Summary
Vi introducerar ett nytt arbetsflöde för elektronmikroskopi utredningar av hjärnvävnad. Metoden tillåter användaren att undersöka neuronala funktioner på ett opartiskt sätt. För elementaranalys presenterar vi också ett skript som automatisk de flesta av arbetsflödet för randomiserade provtagning.
Abstract
Utredningar av de ultrastrukturella funktionerna av nervceller och deras synapser är endast möjligt med elektronmikroskopi. Speciellt för jämförande studier av förändringar i densiteter och fördelningar av sådana funktioner är en opartisk provtagning-protokollet avgörande betydelse för tillförlitliga resultat. Här presenterar vi ett arbetsflöde för bild förvärv av hjärnan prover. Arbetsflödet kan systematisk enhetliga slumpmässig provtagning inom en definierad hjärnregionen, och bilderna kan analyseras med hjälp en disector. Denna teknik är mycket snabbare än omfattande undersökning av seriell avsnitt men fortfarande utgör en genomförbar strategi för att uppskatta de tätheter och fördelningar av ultrastruktur funktioner. Innan inbäddning användes färgade vibratome sektioner som referens för att identifiera hjärnregionen under utredning, som hjälpte påskynda den övergripande prov förberedelsen bearbeta. Denna metod användes för jämförande studier som undersöker effekten av en berikad-Boende miljö på flera ultrastrukturella parametrar i mus hjärnan. Baserat på den framgångsrika användningen av arbetsflödet, anpassade vi den för elementaranalys av hjärnan prover. Vi har optimerat protokollet när det gäller tidpunkten för användar-interaktion. Automatisera alla tidskrävande steg genom att sammanställa ett skript för öppen källkod SerialEM hjälper användaren att fokusera på det huvudsakliga arbetet att förvärva elementärt kartor. Liksom i det ursprungliga arbetsflödet uppmärksammade vi den opartiska urvalsmetod innebär att garantera tillförlitliga resultat.
Introduction
I elektronmikroskopi är det ofta utmanande att prova representativa regioner inom avsnitten. Vi, är som observatör ofta vinklade för att titta på specifika regioner dras till vår uppmärksamhet av iögonfallande funktioner av provet, hindrar en väl fördelad, opartisk provtagning. Provtagning bias kan endast undvikas om varje del av regionen av intresse får samma chans att hamna i en elektron mikrograf1. Det är möjligt att undvika provtagning partiskhet utan en programvarulösning, till exempel genom att trycka trackball av mikroskopet manuellt utan att titta på bilden, så välj provtagning regioner där scenen slutar. Men strängt taget, detta är inte ett slumpmässigt förfarande, eftersom, medvetet eller omedvetet, användaren kan påverka rörelsen av scenen, och, dessutom, detta är inte ett sofistikerat sätt att välja provtagning regioner. Slumpmässig provtagning blir särskilt viktigt om par sektioner används för att bedöma antalet strukturer i en viss volym, till exempel för stereology1, vilket kräver par sektioner, en känd sträcka apart. Det skulle också vara möjligt att bara titta på ett avsnitt och uppskatta antalet specifika strukturer2, men med detta synsätt utredare tenderar att överskatta den numeriska tätheten av större strukturer, om strukturer är mycket små i jämförelse till snittjockleken. Alternativa metoder är att rekonstruera volymer av vävnad från seriell sektioner och därmed få önskad data3. Men detta är mycket tidskrävande och inte en genomförbar strategi för (större) jämförande studier.
För att övervinna dessa problem, har vi utvecklat ett arbetsflöde som tillåter forskare att automatiskt välja prov för att erhålla elektronmikrografier på regelbundna avstånd inom ultratunn sektioner. Placera av elektronmikrografier är slumpmässig, så att opartisk provtagning. Metoden är lämplig både för att fastställa numeriska tätheter av strukturer (till exempel synapser inom en viss neuropil volym4,5) och måtten på strukturella funktioner (exempelvis bredden på den synaptiska spalten, (eller diametern på den postsynaptiska density4,5).
