeren van de regio van belang en verplaatsen van het werkgebied van de microscoop met TIA op de sectie van de reference op meerdere hoekpunten van de ROI te maken van een overzicht van de ROI.
- Neem de coördinaten van de resulterende veelhoek RPS softwarematig. Hiervoor drukt u op coördinaten toevoegen in het dialoogvenster van de RPS -software op elk punt van de veelhoek die nodig is om een overzicht van de ROI in de sectie (Figuur 1Bii).
- Definiëren en invoeren van een geschikte grootte voor de gebieden van de bemonstering en de afstanden tussen de gebieden in RPS software (in de gepresenteerde studie, is de grootte van de steekproef gebieden 7 µm en de afstand tussen hen is 20 µm, resulterend in ten minste 20 bemonstering gebieden binnen de ROI). Druk op Berekenen Raster, vervolgens de software genereert bemonstering gebied coördinaten in een systematische uniforme willekeurige wijze voor de opname van posities binnen de veelhoek (Figuur 1Biii).
Opmerking: Voor een betere oriëntatie, de veelhoek en de bemonstering gebieden binnen de veelhoek kunnen worden weergegeven door de RPS software (Figuur 1Biv).
- Bewaar de bemonsteringspunten op het gedeelte van het referentie- en look-up gebruiken de RPS software en TEM seriële sectie software. Dit zijn de coördinaten van de montages die worden geregistreerd daarna11.
- Druk in de RPS-software, Ga naar de volgende positie te verplaatsen naar de Microscoop fase verplaatsen naar x / y-coördinaten van elke bemonstering gebied in de sectie verwijzingen. Ga naar locatie en plaatst deze coördinaten in de software in de sectie verwijzingen importeren. Herhaal dit voor alle coördinaten.
- Gespiegeld de coördinaten van de sectie van de reference op de sectie look-up, gaat u naar sectie en druk op Ga naar sectie. Voer het nummer van de sectie look-up (meestal ' 2') in het dialoogvenster.
- Voor de opname van de montages (zie volgende stap), schakelen tussen de referentie- en look-up sectie zoals voordien beschreef en de positie op de sectie van de reference met locatie en Ga naar nummerwijzigen. Kies de volgende coördinaat in het dialoogvenster.
- Voor de montages van de SerialEM bij iedere bemonstering coördineren, ga naar bestand en kies Nieuwe Montage uit het drop-down menu. Selecteer het juiste aantal tegels en overlappercentage voor in het dialoogvenster. Voor deze studie, een vergroting van 5000 X is voldoende om te herkennen van de synaptische functies onder studie, maar het beperkte gezichtsveld van de CCD-camera nodig maken montages van 2 x 2 beelden. De montages worden gemaakt met de SerialEM.
- Voordat u gaat opnemen elke montage, passen de focus (of, indien mogelijk, de autofocus optie activeren in de opname-software). Kies de map de montage-bestand opslaan en de opname van de montage te starten door op Start te drukken in het submenu van de montage aan de linkerkant in SerialEM.
6. Analyseer de TEM beelden met ImageJ aan ultrastructurele documentfuncties.
Opmerking: Voor dit, het is belangrijk om een uitgelijnde afbeeldingsstapel maken van de sectie van de referentie- en look-up.
- De beeld-paren met ImageJ beelden op stapel naar een stapel bestand converteren en uitlijnen van de beelden met StackReg (moet worden geïnstalleerd van BIG-EPFL http://sites.imagej.net/BIG-EPFL/; in het onderhavige geval, het algoritme Affine was gebruikt). Voor het verkrijgen van de numerieke dichtheden van cellulaire structurele kenmerken, de op maat gemaakte ImageJ macro Disector genereert een counting frame met een grootte van 5,5 x 5,5 µm willekeurig geplaatst boven de afbeelding met een willekeurige hoek.
- Start de macro Disector (locatie in het menu ImageJ hangt af van de locatie waar het is opgeslagen) en definieer de parameters (grootte van de counting frame, aantal segmenten) als nodig (Figuur 1Cii).
- Het aantal synapse/µm2 met behulp van de Disector. Tellen elke synapse binnen de counting frame dat is zichtbaar in de sectie van de reference, maar niet zichtbaar in de sectie opzoeken. Weglaten van deze synapsen die elkaar met de twee 'verboden lijnen' van de disector overlappen; maar tellen synapsen op de tegenovergestelde 'aanvaarding lijnen'. Hiervoor gebruik van de Multipoint Tool te vinden in de Toolsbar in ImageJ (Figuur 2A, Figuur 2B).
