Summary
脳組織の電子顕微鏡による調査のための斬新なワークフローを紹介します。メソッドでは、公平な方法で神経機能を調べることができます。元素分析は、ランダム サンプリングのワークフローのほとんどを自動化スクリプトを述べる。
Abstract
ニューロンとそのシナプスの微細構造の機能の調査のみ電子顕微鏡観察で可能です。特にため、このような特徴量の分布密度の変化の比較研究、公平なサンプリング プロトコルは、信頼性の高い結果に不可欠です。脳のサンプル画像の獲得のためのワークフローを紹介します。ワークフローが定義されている脳領域内で体系的な均等にランダム サンプリングを可能にし、disector を使用して画像を分析することができます。この手法は連続切片の広範な検査よりもはるかに高速ですが、まだ密度と微細構造の特徴量の分布を推定する実現可能なアプローチを提示します。埋め込み、前にステンド グラス vibratome セクションは調査、全体的な試料準備を助けた速度の処理中の脳の領域を識別するために参照として使用されました。このアプローチは、マウス脳におけるいくつかの微細構造パラメーターで濃縮住宅環境の効果を調査し、比較研究のために使用されました。脳試料の元素分析を目的として適応したワークフローの使用の成功に基づいて、我々。我々 はユーザーとの対話の時間の面でプロトコルを最適化されています。オープン ソース ソフトウェア SerialEM 用のスクリプトをコンパイルすることによってすべての時間のかかる手順を自動化することにより、元素マップを取得の主な仕事に集中するユーザー。元のワークフローと同様に、信頼性の高い結果を保証する公平なサンプリング アプローチに着目。
Introduction
電子顕微鏡のサンプル セクション内の代表的な領域への挑戦です。、、オブザーバーとしてしばしば偏っているサンプルでは、顕著な特徴によって私達の注意に描かれた特定の地域を見ても分散、公平なサンプリングを防止します。関心領域のすべての部分は、電子顕微鏡写真1で終わるのと同じチャンスを取得する場合、サンプリング バイアスを回避のみことができます。どこにステージを停止、サンプリング領域を選択するために、画像を見もせず手動で顕微鏡のトラック ボールを押すことによってソフトウェア ソリューションなしサンプリング バイアスを避けるために不可能です。厳密に言えば、これは意識的にあるいは無意識のうちに、ユーザーは、ステージの動きに影響を持つことができ、また、これはサンプリング領域を選択するの洗練された方法ではありませんので、ランダムなプロシージャではありません。ランダム サンプリングはステレオロジー1セクション、離れた既知の距離のペアを必要とするため、ある特定の容積、たとえば、構造体の数を評価するためにセクションの組み合わせを使用する場合に特に重要になります。構造が非常に小さい場合を除きのより大きい構造の分布密度を過大評価する捜査官アプローチではこの傾向しますが、また 1 つのセクションだけを見るし、特定の構造2の数を推定することが可能になります。切片厚を比較。別のアプローチは、連続切片から組織のボリュームを再構築し、従って目的のデータ3を得るが。しかし、これは非常に時間がかかり、(大きい) の比較研究可能なアプローチしません。
これらの問題を克服するためには、超薄切片内で定期的な間隔で電子顕微鏡写真を取得するためのサンプルを自動的に選択する研究者を可能にするワークフローを開発しました。電子顕微鏡写真の位置はランダムで、公平なサンプリングを可能です。アプローチが適して両方の構造 (たとえば、ある神経ボリューム4,5内シナプス) の数値の密度と構造の機能 (たとえば、幅シナプス間隙の寸法を決定するためまたはシナプス後密度4、5の直径)。
ワークフローでは、サンプリング (RPS) のソフトウェア (スクリプト ソフトウェアは我々 の顕微鏡に付属を使用して Java スクリプトで書かれた) 超薄片への関心の定義済み領域内のグリッドの位置を自動的に計算するカスタムメイドのランダムな点を使ってください。RPS ソフトウェアは、電子顕微鏡写真は、各ポイントで行うことができますので、電子顕微鏡のステージをこれらのあらかじめ定義されたポイントに移動します。まず、ユーザーは関心薄いセクション内の領域を定義します。次に、RPS のソフトウェアは、この領域内のグリッドの位置を計算します。X/最初の位置の y 座標をランダムに作成され、残りの位置は、最初の位置に点で通常のグリッド間隔で配置されます。関心領域のすべての部分は検査対象の同じチャンスがあるのでこれは最小限のデータ コレクションを実行できます。サンプリングのこのアプローチは組織的均等にランダム サンプリングとも呼ばれます (を参照してください詳細については、6、7を参照)。
構造物の数値の密度を決定するため、離れた既知の距離にあるセクションのペアで取り組んでいます。電子顕微鏡写真を所定の位置の 1 つの最初のセクションから取得後、電子顕微鏡連続切片ソフトウェア (私たちの電子顕微鏡に付属しているソフトウェア パッケージの一部) を移動 2 番目のセクションの対応するポイントに対応する位置の電子顕微鏡写真を取得します。定義済みのグリッド内のあらゆる場所にこれを繰り返します。我々 のアプローチで、disector を使用して、電子顕微鏡写真8,9の各ペアの粒子数をカウントします。Disector は、カウント フレーム各セクション8,9の 1 つのペアで構成されます。オブジェクトの分布密度のみ表示されるオブジェクトをカウントすることによって決定されます最初のセクション (または参照セクション) はなく、2 番目のセクション (または参照セクション)。これにより、高速かつ効率的な方法8,9内のオブジェクトの数値の密度を推定します。さらに 1 つのセクションに二次元の構造的特徴を測定できます。
豊かな環境 (EE) 住宅住宅条件4、5、標準的な環境 (SE) と比較して条件にさらされたマウスの海馬のシナプス数の違いを評価するために正常にこのワークフローに用いています。また野生型 (WT) マウスと神経ペプチド Y(NPY) KO マウスの微細構造の違いを評価する SE と EE5の下で続けた。我々 の目標を見ていた具体的数値のシナプス密度などのニューロンの構造的特徴断面にアクティブなゾーンとシナプス後密度、シナプス間隙とシナプス小胞の数の幅の長さために神経接続と異なる実験条件の間活性化の変化を評価します。さらに、特定の脳領域のストアドの神経ペプチドの量を決定するニューロンの芯小胞 (DCV) の分布密度に関心がありました。