Arbetsflödet använder en skräddarsydd slumpmässig punkt provtagning (RPS) programvara (skriven i Java-skript som använder skript programvara medföljer våra Mikroskop) som automatiskt beräknar rutnät ståndpunkter inom ett fördefinierat område av intresse i en ultratunn avsnitt. RPS programvaran flyttar scenen av elektronmikroskopet till dessa fördefinierade punkter, så att en elektron mikrograf kan göras vid varje punkt. Användaren definierar först, en region av intresse inom avsnittet tunn. Därefter beräknar RPS programvaran rutnät ståndpunkter inom denna region. X / y-koordinaterna för den första positionen skapas slumpmässigt, och de resterande positionerna placeras regelbundet rutnät mellanrum i avseende till den första positionen. Eftersom varje del av regionen av intresse har samma chans att granskas, tillåter detta minimal datainsamling. Denna strategi för provtagning också kallas systematisk enhetliga stickprov (se referenser6,7 för mer detaljer).
För att fastställa den numeriska täthet av strukturer, arbetar vi med par av sektioner som är en känd sträcka apart. Efter att få en elektron mikrograf från det första avsnittet i en av de förutbestämda positionerna, flyttar TEM seriell avsnitt programvara (ingår i programpaketet medföljer våra elektronmikroskop) till motsvarande punkt i det andra avsnittet, för att få en elektron mikrograf av motsvarande plats. Detta upprepas för varje plats i rutnätet förutbestämd. I vår strategi används en disector att räkna antalet partiklar i varje par elektronmikrografier8,9. En disector består av ett par counting bågar, en för varje avsnitt8,9. Numeriska tätheten av objekt bestäms genom att bara räkna objekt synliga på första avsnittet (eller referensavsnitt) men inte på andra avsnittet (eller uppslag avsnitt). Detta tillåter för att uppskatta den numeriska täthet av objekt i en snabbt och effektivt sätt8,9. Dessutom på enstaka sektioner, kan tvådimensionell strukturella egenskaper mätas.
Vi har tillämpat detta arbetsflöde framgångsrikt för att bedöma skillnader i synapsen numrerar i hippocampus av möss som utsätts för syreberikad miljö (EE) boendeförhållanden jämfört med standard miljö (SE) bostäder villkor4,5, och även att utvärdera ultrastrukturella skillnaderna mellan vildtyp (WT) möss och neuropeptid Y (NPY) KO möss hålls under SE och EE5. Vårt mål var att titta specifikt på strukturella funktioner av nervceller, såsom numeriska synaptisk densitet, längderna av den aktiva zonen i tvärsnitt och postsynaptiska tätheten, bredden på den synaptiska spalten, och antalet synaptic vesicles, för att bedöma förändringar i neuronala connectivity och aktivering mellan de olika experimentella villkor. Dessutom var vi intresserade av numeriska tätheten av tät-core blåsor (DCV) i nervceller att bestämma mängden lagrade neuropeptider i ett visst hjärnområde.
Baserat på framgången för vår strategi för de studier som beskrivs ovan, på vårt nästa steg, har vi anpassat vårt arbetsflöde för att välja områden för opartisk elementära analyser inom mänskliga hjärnan prover. Detta gjordes till bild järn, som lagras i ferritin molekyler i både neuron och gliaceller. För detta sammanställt vi ett skript som tillät oss att automatisera de flesta åtgärder för en slumpmässig screening process av hjärnan delar i ett avgränsat område.
Protocol
Alla experiment har godkänts av en etisk kommitté vid federala ministeriet för vetenskap och forskning av Republiken Österrike (BMWF-80.104/2-BrGT/2007 och BMWF-66.010/0037-II/3b/2013) eller etik kommissionen av medicinska universitetet i Graz, nummer 28-549 ex 15/16, och genomförs enligt direktivet av Europeiska gemenskaperna rådet den 24 November 1986 (86/609/EEG) och Europaparlamentets och rådets av 22 September2010 direktiv (2010/63/EU). I djurförsök utformades och utförs på ett sådant sätt att antalet djur som används var minimeras.
1. dissektion och fixering av vävnad
- Euthanize möss (21 veckor gammal, kvinnliga C57BL/6J möss och C57BL/6N möss; WT och NPY KO hanmöss på en blandad C57BL / 6:129 / SvJ (1:1) bakgrund respektive) genom att injicera 150 mg/kg pentobarbital intraperitonealt.
- Ta bort hjärnan från skallen och omedelbart halvera dem (separera vänster från höger hjärnhalva) - med en skalpell.
- Placera omedelbart halvorna i glasbehållare med 2% formaldehyd och 2,5% glutaraldehyd i 0,1 M cacodylate buffert (CH3)2AsO2Na·3H2O, pH justeras till 7,4 med 1 M NaCl), pH 7,4 vid 4 ° C.
