Summary
우리는 뇌 조직의 전자 현미경 조사에 대 한 새로운 워크플로 소개합니다. 메서드를 사용 하면 편견된 패션에 신경 기능 검사를 수 있습니다. 원소 분석, 우리는 또한 automatizes 대부분의 무작위 샘플링에 대 한 워크플로 스크립트 제시.
Abstract
전자 현미경 검사 법으로 신경 및 그들의 시 냅 스의 ultrastructural 기능에 대 한 조사만 있습니다. 특히 밀도 변화의 비교 연구와 같은 특징의 배포판에 대 한 편견된 샘플링 프로토콜 신뢰할 수 있는 결과 대 한 생명 이다. 여기, 우리는 뇌 샘플 이미지 수집에 대 한 워크플로 제시. 워크플로 정의 된 뇌 영역 내에서 체계적인 획 일 한 무작위 샘플링을 허용 하 고는 disector를 사용 하 여 이미지를 분석할 수 있습니다. 이 기술은 직렬 섹션의 광범위 한 검사 보다 훨씬 빠릅니다 하지만 여전히 밀도 그리고 열 대권 외의 특징의 분포를 추정 하는 가능한 접근을 선물 한다. 포함, 전에 얼룩진된 vibratome 섹션 두뇌 지역 조사, 전체 견본 준비는 도움이 속도 처리를 식별 하는 참조로 사용 되었다. 이 이렇게 쥐의 뇌에서 여러 매개 변수를 ultrastructural에 농축 주택 환경의 효과 조사 하 고 비교 연구를 위해 사용 되었다. 워크플로의 성공적인 사용에 따라, 우리 뇌 샘플의 원소 분석을 목적으로 적응. 우리는 사용자 상호 작용의 시간 프로토콜 최적화. SerialEM 오픈 소스 소프트웨어에 대 한 스크립트를 컴파일하여 모든 시간이 많이 걸리는 단계를 자동화 원소 지도 취득의 주요 작업에 초점을 사용자를 수 있습니다. 원래 워크플로로 우리는 신뢰할 수 있는 결과 편견된 샘플링 방식에 관심을 지불.
Introduction
전자 현미경에서 그것은 종종 샘플 섹션에서 대표적인 지역 도전입니다. 우리는, 관찰자로 종종 편견 샘플의 눈에 띄는 기능에 의해 우리의 주의에 그려진 특정 지역에서 보고 잘 분산, 편견 샘플링을 방지. 샘플링 바이어스만 피할 수 있습니다 관심 영역의 전자 현미경 사진1에 결말의 동일한 기회가 되 면. 그것은 무대 중지 어디 샘플링 영역 선택 되므로 이미지를 보고 하지 않고 수동으로 현미경의 트랙볼을 누르면 예를 들어 소프트웨어 솔루션 없이 샘플링 바이어스를 피하기 위해 수 있습니다. 그러나 엄밀히 말하면, 이건 임의의 절차 때문에, 의식적으로 또는 무의식적으로, 사용자는 무대의 움직임에 영향을 가질 수 있습니다, 또한,이 샘플링 영역을 선택 하는 정교한 방법이 아니다. 무작위 샘플링 섹션의 쌍 stereology1, 섹션, 알려진된 거리 떨어져의 쌍을 필요로 하는 특정 볼륨에서 예를 들어 구조 수를 평가 하기 위해 사용 하는 경우에 특히 중요 해 집니다. 그것은 또한 수만 단일 섹션을 특정 구조2의 수를 예상 하지만이 방법을 조사 하는 경향이 더 큰 구조의 수 밀도과 대 평가 구조는 매우 작은 하지 않는 한 섹션 두께 비교입니다. 대체 방법을 직렬 섹션에서 조직의 볼륨을 재구성 하 고 따라서3원하는 데이터 얻을 수 있습니다. 그러나 이것은 매우 시간이 소모 하 고 (더 큰) 비교 연구에 대 한 실현 가능한 접근 하지.
이러한 문제를 해결 하려면 워크플로를 자동으로 울트라 얇은 섹션에서 정기적인 간격에 전자 현미경을 얻기 위해 샘플 선택 연구원 수를 개발 했습니다. 전자 현미경의 위치는 임의 편견된 샘플링을 허용. 방식은 적당 한 구조 (예를 들어 시 냅 스는 특정 neuropil 볼륨4,5에서)의 수 밀도 구조 기능 (예를 들어 폭 시 냅 스 갈라진 틈의 크기를 결정 하기 위한 두 또는 postsynaptic 밀도4,5의 직경).
워크플로 샘플링 (RPS) 소프트웨어 (우리의 현미경와 함께 제공 되는 스크립팅 소프트웨어를 사용 하 여 자바 스크립트에서 작성 된) 울트라 얇은 섹션의 미리 정의 된 영역 내에서 격자 위치를 자동으로 계산 하는 주문 품 임의의 포인트를 사용 합니다. RPS 소프트웨어 전자 현미경 사진 각 지점에서 만들 수 있도록 이러한 미리 정의 된 포인트, 전자 현미경의 스테이지를 이동 합니다. 먼저, 사용자는 얇은 섹션 내에서 관심 영역을 정의합니다. 다음, RPS 소프트웨어는이 지역 내의 격자 위치를 계산합니다. X / y 좌표는 첫 번째 위치 무작위로, 생성 되 고 나머지 위치 일반 그리드 간격 첫 번째 위치에 배치 됩니다. 관심 영역의 모든 부분 검사를 받고 동일한 기회를가지고, 때문에 최소한의 데이터 수집을 수 있습니다. 샘플링의이 이렇게 체계적인 획 일 한 무작위 샘플링 라고도 (참조 대 한 자세한 내용은6,7 참조).