次の手順では、上記で説明した研究の取り組みの成功に基づいて人間の脳のサンプル内の公平な元素分析の領域を選択する私たちのワークフローを適応しています。これは、イメージの鉄は、フェリチン分子神経細胞とグリア細胞の両方に格納されます。このため、我々 は定義された領域内の脳のセクションのランダムなスクリーニング プロセスの操作のほとんどを自動化できるスクリプトをコンパイルしました。
Protocol
すべての実験は、連邦科学省とオーストリア共和国 (BMWF-80.104/2-BrGT/2007 と BMWF-66.010/0037-II/3b/2013) の研究または番号 28-549 ex、グラーツ医科大学の倫理委員会の倫理委員会で承認されました。15/16、1986 年 11 月 24 日 (86/609/EEC) のヨーロッパのコミュニティの理事会指令と欧州議会及び 22 September2010 理事会の指令に従って実施 (2010/63/EU)。動物実験は設計され、使用される動物の数が最小化されたそのような方法で行われます。
1. 解剖と組織の固定
- マウスを安楽死させる (21 週古い、女性 c57bl/6 j マウス、C57BL/6 n マウス; 混合 C57BL 雄 WT と NPY KO マウス/6:129/SvJ (1:1) 背景それぞれ) 150 mg/kg のペントバルビ タールを腹腔内に注入することによって。
- 頭蓋骨から脳を取り除くし、すぐに半分にカット (右半球から左を分離する) - メスを使用してください。
- すぐに 2% のホルムアルデヒドとガラス容器に半分を配置し、0.1 M cacodylate で 2.5% グルタルアルデヒド バッファー (CH3)2麻生2Na·3H2O、pH 1 m 7.4 に調整塩化ナトリウム)、pH 7.4 4 ° C で
注意: 定着剤は有毒であるし、細心の注意で処理する必要があります。保護手袋とヒューム フードの下でのみを使用します。 - 少なくとも 24 時間、4 ° C でも同じバッファーに 2 日間の 4 ° C とリンスの頭脳の半分を修正します。バッファーのボリュームで 10 倍の検体量についてすべき。
2. 参照で Vibratome セクションを比較することによって脳の中で関心の領域を識別するマウスからセクション脳アトラス10
- Vibratome に脳サンプルを配置します。脳の向きが正しいことを確認 (この場合、歯冠方向から海馬の選ばれた)。
- 脳の領域 (ROI) に達するまでトリムします。大規模な厚さの部分をカット (e.g。、100 μ m)、関心領域の脳の部分に達すると、各セクションを捨てます。
- 投資収益率と脳の部分の初めに 20 μ m の厚みで vibratome セクションを切り取り、スライド ガラスに vibratome のセクションを開始します。0.05% チオニン酢酸ナトリウム酢酸緩衝液、pH 4.2 1 分 (図 1Ai) でセクションを配置することによって、それらは (ニッスル染色) を染色します。
- 光学顕微鏡を用いたマウス脳アトラスとステンド グラスのセクションを比較し、切断および汚損目的脳座標に達するまで続行します。
3. 埋め込みのサンプル領域を取得
- 右の区域を識別すると、すぐに、vibratome で 150 μ m の厚みでカット 1 つのセクションを開始します。
- Microdissect この vibratome セクションを実体顕微鏡下でかみそりの刃で。ROI 周辺の部品を切り取る。断面透過型電子顕微鏡 (TEM) (1 x 1 mm2より大きくない) の準備手順、次の適切なサイズが必要です。
4. TEM 準備 - 埋め込み、切断および汚損極薄
- 埋め込み
- 2 時間室温 (RT) で 2% オスミウム四酸化ポスト修正。ボリュームを使用して、サンプル ボリュームの少なくとも 10 倍のサンプルをカバーが不要な有毒廃棄物を防ぐために余分な定着剤を使用しないでください。
注意: 四酸化オスミウムが猛毒と細心の注意で処理する必要があります。保護手袋とヒューム フードの下でのみを使用します。 - 前の手順 (50%、70%、80%、96%、100% エタノール) で 20 分使用の手順で EM グレード アルコールよりも大きいボリュームを使用して水分を取り除きます。
- RT に 2 h と 4 ° C で 1:3 一晩用酸化物/埋め込み樹脂プロピレン (1:2) の混合物にした場所で 40 分のプロピレンオキ サイドで配置します。
注意: プロピレンの酸化物は非常に有毒、慎重に処理する必要があります。保護手袋とヒューム フードの下でのみを使用します。 - 2 回 60 分と 90 分 (すべて 45 ° c) 後一度樹脂を変更することにより、100% 樹脂のサンプルを埋め込みます。
- 最後に、適切な金型にサンプルを配置し、3 日間 (図 1Aii) 90 ° C で重合樹脂をさせます。
- 2 時間室温 (RT) で 2% オスミウム四酸化ポスト修正。ボリュームを使用して、サンプル ボリュームの少なくとも 10 倍のサンプルをカバーが不要な有毒廃棄物を防ぐために余分な定着剤を使用しないでください。
- トリミングと、ウルトラミクロトームに押します。
- 両側がお互い (図 1Aiii) に準拠するセクションをできるだけ滑らかなブロックをトリムします。
- 食材 55 nm 極細連続切片 (べきシルバー グレー) は、ウルトラミクロトームを使用しています。スロット グリッドを使用 (スロット幅 1 × 2 mm) pioloform (図 1Aiv) でコーティングします。
- 30 分の 30 の鉛クエン酸 2% 酢酸ウランを使用してスロット グリッドの超薄切片を対比染色 (これは標準的な電子顕微鏡法11) RT で s。
注意: 酢酸ウランは非常に有毒との直接接触は避けるべきであります。保護手袋でのみ処理できます。硝酸鉛は有毒飲み込んだまたは吸入、細心の注意を処理する必要があります。
5 参照に対応する Roi と検索のセクションをソフトウェア パッケージと TEM のイメージの作成
- 向きとセクションの品質を評価する (セクションの大きさ) によって低倍率を用いた tem グリッドのセクションを確認します。