Varning: Fixativ är giftiga och bör hanteras med stor omsorg. Använd endast med skyddshandskar och under spiskåpa. - Fixa de hjärnhalvorna i 2 dagar vid 4 ° C och skölj i samma bufferten för minst 24 h, också vid 4 ° C. Volymen av bufferten bör vara ungefär tiofalt preparatet volym.
2. identifiera regionen av intresse i hjärnan genom att jämföra Vibratome sektioner med referens avsnitt från musen Brain Atlas10
- Placera hjärnan provet på en vibratome. Säkerställa att orienteringen av hjärnan är korrekt (i detta fall en koronalt orientering valdes för hippocampus).
- Trimma tills regionen av intresse (ROI) i hjärnan är nådd. Skär i avsnitt på en stor tjocklek (t.ex., 100 µm) tills delen av hjärnan med regionen av intresse nås och kasta bort varje avsnitt.
- Börja klippa i vibratome avsnitt med 20 µm tjocklek i början å hjärnan med ROI och placera i vibratome avsnitt på en glasskiva. Färga dem (Nissl fläcken) genom att placera avsnitten i 0,05% thionine acetat i natrium acetatbuffert, pH 4,2 för 1 min (figur 1Ai).
- Jämför de färgade sektioner med musen hjärnan atlas med ett ljusmikroskop och fortsätta skära och färgning tills önskad hjärnan koordinaterna är nått.
3. få en prov Region för inbäddning
- Så snart rätt område identifieras, börja skära ett avsnitt på 150 µm tjocklek med vibratome.
- Microdissect detta vibratome avsnitt med ett rakblad i stereo Mikroskop. Skär bort delarna runt ROI. Avsnittet bör ha en lämplig storlek för de följande förberedelser för transmissionselektronmikroskopi (TEM) (inte större än 1 x 1 mm2).
4. TEM förberedelse - inbäddning, ultratunn snittning och färgning
- Bädda in
- Efter korrigering för 2 h i 2% osmium vanligtvis vid rumstemperatur (RT). Använda en volym att Täck över provet med minst 10 gånger provvolymen, men Undvik att använda överskott fixativ för att förhindra onödiga giftigt avfall.
FÖRSIKTIGHET: Osmium vanligtvis är mycket giftigt och bör hanteras med stor omsorg. Använd endast med skyddshandskar och under spiskåpa. - Torka med EM Grade alkoholer i steg om 20 min. Använd en större volym än i föregående steg (50%, 70%, 80%, 96% och 100% etanol).
- Placera i propylenoxid för 40 min på RT. plats i en blandning av propylen oxid/inbäddning harts (1:2) för 2 h på RT och 1:3 övernattning vid 4 ° C.
FÖRSIKTIGHET: Propylenoxid är mycket giftigt och bör hanteras med stor omsorg. Använd endast med skyddshandskar och under spiskåpa. - Bädda in proverna i 100% harts genom att ändra kådan 2 gånger efter 60 min och en gång efter 90 min (alla på 45 ° C).
- Slutligen, placera proverna i ordentlig formarna och låt kådan polymerisera vid 90 ° C i 3 dagar (figur 1Aii).
- Efter korrigering för 2 h i 2% osmium vanligtvis vid rumstemperatur (RT). Använda en volym att Täck över provet med minst 10 gånger provvolymen, men Undvik att använda överskott fixativ för att förhindra onödiga giftigt avfall.
- Trimning och Sectioning på en ultramicrotome.
- Trimma blocket, att säkerställa att sidorna är så smidig som möjligt för avsnitten att följa varandra (figur 1Aiii).
- Råvaror 55 nm ultra-tunn seriell avsnitt (bör silver grå) använder en ultramicrotome. Använder ett rutnät på slot (slot bredd 1 x 2 mm) belagd med pioloform (figur 1Aiv).
- Motfärg ultratunn sektioner på de slot rutnät med 2% uranyl acetat för 30 min och bly citrat för 30 s vid RT (detta är standard elektronmikroskopi metod11).
FÖRSIKTIGHET: Uranyl acetat är mycket giftigt och någon direkt kontakt bör undvikas. Hantera endast med skyddshandskar. Bly nitrat är giftigt vid förtäring eller inandning och bör hanteras med stor omsorg.
