Summary
Wir stellen einen neuartige Workflow für Elektronenmikroskopie Untersuchungen von Hirngewebe. Die Methode ermöglicht dem Benutzer, neuronale Funktionen auf unvoreingenommene Weise zu prüfen. Für die Elementaranalyse präsentieren wir auch eine Skript, die meisten des Workflows für randomisierte Stichprobe automatizes.
Abstract
Untersuchungen der Ultrastrukturforschung Funktionen von Neuronen und ihre Synapsen sind nur möglich mit Elektronenmikroskopie. Vor allem für vergleichende Studien über die Änderungen in den dichten und Distributionen solcher Merkmale unbedingt eine unvoreingenommene Probenahme-Protokoll für zuverlässige Ergebnisse. Hier präsentieren wir Ihnen einen Workflow für die Bildaufnahme Gehirn Proben. Der Workflow ermöglicht einheitliche systematische Stichproben innerhalb einer definierten Gehirnregion, und die Bilder können mit einem Disector analysiert werden. Diese Technik ist wesentlich schneller als umfangreiche Prüfung der Schnittserien aber noch einen Machbaren Ansatz zur Abschätzung der dichten und Verteilungen der Ultrastruktur Features präsentiert. Vor dem Einbetten, wurden gefärbten Vibratome Abschnitte als Referenz verwendet, um die Region des Gehirns untersucht, welche geholfen beschleunigen den gesamten Probenvorbereitung verarbeiten zu identifizieren. Dieser Ansatz war für vergleichende Studien untersuchen die Wirkung der Naturbedingungen bereichert-Gehäuse auf mehrere Ultrastrukturforschung Parameter in das Gehirn der Maus verwendet. Basierend auf den erfolgreichen Einsatz des Workflows, wir es zum Zwecke der Elementaranalyse Gehirn Proben angepasst. Wir optimieren das Protokoll in Bezug auf die Zeit der Benutzer-Interaktion. Automatisieren die zeitaufwändigen Schritte durch die Erstellung eines Skripts für die open-Source-Software SerialEM hilft dem Anwender, konzentrieren sich auf das Hauptwerk der elementaren Karten zu erwerben. Wie in der ursprünglichen Workflow wir geachtet, die unvoreingenommene Stichprobenansatz um zuverlässige Ergebnisse zu garantieren.
Introduction
In der Elektronenmikroskopie ist es oft schwierig, repräsentative Regionen innerhalb der Abschnitte zu probieren. Wir sind als Beobachter oft voreingenommen, zu betrachten, bestimmte Regionen von Auffälligkeiten der Probe, um unsere Aufmerksamkeit gezogen verhindert eine gut verteilte, unvoreingenommene Auswahl. Sampling Bias kann nur vermieden werden, wenn jeder Teil der Region von Interesse die gleiche Chance, in ein Elektron Mikrograph1enden wird. Es ist möglich, Probenahme Verzerrungen ohne eine Software-Lösung, z. B. zu vermeiden, indem man den Trackball des Mikroskops manuell ohne Blick auf das Bild, um die Sample-Bereiche auswählen, wo die Etappe beendet. Aber dies ist streng genommen keine zufällige Verfahren, da bewusst oder unbewusst, der Benutzer kann einen Einfluss auf die Bewegung der Bühne haben, und darüber hinaus dies keine anspruchsvolle Art ist der Auswahl von Sample-Bereiche. Stichproben wird besonders wichtig, wenn Paare von Abschnitten verwendet werden, um die Anzahl der Strukturen in einem bestimmten Volumen, z. B. für Stereologie1, bewerten die Paare von Abschnitten, einem bekannten Abstand erfordert. Es wäre auch möglich, nur einen einzigen Abschnitt betrachten und schätzen die Zahl der spezifischen Strukturen2, aber mit diesem Ansatz Ermittler tendenziell überschätzen die numerische Dichte der größeren Strukturen, es sei denn, die Strukturen sehr klein sind im Vergleich zu der Schnittdicke. Alternative Ansätze sind Mengen von Gewebe aus Schnittserien zu rekonstruieren und somit erhalten die gewünschten Daten3. Aber das ist sehr zeitaufwändig und keinen Machbaren Ansatz für (größere) vergleichende Studien.
Um diese Probleme zu überwinden, haben wir einen Workflow entwickelt, mit dem die Forscher Proben für den Erhalt der Elektron Mikrographen in regelmäßigen Abständen innerhalb von ultra-dünnen Abschnitten automatisch auswählen können. Die Position des Elektrons Mikrographen ist zufällig, so dass unvoreingenommene Probenahme. Das Konzept eignet sich sowohl zur Bestimmung der numerischen dichten Strukturen (z. B. Synapsen innerhalb einer bestimmten Neuropil Band4,5) und die Abmessungen der strukturellen Merkmale (z. B. die Breite der synaptischen Spalt oder den Durchmesser der postsynaptischen Dichte4,5).
Der Workflow verwendet eine maßgeschneiderte Zufallspunkt Probenahme (RPS) Software (geschrieben in Java-Script mit Scripting-Software im Lieferumfang unser Mikroskop), die Startplätze innerhalb eines vordefinierten Bereichs von Interesse in einem ultra-dünnen Abschnitt automatisch berechnet. Die RPS-Software verschiebt die Bühne des Elektronenmikroskops an diese vordefinierten Punkten, sodass ein Elektron Schliffbild an jeder Stelle erfolgen kann. Zunächst definiert der Benutzer eine Region of Interest innerhalb der Dünnschliff. Als nächstes berechnet die RPS-Software Startplätze innerhalb dieser Region. Die X / y-Koordinaten der ersten Position werden nach dem Zufallsprinzip erstellt, und die restlichen Positionen werden in regelmäßigen Raster Abständen in Bezug auf die erste Position platziert. Da jeder Teil der Region von Interesse die gleiche Chance geprüft wird hat, können minimale Datenerhebung. Dieser Ansatz der Probenahme nennt man auch systematische einheitliche Stichproben (siehe Referenzen6,7 für weitere Details).
Für die Ermittlung der numerischen dichten Strukturen, arbeiten wir mit Paaren aus Abschnitten, die einem bekannten Abstand voneinander entfernt sind. Bewegt sich nach Erhalt eines Elektrons Schliffbild aus dem ersten Abschnitt in eine der vorgegebenen Positionen, TEM serielle Abschnitt Software (Teil des Softwarepakets unser Elektronenmikroskop im Lieferumfang) auf den entsprechenden Punkt im zweiten Abschnitt, um erhalten Sie ein Elektron Schliffbild des entsprechenden Standortes. Dies wird für jeden Standort im vorgegebenen Raster wiederholt. In unserem Ansatz wird ein Disector verwendet, um die Anzahl der Partikel in jedem Paar von Elektronen Mikrographen8,9. Ein Disector besteht aus einem Paar von zählen der Frames, eine für jeden Abschnitt8,9. Die numerische Dichte Objekte richtet sich nach nur zählen von Objekten sichtbar auf dem ersten Abschnitt (oder Referenz) aber nicht auf den zweiten Abschnitt (oder Lookup). Dies ermöglicht, um die numerischen dichten von Objekten in einer schnellen und effizienten Weg8,9zu schätzen. Zusätzlich können einzelne Abschnitte, zweidimensionalen strukturellen Merkmale gemessen werden.