- セクションのコーナー ポイントを格納することによって、セクションの仮想イメージを生成するソフトウェア (TEM 画像解析ソフトウェア、または TIA のパッケージは顕微鏡に付属) を開始します。ソフトウェア各セクションに投資収益率の対応する位置を検索することができます。
- セクションに移動し、挿入を参照、検索セクションのコーナー ポイントを追加するを選択します。ポップアップ ウィンドウの指示に従います。参照」と開始、検索セクションに進みます。ポイント 1 および 2 (図 1双) として次のセクションに平行であるセクションのエッジが入力されていることを確認します。
- 関心領域を識別し、投資収益率のアウトラインを作成する投資収益率の複数のコーナー ポイントの参照セクションに TIA を使用してステージを移動する低倍率下での参照セクションを視覚化します。
- RPSのソフトウェアを使用して作成されたポリゴンの座標を記録します。これは、投資収益率 (図 1Bii) セクションで概要を説明するために必要なポリゴンの各ポイントでRPSソフトウェアのダイアログ ボックスで追加の座標を押してください。
- 定義し、 RPSソフトウェアに領域間サンプリング エリアと距離の適切なサイズを入力 (提示におけるサンプリング領域のサイズは 7 μ m 以下と、それらの間の距離は、少なくとも 20 のサンプリング エリア内の結果、20 μ m、投資収益率)。プレスラスターの計算、そして、ソフトウェアは、多角形 (図 1Biii) 内の顕微鏡写真の位置のために均一ランダムの組織的にサンプリング領域の座標を生成します。
注: 良い方向ポリゴンや多角形内のサンプリング領域をRPSソフトウェア (図 1Biv) によって表示されることができます。
- RPSソフトウェアと電子顕微鏡の連続切片のソフトウェアを使用して参照と検索のセクションのサンプリング ポイントを格納します。これらは、モンタージュの座標をその後記録されている11。
- RPS ソフトウェアで押して x 顕微鏡ステージに移動する次の位置への/それぞれの y 座標のサンプリング参照セクション内の領域。参照セクションのソフトウェアでこれらの座標をインポートする場所と挿入に行きます。すべての座標のこの手順を繰り返します。
- 検索セクションに参照セクションから座標を反映するには、セクションに移動し、セクションに進んでを押します。ダイアログ ウィンドウでの検索セクション (通常 ' 2') 番号を入力します。
- モンタージュ (次を参照) の記録のための参照と検索のセクションを切り替える前に説明したよう、場所と数に行く参照セクションの位置を変更します。ダイアログ ウィンドウで、次の座標を選択します。
- 各サンプリングで SerialEM モンタージュを調整、ファイルに移動し、ドロップ ダウン メニューから新しいモンタージュを選択します。ダイアログ ウィンドウで適切なタイル数と重なりの割合を選択します。現在の研究、研究、2 x 2 のイメージのモンタージュを作るために必要な CCD カメラの限られた視野の下でシナプスの機能を認識するための十分な 5000 X の倍率です。モンタージュは、SerialEM で作られています。
- 各モンタージュを記録する前にフォーカスを調整します (または、可能であれば、録音ソフトのオート フォーカスのオプションをアクティブにする)。モンタージュ ファイルを保存し、SerialEM で左にモンタージュ サブメニューの開始を押すことによってモンタージュの録音を開始するフォルダーを選択します。
6. ドキュメント微細構造機能するImageJの TEM 像を分析します。
注: このため、だの参照と検索のセクションから一直線に並べられた画像のスタックを作成することが重要。
- ImageJ スタックに画像と画像対をスタック ファイルに変換し、 StackReg (大きなスイス連邦工科大学存在の場合、アフィン変換はアルゴリズム http://sites.imagej.net/BIG-EPFL/; からインストールするには、画像を配置使用)。細胞の構造特徴の数値の密度を得るためは、カスタムメイド ImageJ マクロDisectorは、ランダムな角度を画像の上にランダムに配置された 5.5 μ m x 5.5 のサイズとカウント フレームを生成します。
- Disectorマクロを起動 ( ImageJメニュー内の位置は、それが保存されているディレクトリに依存) (セグメント数カウント フレームのサイズ) のパラメーターを必要な (図 1Cii) として定義し、。
- シナプス/μ m2 Disector を使用しての数をカウントします。カウントの枠内参照セクションに表示される参照セクションに表示されていないすべてのシナプスをカウントします。省略すると、2 つの禁制線'; disector の交差これらのシナプスしかし、反対 '受け入れ行' にシナプスをカウントを行います。これは、 ImageJ (図 2A図 2B) のToolsbarにある多点ツールを使用します。
- シナプス パラメーターを測定、断面 (参照セクション;、disector で使用される同じイメージ フレーム内) のシナプス間隙でシナプスのみを選択します。
- のプラグイン経由でドロップ ダウン メニュー (図 2A) から ImageJ のプラグインObjectJを開始 |分析。ObjectJ - ドロップダウン ダイアログ ボックスから新しいプロジェクトを開きます。これはマーカー ツール(図 2B、赤い円) の概要やマーク構造をユーザーことができますウィンドウが開きます。ここで示した実験に使用されるシナプスのパラメーターは、次の手順のとおりです。
- マーカー ツール(図 2B赤丸) を使用して構造に沿って線を描画することによってシナプス前膜の長さとシナプス後肥厚部の長さを測定します。
- 両方まっすぐ平行側面と両方の膜から等距離にある分割線中間前及びシナプス後膜をカバーする多角形を描画することによって、シナプス間隙の平均の幅を取得します。
- ドッキングされた小胞の数を決定する、1 つの小胞の直径以下のシナプス前膜からの最大距離を持っているすべての小胞をカウントします。
- ドッキングされていない小胞の数を決定する、同じシナプスにドッキングまたは他のドッキング解除された小胞から 1 つ小胞径の最大距離でこれらの小胞をカウントします。
7. 生産半薄いセクション ドキュメント肉眼形態光顕微鏡の (症例細胞数) 同じ ROI 内として選ばれた TEM 観察の。