5. avbildning av motsvarande ROIs på referensen och Look-Up avsnitt om TEM med programpaket
- Undersök avsnitten på nätet med den TEM som använder en låg förstoring (beroende på storleken på avsnitten) för orientering och att utvärdera kvaliteten på avsnitten.
- Starta programvaran (ett paket med TEM bild analys programvara eller TIA, levereras med mikroskopet) att generera virtuella bilder av avsnitten genom att lagra hörnpunkter av avsnitten. Som gör att programvaran att hitta de motsvarande positionerna av ROI på varje avsnitt.
- Gå till avsnitt och välja Infoga för att lägga till hörnpunkter för avsnittet Referens och look-up. Följ instruktionerna i popupfönstret. Börja med i avsnittet och sedan fortsätta med avsnittet look-up. Se till att kanterna på avsnittet som är parallella till nästa avsnitt som punkterna 1 och 2 (figur 1Bi) anges.
- Visualisera referensavsnittet i låg förstoring att identifiera regionen av intresse och flytta Mikroskop scenen med TIA på referensavsnittet till flera hörnpunkter av ROI för att skapa en disposition av ROI.
- Spela in koordinaterna för den resulterande polygon med RPS programvara. Tryck på Lägg till koordinater i dialogrutan av RPS programvaran på varje punkt av polygonen som behövs för att beskriva ROI i avsnittet (figur 1Bii) för detta.
- Definiera och ange en lämplig storlek för provtagning områden och avstånd mellan områdena i RPS programvara (i den presenterade studien, storleken på områdena provtagning är 7 µm och avståndet mellan dem är 20 µm, vilket resulterar i minst 20 provtagning områden inom den ROI). Tryck på Beräkna Raster, då programvaran genererar provtagning området koordinater enhetliga slumpmässiga systematiskt för den mikrograf positioner inom polygonen (figur 1Biii).
Obs: För bättre orientering, polygonen och de provtagning områden inom polygonen kan visas genom RPS programvaran (figur 1Biv).
- Lagra provtagningspunkter på avsnittet Referens och look-up använder RPS programvaran och TEM seriell avsnitt programvara. Dessa är koordinaterna för montage som registreras efteråt11.
- Tryck i RPS mjukvaran, gå till nästa position att flytta Mikroskop scenen till x / y-koordinaterna för varje provtagning område i referensdelen. Gå till läge och sätt att importera dessa koordinater i programvaran i referensavsnittet. Upprepa detta för alla koordinater.
- Om du vill spegla koordinaterna från referensavsnittet till avsnittet look-up, gå till avsnitt och tryck på gå till avsnittet. Ange antalet avsnittet look-up (oftast ' 2') i dialogfönstret.
- För inspelningen av de montage (se nästa steg), växla mellan avsnittet Referens och look-up som beskrivs före och ändra position på referensavsnittet med läge och gå till nummer. Välj nästa koordinat i dialogfönstret.
- För de SerialEM montage vid varje provtagning samordna, gå till fil och välj Ny Montage från droppa-ned menyn. Välj rätt antal plattor och andelen överlappning i dialogfönstret. För närvarande studerar, 5000 X förstoring är tillräckligt för att känna igen de synaptic funktionerna under studien, men begränsat synfältet av CCD kamera krävs för att göra montage av 2 x 2 bilder. Montage görs med SerialEM.
- Innan inspelning varje montage, justera fokus (eller, om möjligt, aktivera alternativet autofokus i inspelningsprogrammet). Välj mapp att spara filen montage och börja inspelningen av montage genom att trycka på starta i undermenyn montage till vänster i SerialEM.
6. analysera TEM bilder med ImageJ till dokumentet ultrastrukturella funktioner.
Obs: För detta, det är viktigt att skapa en anpassad bildstapel från avsnittet Referens och look-up.
- Konvertera bilden-paren med ImageJ bilder till Stack till en stack fil och justera bilder med StackReg (måste installeras från BIG-EPFL http://sites.imagej.net/BIG-EPFL/; i förevarande fall, den algoritm som Affine var används). För att få den numeriska täthet av cellulära strukturella egenskaper, genererar skräddarsydda ImageJ makrot Disector en counting ram med en storlek på 5,5 x 5,5 µm placerad slumpmässigt över bilden med en slumpmässig vinkel.
- Starta makrot Disector (läge i menyn ImageJ beror på den katalog där den är sparad) och definiera parametrar (bildstorlek counting, antalet segment) som behövs (figur 1Cii).