구조의 숫자 밀도 결정, 우리는 알려진된 거리 떨어져의 쌍 작동 합니다. 미리 결정 된 위치 중 하나에서 첫 번째 섹션에서 전자 현미경 사진 후, 가장 직렬 섹션 소프트웨어 (우리의 전자 현미경과 함께 제공 된 소프트웨어 패키지의 일부)에 두 번째 섹션의 해당 위치로 이동 전자 현미경 사진의 해당 위치를 가져옵니다. 이것은 미리 결정 된 격자에 모든 위치에 대해 반복 됩니다. 우리의 접근 방법에는 disector는 전자 현미경8,9의 각 쌍에 있는 입자의 수를 계산 하는 데 사용 됩니다. 각 섹션8,9한 계산 프레임의 쌍을 disector에 의하여 이루어져 있다. 개체의 숫자 밀도 표시 개체를 계산 하 여 결정 되는 첫 번째 섹션 (또는 참조 섹션)에 두 번째 섹션 (또는 조회 섹션). 이 신속 하 고 효율적인 방법으로8,9에 있는 개체의 숫자 밀도 추정 수 있습니다. 또한 단일 섹션에 2 차원 구조 기능 측정 될 수 있다.
우리는이 워크플로 조건 표준 환경 (SE) 조건4,5, 주택에 비해 주택 농축된 환경 (EE)에 노출 된 쥐의 해 마에서 시 냅 스 숫자에서 차이 평가를 성공적으로 적용 그리고 또한 야생 타입 (WT) 마우스와 neuropeptide Y (NPY) 코 쥐 ultrastructural 차이 평가 하기 위해 SE 및 EE5에서 보관. 우리의 목표 보고 했다 특히 숫자 시 냅 스 밀도 같은 뉴런의 구조 기능 활성 영역 횡단면에서의 postsynaptic 밀도, 시 냅 스 갈라진 틈, 그리고 시 냅 스 소포 수의 폭의 길이 위해 신경 연결 및 활성화 다른 실험 조건 사이 변화를 평가 합니다. 또한, 우리는 특정 뇌 영역에 저장 된 neuropeptides의 양을 결정 하는 뉴런에 조밀한 코어 소포 (DCV)의 숫자 밀도에 관심이 있었다.
우리의 다음 단계에서 설명한 연구에 대 한 우리의 접근 방법의 성공에 따라 우리 인간의 두뇌 샘플 내 편견된 원소 분석에 대 한 영역을 선택 하려면 우리의 워크플로 적응 했습니다. 이 ferritin 분자 신경 그리고 glial 세포에에서 저장 되어 있는 이미지 철 위해서입니다. 이 위해, 우리 뇌 섹션 정의 된 영역에서의 임의의 심사 과정에 대 한 작업의 대부분을 자동화 하는 스크립트 컴파일.
Protocol
모든 실험 과학의 연방 내각 및 오스트리아 공화국 (BMWF-80.104/2-BrGT/2007 및 BMWF-66.010/0037-II/3b/2013)의 연구 또는 의료 대학 그라츠, 수 전 28-549의 윤리 위원회는 윤리 위원회에 의해 승인 되었다 15/16, 그리고 1986 년 11 월 24 일 (86/609/EEC)의 유럽 공동체 위원회의 지시문 및 지시문의 유럽 회의 그리고 22 September2010의 위원회의 실시 (2010/63/EU). 동물 실험 설계 되었고 사용 하는 동물의 수를 최소화 하는 방식으로 수행 됩니다.
1. 해 부 그리고 조직의 고정
- 마우스를 안락사 (21 주 이전, 여성 C57BL/6J 마우스 및 C57BL/6N 쥐; 혼합된 C57BL에 남성 WT와 NPY 코 쥐 / 6:129 / SvJ (1:1) 배경 각각) intraperitoneally 150 mg/kg pentobarbital을 주입 하 여.
- 두개골에서 두뇌를 제거 하 고 즉시 반 (왼쪽 오른쪽 반구에서 분리)-메스를 사용 하 여 그들을 잘라.
- 즉시 2% 포름알데히드와 유리 용기에 반 놓고 0.1 M cacodylate에서 2.5%도 버퍼 (채널3)2아소2Na·3H2O, pH 7.4 1 m를 조정 NaCl), pH 7.4 4 ° c.에
주의:는 fixatives 고 독성이 매우 세 심하게 처리 해야 합니다. 보호 장갑 및 연기 후드만 사용 합니다. - 적어도 24 h, 4 ° c.에도 같은 버퍼에 4 ° C와 린스에서 2 일 동안 뇌 반쪽을 수정 10 배로 견본 볼륨에 대 한 버퍼의 볼륨 이어야 합니다.
2. 기준 Vibratome 섹션을 비교 하 여 뇌 내 관심 영역 식별 섹션에서 마우스 뇌 아틀라스10
- 장소는 vibratome에 뇌 샘플입니다. 두뇌의 방향이 올바른지 확인 하십시오 (이 경우에, 코로나 방향 선정 되었다 해 마).
- 트림의 (수익 ROI) 두뇌 지역에이 때까지. 큰 두께에 섹션을 잘라 (예., 100 µ m)까지 관심 영역으로 두뇌의 부분에 도달 하 고 모든 섹션을 던져.
- ROI와 함께 뇌 부분의 시작 부분에 20 µ m 두께 vibratome 섹션을 잘라 유리 슬라이드에 vibratome 섹션을 시작 합니다. 그들 (Nissl 얼룩) 0.05 %thionine 아세테이트 나트륨 아세테이트 버퍼, pH 4.2 1 분 (그림 1Ai)에 섹션을 배치 하 여 얼룩.
- 가벼운 현미경을 사용 하 여 마우스 뇌 아틀라스와 스테인드 섹션을 비교 하 고 절단 및 얼룩이 지 원하는 두뇌 좌표에 도달할 때까지 계속.
3. 취득 샘플 지역 포함
- 최대한 빨리 오른쪽 영역 식별 되는 vibratome와 150 µ m 두께 절단 한 부분을 시작 합니다.
- Microdissect 스테레오 현미경 면도날으로이 vibratome 섹션. 투자 수익 주위 부분 떨어져 잘라. 섹션에는 전송 전자 현미경 (TEM) (1 x 1 m m2보다 더 큰)에 대 한 다음 준비 단계에 대 한 적당 한 크기가 있어야 합니다.
4. 가장 준비-포함, 울트라 얇은 단면 및 얼룩
- 포함
- 실 온 (RT)에서 2% 오스뮴 tetroxide 2 h에 대 한 사후 수정. 볼륨을 사용 하 여 10 배 이상 샘플 볼륨, 샘플을 커버 하지만 불필요 한 독성 폐기물을 방지 하기 위해 초과 정착 제를 사용 하지 마십시오.