- 透過電子顕微鏡用の超薄切片を切り取り後すぐにカット 2 つの半薄いセクション、0.5 μ m 厚と互いに隣接。ガラス スライド上に配置し、それらを染色 0.5% トルイジン ブルー溶液を用いたします。(DPX 媒体をマウント、distyrene、可塑剤 (リン酸トリクレシル)、キシレンで構成される) とのセクション カバー スリップを配置します。これらの 2 つのセクションを使用して、セルの番号をカウントします。
- 光顕微鏡を用いた低倍率での半薄いセクションを写真します。
注: 捜査構造はイメージで識別できる必要があります。本研究では 20 倍の倍率は、細胞体を識別するために使用されました。必要に応じて、複数の画像を画像処理ソフトと一緒にステッチことができます。 - 2 つの連続した半薄いセクションのペアを揃えて画像処理ソフト (e.g。、 ImageJ)。
注: 回転およびサイズ (セクショニング プロセスによって導入された圧縮アーチファクトのため発生することができます) の違いは、完璧なオーバーレイの 2 つのセクションに調整必要があります。 - 光学顕微鏡画像の ROI の境界線をマークします。投資収益率は、TEM 画像の ROI に対応しなければなりません。この目的のため画像を読み込むImageJ Toolsbar (図 2A) からポリゴン選択を選択します。
- 分析を開くことによって ImageJ を用いた画像全体にわたってグリッドを生成する |ツール |グリッドし、必要に応じてパラメーターを設定します。
- 面積と関心とセクションの厚さの領域内の点の数のポリゴンのボリュームを計算 (ボリューム= NCS * GS * hST ;NCS = カウント クロス セクション;GS = グリッド サイズ;hST切片厚を =)。
- 彼らが 1 つのセクションのみ存在する場合、ROI 内の神経細胞の細胞体から核の数をカウントします。ImageJで、Toolsbar からマルチポイント ツールを選択し、セルをマークします。各セクションのセルをカウントするには後で計算しボリュームごとのセル数 (
;C密度= 細胞密度;Cカウント= 細胞数)。 - ObjectJ 結果] ウィンドウ (図 2C) ですべての測定値を記録します。エクスポートし、さらに使用できるように保存します。
;C密度= 細胞密度;Cカウント= 細胞数)。8. DigitalMicrograph (DM、イメージ フィルターに付属している) との組み合わせで脳サンプルで元素分析の最適化に SerialEM スクリプトを使用してください。
- フィルター (GIF) をイメージングのチューニング。
- TEM にサンプルをロードし、GIF チューニング用のサンプルで穴に使用して行くトラック ボールまたは顕微鏡のジョイスティック。
- DMソフトウェアまたはDMでエネルギー フィルター TEM (透過) に切り替え、DM で CCD カメラを選択します。
- 元素分析の表示倍率を選択 (倍率は興味の構造/領域によって異なります; 現在の場合では、倍率が設定されて 76 k から 125 k まで)。0.001 秒とスタートビューに露出時間を設定します。
- エッジが見ることができる画像のビームをセンターまで慎重にビームを集中します。開口部のエッジが表示されますし、ビームの trackball をもつビームをセンターまでは、C2 の対物絞りを減らします。
- ビームをデフォーカス (C2 周り 46.2%、チューニング用の露光時間は 0.05 の周りする必要があります s) ZLPボタンを押してゼロの損失ピーク (ZLP) を見つける。フル調整ボタンを押すとチューニングの手順を開始します。
- 買収のランダム ポイントを得る。
- TEM 画像表示モードに戻り、カメラを選択し、10 k の倍率でピントを確認 (z 軸を調整し、デフォーカスをゼロに設定)。
- カメラが挿入されていない場合、X 倍率とチェック LM 75 を選択 (それ以外の場合を支配できないこと SerialEM ソフトウェアによって)。
- SerialEM を起動し、新しいプロジェクトを開きます。
- ナビゲーターを開きます。(ビューやレコード) のカメラ & スクリプト コントロールでのカメラの設定を確認し、ビューを起動 (カメラは自動的に挿入されます)。
- 角を超薄いセクションのマップ、「ナビゲーター」ウィンドウでポイントを追加を選択します。
- 超薄いセクションの端のコーナー ポイントを設定します。右マウス キーを押しながら、コーナー ポイントにステージを移動します。セクションの隅に達したら、左マウス クリックでコーナー ポイントを追加します。3 コーナー ポイントを追加手順を繰り返します。「ナビゲーター」ウィンドウで、ストアド ポイントのコーナー ポイントのボックスCがチェックされていることを確認します。
- (倍率 LM 75 で望ましい) コーナーのモンタージュを起動、SerialEM メニュー バーでナビゲーターに移動しMontaging とグリッドとセットアップ コーナー モンタージュをドロップ ダウン メニューから選択。
注意: 最高のフィッティングに選択したレコードのパラメーターの設定が表示されます。必要に応じてそれらを変更します。今回のケースでは、重ね合わせる割合だけは 20% に変更されました。
- モンタージュ イメージのセクション/投資収益率の概要を示します。「ナビゲーター」ウィンドウで追加のポリゴンを選択し複数の右マウス クリックでセクションを説明します。ナビゲーターのドロップ ダウン メニューでポイントの追加] グリッドを選択し、(距離実験の質問に依存する点の間の距離を定義例えば。、10 μ m、図 3)。
- スクリプト命令に従います。ナビゲーターで示すように、グリッドのポイントの数を入力し、獲得ポイント数を入力してください (例., 20)。
- スクリプトは、グリッド線を避けることができるようには、照明のしきい値を設定します。スクリプト命令に従うし、グリッド バー 4 分の 1 でビューのフィールドをカバーするために手動でステージを移動します。表示されている値によると照明のしきい値値 (表示される値よりも高くする必要があります) を入力します。
- 獲得ポイントが選択され、調理のルーチンが終了まで待ちます。
注: これは長い時間がかかるしすることができます一晩行う;スクリプトは、調理のルーチンを終えた後スタンバイに顕微鏡を送信します。料理のルーチンは、電子ビームの部分を安定させるために重要です。