Wir haben diesen Workflow erfolgreich um Unterschiede in der Synapse Zahlen im Hippocampus von Mäusen angereicherten Umgebung (EE) Wohnverhältnisse verglichen mit Standardumgebung (SE) Gehäuse Bedingungen4,5ausgesetzt bewerten angewendet, und auch die Ultrastrukturforschung Unterschiede zwischen Wildtyp (WT) Mäuse und Neuropeptid Y (NPY) KO-Mäusen unter SE und EE5gehalten zu bewerten. Unser Ziel war es, speziell Strukturmerkmale von Neuronen, wie die numerische synaptische Dichte, die Längen von der aktiven Zone in Querschnitten und der postsynaptischen Dichte, die Breite der synaptischen Spalt und die Anzahl der synaptischen Vesikel betrachten, um Änderungen in neuronale Konnektivität und Aktivierung zwischen den verschiedenen experimentellen Bedingungen zu beurteilen. Darüber hinaus waren wir interessiert die numerische Dichte von dichten Kern Vesikeln (DCV) in den Neuronen, die Menge des gespeicherten Neuropeptide in einem bestimmten Bereich des Gehirns bestimmen.
Basierend auf dem Erfolg unseres Ansatzes für die Studien beschriebenen, in unseren nächsten Schritt haben wir unseren Workflow markieren Sie Bereiche für unvoreingenommene elementare Analysen im menschlichen Gehirn Proben angepasst. Dies geschah zu Bild Eisen in Ferritin-Moleküle in Neuronen und Gliazellen gespeichert. Hierzu haben wir eine Skript, das uns erlaubt, die meisten Operationen für eine zufällige Screening-Prozess des Gehirns Abschnitte in einem definierten Bereich zu automatisieren.
Protocol
Alle Experimente wurden durch eine Ethikkommission an das Bundesministerium für Wissenschaft und Forschung der Republik Österreich (BMWF-80.104/2-BrGT/2007 und BMWF-66.010/0037-II/3b/2013) oder Ethikkommission der medizinischen Universität Graz, Nummer 28-549 ex genehmigt. 15/16, und entsprechend der Richtlinie des Rates der Gemeinden vom 24. November 1986 (86/609/EWG) und der Richtlinie des Europäischen Parlaments und des Rates von 22 September2010 durchgeführt (2010/63/EU). Die Tierversuche wurden entworfen und durchgeführt in einer Weise, dass die Zahl der verwendeten Tiere minimiert wurde.
1. Präparation und Fixierung des Gewebes
- Einschläfern Mäuse (21 Wochen alten, weiblichen Mäusen C57BL/6J und C57BL/6N Mäuse; männliche WT und NPY KO Mäuse auf eine gemischte C57BL / 6:129 / SvJ (1:1) Hintergrund bzw.) durch intraperitoneale Injektion von Pentobarbital 150 mg/kg.
- Entfernen Sie die Gehirn aus dem Schädel und sofort halbieren Sie (links von der rechten Hemisphäre trennt) - mit einem Skalpell.
- Sofort legen Sie die Hälften in Glasbehältern mit 2 % Formaldehyd und 2,5 % Glutaraldehyd in 0,1 M Cacodylate-Puffer (CH3)2AsO2Na·3H2O, pH-Wert eingestellt auf 7,4 mit 1 M NaCl), pH-Wert 7,4 bei 4 ° C.
Achtung: Das Fixiermittel sind giftig und sollten mit großer Sorgfalt behandelt werden. Verwenden Sie nur mit Schutzhandschuhen und unter dem Abzug. - Beheben der Gehirnhälften für 2 Tage bei 4 ° C und Spülen in den gleichen Puffer für mindestens 24 h, auch bei 4 ° C. Das Volumen des Puffers sollten sich ungefähr um das Zehnfache Volumen der Probe befinden.
2. identifizieren Sie des Interessenbereichs im Gehirn durch den Vergleich Vibratome Abschnitte mit Referenz Abschnitte von der Maus Brain Atlas10
- Legen Sie die Gehirn-Probe auf einem Vibratome. Stellen Sie sicher, dass die Ausrichtung des Gehirns stimmt (in diesem Fall eine koronale Orientierung für den Hippocampus gewählt wurde).
- Schneiden Sie, bis die Region of Interest (ROI) im Gehirn erreicht ist. Schneiden Sie die Abschnitte bei einer großen Dicke (zB., 100 µm) bis der Teil des Gehirns mit der Region von Interesse erreicht ist und jeder Abschnitt wegwerfen.
- Beginnen Sie, schneiden die Vibratome Abschnitte mit 20 µm Dicke zu Beginn des Gehirn teils mit den ROI und die Vibratome Abschnitte auf einen Objektträger. Färben sie (Nissl Fleck) indem man die Abschnitte in 0,05 % Thionin Acetat in Natrium-Acetat-Puffer, pH 4,2 für 1 min (Abbildung 1Ai).
- Vergleichen Sie die verschmutzten Bereiche mit der Maus-Gehirn-Atlas mit einem Lichtmikroskop und weiter schneiden und färben bis zum Erreichen der gewünschten Gehirn-Koordinaten.
3. Erhalt einer Probe-Region für die Einbettung
- Als Bereich richtige erkannt wird, starten Sie schneiden einen Abschnitt bei 150 µm Dicke mit der Vibratome.
- Microdissect diesem Vibratome Abschnitt mit einer Rasierklinge unter dem Stereo-Mikroskop. Schneiden Sie die Teile um den ROI. Der Abschnitt sollte eine geeignete Größe für die folgenden Vorbereitungsschritte für die Transmissionselektronenmikroskopie (TEM) (nicht größer als 1 x 1 mm2) haben.
(4) TEM Vorbereitung - Einbettung, ultra-dünnen Schnitt und Färbung
- Einbetten von
- Post-Update für 2 h in 2 % Osmium ausgefällt bei Raumtemperatur (RT). Verwenden Sie ein Volume, um die Probe mit mindestens 10 Mal das Probenvolumen abdecken, aber vermeiden die Verwendung von überschüssigen Fixiermittel, um unnötige Giftmüll zu verhindern.
Achtung: Osmium ausgefällt ist hochgiftig und sollte mit großer Sorgfalt behandelt werden. Verwenden Sie nur mit Schutzhandschuhen und unter dem Abzug. - Entwässern Sie mit EM Grade Alkohole in Schritten von 20 min. Einsatz ein größeres Volumen als die im vorherigen Schritt (50 %, 70 %, 80 %, 96 % und 100 % Ethanol).
- Legen Sie in Propylenoxid für 40 min bei RT in eine Mischung aus Propylen Oxid/Einbettung Harz (1:2) 2 h bei RT und 1:3 Übernachtung bei 4 ° C.