- Voor het meten van SYNAPS parameters, selecteert u alleen de synapsen met een synaptic gespleten georiënteerde in dwarsdoorsnede (op het gedeelte met naslaginformatie; binnen de dezelfde afbeeldingsframes gebruikt voor de disector).
- De plugin ObjectJ ImageJ starten vanuit het drop-down menu(Figuur 2)via Plugins | Analyseren. Een nieuw project openen vanuit het dialoogvenster van de drop-down ObjectJ. Dit opent een venster waarmee de gebruiker overzichts- en mark structuren met Marker Tool (Figuur 2B, rode cirkel). De synaptische parameters gebruikt voor de experimenten die hier gepresenteerd worden beschreven in de volgende stappen.
- Meet de lengte van de presynaptische membraan en postsynaptisch dichtheid lengte door het tekenen van een lijn langs de structuur met behulp van de Marker Tool (Figuur 2B, rode cirkel).
- De gemiddelde breedte van de synaptische gespleten verkrijgen door het tekenen van een veelhoek die betrekking hebben op zowel de pre- en postsynaptisch membraan, met rechte parallelle kanten en een gesegmenteerde lijn midway, equidistante aan beide membranen.
- Voor het bepalen van het aantal dok blaasjes, tellen alle blaasjes die een maximale afstand van de presynaptische membraan van een blaasje diameter of minder hebben.
- Voor het bepalen van het aantal losgekoppelde blaasjes, tellen deze blaasjes met een maximale afstand van een blaasje diameter van dok of andere losgekoppelde blaasjes op de dezelfde synaps.
7. productie van semi-dunne secties voor licht microscopie tot macroscopische eigenschappen van Document (in casu het celaantal) binnen de dezelfde ROI als gekozen voor het TEM-onderzoek.
- Onmiddellijk na het snijden de uiterst dunne secties voor TEM, gesneden twee semi-dunne secties, 0,5 µm dik en onmiddellijk naast elkaar. Plaats op een glasplaatje en vlekken hen met behulp van 0,5% toluïdine blauwe oplossing. Plaats een cover slip op de secties (met DPX montage medium, bestaande uit distyrene, een weekmaker (tricresyl fosfaat) en xyleen). Deze twee secties worden gebruikt voor de cel getallen tellen.
- De semi-dunne secties bij lage vergroting met behulp van een lichte Microscoop te fotograferen.
Opmerking: De structuren onderzochte herkenbaar moeten zijn in de beelden. In de huidige studie, werd 20 X vergroting gebruikt voor het identificeren van cel organen. Indien nodig, kunnen meerdere afbeeldingen samen met een beeld processing software worden gestikt. - De paren van twee opeenvolgende semi-dunne secties uitlijnen met een beeld processing software (bijv., ImageJ).
Opmerking: Verschillen in rotatie en grootte (kan optreden als gevolg van compressie artefacten geïntroduceerd door het vectorafbeeldingsbestanden proces) moeten worden aangepast voor een perfecte overlay van de twee secties. - De rand van de ROI op de lichte microscopie van afbeelding markeren. De ROI moet overeenkomen met de ROI gebruikt voor de TEM-beelden. Voor dit doel, de beelden in ImageJ laden en kies de veelhoek-selectie van de Toolsbar (Figuur 2).
- Genereren van een raster over de hele afbeelding met behulp van ImageJ door het openen van analyseren | Tools | Raster en stel de parameters zo nodig.
- Berekenen van de oppervlakte en het volume van de veelhoek van raster-punten binnen de ruimte van belang en sectie dikte (Volume = NCS * eenGS * hST ; NCS = geteld Cross secties; EenGS = rastergrootte; hST = sectie dikte).
- Het aantal kernen van de neuronale cel organen binnen de ROI als ze slechts op één sectie aanwezig zijn. Multipoint Tool in ImageJ kiezen uit de Toolsbar en de cellen markeren. Na het tellen van de cellen in elke sectie, het aantal cellen per volume berekenen (
; Cdichtheid = celdichtheid; CCount = aantal cellen). - Alle metingen opnemen in het venster ObjectJ resultaten (Figuur 2C). Exporteren en deze opslaan voor verder gebruik.
; Cdichtheid = celdichtheid; CCount = aantal cellen).8. gebruik SerialEM Script om de elementaire analyse optimaliseren in hersenen monsters in combinatie met DigitalMicrograph (DM, geleverd met imaging filter).