- エネルギー フィルター TEM (透過) の元素分析
- TIA/DMで透過モードを選択し、 DMでCCD カメラを選択します。
- ビームをセンター、各サンプリング座標にステージを移動するコマンドをスクリプトに従います。
注: ユーザーは、ステージを次の座標に移動するかどうかは求められます。 - ゼロの損失ピーク (ZLP) を合わせ、 C2を 〜 46.2% に設定します。
- 60 eV のエネルギーを設定 (この場合、値は Fe M のエッジを検出するため設定です)、0.4 s. 挿入で 10 eV と露出の時にスリット、スリットと C2 を 〜 43.9% に設定します。
- ビューを起動して、イメージの焦点を当てます。
- 46.2 %c2に設定、ZLP を合わせ、 C2を 43.9% に設定。
- 元素の特定設定を持つ元素マップを取得します。
注: 取得] ダイアログで既定の設定を使用できますが、これらの事前テストをお勧め可能であればフィルターの例のイメージは、図 4に示します。 - 46.2% にC2を設定し、厚みマップを取得します。
- すべての決定の取得ポイント (ステップ 8.3.2-8.3.12) を繰り返します。
- スクリプトの指示に従い、単一の電子顕微鏡写真や獲得ポイントのモンタージュを得る。すべて (超) 構造の情報は表示/個人を特定できるので、倍率を選択します。
- 結果ウィンドウ、ナビゲーター ファイル ログを保存し、スリットを削除します。
- バルブを閉じて、サンプルを削除、TEM をシャット ダウンします。
Representative Results
ここでは、透過電子顕微鏡用自動かつ公平な方法で領域を選択するワークフローについて述べる。ユーザーは、電子顕微鏡の下で極薄セクション内で関心のある分野を選択し、領域内の 20 のサンプリング領域の座標を自動的に計算する私たちのRPSソフトウェアを含むワークフローのいくつかのソフトウェア ソリューションを使用して関心します。その後、TEM ステージは、写真の各サンプリング領域に移動されます。これセクションの一つを分析してセクション、捜査官のバイアスのないイメージングのための領域を選択することができます既知の距離を離れてのペアを分析するための両方可能です。
このワークフローは、マウスの脳のセクション4、5の微細構造の機能を文書化するときに貴重な証明しました。これらの研究では関心のある領域として海馬歯状回 (DGpl) の多形細胞層を調べた。超薄片に収まる背 DG (前 −1.3) の冠状断面とその輪郭が低倍率で容易に認識されるので、DG を調べるに適した手法を証明しました。他の頭脳領域を検討するなら、彼らのサイズおよび実験を計画する前に特徴を確認することが重要でしょう。
ここで説明したワークフローを適用する EE 住宅が大幅では DGpl4、標準的な住宅事情を尊重し、シナプス間隙の幅を増加することを示した。また、EE 収容動物4、神経ペプチドの世帯の変化を示すは密中心の小胞の数が低下しました。WT と NPY のノックアウト マウスは、EE の条件の下で保たれた、ニューロン/µm³、DGpl の数増やさ SE 住宅5点で DCV の密度が減少します。対照的に、NPY ノックアウト条件5の住宅の独立した予約プール (ドッキング解除されたシナプス小胞) のシナプス小胞の大幅な増加となりました。シナプスの裂け目の幅に及ぼす EE は EE 建物重量と NPY KO マウス5の重要な違いの結果 NPY の島グループで逆転しました。WT と NPY の行動の研究と一緒ノックアウト動物は NPY の EE5の神経生物学の効果のための重要な役割を示すこのどちらの住宅条件の下で開催。
人間の脳に格納された鉄を視覚化するには、スクリプトはコンパイル時のエネルギーを得ることを目的と全体に極薄のセクション内から獲得のポイントは、これらの各ポイントでの電子顕微鏡像をフィルター処理をランダムに選択する SerialEM ソフトウェア.電子顕微鏡には、セクションをロードした後、スクリプト実行セクションの安定化 (すなわち。、' 標本料理 ' ルーチン) 一晩。スクリプトは、図 3に格子が付いているものからユーザーが定義済みのポイントの数をランダムに選択します。テストの顕微鏡写真を生産しその灰色レベルをチェック、スクリプトは、選択したポイントがグリッド線に上陸ポイントを拒否するセクションの目に見える部分に位置するかどうかをチェックしました。ワークフローのほとんどは、ユーザーの最小限の操作でスクリプトによって処理されました。ただし、それはなかった (このセットアップ)、エネルギー フィルタ リング顕微鏡写真を自動的に記録することが可能 SerialEM のオート フォーカス ルーチンのあまりにも小さな光があったと。したがって、我々 はすぐにスクリプト各ポイントにステージを移動手動でフォーカスを調整し、鉄の透過イメージを作った DM のソフトウェアに切り替えました。死後人間の脳から EFTEM 鉄イメージの例を図 4に示します。
図 1。ワークフローの図。(A) (矢印の方向) にサンプル準備の主な手順を示します: vibratome セクション (i)、embedding(ii)、半薄いと超薄いセクション (iii) を切断し、銅グリッド (iv) の超薄切片のペアをキャッチします。顕微鏡サプライヤーのソフトウェアおよびカスタムメイドの RPS ソフトウェアの使用状況を記録サイトを決定するサンプリング領域座標を作成する(B) 。セクションのコーナー ポイントは、顕微鏡ソフトウェアに格納され、投資収益率 (半薄いセクションの助けによって識別される) の通りです (私は);ROI の領域をサンプリングのグリッドが生成されます、ランダム シフト (赤矢印) が x で導入されたと y。(Ii); 記録サイトを決定するシフトを持ってない、黒の正方形ではなく、ランダムに移される青の正方形が使用されるように、シフトは (黒矢印)、サンプリング領域間の距離よりも小さい(黒と青の正方形として描画) 投資収益率の枠内でのみサンプリング領域は、記録に使用されます。顕微鏡写真は、参照セクション (黒い正方形) と参照セクション (青い四角) の対応する場所の両方に作られています (iii)。(C)の顕微鏡写真は十分な倍率での各サンプリング分野で行われます。