Achtung: Propylenoxid ist hochgiftig und sollte mit großer Sorgfalt behandelt werden. Verwenden Sie nur mit Schutzhandschuhen und unter dem Abzug. - Betten Sie die Proben in 100 % Harz ein, indem das Harz, 2 Mal nach 60 min und einmal nach 90 min (alle bei 45 ° C).
- Zu guter Letzt die Proben in die richtigen Formen und lassen Sie das Harz bei 90 ° C für 3 Tage (Abbildung 1Aii) polymerisieren.
- Post-Update für 2 h in 2 % Osmium ausgefällt bei Raumtemperatur (RT). Verwenden Sie ein Volume, um die Probe mit mindestens 10 Mal das Probenvolumen abdecken, aber vermeiden die Verwendung von überschüssigen Fixiermittel, um unnötige Giftmüll zu verhindern.
- Trimmen und Berandungen auf ein regungsloses.
- Schneiden Sie den Block, um sicherzustellen, dass die Seiten so reibungslos wie möglich für die Abschnitte zueinander (Abbildung 1Aiii) einzuhalten sind.
- Produkte 55 nm ultra-dünnen Serienschnitte (Silber grau sein sollte) unter Verwendung einer regungsloses. Verwenden Sie ein Slot-Raster (Breite Schlitz 1 x 2 mm) mit Pioloform (Abbildung 1Aiv) beschichtet.
- Gegenfärbung ultra-dünne Abschnitte auf den Slot-Gittern mit 2 % Uranyl Acetat für 30 min und Blei Citrat für 30 s bei RT (Dies ist standard-Elektronen-Mikroskopie Methode11).
Achtung: Uranyl-Acetat ist hochgiftig und ein direkter Kontakt vermieden werden. Nur mit Schutzhandschuhen verarbeiten. Blei Nitrat ist giftig, wenn es verschluckt oder eingeatmet und mit großer Sorgfalt behandelt werden.
5. Darstellung der entsprechenden ROIs auf der Referenz und Nachschlage-Abschnitte auf TEM mit Software-Paketen
- Prüfen Sie die Abschnitte in der Startaufstellung mit dem TEM mit einer niedrigen Vergrößerung (abhängig von der Größe der Abschnitte), zur Orientierung und zur Bewertung der Qualität der Abschnitte.
- Starten Sie die Software (ein Paket von TEM Bildanalyse-Software oder TIA, mitgelieferte Mikroskop), virtuelle Bilder der Abschnitte durch speichern die Eckpunkte der Abschnitte zu generieren. Das erlaubt die Software die entsprechenden Positionen des ROI auf jedem Abschnitt zu finden.
- Gehen Sie zum Abschnitt und wählen Sie Einfügen , um die Eckpunkte für die Referenz und Look-up Abschnitt hinzuzufügen. Befolgen Sie die Anweisungen im Popup-Fenster. Beginnen Sie mit der Referenzabschnitt und fahren Sie mit Abschnitt nachschlagen. Stellen Sie sicher, dass die Kanten des Abschnitts, die parallel zum nächsten Abschnitt als Nummern 1 und 2 (Abbildung 1Bi) eingegeben werden.
- Abschnitt "Reference" unter geringer Vergrößerung des Interessenbereichs zu identifizieren und verschieben den Mikroskoptisch mit TIA auf Referenzabschnitt um mehrere Eckpunkte des ROI erstellen eine Gliederung des ROI zu visualisieren.
- Notieren Sie die Koordinaten des resultierenden Polygons mit RPS -Software. Drücken Sie dazu Hinzufügen Koordinaten in das Dialogfeld der RPS -Software an jedem Punkt des Polygons, die benötigt wird, um den ROI im Abschnitt (Abbildung 1Bii) zu skizzieren.
- Definieren und geben Sie eine geeignete Größe für die Probenahme und Abstände zwischen den Bereichen in RPS -Software (in der vorliegenden Studie ist die Größe der Stichprobe Bereiche 7 µm und die Entfernung zwischen ihnen beträgt 20 µm, wodurch mindestens 20 Probenahme Bereiche innerhalb der (ROI). Presse Raster berechnen, dann die Software generiert Probenahme Bereich Koordinaten einheitliche zufällige systematisch für das Schliffbild Positionen innerhalb des Polygons (Abbildung 1Biii).
Hinweis: Zur besseren Orientierung können das Polygon und die Probenahme Bereiche innerhalb des Polygons durch die RPS -Software (Abbildung 1Biv) angezeigt.
- Speichern Sie die Probenahmestellen auf Abschnitt Referenz und Look-up mit dem RPS -Software und TEM serielle Abschnitt Software. Dies sind die Koordinaten der Montagen sind danach11aufgenommen.
- In der RPS-Software drücken Sie gehen zur nächsten Umzug Mikroskoptisch in X / y-Koordinaten der einzelnen Stichproben Bereich im Referenzbereich. Zur Lage und legen Sie diese Koordinaten in der Software im Abschnitt Daten importieren. Wiederholen Sie diesen Vorgang für alle Koordinaten.
- Um die Koordinaten von Referenzabschnitt auf die Lookup-Abschnitt zu spiegeln, gehen Sie zum Abschnitt und drücken Sie, gehen Sie zum Abschnitt. Geben Sie die Nummer des Abschnitts Look-up (in der Regel "2") im Dialogfenster.
- Für die Aufzeichnung von den Montagen (siehe nächster Schritt), wechseln Sie zwischen Abschnitt Referenz und nachschlagen, wie zuvor beschrieben, und ändern Sie die Position auf dem Referenzabschnitt mit Standort und gehen Sie auf Nummer. Wählen Sie die nächste Koordinate im Dialogfenster.
- Koordinieren Sie für den SerialEM-Montagen bei jeder Probenahme, gehen Sie auf Datei und wählen Sie Neue Montage aus der Drop-Down-Menü. Wählen Sie die richtige Anzahl der Kacheln und den Prozentsatz der Überlappung im Dialogfenster. Für die Gegenwart zu studieren, eine Vergrößerung von 5000 X ist ausreichend, um die synaptischen Funktionen unter Studie, aber begrenzte Sichtfeld der CCD Kamera benötigt, um Montagen von 2 x 2 Bildern erkennen. Die Montagen werden mit der SerialEM gemacht.
- Passen Sie vor der Aufnahme jeder Montage den Fokus (oder, wenn möglich, aktivieren Sie die Autofokus-Option in der Aufzeichnungssoftware). Wählen Sie den Ordner der Montage-Datei speichern und starten Sie die Aufnahme der Montage durch Drücken der Taste starten Sie in das Untermenü "Montage" auf der linken Seite im SerialEM.
6. die TEM-Bilder mit ImageJ , Ultrastrukturforschung Dokumentfunktionen analysieren.
Hinweis: Hierfür ist es wichtig, ein ausgerichteten Bildstapel aus Abschnitt Referenz und Look-up zu erstellen.
- Umwandeln Sie Bildpaare mit ImageJ Bilder zum Stapel in einen Stapel-Datei und richten Sie die Bilder mit StackReg (muss vom BIG-EPFL Http://sites.imagej.net/BIG-EPFL/; im vorliegenden Fall, der Algorithmus war Affine installiert werden verwendet). Um die numerischen dichten zellulären strukturelle Merkmale zu erhalten, erzeugt das maßgeschneiderte ImageJ-Makro Disector einen Counting Rahmen mit einer Größe von 5,5 x 5,5 µm zufällig über das Bild mit einem zufälligen Winkel gelegt.