- Afstemming van Imaging Filter (GIF).
- Het monster in de TEM laden en gaan naar een gat in de steekproef voor de GIF-tuning met behulp van de trackball of voor de joystick van de Microscoop.
- Schakel over naar Energie gefilterd TEM (EFTEM) in DM software/of DM en selecteer CCD camera in DM.
- Kies de vergroting van de elementaire analyse (de vergroting hangt af van de structuur/interessegebied; in het onderhavige geval, de vergroting ligt van 76 k tot 125 k). Stel de belichtingstijd op 0,001 s en start weergave.
- Focus de lichtbundel zorgvuldig totdat de randen kunnen worden gezien en de balk in de afbeelding te centreren. Verklein C2/de objectieve diafragma tot de randen van het diafragma zichtbaar zijn en centreren van de bundel met de trackball voor de balk.
- De lichtbundel Defocus (rond C2 46,2%, belichtingstijd voor tuning moet ongeveer 0,05 s) en de nul verlies piek (ZLP) vinden door op de knop van het ZLP . De tuning procedure starten door op de knop volledige tune .
- Krijg willekeurige punten van overname.
- Ga terug naar TEM imaging modus en selecteer de Camera en controleer de focus bij vergroting 10 k (z-as aanpassen en defocus ingesteld op nul).
- Selecteer LM 75 X vergroting en controleren als de camera wordt niet ingevoegd (anders kan niet worden beheerd door SerialEM software).
- Start SerialEM en open een nieuw project.
- Open de navigator. Controleer de instellingen voor de camera in Camera & Script besturingselementen (voor weergave en RECORD) en start de weergave (camera wordt automatisch ingevoegd).
- Om een hoek van de ultra-dunne sectie kaart, kies Add van punten in het Navigator-venster.
- Stel de hoekpunten aan de randen van een ultra-dunne sectie. Het werkgebied naar een hoekpunt verplaatsen door de rechter-muis-toets ingedrukt. Wanneer een hoek van de sectie is bereikt, voeg een hoekpunt met muis-klikken met de linkermuisknop. Herhaal de procedure voor het toevoegen van 3 meer hoekpunten. Zorg ervoor dat het vak C voor hoekpunten in het navigator-venster is aangevinkt bij de opgeslagen punten.
- Om te beginnen de hoek montage (voorkeur bij vergroting LM 75), ga naar Navigator in de SerialEM menubalk en kies Montaging & rasters en Setup hoek Montage uit het drop-down menu.
Opmerking: De best passende instellingen voor de gekozen record parameters worden weergegeven. Wijzig deze zo nodig. In het onderhavige geval, werd alleen het overlappingspercentage veranderd naar 20%.
- Een overzicht van de sectie/ROI op de afbeelding van de montage. Kies Toevoegen veelhoek in het navigator-venster en een overzicht van de sectie met meerdere recht-muis-klikken. Kies toevoegen raster van punten in het navigator drop-down menu en definiëren van een afstand tussen de punten (de afstand is afhankelijk van de experimentele vraag; bijv., 10 µm, Figuur 3).
- Volg de scriptopdrachten. Voer het nummer van de rasterpunten zoals aangegeven in de navigator en voer het aantal punten van de overname (bv., 20).
- De drempel van de verlichting zo instellen dat het script raster bars kunt vermijden. Volg de scriptopdrachten en verplaatsen van het werkgebied handmatig ter dekking van het gezichtsveld door een kwart met een raster-bar. Volgens de waarde die wordt weergegeven, voert u een drempelwaarde van de verlichting (moet hoger zijn dan de waarde die wordt weergegeven).
- Wacht tot de punten voor aanschaf zijn geselecteerd en de keuken routine is voltooid.
Let op: Dit duurt erg lang en kan 's nachts; het script stuurt de Microscoop in stand-by na afwerking van de keuken routine; de keuken routine is belangrijk voor het stabiliseren van de secties in de elektronenbundel.
- Energie gefilterd de elementaire analyse TEM (EFTEM)
- Kies EFTEM modus in TIA/DM en selecteer CCD camera in DM.
- Centreren van de lichtbundel en volg de scriptopdrachten die het podium naar elke coördinaat bemonstering verplaatsen zal.