주의: 오스뮴 tetroxide 매우 독성이 이며 매우 세 심하게 처리 해야 합니다. 보호 장갑 및 연기 후드만 사용 합니다. - 이전 단계 (50%, 70%, 80%, 96%, 100% 에탄올)에서 그 보다 더 큰 볼륨 그들 학년 20 분 사용의 단계에서 알콜을 사용 하 여 탈수.
- 프로필 렌 산화 프로필 렌 산화물/박 용 수 지 (1:2) RT에서 2 h와 4 ° c.에 1:3 하룻밤의 혼합물으로 실시간 장소에서 40 분에
주의: 프로필 렌 산화물은 매우 독성이 고 매우 세 심하게 처리 해야 합니다. 보호 장갑 및 연기 후드만 사용 합니다. - 60 분 후 2 번과 (45 ° C에서 모두) 90 분 후 수 지를 변경 하 여 100% 수 지에 샘플을 포함 합니다.
- 마지막으로, 샘플 적절 한 금형에 놓고 (그림 1좋아) 3 일 동안 90 ° C에서 유해 수 지를 보자.
- 실 온 (RT)에서 2% 오스뮴 tetroxide 2 h에 대 한 사후 수정. 볼륨을 사용 하 여 10 배 이상 샘플 볼륨, 샘플을 커버 하지만 불필요 한 독성 폐기물을 방지 하기 위해 초과 정착 제를 사용 하지 마십시오.
- 트리밍 그리고 단면화는 ultramicrotome에.
- 양쪽은 서로 (그림 1Aiii)에 섹션에 대 한 가능한 부드러운 블록을 잘라.
- 생산 55 nm 초박형 직렬 섹션 (되어야 실버 회색)는 ultramicrotome를 사용 합니다. 슬롯 그리드를 사용 하 여 (슬롯 너비 1 x 2 m m) pioloform (그림 1Aiv) 코팅.
- 30 분 및 30에 대 한 리드 시트르산 2 %uranyl 아세테이트를 사용 하 여 슬롯 격자에 울트라 얇은 섹션 counterstain (이것은 표준 전자 현미경 검사 법 방법11) RT에서 s.
주의: Uranyl 아세테이트 매우 독성 하 고 어떤 직접적인 접촉을 피해 야 한다. 보호 장갑 만으로 처리 합니다. 리드 질산염은 유해 삼 킨 경우 또는 흡입 매우 세 심하게 처리 해야 합니다.
5. 가장 소프트웨어 패키지에 참조에 해당 ROIs 및 조회의 이미징
- 검토 격자 섹션 (섹션의 크기)에 따라서 낮은 확대를 사용 하 여 가장와 방향에 대 한 섹션의 품질을 평가 하.
- 섹션의 꼭지점을 저장 하 여 섹션의 가상 이미지를 생성 하 (현미경으로 제공 하는 가장 이미지 분석 소프트웨어, 또는 티아, 패키지) 소프트웨어를 시작 합니다. 그 소프트웨어를를 각 섹션에 투자 수익의 해당 위치를 찾을 수 있습니다.
- 섹션 에 고 참조 및 조회 섹션에 대 한 꼭지점을 추가 하려면 삽입 을 선택 하십시오. 팝업 창의 지시를 따릅니다. 참조 섹션 시작 하 고 조회 섹션을 계속. 포인트 1과 2그림 1(Bi) 병렬 다음 섹션에는 섹션의 가장자리는 입력 다는 것을 확인 하십시오.
- 관심 영역을 식별 하 고 투자 수익에 대 한 개요를 만드는 데 투자 수익의 다중 모퉁이점을 참조 섹션에 티아를 사용 하 여 현미경 단계 이동 낮은 확대 아래 참조 섹션을 시각화.
- RPS 소프트웨어를 사용 하 여 결과 다각형의 좌표를 기록 합니다. 이 대 한 투자 수익 (그림 1Bii) 섹션에서 설명 하는 데 필요한 다각형의 각 시점에서 RPS 소프트웨어의 대화 상자에서 추가 좌표 를 누릅니다.
- 정의 하 고 RPS 소프트웨어에 영역 사이의 샘플링 지역과 거리에 대 한 적당 한 크기를 입력 (제시 연구에서 샘플링 영역의 크기 7 µ m 이며 그들 사이의 거리는 20 µ m, 20 샘플링 일대에 결과 투자 수익)입니다. 보도 계산 래스터, 다음 소프트웨어 방식 체계적인 균일 한 임의의 다각형 (그림 1Biii) 내의 현미경 사진의 위치에 대 한 샘플링 영역 좌표를 생성합니다.
참고: 더 나은 방향에 대 한 다각형, 다각형 내 샘플링 영역과 표시할 수 있습니다 RPS 소프트웨어 (그림 1Biv)에 의해.
- RPS 소프트웨어 및 가장 직렬 섹션 소프트웨어를 사용 하 여 참조 및 조회 섹션에 샘플링 포인트를 저장 합니다. 이들은 montages의 좌표를 기록 후11.
- RPS 소프트웨어에서 x 현미경 단계를 이동 하려면 다음 위치로 이동 하는 것을 눌러 각각의 y 좌표 참조 섹션에서 영역을 샘플링 /. 위치 및 삽입 참조 섹션에서 소프트웨어에서 이러한 좌표를 가져오기로 이동 합니다. 모든 좌표에 대해 이것을 반복 합니다.
- 조회 섹션에 참조 섹션에서 좌표를 미러링하려면 섹션 으로 이동 하 누르고 섹션으로 이동. 대화 창에서 조회 섹션 (보통 ' 2')의 번호를 입력 합니다.
- (다음 단계 참조) 몽타주의 기록에 대 한 전에 설명한 대로 참조 및 조회 섹션 사이 전환 하 고 위치 와 번호 이동참조 섹션에서 위치를 변경 합니다. 대화 창에서 다음 좌표를 선택 합니다.
- SerialEM montages 각 샘플링에 대 한 조정 하 고 파일 을 이동 드롭 다운 메뉴에서 새 몽타주 를 선택 합니다. 대화 창에서 타일의 오른쪽 번호와 중복의 비율을 선택 합니다. 현재에 대 한 연구, 5000 X의 확대는 연구, 하지만 2 x 2 이미지의 몽타주를 만드는 데 필요한 CCD 카메라의 제한 된 시야에서 시 냅 스 기능을 인식 하기에 충분. 몽타주는 SerialEM와 함께 만들어집니다.