- Starten Sie das Makro Disector (Speicherort im Menü ImageJ richtet sich nach dem Verzeichnis, wo es gespeichert ist) und definieren Sie die Parameter (Größe des Rahmens zählen, Anzahl der Segmente) als benötigt (Abbildung 1Cii).
- Die Anzahl der Synapse/µm2 unter Verwendung der Disector. Zählen Sie jede Synapse Rahmen zählen, die sichtbar im Referenzbereich, aber im Abschnitt Lookup nicht sichtbar ist. Lassen Sie Weg, die Synapsen, die kreuzen sich mit den zwei "verboten Linien" von der Disector; aber zählen Synapsen auf den gegenüberliegenden "Akzeptanz-Linien". Verwenden Sie dazu die Multipoint-Werkzeug befindet sich in der Toolsbar in ImageJ (Abbildung 2A, Abbildung 2B).
- Synapse Parameter messen, wählen Sie nur die Synapsen mit einer synaptischen Spalt orientierte im Querschnitt (im Referenzabschnitt; im gleichen Bildrahmen für die Disector verwendet).
- Starten Sie das Plugin ObjectJ in ImageJ aus dem Dropdown-Menü (Abb. 2A) über Plugins | Analysieren Sie. Öffnen Sie ein neues Projekt aus dem ObjectJ Drop-Down-Dialog. Dies öffnet ein Fenster, das dem Benutzer, Gliederung und Mark Strukturen mit Marker-Tool (Abbildung 2B, roter Kreis erlaubt). Die synaptischen für die hier vorgestellten Experimente verwendeten Parameter werden in den folgenden Schritten beschrieben.
- Messen Sie die Länge der präsynaptischen Membran und postsynaptischen Dichte durch Ziehen einer Linie entlang der Struktur mit dem Marker-Tool (Abbildung 2B, roter Kreis).
- Die mittlere Breite von den synaptischen Spalt durch Zeichnen eines Polygons deckt sowohl die prä- und postsynaptischen Membran mit direkt parallelen Seiten und eine segmentierte Linie auf halbem Weg, äquidistant, beide Membranen zu erhalten.
- Zur Ermittlung der Anzahl der angedockte Vesikel, zählen Sie alle Bläschen, die eine maximale Entfernung von der präsynaptischen Membran von einem Vesikel Durchmesser oder weniger haben.
- Zur Ermittlung der Anzahl der nicht angedockte Vesikel, zählen Sie diese Vesikel mit einem maximalen Abstand von einem Vesikel Durchmesser von angedockt oder andere nicht angedockte Vesikel an der gleichen Synapse.
7. Herstellung von semi-dünne Abschnitte für Licht-Mikroskopie zur makroskopischen Dokumentfunktionen (im vorliegenden Fall die Handynummer) innerhalb der gleichen ROI ausgewählt für die TEM-Untersuchung.
- Sofort nach dem Abschneiden der ultra-dünne Abschnitte für TEM, schneiden Sie zwei semi-dünne Abschnitte, 0,5 µm dick und unmittelbar nebeneinander. Setzen Sie auf einen Glasobjektträger und färben sie mit 0,5 % Toluidin blau-Lösung. Legen Sie ein Deckglas auf den Abschnitten (mit DPX Montage Medium, bestehend aus Distyrene, Weichmacher (Tricresyl Phosphate) und Xylol). Diese beiden Abschnitte werden verwendet, um die Zelle Zahlen zählen.
- Die semi-dünne Abschnitte bei kleiner Vergrößerung mit einem Lichtmikroskop zu fotografieren.
Hinweis: Die Strukturen unter Untersuchung müssen in den Bildern erkennbar sein. In der vorliegenden Studie war 20 X Vergrößerung zum Zellkörper zu identifizieren. Bei Bedarf können mehrere Bilder zusammen mit einer Bildbearbeitungssoftware zusammengefügt werden sollen. - Richten Sie die Paare von zwei aufeinander folgenden semi-dünne Abschnitte mit Bildverarbeitungs-Software (zB., ImageJ).
Hinweis: Unterschiede der Rotation und Größe (kann durch Kompression Artefakte eingeführt durch den speziellen Prozess auftreten) sollte für eine perfekte Überlagerung der beiden Abschnitte angepasst werden. - Markieren Sie die Grenze des ROI auf der Lichtmikroskopie Bild. Der ROI entspricht der ROI für die TEM-Bilder verwendet. Laden Sie zu diesem Zweck die Bilder in ImageJ und wählen Sie die Polygonauswahl aus der Toolsbar (Abb. 2A).
- Generieren Sie ein Raster über das gesamte Bild mit ImageJ durch die Eröffnung analysieren | Werkzeuge | Raster und legen Sie die Parameter nach Bedarf.
- Berechnen Sie die Fläche und das Volumen des Polygons aus der Anzahl der Rasterpunkte im Bereich der Zins- und Abschnitt Dicke (Volumen = NCS * GS * hST ; N-CS = gezählt Cross Abschnitte; GS = Rastergröße; hST = Wandstärke).
- Die Anzahl der Kerne von neuronalen Zellkörpern innerhalb der ROI, wenn sie nur auf einem Abschnitt vorhanden sind. Die Toolsbar wählen Sie Multipoint-Tool in ImageJ aus und markieren Sie die Zellen. Nach Auszählung der Zellen in jedem Abschnitt, berechnen Sie die Anzahl der Zellen pro Volumen (
; C-Dichte = Zelldichte; CAnzahl = Anzahl der Zellen). - Notieren Sie alle Messungen im ObjectJ Fenster (Abbildung 2C). Exportieren und für die weitere Verwendung speichern.
; C-Dichte = Zelldichte; CAnzahl = Anzahl der Zellen).8. unter Verwendung SerialEM Skript zur Optimierung der Elementaranalyse in Gehirn-Muster in Kombination mit DigitalMicrograph (DM, mit bildgebenden Filter geliefert).
- Tuning von Imaging-Filter (GIF).
- Laden Sie die Probe in der TEM und gehen zu einem Loch in der Probe für die GIF-tuning mit dem Trackball oder den Joystick des Mikroskops.
- Wechseln Sie zur Energie gefiltert TEM (LUTETIUM) in DM Software und/oder DM und wählen Sie CCD-Kamera in DM.
- Wählen Sie die Vergrößerung für die Elementaranalyse (die Vergrößerung abhängig von der Struktur/Bereich von Interesse, im vorliegenden Fall ist die Vergrößerung von 76 k bis zu 125 k gesetzt). Legen Sie die Belichtungszeit auf 0,001 s und Start Ansicht.
- Konzentrieren Sie den Strahl sorgfältig, bis die Kanten zu sehen und den Balken in das Bild zu zentrieren. Reduzieren Sie C2/das Objektiv Blende, bis die Kanten der Öffnung sichtbar sind und zentrieren Sie den Strahl mit dem Trackball für den Träger.