- Räkna antalet synaps/µm2 använda Disector. Räkna varje synaps inom ramen counting som är synliga i referensavsnittet, men inte syns i avsnittet sökning. Utelämna de synapser som skär med de två 'förbjudet linjer' av disector; men räknas synapser på motsatt 'acceptans linjer'. Till detta Använd Multipoint verktyg ligger i den Toolsbar i ImageJ (figur 2A, figur 2B).
- För att mäta synaps parametrar, välj bara synapserna med en synaptiska spalten orienterade i tvärsnitt (på referensavsnittet; inom de samma bild ramar används för disector).
- Starta plugin ObjectJ i ImageJ från droppa-ned menyn (figur 2A) via Plugins | Analysera. Öppna ett nytt projekt från ObjectJ nedrullningsbara dialogrutan. Detta kommer att öppna ett fönster som tillåter användaren att konturen och mark strukturer med Markör verktyg (figur 2B, röd cirkel). De synaptic parametrar som används för experiment presenteras här beskrivs i följande steg.
- Mät längden på presynaptiska membranet och postsynaptiska densitet längd genom att dra en linje längs struktur med hjälp av Markör verktyg (figur 2B, röd cirkel).
- Få den synaptiska spalten genomsnittlig bredd genom att rita en polygon som täcker både pre- och postsynaptiska membranet, med raka parallella sidor och en segmenterad linje halvvägs, lika långt till båda membran.
- För att fastställa antalet dockade blåsor, räkna alla blåsor som har ett maximalt avstånd från presynaptiska membranet en vesikel diameter eller mindre.
- För att fastställa antalet fråndockade blåsor, räknas dessa blåsor med ett maximalt avstånd av en vesikel diameter från dockade eller andra fråndockade blåsor på samma synapsen.
7. producera semi tunna snitt för ljus Microscopy till dokumentet makroskopiska funktioner (i förevarande fall antalet cell) inom samma ROI som valts för TEM utredning.
- Omedelbart efter styckning avsnitten ultratunn för TEM, skär två semi tunna snitt, 0,5 µm tjock och omedelbart intill varandra. Placera på en glasskiva och färga dem med toluidinblått blå lösning 0,5%. Placera ett täckglas på avsnitten (med DPX montering medium, består av distyrene, mjukgörare (tricresyl fosfat) och xylen). Dessa två avsnitt används för att räkna den cell nummer.
- Fotografera de semi tunna snitt i låg förstoring med ett ljusmikroskop.
Observera: Strukturerna under utredning skall identifieras i bilderna. I den aktuella studien, var 20 X förstoring för att identifiera cellen organ. Vid behov kan vara sys ihop flera bilder med ett bildbehandlingsprogram. - Justera parar av två på varandra följande semi tunna snitt med ett bildbehandlingsprogram (t.ex., ImageJ).
Obs: Skillnader av rotation och storlek (kan uppstå på grund av komprimering artefakter infördes genom snittningen) bör justeras för en perfekt överlagring av två avsnitt. - Markera gränsen av ROI på ljusmikroskopi bilden. ROI måste motsvara ROI används för TEM bilder. För detta ändamål, läsa in bilder i ImageJ och välj polygon markeringen från den Toolsbar (figur 2A).
- Generera ett rutnät över hela bilden med ImageJ genom att öppna analysera | Verktyg | Grid och ställa in parametrar som behövs.
- Beräkna area och volym av polygonen från antalet rutnät-punkter inom området av intresse och avsnitt tjocklek (volym = NCS * enGS * hST ; NCS = räknade kors sektioner; EnGS = stödrastrets storlek; hST = snittjocklek).
- Räkna antalet kärnor från neuronala cellen organ inom ROI om de förekommer endast på ett avsnitt. Välj Multipoint verktyg i ImageJ från Toolsbar och markera cellerna. Efter räkna cellerna på varje avsnitt, beräkna antalet celler per volym (
; Cdensitet = Cell densiteten; Cräkna = Cell sammanräkning). - Registrera alla mätningar i fönstret ObjectJ resultaten (figur 2C). Exportera och spara dem för vidare användning.
; Cdensitet = Cell densiteten; Cräkna = Cell sammanräkning).8. använda SerialEM skript för att optimera elementaranalys i hjärnan prover i kombination med DigitalMicrograph (DM, medföljer avbildningsfiltret).