Opmerking: De gebruiker wordt gevraagd als het werkgebied moet worden verplaatst naar de volgende coördinaat. - Uitlijnen van de nul verlies piek (ZLP) en C2 ingesteld op ~ 46,2%.
- De energie vastgesteldop 60 eV (in dit geval de waarde is ingesteld voor de opsporing van de Fe M-edge), gleuf te 10 eV en blootstelling tijde 0.4 s. invoegen de gleuf en C2 ingesteld op ~ 43.9%.
- Start weergave en richten het beeld.
- C2 ingesteld op 46,2%, uitlijnen ZLP en C2 terug naar 43.9%.
- Verwerven elementaire kaart met elementaire specifieke instellingen.
Opmerking: Standaardinstellingen kunnen worden gebruikt in het dialoogvenster van de overname, maar het is aangeraden om te testen deze vooraf, indien mogelijk; voorbeeld gefilterd afbeeldingen worden weergegeven in Figuur 4. - C2 ingesteld op 46,2% en het verwerven van dikte kaart.
- Herhaal voor alle vastberaden overname punten (8.3.2-8.3.12 stap).
- Volg de instructies van het script en krijgen de één electron microfoto of montages van de overname punten. Kies de vergroting zodat alle (ultra-) structurele informatie zichtbaar/identificeren.
- LOG bestand opslaan, navigator en resultatenvenster en verwijder de gleuf.
- Sluit de klep, verwijderen van het monster en de TEM afgesloten.
Representative Results
Hier beschrijven we een werkstroom om de gebieden te selecteren bij TEM in een automatische en onpartijdige manier. De gebruiker selecteert de interessegebied binnen een ultra-dunne gedeelte onder de TEM en maakt gebruik van verschillende softwareoplossingen voor de werkstroom met inbegrip van onze RPS -software die automatisch de coördinaten van 20 bemonstering gebieden binnen het gebied van berekent belang. Vervolgens wordt de TEM-fase verplaatst naar elk gebied van bemonstering voor fotografie. Dit kan zowel voor het analyseren van enkele secties en voor het analyseren van paren van secties, een bekende afstand van elkaar, waardoor de selectie van gebieden voor imaging zonder de vooringenomenheid van de onderzoeker.
Deze werkstroom bleek waardevol wanneer ultrastructurele functies in muis hersenen secties4,5te documenteren. In deze studies, werd de polymorf cellaag van de getand gyrus (DGpl) onderzocht als een gebied van belang. Onze methode bleek geschikt voor de behandeling van de DG, omdat een coronale deel van de dorsale DG (Bregma −1.3) in een ultra-dunne sectie past en haar contouren zijn gemakkelijk herkend bij lage vergroting. Als andere hersengebieden worden onderzocht moesten, zou het belangrijk om te controleren hun grootte en bijzondere kenmerken voor de planning van de experimenten.
De workflow die hier worden beschreven toe te passen bleek dat EE huisvesting de breedte van de synaptische gespleten aanzienlijk in de DGpl4, met betrekking tot standaard woonomstandigheden verhoogt. Bovendien was het aantal dichte kern blaasjes aanzienlijk gedaald in de EE-gehuisvest dieren4, met vermelding van de wijzigingen in het huishouden van neuropeptides. Wanneer WT en NPY knock-out muizen werden gehouden onder omstandigheden van EE, verhoogd het aantal neuronen/µm³ in de DGpl terwijl de dichtheid van DCV met betrekking tot SE-huisvesting5 daalde. In tegenstelling, resulteerde NPY uitnemen in een aanzienlijke stijging van synaptische vesikels in de reserve pool (losgekoppelde synaptische vesikels) onafhankelijk van de huisvesting van voorwaarden5. Het effect van EE op de breedte van de synaptische gespleten werd omgekeerd in de NPY KO groep wat resulteert in een significant verschil tussen EE-gehuisvest WT en NPY KO muizen5. Samen met behavioral studies van WT en NPY knock-out dieren gehouden onder beide soorten huisvesting, dit geeft een cruciale rol van NPY voor de neurobiologische gevolgen van EE5.