- Defocus den Strahl (um C2 46,2 %, Belichtungszeit für tuning sollte um 0,05 s) und die Null Verlust Peak (ZLP) durch Drücken der Taste ZLP zu finden. Starten Sie den tuning Vorgang durch Drücken der Taste voll zu stimmen .
- Zufällige Punkte des Erwerbs.
- Wechseln Sie zurück zum TEM imaging-Modus und wählen Sie die Kamera und überprüfen Sie den Fokus bei Vergrößerung 10 k (z-Achse einstellen und Unschärfe auf Null gesetzt).
- Wählen Sie LM 75 X Vergrößerung und überprüfen Sie, wenn die Kamera nicht eingelegt ist (sonst es nicht kontrollierbar durch SerialEM Software).
- Starten Sie SerialEM und öffnen Sie ein neues Projekt.
- Öffnen Sie den Navigator. Überprüfen Sie die Einstellungen für die Kamera in Kamera & Skript-Steuerung (für Ansicht und Aufzeichnung) und VIEW starten (Kamera wird automatisch eingefügt).
- Machen Sie eine Ecke des Abschnitts ultraflache Karte, wählen Sie Punkte hinzufügen im Fenster "Navigator".
- Setzen Sie die Eckpunkte an den Rändern eines ultra-dünnen Abschnitts. Verschieben Sie die Phase in einen Eckpunkt, indem Sie die Maus-rechts-Taste gedrückt halten. Wenn eine Ecke des Abschnitts erreicht ist, fügen Sie einen Eckpunkt mit Klick der linken Maustaste. Wiederholen Sie den Vorgang um 3 Weitere Eckpunkte hinzuzufügen. Stellen Sie sicher, dass im Fenster "Navigator" die C -Box für Eckpunkte für die gespeicherten Punkte angekreuzt ist.
- Um die Ecke-Montage (vorzugsweise bei Vergrößerung LM 75) zu starten, finden Sie Navigator in der SerialEM-Menüleiste und wählen Sie Montaging & Gitter und Setup Ecke Montage aus dem Dropdown-Menü.
Hinweis: Die am besten passende Einstellungen für die ausgewählten Datensatz Parameter werden angezeigt. Bei Bedarf ändern. Im vorliegenden Fall war nur die Überlappung Prozentsatz auf 20 % geändert.
- Den Abschnitt/ROI auf Montage Bild zu skizzieren. Wählen Sie Polygon hinzufügen im Fenster "Navigator" und skizzieren Sie Abschnitt mit mehrere Rechte-Maus-Klicks zu. Wählen Sie Add Raster von Punkten in der Navigator-Drop-Down-Menü und legen Sie eine Entfernung zwischen den Punkten (der Abstand hängt von der experimentellen Frage; zB., 10 µm, Abbildung 3).
- Befolgen Sie die Script-Befehle. Geben Sie die Anzahl der Rasterpunkte im Navigator angezeigt und geben Sie die Anzahl der Erwerb Punkte (zB., 20).
- Festlegen Sie die Beleuchtung Schwellenwert, damit das Skript Raster Bars vermeiden kann. Folgen Sie die Script-Befehle und verschieben Sie die Phase manuell, um das Sichtfeld um ein Viertel mit einer Raster-Bar zu decken. Geben Sie den angezeigten Wert einen Schwellenwert, Beleuchtung (höher als der angezeigte Wert sein sollte).
- Warten Sie, bis die Punkte für den Erwerb ausgewählt sind und die kochende Routine beendet ist.
Hinweis: Dies dauert sehr lange und kann heute auf morgen geht; das Skript sendet das Mikroskop in Standby-Modus nach Abschluss der Kochen-Routine; die kochte-Routine ist wichtig, die Abschnitte in den Elektronenstrahl zu stabilisieren.
- Energie gefiltert TEM (LUTETIUM) Elementaranalyse
- Wählen Sie LUTETIUM -Modus in TIA/DM und CCD-Kamera in DM.
- Zentrieren Sie den Strahl und befolgen Sie die Script-Befehle, die die Bühne für jede Probenahme Koordinate verschieben möchten.
Hinweis: Der Benutzer wird gefragt, ob die Stufe auf die nächste Koordinate verschoben werden soll. - Richten Sie die Null Verlust Peak (ZLP) und C2 auf ~ 46,2 % festgelegt.
- Setzen Sie die Energie bei 60 eV (in diesem Fall ist der Wert für den Nachweis der Fe M-Kante festgelegt), geschlitzt 10 eV und Belichtung Zeit bei 0,4 S. Insert den Schlitz und C2 auf ~ 43,9 % festgelegt.
- View starten und das Bild zu konzentrieren.
- C2 auf 46,2 %, ZLP ausgerichtet und eingestellt C2 auf 43,9 % zurück.
- Erwerben Sie elementare Karte mit elementaren spezifischen Einstellungen.
Hinweis: Standard-Einstellungen können im Dialogfeld "Erwerb" verwendet werden, aber es empfiehlt sich, diese vorher zu testen wenn möglich; Beispiel, die gefilterte Bilder sind in Abbildung 4dargestellt. - C2 auf 46,2 % eingestellt und Dicke Karte zu erwerben.
- Wiederholen Sie für alle ermittelten Erwerb Punkte (Schritt 8.3.2-8.3.12).
- Folgen Sie den Anweisungen des Skripts und die einzelnen Elektron Mikrographen oder Montagen der Erwerb Punkte. Wählen Sie die Vergrößerung, damit alle (Ultra-) strukturelle Informationen sichtbar/identifizierbar ist.
- Speichern Sie LOG Datei, Navigator und Ergebnisfenster und entfernen Sie den Schlitz.
- Schließen Sie das Ventil, entfernen Sie die Probe und die TEM Herunterfahren.
Representative Results
Hier beschreiben wir einen Workflow, um einen Bereich für TEM auf automatische und unvoreingenommene Weise zu wählen. Der Benutzer wählt den gewünschten Bereich in ein ultra-dünnen Abschnitt unter der TEM und nutzt mehrere Software-Lösungen für den Workflow einschließlich unserer RPS -Software, die berechnet automatisch die Koordinaten der 20 Probenahme Bereiche innerhalb des Bereichs von Interesse. Dann bewegt sich die TEM-Bühne jedes Stichprobenraum für Fotografie. Dies ist möglich, für einzelne Abschnitte zu analysieren und für die Analyse von Paaren von Abschnitten, einem bekannten Abstand zueinander, wodurch Auswahl von Flächen für die Bildgebung ohne Voreingenommenheit des Prüfers.
Dieser Workflow als wertvoll erwiesen, wenn Ultrastrukturforschung Funktionen in Maus Gehirn Abschnitte4,5dokumentiert. In diesen Studien wurde der polymorphen Zellschicht von dentate Gyrus (DGpl) als ein Gebiet von Interesse geprüft. Unsere Methode erwies sich als geeignet für die Prüfung der DG, da ein koronaler Abschnitt der dorsalen GD (Bregma −1.3) in einen ultra-dünnen Abschnitt passt und seine Umrisse sind ohne weiteres bei kleiner Vergrößerung erkannt. Würden andere Hirnregionen untersucht werden, wäre es wichtig, ihre Größe und besondere Kennzeichen vor der Planung der Experimente zu überprüfen.