- Trimning av Imaging Filter (GIF).
- Läsa in provet i TEM och gå till ett hål i provet för GIF trimma använda styrkulan eller joysticken av mikroskopet.
- Växla till Energi filtreras TEM (EFTEM) i DM programvara eller DM och välj CCD kamera i DM.
- Välja förstoringen för elementär analys (förstoringen beror på strukturen/området av intresse, i förevarande fall ligger förstoringen från 76 k upp till 125 k). Ställa in exponeringstiden till 0,001 s och börja Visa.
- Fokusera strålen noggrant tills kanterna kan ses och centrera strålen i bilden. Minska C2/den objektiva bländare tills kanterna på bländaren är synliga och centrera balken med trackball för balken.
- Defocus balken (runt C2 46,2%, bör exponeringstid tuning runt 0.05 s) och hitta den noll förlust toppen (ZLP) genom att trycka på knappen ZLP . Börja trimma förfarandet genom att trycka på knappen Full tune .
- Få slumpmässiga punkter av förvärvet.
- Växla tillbaka till TEM imaging läge och välj kamera för att kontrollera fokus vid förstoring 10 k (justera z-axeln och ange oskärpa till noll).
- Välj LM 75 X förstoring och kontrollera om kameran inte är isatt (annars det inte kan kontrolleras av SerialEM programvara).
- Starta SerialEM och öppna ett nytt projekt.
- Öppna navigatorn. Kontrollera inställningarna för kameran i kamera & skript kontroller (för Visa och posten) och starta VIEW (kamera infogas automatiskt).
- Att göra ett hörn karta över avsnittet ultratunn, välja lägga till punkter i Navigator-fönstret.
- Ställ in hörnpunkter på kanterna av en ultra-tunn avsnitt. Flytta scenen till en hörnpunkt genom att hålla ned höger-mus-nyckel. När ett hörn av avsnittet nås, lägga till en hörnpunkt med vänster-musklick. Upprepa proceduren för att lägga till 3 fler hörnpunkter. Kontrollera att rutan C för hörnpunkter i navigator-fönstret är förkryssat för de lagra punkterna.
- För att börja i hörnet montage (att föredra vid förstoring LM 75), gå till Navigator i SerialEM-menyraden och välj Montaging och rutnät och Setup hörnet Montage från droppa-ned menyn.
Obs: Bäst passande inställningar för de valda posten parametrarna visas. Ändra dem om det behövs. I förevarande fall har endast överlappning procentandelen ändrats till 20%.
- Beskriva avsnitt/ROI på bilden för montage. Välj Lägg till Polygon i navigator-fönstret och beskriva avsnittet med flera rätt-klick. Välj Lägg till rutnät av punkter på navigator nedrullningsbara meny och definiera ett avstånd mellan punkter (avståndet beror på experimentell frågan; t.ex., 10 µm, figur 3).
- Följ skriptkommandona. Ange antalet poäng som rutnätet som visas i navigatorn och ange antalet poäng som förvärv (t.ex., 20).
- Ange tröskelvärdet belysning så att skriptet kan undvika rutnätet barer. Följ skriptkommandona och flytta stadiet manuellt för att täcka synfält med en fjärdedel med grid-bar. Enligt värdet som visas, ange ett tröskelvärde för belysning (bör vara högre än det värde som visas).
- Vänta tills punkterna för förvärvet väljs och rutinen matlagning är klar.
Anmärkning: Detta tar lång tid och kan ske över en natt; skriptet skickar mikroskopet i vänteläge efter avslutad matlagning rutin; Rutinen matlagning är viktigt att stabilisera avsnitten i elektronstrålen.
- Energi filtreras TEM (EFTEM) elementaranalys
- Välj EFTEM läge i TIA/DM och välj CCD-kamera i DM.
- Centrum balken och följ de skriptkommandon som kommer att flytta scenen till varje provtagning koordinat.
Obs: Användaren blir ombedd om scenen bör flyttas till nästa koordinat. - Justera den noll förlust toppen (ZLP) och C2 att ~ 46,2%.
- Ställa in energin på 60 eV (i det här fallet är värdet för detektion av Fe M-kanten), slit vid 10 eV och exponering tid på 0,4 s. Infoga skåran och inställt ~ 43,9% C2.
- Börja Visa och fokusera bilden.
- Ange C2 till 46,2%, justera ZLP och ange C2 tillbaka till 43,9%.