- 각 몽타주를 기록 하기 전에 초점을 재조정 하거나, 만약에 가능 하다 면, 레코딩 소프트웨어에서 자동 옵션을 활성화. 몽타주 파일을 저장 하 고 SerialEM에서 왼쪽에 몽타주 하위 메뉴에서 시작 을 누르면 몽타주의 녹음을 시작 하는 폴더를 선택 하십시오.
6. 문서 Ultrastructural 기능에 ImageJ 가장 이미지 분석.
참고:이 위해, 중요 하다 및 조회 섹션에서 정렬된 이미지 스택을 만들.
- 스택 파일에 ImageJ 스택에 이미지 이미지 쌍을 변환 하 고 StackReg (큰 EPFL 현재의 경우 부등 각 은 알고리즘에에서 http://sites.imagej.net/BIG-EPFL/;에서에서 설치 되는 이미지를 정렬 사용). 세포 구조 기능의 숫자 밀도를, 주문 품 ImageJ 매크로 Disector 임의의 각도와 이미지 위에 무작위로 배치 5.5 µ m x 5.5의 크기 계산 프레임을 생성 합니다.
- 매크로 Disector 를 시작 ( ImageJ 메뉴에 위치 저장 위치 디렉터리에 따라 다릅니다) 필요한 (그림 1Cii)로 매개 변수 (세그먼트의 숫자 계산 프레임의 크기)를 정의 하 고.
- Disector를 사용 하 여 시 냅 스 / µ m2 의 수를 계산 합니다. 참조 섹션에 표시 하지만 조회 섹션에 표시 되지 않는 계산 내 모든 시 냅 스를 계산 합니다. 두 개의 '금지 선' disector;의 교차 하는 그 시 냅 스를 생략 하지만 반대 '합격 선'에 시 냅 스를 포함지 않습니다. 이 위해 ImageJ (그림 2A, 그림 2B)에서 Toolsbar 에 위치한 멀티 도구 를 사용 합니다.
- 냅 파라미터 측정에 대 한 시 냅 스 갈라진 크로스 섹션 (참조 섹션에, 사용 되는 disector 같은 이미지 프레임 이내)에 시 냅 스 선택 합니다.
- 플러그인을 통해 드롭-다운 메뉴 (그림 2A)에서 플러그인 ObjectJ ImageJ에서 시작 | 분석. ObjectJ 드롭 다운 대화 상자에서 새 프로젝트를 엽니다. 마커 도구 (그림 2B, 빨간색 원) 개요 및 마크 구조를 사용자를 수 있는 창이 열립니다. 여기에 제시 된 실험을 위해 사용 하는 시 냅 스 매개 변수는 다음 단계에 설명 되어 있습니다.
- 마커 도구 (그림 2B, 빨간색 동그라미)를 사용 하 여 구조를 따라 선을 그려 연 접 막의 길이 및 postsynaptic 밀도 길이 측정 합니다.
- 모두 똑바로 병렬 측면과 두 막 등거리 세그먼트 선 미드웨이와 사전 및 postsynaptic 막 다루는 다각형을 그려서 시 냅 스 갈라진 틈의 평균 너비를 얻을.
- 도킹 된 소포 수 결정, 모든 소포는 연 접 막 한 소포 직경의 또는 더 적은에서 최대 거리를 계산 합니다.
- 고정된 소포 수를 결정 한 소포 직경 동일한 시 냅 스에서 도킹 또는 다른 고정된 소포에서의 최대 거리와 그 소포는 포함.
7. 생산 반 얇은 섹션 문서 거시적인 기능에 가벼운 현미경 검사 법 (현재의 경우 휴대폰 번호)에 같은 투자 수익 내 선택으로 가장 조사에 대 한.
- 가장에 대 한 매우 얇은 섹션을 절단, 직후 두 반 얇은 섹션, 0.5 µ m 두께 서로 인접 한 컷. 유리 슬라이드에 놓고 얼룩 0.5% 톨루이 블루 솔루션을 사용 하 여. (와 매체를 장착, distyrene, 가소제 (tricresyl 인산 염), 크 실 렌의 구성 된 DPX) 섹션에 커버 슬립을 놓습니다. 이 두 섹션 셀 숫자를 계산 하는 데 사용 됩니다.
- 가벼운 현미경을 사용 하 여 낮은 배율에 반 얇은 섹션 사진.
참고: 조사 구조 이미지에서 식별 해야 합니다. 현재 연구에서 20 배 확대 셀 시체를 식별 하기 위해 사용 되었다. 필요한 경우, 여러 개의 이미지는 이미지 프로세싱 소프트웨어와 함께 바느질 될 수 있다. - 이미지 프로세싱 소프트웨어와 함께 두 개의 연속 반 얇은 섹션의 쌍을 정렬 (예., ImageJ).
참고: 회전 및 크기 (압축 인공 물 단면 프로세스 도입으로 인해 발생할 수 있습니다)의 차이 두 섹션의 완벽 한 오버레이 대 한 조정 되어야 한다. - 가벼운 현미경 이미지에 ROI의 테두리를 표시 합니다. 투자 수익 투자 수익 가장 이미지 사용에 일치 해야 합니다. 이 위해 ImageJ 로 이미지를 로드 하 고 Toolsbar (그림 2A)에서 다각형 선택을 선택 합니다.
- 분석을 열어 ImageJ를 사용 하 여 전체 이미지에 그리드를 생성 | 도구 | 표 필요에 따라 매개 변수를 설정 하 고.
- 계산 영역 및 관심과 두께의 영역 내에서 격자 점의 수에서 다각형의 볼륨 (볼륨 NCS = * GS * hST ; NCS = 크로스 계산 섹션; GS = 격자 크기; h세인트 섹션 두께 =).
- 만약 그들이 한 부분에만 하 게 존재 하는 투자 수익 내 신경 셀 시체에서 핵의 수를 계산 하 고 ImageJ 는 Toolsbar에서 멀티 도구 를 선택 하 고 셀을 표시 합니다. 각 섹션의 셀을 계산 후 볼륨 당 세포의 수를 계산 (
; C밀도 = 셀 밀도; C수 세포 수 =). - 모든 측정 ObjectJ 결과 창 (그림 2C)에서 기록 합니다. 수출 하 고 추가 사용 하기 위해 그들을 저장 합니다.