(この場合は 2 x 2 の画像が一緒に合併) に必要な場合にいくつかのマージされた画像から成るモンタージュは、(i);構造フレーム内と、'受け入れ回線で' (点線の枠線) はカウントされますにはなく、これら「禁制線」(固体フレーム ライン) カウント フレームを生成し画像オーバーレイとして示す、(ii).この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 2.公平なカウント フレームと超薄切片のペアに微細構造パラメーターを測定します。(A)カウントおよび細胞構造の分析に使用する ImageJ ウィンドウの概要。左側は、オーバーレイとしてカウント フレームと電子顕微鏡写真を示します。右側: ドロップ ダウン メニュー (上) と (下) のツールバー ImageJ ユーザー インターフェイス (青い四角形)ObjectJ オブジェクト エディター (緑色の四角形)。測定するためのツールを選択することができますObjectJ ツールウィンドウ (オレンジ色の四角形) とすべての測定値が記載されていますObjectJ 結果ウィンドウ (黒の四角形)。電子顕微鏡写真 (両方のセクション - 矢印のシナプス; 参照セクション矢印でのみシナプス) 上の表示マークのシナプスから(B)の詳細。それらはのマルチポイント ツールを使用してマークされて(赤い円) ImageJ のツールバーから。(C)名前とシナプス機能の計測パラメーターはObjectJ ツールを使用してを定義されています。マーカー ツールと関心がある機能を選択および構造に沿って左マウス クリックによってイメージで描かれたアウトライン。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 3。選択するエネルギー フィルター電子顕微鏡の ROI 内元素マッピングのための領域をサンプリングします。SerialEM は、関心領域を選択する、一定の間隔 (A と B の画像のピンクの十字) でサンプリング エリアの高い数を示唆するに使用されます。スクリプトは、(これらの定義済みの座標) から獲得のためのサンプリング エリアをランダムに選択します。貧しい照明サンプリング エリアは、できるだけ早く 20 よく照らされたサンプリング領域を ROI 内で選択されているグリッド線とスクリプト停止を避けるために拒否されます。(A)関心、説明可能なサンプリング エリアの数が多いと、多角形の全体の領域の概要は、X のランダムな選択の前にサンプリング エリアを表示(B)に詳細でマーク。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 4。元素マップ (EFTEM) 取得の例。獲得ポイント周辺の(A)明視野 TEM 顕微鏡写真ランダムに選択された領域は元素マップを得るために使用された、黒の四角形でマークします。(B) EFTEM 済みエッジ ウィンドウ画像ランダムに選択されたエリアで行われました。(C) EFTEM 後エッジ ウィンドウ イメージの同じエリアで行われました。(D)同じ面積 (M エッジ) の鉄の元素マップ。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
Discussion
ここに示すワークフローでは、研究者は公平な方法で超微細構造の機能でデータを取得できます。これは連続切片からボリューム調査より大いにより少なく時間のかかるです。複数の異なるアプリケーションは、この目標を達成するために使用されます。最初は、当社のカスタムメイドのRPSのソフトウェア (可用性の詳細については、対応する著者までご連絡ください) が用いられるサンプリング領域の座標を選択するランダム ステージ シフトを導入します。これにより、投資収益率の体系的な均等にランダム サンプリング。次に、特定の構造をカウントするため我々 は以前研究13,14,15従来に比べて斬新な方法で、既知の距離と 2 つの連続したセクションの比較、disector メソッド、適応の体系的な均等にランダム サンプリングのカスタムメイドの RPS ソフトウェア。これは連続切片からボリューム全体を 3 D 再構成と比べて時間を節約できます。カスタムメイドの RPS ソフトウェアはワークフローを再現するための制限要因である顕微鏡の種類用に特に開発します。この特定のソフトウェアからの代替をスクリプトことができます、他の機種と互換性のあるアプリケーションとなります。
我々 は正常に私たちの比較研究4、5のこのアプローチを使用しました。神経組織の超薄切片の関心のある領域を説明した、このエリア内で体系的な均一ランダム サンプリングによる撮影を行った。利子海馬歯状回の多形層の領域が我々 のアプローチに有益なことを調査するためではなく小さな領域をあることに注意する必要があります。ランダムに配置された disector 内 DCV の数を評価し、, アダルト NPY ノックアウト マウスとマウス SE EE と大人 WT 入って成体マウスの DGpl におけるシナプスの微細構造機能がいくつか.我々 のアプローチを使用して、収集したデータは、調査のパラメーターのいくつかの変化を示した。これらの調査結果は、幼若動物2の他の同様の研究からのものを確認しました。
このワークフローの実験的使用法の欠点は、ユーザーが (私たちの場合は、ユーザー インターフェイス、TEM シリアル セクションで異なるユーザー インターフェイスに慣れる必要があると、このマルチ アプリケーション アプローチは利便性の面で理想的なないことかもしれません、RPS のソフトウェア、および SerialEM ソフトウェア)。効率的な方法ですべてのアプリケーションを扱うことを学ぶ時間がかかるは、考慮する必要があります。ただし、このワークフローを使用する方法の学習に時間を投資はまだ明確に有利なシリアル断面 TEM 全体ボリュームを分析に必要な時間をかけて。関心のある分野の体系的な均一ランダム サンプリングによって配置 disector を使用しての方法は、セクション/ボリュームの高い金額を調査することがなく信頼性の高いデータ1を提示すれば十分です。