Anwendung des hier beschriebenen Workflows zeigte, dass EE Gehäuse die Breite der synaptischen Spalt in der DGpl4, in Bezug auf standard-Gehäuse Bedingungen deutlich erhöht. Darüber hinaus wurde die Anzahl der Rumpfkern Vesikel in der EE-beherbergt Tiere4, unter Angabe der Änderungen im Haushalt von Neuropeptiden deutlich verringert. Beim WT und NPY-Knockout-Mäusen unter EE Bedingungen gehalten wurden, stieg die Zahl der Neuronen/µm³ in der DGpl sank die Dichte des DCV in Bezug auf SE-Gehäuse5. Im Gegensatz dazu führte NPY Ko zu einem deutlichen Anstieg der synaptischen Vesikel in den Reserve-Pool (nicht angedockte synaptischen Vesikel) unabhängig von Bedingungen5Gehäuse. Die Wirkung von EE auf die Breite der synaptischen Spalt wurde in der NPY KO-Gruppe, die wiederum eines signifikanten Unterschied zwischen EE untergebracht WT und NPY KO Mäusen5aufgehoben. Zusammen mit Verhaltensstudien des WT und NPY Ko Tiere gehalten unter beide Arten von Mobilfunk-Sendemasten, dies bedeutet eine entscheidende Rolle von NPY für die neurobiologischen Auswirkungen von EE5.
Zur Visualisierung der Eisen im menschlichen Gehirn gespeichert, wurde ein Skript kompiliert für SerialEM Software, zufällig zu wählen, dass die Punkte des Erwerbs von innerhalb eines ganzen ultradünnen, mit dem Ziel der Erlangung einer Energiepreis Elektron Schliffbild an jedem dieser Punkte gefiltert . Nach dem Laden der Abschnitt in dem Elektronen-Mikroskop, das Script ausgeführt die Stabilisierung des Abschnitts (zB., die "Probe-kochen" Routine) über Nacht. Das Skript dann nach dem Zufallsprinzip ausgewählt, eine Reihe von Punkten, die vom Benutzer über die markierten mit einem Gitter in Abbildung 3vordefiniert. Durch die Herstellung einer Test-Schliffbild und Überprüfung der Graustufen, überprüft das Skript befänden die gewählten Punkte auf einen sichtbaren Teil des Abschnitts, Ablehnung der Punkte, die auf Raster Bars gelandet. Die meisten der Workflow wurde durch das Skript mit minimaler Interaktion des Benutzers behandelt. Jedoch war es nicht möglich Energie gefiltert Mikrographen (mit diesem Setup), automatisch zu erfassen, da gab es zu wenig Licht für den Autofokus-Routine des SerialEM. Daher haben wir auf DM Software umgestellt, sobald das Skript hatte zog die Bühne an jedem Punkt im Mittelpunkt von hand angepasst und ein LUTETIUM-Bild aus Eisen gemacht. Ein Beispiel für ein LUTETIUM Eisen Bild von Post-Mortem Gehirn ist in Abbildung 4dargestellt.
Abbildung 1. Abbildung des Workflows. (A) die wichtigsten Schritte von der Probenvorbereitung werden angezeigt (in Richtung des Pfeils): Vibratome Abschnitte (i), embedding(ii), semi-dünn und ultra-dünne Abschnitte (Iii) schneiden und fangen Paare von ultra-dünnen Abschnitten auf Kupfer Gittern (iv). (B) Nutzung der Software und maßgeschneiderte RPS-Software des Lieferanten Mikroskop Probenahme Bereich Koordinaten erstellen, die die Aufnahme Standorte zu bestimmen. Die Eckpunkte der Abschnitte sind in der Mikroskopie-Software hinterlegt und der ROI ist skizziert (identifiziert mit Hilfe der semi-dünne Abschnitte) (i); ein Raster von Bereichen Probenahme über den ROI erzeugt wird, eine zufällige Verschiebung (roter Pfeil) wird eingeführt in x und y. Die Verschiebung ist kleiner als der Abstand zwischen den Bereichen Probenahme, (schwarze Pfeile), so dass anstelle der schwarzen Quadrate, die keine Verschiebung, die blauen Quadrate, die nach dem Zufallsprinzip verschoben sind, verwendet werden, um die Aufnahme Standorte (Ii); nur Stichproben Bereiche innerhalb der Grenzen des ROI (als schwarze und blaue Quadrate gezeichnet) sind für die Aufnahme verwendet. Mikrographen erfolgt im Abschnitt "Reference" (schwarze Quadrate) und an entsprechenden Stellen im Abschnitt Lookup (blaue Quadrate) (Iii). (C) ein Schliffbild erfolgt an jedem Stichprobenraum bei ausreichender Vergrößerung; eine Montage bestehend aus mehreren zusammengeführten Bilder erfolgt bei Bedarf (in diesem Fall 2 x 2 Bilder wurden zusammengeführt) (i); Counting Rahmen erzeugt und als Overlay in der Abbildung gezeigt, Strukturen im Rahmen und auf die "Akzeptanz-Linien" (gestrichelte Rahmenlinien) gezählt werden, nicht jedoch auf die "verbotenen Linien" (aus massivem Linien) (Ii). Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 2 . Ultrastrukturforschung Messparameter auf einem Paar von ultra-dünnen Abschnitten mit einem unvoreingenommenen Counting Rahmen. (A) Überblick über die ImageJ-Fenster für zählen und Analyse zelluläre Strukturen verwendet. Linke Seite zeigt das Elektron Schliffbild mit dem zählen Rahmen als Overlay. Auf der rechten Seite: ImageJ-Benutzeroberfläche (blaues Rechteck) mit Drop-Down-Menü (oben) und die Symbolleiste (siehe unten); das ObjectJ-Objekt-Editor (grünes Rechteck); die ObjectJ Tools -Fenster (orange Rechteck) wo die Instrumente zur Messung der ausgewählt werden kann und wo die Messungen dokumentiert sind ObjectJ Ergebnisfenster (schwarzes Rechteck). (B) Detail eine deutliche Synapsen angezeigt, auf das Elektron Schliffbild (Synapsen auf beiden Abschnitten - Pfeile; Synapse nur auf die Lookup-Abschnitt-Pfeilspitzen). Diejenigen sind gekennzeichnet mit dem Multipoint-Tool (roter Kreis) aus der Symbolleiste in ImageJ. (C) die Namen und Messparameter der synaptischen Funktionen werden über die ObjectJ Toolsdefiniert. Das Marker-Tool und die Funktion von Interesse sind ausgewählt und die Umrisse gezeichnet im Bild von links-Maus-Klicks entlang der Struktur. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 3. Sampling-Bereiche für elementare Zuordnung innerhalb einer ROI für Energie gefiltert Transmissions-Elektronenmikroskopie auswählen. SerialEM wird verwendet, um eine Zielregion auswählen und eine hohe Anzahl von Stichproben Bereiche im regelmäßigen Abstand (rosa Kreuze in den Bildern A und B) vorzuschlagen. Ein Skript wählt dann nach dem Zufallsprinzip Sampling Bereiche (von diesen vorgegebenen Koordinaten) für den Erwerb. Probenahme-Gebieten mit schlechter Beleuchtung werden zur Vermeidung von Raster-Bars und das Skript beendet, sobald 20 gut beleuchteten Probenahme Bereiche innerhalb der ROI ausgewählt wurden abgelehnt. (A) Überblick über den gesamten Bereich der Interesse, dargestellt durch ein Polygon mit einer hohen Anzahl von möglich Probenahme Bereiche mit x. (B) Detail von A zeigt die Probenahme Bereiche vor zufälligen Auswahl markiert. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 4. Beispiel für elementare Karte (LUTETIUM) Erwerb. (A) Hellfeld-TEM Mikrograph der Gegend um Erwerb Punkt. Ein nach dem Zufallsprinzip ausgewählter Bereich wurde verwendet, um eine elementare Karte zu bekommen und wird von einem schwarzen Rechteck markiert. (B) LUTETIUM Pre-edge Fenster Bild gemacht in den zufällig ausgewählten Bereich. (C) LUTETIUM Post-edge Fenster Bild in der gleichen Gegend gemacht. (D) elementare Karte von Eisen des gleichen Gebietes (M-Kante). Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Discussion
Die hier vorgestellten Workflow ermöglicht den Forscher zum Abrufen von Daten auf Ultrastrukturforschung Funktionen auf unvoreingenommene Weise. Dies ist viel weniger Zeit in Anspruch als Volumen Untersuchungen von Schnittserien. Mehrere Anwendungen werden verwendet, um dieses Ziel zu erreichen. Zunächst wird unsere maßgeschneiderte RPS -Software (für Informationen über Verfügbarkeit, kontaktieren Sie bitte den entsprechenden Autor) verwendet, um einzuführen, eine zufällige Bühne-Schicht um die Probenahme Bereich Koordinaten auszuwählen. Dies ermöglicht eine einheitliche systematische Stichproben des ROI. Als nächstes für die Zählung der spezifischen Strukturen angepasst wir die Disector-Methode, wo 2 aufeinanderfolgende Abschnitte mit bekannten Abstand verglichen werden, in neuartiger Weise im Vergleich zu früheren Studien13,14,15 , wie wir es gewohnt unsere maßgeschneiderte RPS-Software für systematische einheitliche Stichproben. Das spart Zeit im Vergleich zu 3D Rekonstruktion ganze Bände von Schnittserien. Die maßgeschneiderte RPS-Software ist speziell für eine Art von Mikroskop entwickelt, die ein limitierender Faktor für die Reproduktion des Workflows ist. Eine Alternative von dieser speziellen Software wäre eine Anwendung, die erlaubt, scripting und ist kompatibel mit anderen Mikroskop-Modellen.
Wir verwendet erfolgreich diesen Ansatz für unsere Vergleichsstudien4,5. Auf ultra-dünnen Abschnitten des neuronalen Gewebes Interessenbereich wurde skizziert und Bilder wurden durch systematische einheitliche Stichproben innerhalb dieses Bereichs. Es muss darauf hingewiesen werden, dass das Gebiet von Interesse, die polymorphen Schicht der dentate Gyrus, ist ein eher kleines Gebiet zu untersuchen, die für unser Ansatz von Vorteil sein könnte. Innerhalb einer zufällig platzierte Disector wir untersuchten die Anzahl der DCV und mehrere Ultrastrukturforschung Merkmale der Synapsen in der DGpl des Erwachsenen Mäusen in SE und EE sowie Erwachsenen WT Mäuse im Vergleich zu Erwachsenen NPY-Knockout-Mäusen untergebracht. Mit unserem Ansatz, die gesammelten Daten zeigten Veränderungen in einigen der untersuchten Parameter. Diese Feststellungen bestätigt diejenigen aus anderen ähnlichen Studien in juvenile Tiere2.
Ein Nachteil der experimentellen Nutzung dieser Workflow könnte sein, dass diese multi-application-Ansatz nicht im Hinblick auf Benutzerfreundlichkeit, ideal ist, da die Benutzer benötigen, um sich bequem mit verschiedenen Benutzeroberflächen (in unserem Fall, das User-Interface, TEM serielle Abschnitt die RPS und SerialEM Software). Lernen, alle Anwendungen auf effiziente Weise zu behandeln ist zeitaufwendig und sollte Rechnung getragen werden. Allerdings ist investieren die Zeit in das Erlernen dieser Workflow verwenden noch deutlich günstiger im Laufe der Zeit die benötigt wird, um ganze Bände mit seriellen Abschnitt TEM zu analysieren. Die Methode der Verwendung eines Disector durch systematische einheitliche Stichproben in den gewünschten Bereich platziert ist ausreichend, um zuverlässige Daten1 ohne die Notwendigkeit, ein hohes Maß an Abschnitte/Volumen untersuchen zu präsentieren.
Um die Ergebnisse unserer Studien zu maximieren, war es wichtig, während der Probenvorbereitung, gut aufpassen, wie die Erhaltung der Gewebe und Strukturen nicht nur entscheidend für die Bewertung der strukturellen Merkmale, sondern auch für den Bereich eindeutig zu identifizieren. Ein entscheidender Faktor, und vielleicht ein weiterer Nachteil dieser Methode ist, dass eine hohe Qualität der ultra-dünne Abschnitte Paare erforderlich ist: Es darf keine Löcher oder Falten, die das Untersuchungsgebiet aus den Abschnitten zu decken und die Schnittdicke muss sein homogene gepflegt. Der Forscher muss gut ausgebildete in ultramicrotomy sein. Pflege muss auch getroffen werden, wenn die Abschnitte in der TEM, imaging, wie in den Abschnitten empfindlich gegenüber Elektronen Strahl Schaden sind und können leicht zerreißen. Darüber hinaus ist es wichtig, die richtige Anzahl von Stichproben Bereiche in den ROI zu wählen. Abhängig von den experimentellen Ziel muss die Vergrößerung des Elektrons Mikrographen sorgfältig eingestellt werden. Für unsere Experimente sind insbesondere zählen Synapsen im Zentralnervensystem, 20 Regionen von Interesse in einem Abschnitt mit einer Fläche von 30.25 µm2 optimal. Es wird empfohlen, das Personal gut in die Funktionen in Frage (in unserem Fall Synapsen, synaptischen Funktionen und DCV) zu erkennen, um zuverlässige Ergebnisse zu erhalten. Um die Synapsen zu identifizieren, die synaptischen Vesikel müssen erkennbar sein und dies erfordert eine Auflösung von mindestens 10 nm. Hierzu eine Vergrößerung von 5000 X war optimal, aber es muss darauf hingewiesen werden, dass die Vergrößerung abhängig von Hardware-Parameter wie die Art und Position der Kameras und für andere Mikroskop und/oder Kamera-Typen angepasst werden müssten. Es muss auch darauf hingewiesen, dass das Protokoll Anwendungen spezifisch für eine TEM verwendet und Benutzer mit anderen Modellen die Unterschiede in der Einrichtung zu berücksichtigen müssen.