; C밀도 = 셀 밀도; C수 세포 수 =).8. DigitalMicrograph (DM, 이미지 필터와 함께 제공)와 함께에서 뇌 샘플에서 SerialEM 스크립트 최적화 요소 분석을 사용 합니다.
- 필터 (GIF) 이미지의 조정.
- 편으로 샘플을 로드 하 고 이동 GIF 튜닝에 대 한 샘플에 구멍을 사용 하 여 트랙볼 또는 현미경의 조이스틱.
- DM 소프트웨어 또는 DM 에 에너지 필터링 편 (EFTEM)로 전환 하 고 DM에 CCD 카메라를 선택 합니다.
- 원소 분석에 대 한 확대를 선택 (배율 구조/관심 분야에 따라, 현재의 경우에는 확대 되어 76 k에서 최대 125 k). 0.001 s와 시작 보기노출 시간을 설정 합니다.
- 가장자리 볼 수 있는 중심 이미지에서 빔까지 신중 하 게 빔이 집중. 조리개의 가장자리는 표시 되 고 광선 빔 위한 트랙볼을 센터까지 C2/는 객관적인 조리개를 줄일 수 있습니다.
- 빔을 defocus (C2 주위 46.2%, 튜닝에 대 한 노출 시간 0.05 주위 되어야 s) ZLP 버튼을 눌러 0 손실 피크 (ZLP)을 찾을. 전체 조정 버튼을 누르면 튜닝 절차를 시작 합니다.
- 인수의 임의의 포인트를 얻을.
- 가장 모드를 이미징 다시 전환 카메라 를 선택 하 고 배율 10 k에 초점을 확인 (z 축 조정 및 defocus 0으로 설정).
- 카메라 끼워져 있지 않으면 LM 75 X 확대 및 체크 선택 (그렇지 않으면 그것은 제어할 수 없는 SerialEM 소프트웨어에 의해).
- SerialEM를 시작 하 고 새 프로젝트를 엽니다.
- 탐색기를 엽니다. (대 한 보기 및 기록) 카메라 카메라 & 스크립트 컨트롤에 대 한 설정을 확인 하 고 보기 시작 (카메라는 자동으로 삽입 됩니다).
- 울트라 얇은 섹션의 지도, 네비게이터 창에 포인트를 추가 선택 코너를 확인 하십시오.
- 울트라 얇은 섹션의 가장자리에서 꼭지점을 설정 합니다. 오른쪽 마우스 키를 눌러 스테이지 모퉁이점을 이동 합니다. 섹션의 코너에 도달 하면 왼쪽 마우스 클릭으로 모퉁이점을 추가 합니다. 3 더 많은 꼭지점을 추가 하는 절차를 반복 합니다. 탐색기 창에서 코너 포인트 상자 C 가 저장 포인트 났는 다는 것을 확인 하십시오.
- 시작 하려면 코너 몽 타 쥬 (확대 LM 75 바람직합니다), SerialEM 메뉴 모음에서 탐색기 로 이동 하 고 드롭 다운 메뉴에서 Montaging & 격자 및 설치 코너 몽 타 쥬 를 선택 합니다.
참고: 최고의 피팅 선택한 레코드 매개 변수에 대 한 설정이 표시 됩니다. 필요 하다 면 그들을 변경 합니다. 현재의 경우에만 중복 비율 20%로 변경 되었습니다.
- 몽타주 이미지 섹션/투자 수익을 설명 합니다. 탐색기 창에 추가 다각형 을 선택 하 고 윤곽을 여러 번 클릭 오른쪽-마우스-섹션. 탐색기 메뉴에서 포인트의 추가 그리드 를 선택 하 고 (거리에 따라 달라 집니다 실험 질문; 포인트 사이의 거리를 정의 예., 10 µ m, 그림 3).
- 스크립트 명령에 따라. 탐색기에서와 같이 격자 점의 수를 입력 하 고 획득 포인트의 번호를 입력 (예., 20).
- 스크립트 그리드 바 피할 수 있도록 조명 임계값을 설정 합니다. 스크립트 명령에 따라 하 고 수동으로 그리드 바 1 분기 하 여 보기의 필드를 커버 하는 무대를 이동 합니다. 표시 된 값에 따라 (는 표시 되는 값 보다 클 수) 임계값 조명 값을 입력 합니다.
- 수집에 대 한 포인트를 선택 하 고 요리 루틴 완료 때까지 기다리십시오.
참고:이 오랜 시간 고 수 해 하룻밤; 스크립트; 요리 루틴을 완료 한 후 대기로 현미경을 보냅니다. 요리 루틴은 전자 빔에 섹션을 안정화 해야 합니다.
- 에너지 편 (EFTEM) 원소 분석 필터링
- TIA/DM 에 EFTEM 모드를 선택 하 고 DM에 CCD 카메라 를 선택 합니다.
- 센터는 빔 하 고 무대 각 샘플링 좌표를 이동 하는 스크립트 명령을 따르십시오.
참고: 사용자 표시 됩니다 무대 다음 좌표를 이동 한다. - 0 손실 피크 (ZLP) 하며 C2 ~ 46.2%로 설정 됩니다.
- 60 eV 에너지 설정 (이 경우, 값은 설정 Fe M 가장자리의 검출에 대 한), 0.4 s. 삽입에 10 eV 및 노출 시간에 슬릿 슬릿과 C2 ~ 43.9%로 설정.
- 보기 시작 하 고 이미지를 초점.
- 46.2 %c 2 를 설정 하 고 정렬 ZLP 43.9%로 다시 C2 를 설정 합니다.
- 원소 특정 설정으로 원소 지도 획득 합니다.
참고: 기본 설정 인수 대화 상자에서 사용할 수 있습니다 하지만이 미리 테스트 하는 것이 좋습니다 만약에 가능 하다 면; 예를 들어 필터링 된 이미지는 그림 4에 나와 있습니다. - C2 46.2%로 설정 하 고 두께 지도 확보.
- 모든 결정된 수집 포인트 (단계 8.3.2-8.3.12)에 대 한 반복 합니다.