Voor het visualiseren van het ijzer opgeslagen in het menselijk brein, werd een script samengesteld voor SerialEM software willekeurig kiezen de punten van de acquisitie van binnen een hele uiterst dunne sectie, met als doel een energiestelsels gefilterd electron opname op elk van deze punten . Het script uitgevoerd nadat de sectie in de elektronenmicroscoop is geladen, de stabilisatie van de sectie (dwz., de 'specimen-koken' routine) 's nachts. Het script vervolgens willekeurig geselecteerd uit een aantal punten die vooraf door de gebruiker van die voorzien van een rooster in Figuur 3. Door de productie van een test-opname en controleren van de grijsniveaus, het script gecontroleerd als de gekozen punten werden gevestigd op een zichtbare gedeelte van de sectie, afwijzing van de punten die op raster bars landde. De meeste van de workflow werd behandeld door het script met minimale interactie van de gebruiker. Het was echter niet mogelijk om te registreren automatisch energie gefilterd microfoto (met deze setup), omdat er te weinig licht voor de autofocus routine van SerialEM. Dus overstapten we op DM software zodra het script had het werkgebied verplaatst naar elk punt, de focus met de hand aangepast, en maakte een EFTEM beeld van ijzer. Een voorbeeld voor een afbeelding van de ijzeren EFTEM van post mortem menselijk brein is weergegeven in Figuur 4.
Figuur 1. Afbeelding van de werkstroom. (A) de belangrijkste stappen van de bereiding van de monsters worden weergegeven (in de richting van de pijl): vibratome secties (i), embedding(ii), semi-dun en ultra-dunne secties (iii) knippen en vangen van paren van uiterst dunne secties op koperen roosters (iv). (B) gebruik van zowel de software en de software van op maat gemaakte RPS van de leverancier van de Microscoop bemonstering gebied coördinaten die bepalend zijn voor de opname-sites maken. De hoekpunten van de secties worden opgeslagen in de software van de microscopie en de ROI is geschetst (aangeduid met behulp van de semi-dunne secties) (i); een raster van bemonstering gebieden wordt gegenereerd over de ROI, een willekeurige verschuiving (rode pijl) is geïntroduceerd in x en y. De verschuiving is kleiner dan de afstand tussen de gebieden van de bemonstering, (zwarte pijlen), zodat in plaats van de zwarte vierkantjes, die geen verschuiving hebben, de blauwe vierkantjes, die willekeurig worden verschoven, worden gebruikt om te bepalen de opname sites (ii); alleen bemonstering gebieden binnen de grenzen van de ROI (getekend als zwarte en blauwe vierkantjes) worden gebruikt voor de opname. Microfoto bestaan zowel in de bijbehorende locaties in de sectie opzoeken (blauwe vierkantjes) in de sectie van de reference (zwarte vierkantjes) (iii). (C) een opname wordt gemaakt op elk gebied van bemonstering bij een voldoende vergroting; een bestaande uit verschillende samengevoegde afbeeldingen montage geschiedt indien nodig (in dit geval, 2 x 2 beelden waren samengevoegd) (i); een frame counting is gegenereerd en weergegeven als een overlay in het beeld, structuren binnen het frame en op de 'aanvaarding lijnen' (onderbroken frame lijnen) zal worden geteld, maar niet die op de 'verboden lijnen' (solide frame lijnen) (ii). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2 . Het meten van ultrastructurele parameters op een paar uiterst dunne secties met een onbevooroordeelde counting frame. (A) overzicht van de Vensters van de ImageJ gebruikt voor het tellen en analyseren van cellulaire structuren. Linkerzijde toont het elektron-opname met de counting frame als een overlay. Aan de rechterkant: de ImageJ user interface (blauwe rechthoek) met het drop-down menu (boven) en de werkbalk (zie hieronder); de object-editor ObjectJ (groene rechthoek); het scherm (oranje rechthoek) van de ObjectJ extra waar de instrumenten voor het meten van kunnen worden geselecteerd en het venster met resultaten van de ObjectJ (zwarte rechthoek) waar alle metingen zijn gedocumenteerd. (B) Detail van het een het tonen van de gemarkeerde synapsen op de opname van de elektron (synapsen op beide afdelingen - pijlen; synapse alleen op de lookup sectie-pijlpunten). Die zijn gemarkeerd met het Multipoint-gereedschap (rode cirkel) vanaf de werkbalk in ImageJ. (C) de namen en meten parameters van de synaptische functies worden gedefinieerd met behulp van de Tools van ObjectJ. Het Marker-Tool en de functie van belang zijn geselecteerd en de omtrek die in de afbeelding links-muis-kliks langs de structuur. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 3. Bemonstering van gebieden voor elementaire toewijzing binnen een ROI voor energie gefilterd transmissie-elektronenmicroscopie selecteren. SerialEM wordt gebruikt om een gebied van belang te selecteren en voor te stellen een groot aantal gebieden van de bemonstering op een regelmatige afstand (roze kruisen in de beelden A en B). Een script selecteert vervolgens willekeurig bemonstering gebieden (van deze vooraf gedefinieerde coördinaten) voor overname. Bemonstering gebieden met slechte verlichting worden verworpen om te voorkomen dat raster bars en het script stopt zodra 20 goed verlichte bemonstering gebieden zijn geselecteerd binnen de ROI. (A) overzicht van het hele gebied van belang, geschetst door een veelhoek, met een groot aantal mogelijke bemonstering gebieden gemarkeerd met X. (B) Detail van A tonen de bemonstering gebieden voor willekeurige selectie. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 4. Voorbeeld van de verwerving van de elementaire kaart (EFTEM). (A) helder veld TEM-opname van gebied rond overname punt. Een willekeurig geselecteerd gebied werd gebruikt voor het verkrijgen van een elementaire kaart en wordt gekenmerkt door een zwarte rechthoek. (B) de EFTEM vooraf kant venster afbeelding gemaakt in de willekeurig geselecteerde gebied. (C) EFTEM de post kant venster afbeelding gemaakt op hetzelfde gebied. (D) elementaire kaart van ijzer van hetzelfde gebied (M-edge). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Discussion
De hier gepresenteerde werkstroom kan de onderzoeker om gegevens over ultrastructurele kenmerken op onpartijdige wijze. Dit is veel minder tijdrovend dan volume onderzoeken van seriële secties. Verschillende toepassingen worden gebruikt om dit doel te bereiken. In eerste instantie onze op maat gemaakte RPS -software (voor gegevens over de beschikbaarheid, neem contact op met de overeenkomstige auteur), wordt gebruikt om een willekeurige fase-verschuiving Schakel de bemonstering gebied coördinaten. Hierdoor is een systematische uniforme aselecte steekproef van de ROI. Vervolgens voor het tellen van specifieke structuren, aangepast we de disector methode, waar 2 opeenvolgende secties met bekende afstand worden vergeleken, in een nieuwe manier in vergelijking met eerdere studies13,14,15 , zoals we plachten onze op maat gemaakte RPS software voor systematische uniforme steekproeven. Dit bespaart tijd in vergelijking met 3D-reconstructie van gehele volumes van seriële secties. De op maat gemaakte RPS-software is speciaal ontwikkeld voor een bepaald type van Microscoop die een beperkende factor is voor het reproduceren van de werkstroom. Een alternatief van deze specifieke software zou een toepassing waarmee scripts en is compatibel met andere Microscoop modellen.
Wij met succes gebruikt deze aanpak voor onze vergelijkende studies4,5. Op uiterst dunne secties van neuronale weefsel, de interessegebied werd geschetst en beelden werden genomen door systematische uniforme steekproeven binnen dit gebied. Het dient te worden opgemerkt dat het gebied van belang, de polymorf laag van het getand gyrus, een vrij klein gebied is te onderzoeken die wellicht nuttig zijn voor onze aanpak. Binnen een willekeurig geplaatste disector, we het aantal DCV geëvalueerd en diverse ultrastructurele kenmerken van synapsen in de DGpl van volwassen muizen gehuisvest in SE en EE evenals volwassen WT muizen versus volwassen NPY knock-out muizen. Met behulp van onze aanpak, de verzamelde data toonde veranderingen in een aantal van de onderzochte parameters. Deze bevindingen bevestigd die van andere soortgelijke studies in jonge dieren2.
Een nadeel van het experimentele gebruik van deze werkstroom kan worden dat deze multi-application-aanpak niet ideaal in termen van gebruiksgemak, is als de gebruikers nodig hebt om comfortabel met verschillende user-interfaces (in ons geval, de gebruikersinterface, TEM seriële sectie de RPS software en SerialEM software). Leren omgaan met alle toepassingen op een efficiënte manier is tijdrovend en rekening moet worden gehouden. Investeren de tijd in het leren gebruiken van deze workflow is echter nog steeds duidelijk gunstige na verloop van de tijd die nodig is voor het analyseren van gehele volumes met seriële sectie TEM. De methode van het gebruik van een disector geplaatst door systematische uniforme aselecte steekproef op het gebied van belang is voldoende om te presenteren betrouwbare gegevens1 zonder de noodzaak te onderzoeken van een hoog bedrag van secties/volume.