私たちの研究の結果を最大にするには、だったサンプル準備中に良い世話をする重要な組織と構造の保全は関心のある領域を明確に識別するためにも、構造の機能を評価するために重要ではないです。極めて重要な要因、おそらくこのメソッドの欠点は超薄切片のペアの高品質が必要である: 必要があります穴やしわ、セクションのいずれかでの調査で領域をカバーして切片厚がある必要があります同質を維持しました。研究者は、よく訓練された超でなければなりません。ケアは、イメージング、TEM のセクションのセクションの電子線照射損傷に敏感であるし、容易に引き裂くことができるときに取られるもあります。さらに、投資収益率のサンプリング領域の適切な数を選択することが重要です。実験の目的に応じて電子顕微鏡の倍率は慎重に設定します。実験の具体的には、中枢神経系のシナプスを数える 30.25 μ m2の領域に 1 つのセクションの利子の 20 地域が最適。信頼性の高い結果を得るため (当社の場合シナプス、シナプス機能と DCV) で、問題の機能を認識し、人材育成をお勧めします。シナプスを識別するためにシナプスの小胞を識別する必要があります、これは少なくとも 10 の解像度を必要とする nm。このため、5000 X の倍率は最適なだが、倍率が種類やカメラの位置などハードウェアのパラメーターに依存し、他の顕微鏡やカメラの種類について、適合する必要がありますに注意します。プロトコルが 1 つの TEM に固有のアプリケーションを使用することと、他のモデルとユーザーがセットアップの違いを考慮することを明記しています。
当社のワークフローについて、適合できるだけでなく神経科学、生物科学、また物質科学の幅広い分野で他の多くのアプリケーション (電子顕微鏡の高分解能が必要な) 場合研究の質問は、体系的な制服が要求されたときと考えていますランダム サンプリングと試料の量は、分析の時間の効率的な方法を求めています。たとえば、現在ヒトの脳における鉄店のローカライズに興味を持っております。このため、我々 は最近ランダムに選択されたエリアの超薄切片の元素分析を有効にする、私たちのワークフローを適応しています。ワークフローに必要なアプリケーションの数を最小限にするため事前ランダムに選択することができますポイントを設定する段階を移動するプログラミング可能であるのでだけ、SerialEM ソフトウェアを使用してを適用する目的とします。ワークフローを完全自動化することを目的に、TEM を制御するための独自のスクリプトを作成しました。これは満足のいく結果に至らなかったフィルターの画像モードでオート フォーカスを除いて可能な証明。したがって、焦点を当て、エネルギー フィルター画像を得る DM のソフトウェアを使用しました。
要約すると、公平な方法で電子顕微鏡像を得ることに支援するソフトウェア ソリューションを紹介します。
Disclosures
著者が明らかに何もありません。
Acknowledgments
FWF、オーストリア科学基金プロジェクト番号 P 29370 B27 によって資金を供給
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Pentobarbital | SigmaAldrich | P3761 | |
| Formaldehyde | Merck | 1040051000 | 1kg |
| Glutardialdehyde | Science Services | E 16210 | 25%; 100ml; EM grade |
| cacodylate buffer | Merck | C4945 | 250g; Dimethylarsinic acid sodium trihydrate |
| Thionine acetate/Ceristain | Merck | 861340 | |
| acetic acid | Merck | 1000631000 | 1 L |
| Sodium hydroxide | Merck | 1064951000 | 1 kg, pellets |
| osmium tetraoxide | Science Services | E 19110 | 10x1g |
| TAAB embedding resin | Science Services | TAT001 | 500g |
| DMP-30 | Science Services | TAD024 | 100g |
| DDSA | Science Services | TAD025 | 500g |
| Uranyl acetate dihydrate | Plano GmbH | 19481 | depleted, 25g |
| Ultrastain 2 | Leica | 16707235 | Lead citrate |
| Toluidine blue solution | Agar Scientific | AGR1727 | 10g |
| Pioloform | Plano GmbH | R1275 | 10g Powder |
| Proylenoxide | SigmaAldrich | 82320-1L | 1L |
| DPX embedding medium | Plano GmbH | R1320 | embedding medium for semi-thin sections on glass slide, 50 ml |
| Vibratome, Leica VT 1000 | Leica Microsystems, Vienna, Austria | ||
| Leica Ultracut UCT, ultramicrotom | Leica Microsystems, Wetzlar, Germany | ||
| Tecnai G2 20 | FEI,Eindhoven, Netherlands | ||
| Megaview wide angle camera | Olympus Soft Imaging Solution, Münster, Germany | ||
| US 1000 digital camera | Gatan, Pleasanton, USA | ||
| TEM Imaging Analysis Software | FEI,Eindhoven, Netherlands | ||
| FEI Serial Section Software | FEI,Eindhoven, Netherlands | ||
| Fiji, ImageJ 1.52e | National Institute of Health, USA | ||
| SPSS 20.0 | SPSS Inc., Chicago, IL, USA | ||
| SerialEM | Regents of the University of Colorado | ||