- 스크립트의 지시에 따라 그리고 단일 전자 현미경 또는 획득 포인트의 몽타주. 모든 (울트라-) 구조 정보 표시/식별 되도록 배율을 선택 합니다.
- 로그 파일, 탐색기 창과 결과 저장 하 고 슬릿을 제거.
- 밸브를 닫습니다, 그리고 샘플을 제거 하 고는 편 종료.
Representative Results
여기, 우리 자동이 고 공평한 방법으로 가장에 대 한 영역을 선택 하는 워크플로 설명 합니다. 사용자는 가장 아래 울트라 얇은 섹션 내에서 관심 영역을 선택 하 고 우리의 RPS 소프트웨어를 자동으로 계산 하는 영역 내에 20 샘플링 영역의 좌표를 포함 하 여 워크플로에 대 한 몇 가지 소프트웨어 솔루션을 사용 하 여 관심입니다. 그런 다음 가장 단계는 사진에 대 한 각 샘플링 영역으로 이동 됩니다. 이것은 가능한 모두 단일 섹션을 분석 하기 위한 분석을 위한 섹션, 알려진된 거리 떨어져, 수 사관의 편견 없이 이미징 영역 선택 수의 쌍 이다.
마우스 뇌 섹션4,5ultrastructural 기능을 작성할 때이 워크플로 귀중 한 입증 했다. 이러한 연구에서 변이 세포 층 (DGpl)가 뇌의 관심의 영역으로 시험 되었다. 우리의 방법 입증 등 DG (Bregma −1.3)의 코로나 섹션 울트라 얇은 섹션에 맞는 그것의 윤곽선은 쉽게 낮은 확대율에서 인식 때문에 DG, 검사에 적합. 만약 다른 뇌 영역 검사 했다, 그들의 크기 및 실험을 계획 하기 전에 기능을 구별 하는 중요 한 것입니다.
여기서 설명 하는 워크플로 적용 EE 주택 크게 DGpl4, 표준 주택 조건에 시 냅 스 갈라진 틈의 폭을 증가 했다. 또한, 고밀도 코어 소포 수 EE 지 내게 동물4, neuropeptides의 가정에 변화를 나타내는 크게 감소 했다. WT와 NPY 녹아웃 쥐 EE 조건 하에서 유지 했다 때 SE 주택5점에서 DCV의 밀도가 감소 하는 동안 신경/µm³에는 DGpl의 수 증가. 반면에, NPY 녹아웃 주택 조건5의 독립적인 예약 풀 (고정된 시 냅 스 소포)에서 시 냅 스 소포의 상당한 증가 귀착되는. 시 냅 스 갈라진 틈의 폭에 EE의 효과 EE 보관 WT와 NPY 코 쥐5사이 상당한 차이가 결과 NPY 코 그룹에 반전 했다. WT와 NPY의 행동 연구에 함께 찍은 녹아웃 동물 개최 두 가지 유형의 주택 조건에서이 EE5neurobiological 효과 NPY의 중요 한 역할을 나타냅니다.
인간의 두뇌에 저장 된 철, 시각화에 대 한 스크립트 SerialEM 소프트웨어를 임의로 선택 하는 에너지를 얻기의 목적으로 전체 ultrathin 섹션 내에서 수집의 포인트 필터링이 점의 각각에 전자 현미경 사진에 대 한 컴파일된 . 전자 현미경에는 섹션을 로드 한 후 스크립트 수행 섹션의 안정화 (즉., ' 표본 요리 ' 루틴) 하룻밤. 스크립트 다음 무작위로 선정 되어 포인트 격자 그림 3에서 표시에서 사용자는 미리 정의 된 수 있습니다. 생산 테스트 현미경 사진의 회색 레벨을 검사 함으로써 스크립트 선택한 포인트 포인트 그리드 바에 착륙 거부 섹션의 보이는 부분에 있는 경우 확인 합니다. 대부분의 워크플로 사용자의 최소한의 상호 작용으로 스크립트에 의해 처리 되었습니다. 그러나, 그것은 불가능 했다 자동으로 기록 (이 설치)와 에너지 필터링 현미경 거기 SerialEM의 자동 초점 루틴에 대 한 너무 작은 빛을 했다. 따라서, 우리는 전환 DM 소프트웨어 스크립트, 초점을 조정 하 고 철의 EFTEM 이미지를 만든 각 지점에 무대를 이동 했다. 사후 인간의 두뇌에서 EFTEM 철 이미지에 대 한 예는 그림 4에 표시 됩니다.