Maximaliseren van de uitkomst in onze studies, was het essentieel voor de goede zorgen tijdens de bereiding van de monsters, zoals het behoud van het weefsel en de structuren niet alleen cruciaal is voor de evaluatie van de structurele kenmerken, maar ook voor het terrein van belang ondubbelzinnig te identificeren. Een cruciale factor, en misschien een ander nadeel van deze methode is dat een hoge kwaliteit van de ultra-dunne secties paren vereist: moeten er geen gaten of rimpels die betrekking hebben op het gebied onder onderzoek in een van de secties en de dikte van de sectie moet worden homogene gehandhaafd. De onderzoeker moet goed opgeleide in ultramicrotomie. Zorg moet ook worden genomen bij de beeldvorming van de secties in de TEM, zoals de secties gevoelig voor electron beam schade zijn en kunnen gemakkelijk uit elkaar scheuren. Bovendien is het belangrijk om te kiezen van het juiste aantal bemonstering gebieden in de ROI. Afhankelijk van de experimentele doel moet de vergroting van de electron microfoto zorgvuldig worden ingesteld. Voor onze experimenten specifiek, zijn tellen synapsen in het centrale zenuwstelsel, 20 regio's van de rente over een sectie met de oppervlakte van 30.25 µm2 optimaal. Het is aangeraden om het personeel goed in het herkennen van de functies in kwestie (in ons geval synapsen, synaptic functies en DCV) om betrouwbare resultaten te trainen. Teneinde de synapsen, de synaptische vesikels herkenbaar moeten zijn en dit vereist een resolutie van minstens 10 nm. Hiervoor een vergroting van 5000 X was optimaal, maar er moet worden opgemerkt dat de vergroting hangt af van hardware parameters zoals het type en de positie van de camera's en moeten zou worden aangepast voor andersoortige Microscoop en/of camera. Het heeft ook te worden opgemerkt dat het protocol toepassingen specifiek voor één TEM gebruikt en dat gebruikers met andere modellen moeten overwegen de verschillen in de instellingen.
Wij geloven dat onze workflow kan aangepast worden voor vele andere toepassingen niet alleen in de neurowetenschappen, maar op een breed gebied van biologische wetenschappen en ook Materiaalkunde (wanneer de hoge resolutie van een TEM nodig is) wanneer de onderzoeksvraag vraagt om een systematische uniform steekproeven en de hoeveelheid monsters worden onderzocht vraagt om een tijd-efficiënte manier van analyse. Bijvoorbeeld, zijn wij momenteel ook geïnteresseerd bij het lokaliseren van ijzer winkels in de menselijke hersenen. Hiervoor hebben wij onlangs onze workflow, zodat de elementaire analyse op uiterst dunne secties op willekeurig gekozen gebieden aangepast. Oog op het minimaliseren van het aantal toepassingen die nodig zijn voor de workflow, we gericht toe te passen met behulp van de SerialEM software alleen, omdat het kan worden geprogrammeerd voor het verplaatsen van het werkgebied om vooraf punten die kunnen worden geselecteerd in een willekeurige mode. We aangepaste scripts om te controleren de TEM, met als doel de workflow volledig automatizing gemaakt. Dit bleek mogelijk met uitzondering van de autofocus in gefilterde imaging modus, die deed geen bevredigende resultaten opleveren. We gebruikten dus DM software voor scherpstellen en voor het verkrijgen van de energie-gefilterd beelden.