Wir glauben, dass unser Workflow angepasst werden kann für viele andere Anwendungen, die nicht nur in den Neurowissenschaften, sondern in einem breiten Feld von Biologie und Materialwissenschaften (wenn die hohe Auflösung von einem TEM benötigt wird) wenn die Forschungsfrage eine systematische Uniform erfordert Stichproben und die Menge der zu untersuchenden Proben bittet um eine Zeit effiziente Methode zur Analyse. Zum Beispiel sind wir derzeit interessiert bei der Lokalisierung von Eisenspeicher im menschlichen Gehirn. Hierzu haben wir vor kurzem unseren Workflow, um elementare Analyse auf ultra-dünnen Abschnitten in zufällig ausgewählten Bereichen ermöglichen angepasst. Um die Anzahl der Anwendungen zu minimieren, die für den Workflow benötigt werden, hatten wir vor, bewerben Sie sich über die SerialEM Software nur, weil es programmiert werden kann, verschieben Sie die Phase Punkte vorzugeben, die in einer zufälligen ausgewählt werden können. Wir erstellt benutzerdefinierte Skripts zur Steuerung der TEM, mit dem Ziel, den Workflow vollständig automatisieren. Dies erwies sich als machbar, mit Ausnahme der Autofokus im gefilterten bildgebenden Modus, der nicht zu befriedigenden Ergebnissen. Wir nutzten so DM Software für die Fokussierung und für den Erhalt der Energie-gefilterte Bilder.
Zusammenfassend stellen wir Software-Lösungen, die helfen bei der Beschaffung von Elektron Mikrographen auf unvoreingenommene Weise.
Disclosures
Die Autoren haben nichts preisgeben.
Acknowledgments
Gefördert durch den Österreichischen Wissenschaftsfonds FWF, Projektnummer P 29370 B27
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Pentobarbital | SigmaAldrich | P3761 | |
| Formaldehyde | Merck | 1040051000 | 1kg |
| Glutardialdehyde | Science Services | E 16210 | 25%; 100ml; EM grade |
| cacodylate buffer | Merck | C4945 | 250g; Dimethylarsinic acid sodium trihydrate |
| Thionine acetate/Ceristain | Merck | 861340 | |
| acetic acid | Merck | 1000631000 | 1 L |
| Sodium hydroxide | Merck | 1064951000 | 1 kg, pellets |
| osmium tetraoxide | Science Services | E 19110 | 10x1g |
| TAAB embedding resin | Science Services | TAT001 | 500g |
| DMP-30 | Science Services | TAD024 | 100g |
| DDSA | Science Services | TAD025 | 500g |
| Uranyl acetate dihydrate | Plano GmbH | 19481 | depleted, 25g |
| Ultrastain 2 | Leica | 16707235 | Lead citrate |
| Toluidine blue solution | Agar Scientific | AGR1727 | 10g |
| Pioloform | Plano GmbH | R1275 | 10g Powder |
| Proylenoxide | SigmaAldrich | 82320-1L | 1L |
| DPX embedding medium | Plano GmbH | R1320 | embedding medium for semi-thin sections on glass slide, 50 ml |
| Vibratome, Leica VT 1000 | Leica Microsystems, Vienna, Austria | ||
| Leica Ultracut UCT, ultramicrotom | Leica Microsystems, Wetzlar, Germany | ||
| Tecnai G2 20 | FEI,Eindhoven, Netherlands | ||
| Megaview wide angle camera | Olympus Soft Imaging Solution, Münster, Germany | ||
| US 1000 digital camera | Gatan, Pleasanton, USA | ||
| TEM Imaging Analysis Software | FEI,Eindhoven, Netherlands | ||
| FEI Serial Section Software | FEI,Eindhoven, Netherlands | ||
| Fiji, ImageJ 1.52e | National Institute of Health, USA | ||
| SPSS 20.0 | SPSS Inc., Chicago, IL, USA | ||
| SerialEM | Regents of the University of Colorado | ||
| RPS (random point sampling) software 0.9a | custom-made | ||
| Disector v1.0.2 (ImageJ macro) | custom-made | ||
| EFTEMSerialEM (SerialEM script) | custom-made |
References
- Howard, V., Reed, M. Unbiased Stereology: Three-Dimensional Measurement in Microscopy. , BIOS Scientific Publishers. Oxford. (1998).
- Nakamura, H., Kobayashi, S., Ohashi, Y., Ando, S. Age-changes of brain synapses and synaptic plasticity in response to an enriched environment. Journal of Neuroscience Research. 56 (3), 307-315 (1999).
- Landers, M. S., Knott, G. W., Lipp, H. P., Poletaeva, I., Welker, E. Synapse formation in adult barrel cortex following naturalistic environmental enrichment. Neuroscience. 199, 143-152 (2011).
- Reichmann, F., et al. A novel unbiased counting method for the quantification of synapses in the mouse brain. Journal of Neuroscience Methods. 240, 13-21 (2015).
- Reichmann, F., et al. Environmental enrichment induces behavioural disturbances in neuropeptide Y knockout mice. Scientific Report. 6, 28182 (2016).
- Mayhew, T. M. Taking Tissue Samples from the Placenta: An Illustration of Principles and Strategies. Placenta. 29, 1-14 (2008).
- Ferguson, S., Steyer, A. M., Mayhew, T. M., Schwab, Y., Lucocq, J. M. Quantifying Golgi structure using EM: combing volume-SEM and stereology for higher throughput. Histochemistry and Cell Biology. 147, 653-669 (2017).
- Sterio, D. C. The unbiased estimation of number and sizes of arbitrary particles using the disector. Journal of Microscopy. 134 (2), 127-136 (1984).
- Gundersen, H. J., et al. The new stereological tools: disector, fractionator, nucleator and point sampled intercepts and their use in pathological research and diagnosis. APMIS. 96 (10), 857-881 (1988).
- Franklin, K. B. J., Paxinos, G. The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates. , Elsevier/Academic Press. (2008).
- Lewis, P. R., Knight, D. P. Staining Methods for Sectioned Material. , Elsevier/North-Holland Biomedical Press. (1988).
- Mastronarde, D. N. Automated electron microscope tomography using robust prediction of specimen movements. J Struct Biol. 152 (1), can be downloaded from http://bio3d.colorado.edu/SerialEM 36-51 (2005).
- Rampon, C., Tang, Y. P., Goodhouse, J., Shimizu, E., Kyin, M., Tsien, J. Z. Enrichment induces structural changes and recovery from nonspatial memory deficits in CA1 NMDAR1-knockout mice. Nature Neuroscience. 3 (3), 238-244 (2000).
- Xu, X., Ye, L., Ruan, Q. Environmental enrichment induces synaptic structural modification after transient focal cerebral ischemia in rats. Experimental Biology and Medicine. 234 (3), 296-305 (2009).
- Lonetti, G., et al. Early environmental enrichment moderates the behavioral and synaptic phenotype of MeCP2 null mice. Biological Psychiatry. 67 (7), 657-665 (2010).