그림 1. 워크플로 그림. (A) 시료 준비의 주요 단계 (화살표 방향)에 표시 됩니다: vibratome 섹션 (i), embedding(ii), 얇은 반 및 초박형 섹션 (iii), 절단 및 구리 격자 (iv)에 울트라 얇은 섹션의 쌍 잡기. (B) 녹음 사이트를 결정 하는 샘플링 영역 좌표를 만들려고 현미경 공급 업체의 소프트웨어와 주문 품 RPS 소프트웨어의 사용입니다. 섹션의 모퉁이점 현미경 소프트웨어에 저장 되 고 투자 수익 (세미 얇은 섹션의 도움으로 확인) 설명 하는 (i); 그리드 영역을 샘플링의 투자 수익을 통해 생성, 무작위 변화 (빨간색 화살표) x에 도입 및 y. 아무 변화는 검은 사각형 대신 임의로 이동, 파란색 사각형 기록 사이트 (ii);를 결정 하기 위해 사용 (검은 화살표), 샘플링 영역 사이의 거리 보다 작은입니다. (검은색과 파란색 사각형으로 그려) 투자 수익의 테두리 내에서 샘플링 영역만 녹화에 사용 됩니다. 현미경 사진 참조 섹션 (검은 사각형)와 조회 섹션 (파란색 사각형)에서 해당 위치에 만들어집니다 (iii). (C)는 현미경 사진에 충분 한 확대;에서 각 샘플링 영역에서 이루어집니다. (이 경우에는 2 x 2 이미지 함께 합병 되었다)에서 필요한 경우 여러 병합 된 이미지의 구성 된 몽타주 이루어집니다 (i); 계산 프레임 생성 되 고 이미지에서 오버레이로 표시, 아니라 그는 '금 단의 선' (단단한 프레임 라인)에 구조는 내 '합격 선' (점선된 프레임 라인)에 계산 (ii). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2 . 울트라 얇은 섹션 편견 계산 프레임의 한 켤레에 ultrastructural 매개 변수를 측정. (A) 계산 하 고 세포 구조 분석 사용 ImageJ 창의 개요. 왼쪽 계산 프레임 전자 현미경 사진 오버레이 표시합니다. 오른쪽에: 드롭-다운 메뉴 (위)와 (아래); 도구 모음 ImageJ 사용자 인터페이스 (파란색 사각형) ObjectJ 개체 편집기 (녹색 사각형); 측정 도구를 선택할 수 있습니다 ObjectJ 도구 창 (주황색 사각형) 그리고 모든 측정 문서화는 ObjectJ 결과 창 (검은 사각형). (B)는 전자 현미경 사진 (두 섹션-화살표에 시 냅 스, 조회 섹션-화살촉에만 냅)에 표시 된 시 냅 스를 보여주는에서 세부 사항. 그 멀티-도구를 사용 하 여 표시 된 (빨간 원) ImageJ의 도구 모음 . (C) 이름 및 시 냅 스 기능 측정 매개 변수 ObjectJ 도구를 사용 하 여 정의 됩니다. 마커 도구 과 관심의 기능을 선택 하 고 개요 구조에 따라 왼쪽 마우스 클릭 하 여 이미지에 그려진. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3. 에너지 걸러진 전송 전자 현미경 검사 법에 대 한 투자 수익 내 원소 매핑 영역을 샘플링 하는 선택. SerialEM 관심 영역을 선택 하 고 일정 간격 (핑크 십자가 이미지 A와 B)에 샘플링 영역의 높은 숫자를 제안 하는 데 사용 됩니다. 스크립트 다음 무작위로 수집 (에서 이러한 미리 정의 된 좌표) 샘플링 영역을 선택합니다. 가난한 조명 샘플링 영역을 최대한 빨리 20 잘 조명된 샘플링 지역 투자 수익 내에서 선택 된 그리드 바 스크립트 중지 피하기 위해 거부 됩니다. (A) 높은 수가 가능한 샘플링 영역 다각형에 의해 제시 된 관심의 전체 영역의 개요 표시 (B) 세부의 A 무작위 선택 하기 전에 샘플링 영역을 보여주는 엑스. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 4. 원소 지도 (EFTEM) 인수의 예제입니다. (A) 밝은 필드 가장 수집 포인트 주변의 현미경 사진. 무작위로 선택 된 지역 원소 지도 가져오는 데 사용 되었다 고 검은색 사각형으로 표시 됩니다. (B) EFTEM 중 무작위로 선택 된 영역에서 창 이미지 가장자리. (C) EFTEM 후 창 이미지 같은 지역에서 만든 가장자리. (D) 같은 지역 (M-가장자리)의 철의 원소 지도. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
Discussion
여기에 제시 된 워크플로 연구원을 ultrastructural 기능 편견된 패션에 데이터를 얻을 수 있습니다. 이것은 직렬 섹션에서 볼륨 조사 보다 훨씬 적은 시간이 소요입니다. 여러 다른 응용 프로그램은이 목표를 달성 하는 데 사용 됩니다. 처음에, 우리의 주문 품 RPS 소프트웨어 (가용성에 대 한 내용은 해당 저자를 문의 하시기 바랍니다)에 대 한 사용 됩니다 샘플링 영역 좌표를 선택 하 임의 단계 변화를 소개 하. 투자 수익의 체계적인 획 일 한 무작위 샘플링 수 있습니다. 다음, 특정 구조 계산, 우리가 적응, 우리 이전 연구13,,1415 에 비해 소설 방식에서, 알려진 거리 2 연속 섹션 비교는 disector 메서드를 우리의 체계적인 획 일 한 무작위 샘플링에 대 한 주문 품 RPS 소프트웨어입니다. 이 직렬 섹션에서 전체 볼륨 3 차원 재구성에 비교 하 여 시간이 절약 됩니다. 맞춤 RPS 소프트웨어는 한 가지 유형의 워크플로 재현에 대 한 제한 요소는 현미경에 대 한 구체적으로 개발 된다. 이 특정 소프트웨어에서 대안 스크립팅 허용 하 고 다른 현미경 모델에 호환 되는 응용 프로그램 것입니다.
우리는 성공적으로 우리의 비교 연구4,5에 대 한이 접근을 사용합니다. 울트라 얇은 부분의 신경 조직, 관심 영역 설명 했다 고 사진이이 지역 내의 체계적인 획 일 한 무작위 샘플링에 의해 촬영 되었다. 그것은 관심가 이랑의 변이 레이어 영역 오히려 작은 지역 조사는 우리의 접근 방법에 대 한 도움이 될 수 있다 있다. 무작위로 배치 disector 내에서 우리 DCV의 수를 평가 하 고 성인 쥐의 DGpl에서 시 냅 스의 여러 가지 ultrastructural 기능 성인 NPY 녹아웃 마우스 대 마우스 SE와 EE 뿐만 아니라 성인 WT에 보관 합니다. 우리의 접근 방식을 사용 하 여, 수집 된 데이터 조사 매개 변수 중 일부에 변화를 보여주었다. 이러한 연구 결과 청소년 동물2다른 유사한 연구에서 사람을 확인 했다.
이 워크플로의 실험 사용의 단점은이 다중 응용 프로그램 응용 프로그램 접근 하지 이상적입니다, 사용자 편의성 측면에서 사용자 (우리의 경우, 사용자 인터페이스, 가장 직렬 섹션에서에서 다른 사용자 인터페이스와 함께 편안 하 게 필요가 있을 RPS 소프트웨어 및 SerialEM 소프트웨어). 효율적인 방법으로 모든 응용 프로그램을 처리 하기 위해 학습 시간이 소요 하 고 고려 되어야 한다. 그러나,이 워크플로 사용 하 여 학습에 시간을 투자는 여전히 명확 하 게 유리한 직렬 섹션 가장 전체 볼륨을 분석 하는 데 필요한 시간 동안. 관심 분야에서 체계적인 획 일 한 무작위 샘플링에 의해 배치 하는 disector를 사용 하 여의 방법은 섹션/볼륨의 높은 금액을 조사 하는 필요 없이 신뢰할 수 있는 데이터1 을 제시 하는 충분 한 이다.