Kortom presenteren we software-oplossingen die helpen bij het verkrijgen van electron microfoto op een onpartijdige manier.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Gefinancierd door de Oostenrijkse wetenschap Fonds, FWF, projectnummer P 29370 B27
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Pentobarbital | SigmaAldrich | P3761 | |
| Formaldehyde | Merck | 1040051000 | 1kg |
| Glutardialdehyde | Science Services | E 16210 | 25%; 100ml; EM grade |
| cacodylate buffer | Merck | C4945 | 250g; Dimethylarsinic acid sodium trihydrate |
| Thionine acetate/Ceristain | Merck | 861340 | |
| acetic acid | Merck | 1000631000 | 1 L |
| Sodium hydroxide | Merck | 1064951000 | 1 kg, pellets |
| osmium tetraoxide | Science Services | E 19110 | 10x1g |
| TAAB embedding resin | Science Services | TAT001 | 500g |
| DMP-30 | Science Services | TAD024 | 100g |
| DDSA | Science Services | TAD025 | 500g |
| Uranyl acetate dihydrate | Plano GmbH | 19481 | depleted, 25g |
| Ultrastain 2 | Leica | 16707235 | Lead citrate |
| Toluidine blue solution | Agar Scientific | AGR1727 | 10g |
| Pioloform | Plano GmbH | R1275 | 10g Powder |
| Proylenoxide | SigmaAldrich | 82320-1L | 1L |
| DPX embedding medium | Plano GmbH | R1320 | embedding medium for semi-thin sections on glass slide, 50 ml |
| Vibratome, Leica VT 1000 | Leica Microsystems, Vienna, Austria | ||
| Leica Ultracut UCT, ultramicrotom | Leica Microsystems, Wetzlar, Germany | ||
| Tecnai G2 20 | FEI,Eindhoven, Netherlands | ||
| Megaview wide angle camera | Olympus Soft Imaging Solution, Münster, Germany | ||
| US 1000 digital camera | Gatan, Pleasanton, USA | ||
| TEM Imaging Analysis Software | FEI,Eindhoven, Netherlands | ||
| FEI Serial Section Software | FEI,Eindhoven, Netherlands | ||
| Fiji, ImageJ 1.52e | National Institute of Health, USA | ||
| SPSS 20.0 | SPSS Inc., Chicago, IL, USA | ||
| SerialEM | Regents of the University of Colorado | ||
| RPS (random point sampling) software 0.9a | custom-made | ||
| Disector v1.0.2 (ImageJ macro) | custom-made | ||
| EFTEMSerialEM (SerialEM script) | custom-made |
References
- Howard, V., Reed, M. Unbiased Stereology: Three-Dimensional Measurement in Microscopy. , BIOS Scientific Publishers. Oxford. (1998).
- Nakamura, H., Kobayashi, S., Ohashi, Y., Ando, S. Age-changes of brain synapses and synaptic plasticity in response to an enriched environment. Journal of Neuroscience Research. 56 (3), 307-315 (1999).
- Landers, M. S., Knott, G. W., Lipp, H. P., Poletaeva, I., Welker, E. Synapse formation in adult barrel cortex following naturalistic environmental enrichment. Neuroscience. 199, 143-152 (2011).
- Reichmann, F., et al. A novel unbiased counting method for the quantification of synapses in the mouse brain. Journal of Neuroscience Methods. 240, 13-21 (2015).
- Reichmann, F., et al. Environmental enrichment induces behavioural disturbances in neuropeptide Y knockout mice. Scientific Report. 6, 28182 (2016).
- Mayhew, T. M. Taking Tissue Samples from the Placenta: An Illustration of Principles and Strategies. Placenta. 29, 1-14 (2008).
- Ferguson, S., Steyer, A. M., Mayhew, T. M., Schwab, Y., Lucocq, J. M. Quantifying Golgi structure using EM: combing volume-SEM and stereology for higher throughput. Histochemistry and Cell Biology. 147, 653-669 (2017).
- Sterio, D. C. The unbiased estimation of number and sizes of arbitrary particles using the disector. Journal of Microscopy. 134 (2), 127-136 (1984).
- Gundersen, H. J., et al. The new stereological tools: disector, fractionator, nucleator and point sampled intercepts and their use in pathological research and diagnosis. APMIS. 96 (10), 857-881 (1988).
- Franklin, K. B. J., Paxinos, G. The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates. , Elsevier/Academic Press. (2008).
- Lewis, P. R., Knight, D. P. Staining Methods for Sectioned Material. , Elsevier/North-Holland Biomedical Press. (1988).
- Mastronarde, D. N. Automated electron microscope tomography using robust prediction of specimen movements. J Struct Biol. 152 (1), can be downloaded from http://bio3d.colorado.edu/SerialEM 36-51 (2005).
- Rampon, C., Tang, Y. P., Goodhouse, J., Shimizu, E., Kyin, M., Tsien, J. Z. Enrichment induces structural changes and recovery from nonspatial memory deficits in CA1 NMDAR1-knockout mice. Nature Neuroscience. 3 (3), 238-244 (2000).
- Xu, X., Ye, L., Ruan, Q. Environmental enrichment induces synaptic structural modification after transient focal cerebral ischemia in rats. Experimental Biology and Medicine. 234 (3), 296-305 (2009).
- Lonetti, G., et al. Early environmental enrichment moderates the behavioral and synaptic phenotype of MeCP2 null mice. Biological Psychiatry. 67 (7), 657-665 (2010).