| RPS (random point sampling) software 0.9a | custom-made | ||
| Disector v1.0.2 (ImageJ macro) | custom-made | ||
| EFTEMSerialEM (SerialEM script) | custom-made |
References
- Howard, V., Reed, M. Unbiased Stereology: Three-Dimensional Measurement in Microscopy. , BIOS Scientific Publishers. Oxford. (1998).
- Nakamura, H., Kobayashi, S., Ohashi, Y., Ando, S. Age-changes of brain synapses and synaptic plasticity in response to an enriched environment. Journal of Neuroscience Research. 56 (3), 307-315 (1999).
- Landers, M. S., Knott, G. W., Lipp, H. P., Poletaeva, I., Welker, E. Synapse formation in adult barrel cortex following naturalistic environmental enrichment. Neuroscience. 199, 143-152 (2011).
- Reichmann, F., et al. A novel unbiased counting method for the quantification of synapses in the mouse brain. Journal of Neuroscience Methods. 240, 13-21 (2015).
- Reichmann, F., et al. Environmental enrichment induces behavioural disturbances in neuropeptide Y knockout mice. Scientific Report. 6, 28182 (2016).
- Mayhew, T. M. Taking Tissue Samples from the Placenta: An Illustration of Principles and Strategies. Placenta. 29, 1-14 (2008).
- Ferguson, S., Steyer, A. M., Mayhew, T. M., Schwab, Y., Lucocq, J. M. Quantifying Golgi structure using EM: combing volume-SEM and stereology for higher throughput. Histochemistry and Cell Biology. 147, 653-669 (2017).
- Sterio, D. C. The unbiased estimation of number and sizes of arbitrary particles using the disector. Journal of Microscopy. 134 (2), 127-136 (1984).
- Gundersen, H. J., et al. The new stereological tools: disector, fractionator, nucleator and point sampled intercepts and their use in pathological research and diagnosis. APMIS. 96 (10), 857-881 (1988).
- Franklin, K. B. J., Paxinos, G. The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates. , Elsevier/Academic Press. (2008).
- Lewis, P. R., Knight, D. P. Staining Methods for Sectioned Material. , Elsevier/North-Holland Biomedical Press. (1988).
- Mastronarde, D. N. Automated electron microscope tomography using robust prediction of specimen movements. J Struct Biol. 152 (1), can be downloaded from http://bio3d.colorado.edu/SerialEM 36-51 (2005).
- Rampon, C., Tang, Y. P., Goodhouse, J., Shimizu, E., Kyin, M., Tsien, J. Z. Enrichment induces structural changes and recovery from nonspatial memory deficits in CA1 NMDAR1-knockout mice. Nature Neuroscience. 3 (3), 238-244 (2000).
- Xu, X., Ye, L., Ruan, Q. Environmental enrichment induces synaptic structural modification after transient focal cerebral ischemia in rats. Experimental Biology and Medicine. 234 (3), 296-305 (2009).
- Lonetti, G., et al. Early environmental enrichment moderates the behavioral and synaptic phenotype of MeCP2 null mice. Biological Psychiatry. 67 (7), 657-665 (2010).