우리의 연구 결과 최대화 하기 위해 그것은 샘플 준비 하는 동안 잘 돌 중요 한 조직과 구조 보존만 관심의 영역을 명확 하 게 식별 하는 데 뿐만 아니라 구조 기능을 평가 하기 위한 중요 하지 않습니다. 중추적인 요소, 그리고 아마도 또 다른 단점은이 방법의 초박형 섹션 쌍의 고품질 필요 하다는 것 이다: 아무 구멍 또는 주름을 조사 섹션 중 하나에서 영역을 커버 해야 하며 섹션 두께 이어야 균질 유지. 연구원은 ultramicrotomy에서 숙련 되어야 합니다. 케어 섹션 전자 빔 손상에 민감한 고 쉽게 떨어져 찢을 수 있다, 가장에 섹션을 이미징 하는 경우에 또한 있다. 또한, 그것은 투자 수익에 샘플링 영역의 오른쪽 숫자를 선택 하는 것이 중요입니다. 실험 목적에 따라 전자 현미경의 확대는 신중 하 게 설정할 수 있다. 우리의 실험에 대 한 특히, 중앙 신경에 시 냅 스를 계산 20 한 구역에 대 한 관심의 30.25 µ m2 의 영역으로는 최적의. 신뢰할 수 있는 결과 얻기 위해 문제의 (우리의 경우 시 냅 스, 시 냅 스 기능 및 DCV) 기능을 인식에서 직원을 훈련 하는 것이 좋습니다. 시 냅 스를 식별, 시 냅 스 소포 식별 해야 하며이 적어도 10의 해상도 nm. 이 위해, 5000 X의 확대 최적의 했지만 배율을 하드웨어 매개 종류와 카메라의 위치에 따라 달라 집니다 그리고 다른 현미경 및 카메라 유형에 대 한 적응 시킬 필요가 있을 것입니다 지적 하는. 그것은 또한 지적 한 가장에 대 한 응용 프로그램 특정 프로토콜에 사용 하는 다른 모델 사용자 설정에서 차이 고려해 야 하는 있다.
우리는 우리의 워크플로 적응 시킬 수 있다 신경 과학 뿐만 아니라 생물 과학 및 재료 과학의 넓은 분야에 많은 다른 응용을 위해 (해당 되는 경우에 가장 높은 해상도 필요) 체계적인 제복을 요구 하는 연구 질문 때마다 믿습니다. 무작위 샘플링 및 검사 샘플의 분석의 시간 효율적인 방법으로 요구 한다. 예를 들어 우리는 현재 인간 두뇌에 철 매장 지역화 관심이 있습니다. 이 위해, 우리 최근 우리의 워크플로, 임의로 선택 된 영역에 울트라 얇은 섹션에 원소 분석를 적응 시켰다. 워크플로에 필요한 응용 프로그램의 수를 최소화 하기 위해 우리가 있기 때문에 미리 포인트를 설정 임의의 방식으로 선택할 수 있는 무대를 이동 하도록 프로그래밍할 수 있습니다만, SerialEM 소프트웨어를 사용 하 여 적용 목적입니다. 사용자 지정된 스크립트 워크플로 전적으로 자동화의 목표와 더불어 가장 제어를 만들었습니다. 이 만족 스러운 결과 얻을 하지 않았다 필터링 된 이미징 모드에서는 autofocusing 제외 가능한 입증 했다. 우리는 따라서 초점을 위한 고 에너지 필터링 된 이미지를 얻기 위해 DM 소프트웨어 사용.
요약 하자면, 우리는 편견 방식에서 전자 현미경을 얻는 데 도움이 소프트웨어 솔루션 제시.
Disclosures
저자는 공개 없다.
Acknowledgments
오스트리아 과학 기금, FWF, 프로젝트 번호 P 29370 B27에 의해 자금
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Pentobarbital | SigmaAldrich | P3761 | |
| Formaldehyde | Merck | 1040051000 | 1kg |
| Glutardialdehyde | Science Services | E 16210 | 25%; 100ml; EM grade |
| cacodylate buffer | Merck | C4945 | 250g; Dimethylarsinic acid sodium trihydrate |
| Thionine acetate/Ceristain | Merck | 861340 | |
| acetic acid | Merck | 1000631000 | 1 L |
| Sodium hydroxide | Merck | 1064951000 | 1 kg, pellets |
| osmium tetraoxide | Science Services | E 19110 | 10x1g |
| TAAB embedding resin | Science Services | TAT001 | 500g |
| DMP-30 | Science Services | TAD024 | 100g |
| DDSA | Science Services | TAD025 | 500g |
| Uranyl acetate dihydrate | Plano GmbH | 19481 | depleted, 25g |
| Ultrastain 2 | Leica | 16707235 | Lead citrate |
| Toluidine blue solution | Agar Scientific | AGR1727 | 10g |
| Pioloform | Plano GmbH | R1275 | 10g Powder |
| Proylenoxide | SigmaAldrich | 82320-1L | 1L |
| DPX embedding medium | Plano GmbH | R1320 | embedding medium for semi-thin sections on glass slide, 50 ml |
| Vibratome, Leica VT 1000 | Leica Microsystems, Vienna, Austria | ||
| Leica Ultracut UCT, ultramicrotom | Leica Microsystems, Wetzlar, Germany | ||
| Tecnai G2 20 | FEI,Eindhoven, Netherlands | ||
| Megaview wide angle camera | Olympus Soft Imaging Solution, Münster, Germany | ||
| US 1000 digital camera | Gatan, Pleasanton, USA | ||
| TEM Imaging Analysis Software | FEI,Eindhoven, Netherlands | ||
| FEI Serial Section Software | FEI,Eindhoven, Netherlands | ||
| Fiji, ImageJ 1.52e | National Institute of Health, USA | ||
| SPSS 20.0 | SPSS Inc., Chicago, IL, USA | ||
| SerialEM | Regents of the University of Colorado | ||
| RPS (random point sampling) software 0.9a | custom-made | ||
| Disector v1.0.2 (ImageJ macro) | custom-made | ||
| EFTEMSerialEM (SerialEM script) | custom-made |
References
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