- Förvärva elementärt karta med elementärt specifika inställningar.
Obs: Standardinställningarna kan användas i dialogrutan förvärv, men det är rekommenderat att testa dessa i förväg, om möjligt; exempel filtreras bilder visas i figur 4. - Inställt 46,2% C2 och förvärva tjocklek karta.
- Upprepa för alla beslutsamma förvärv punkter (steg 8.3.2-8.3.12).
- Följ instruktionerna i skriptet och få enda elektronmikrografier eller montage av de förvärv punkterna. Välja förstoringen så att alla (ultra-) strukturella uppgifter är synliga/identifierbar.
- Spara loggen fil, navigator och resultatfönstret och ta bort skåran.
- Stäng ventilen, ta bort provet och stänga ned TEM.
Representative Results
Här beskriver vi ett arbetsflöde för att markera områdena för TEM i en automatisk och opartiskt sätt. Användaren väljer området av intresse inom en ultratunn avsnitt under TEM, och använder flera mjukvarulösningar för arbetsflödet inklusive vår RPS programvara som automatiskt beräknar koordinaterna för 20 provtagning områden inom området intresse. Sedan, TEM scenen flyttas till varje provtagningsområdet för fotografering. Detta är möjligt både för att analysera enstaka sektioner och för att analysera par sektioner, en känd sträcka isär, vilket gör att välja områden för avbildning utan bias av prövaren.
Detta arbetsflöde visade sig vara värdefull när dokumentera ultrastrukturella funktioner i mus hjärnan avsnitt4,5. I dessa studier undersöktes det polymorph celllagrar av dentate gyrus (DGpl) som ett område av intresse. Vår metod visat sig lämplig för att undersöka generaldirektoratet, eftersom en koronalt avsnitt dorsala GD (Bregma −1, 3) passar in i en ultratunn avsnitt och dess konturer redovisas lätt i låg förstoring. Om andra regioner i hjärnan skulle undersökas, skulle det vara viktigt att kontrollera deras storlek och utmärkande egenskaper innan du planerar experiment.
Tillämpa arbetsflödet beskrivs här visade att EE bostäder ökar bredden på den synaptiska spalten betydligt i DGpl4, i respekt för standard boendeförhållanden. Dessutom minskade antalet tät kärna blåsor betydligt EE-inrymt djur4, som anger förändringar i hushållet av neuropeptider. När WT och NPY knockoutmöss hölls EE villkor, ökade antalet nervceller/µm³ i DGpl medan tätheten av DCV minskat i förhållande till SE-bostäder5. Däremot resulterade NPY knockout i en betydande ökning av synaptiska vesikler i reserven poolen (fråndockade synaptiska vesikler) oberoende av bostäder villkor5. Effekten av EE på bredden på den synaptiska spalten återfördes i gruppen NPY KO vilket resulterar i en betydande skillnad mellan EE-inrymt WT och NPY KO möss5. Tillsammans med beteendemässiga studier av WT och NPY knockout djur som hölls under båda typerna av boendeförhållanden, detta indikerar en avgörande roll för NPY för neurobiologiska effekterna av EE5.
För att visualisera järn lagras i den mänskliga hjärnan, sammanställdes ett skript för SerialEM programvara för att slumpmässigt välja punkterna i förvärv från inom en hela ultrathin avsnitt, i syfte att erhålla en energi filtreras electron mikrograf på alla dessa punkter . Efter lastning avsnittet i elektronmikroskopet, manuset utförs stabiliseringen av avsnittet (dvs., rutinen 'specimen-matlagning') över natten. Skriptet sedan ut slumpmässigt ett antal punkter som fördefinierade av användaren från de markerade med ett galler i figur 3. Genom att producera en test mikrograf och kontrollera dess gråskalor, kontrolleras skriptet om de valda punkterna var belägna på en synlig del av avsnittet, att förkasta de punkter som landade på rutnätet barer. De flesta av arbetsflödet hanterades av skriptet med minimal interaktion med användaren. Dock var det inte möjligt att automatiskt registrera energi filtreras micrographs (med denna setup), som det fanns för lite ljus för rutinen autofokus av SerialEM. Därför bytte vi till DM programvaran så fort skriptet hade flyttat scenen till varje punkt, justerat fokus för hand, och gjort en EFTEM bild av järn. Ett exempel för en EFTEM järn bild från postmortala mänskliga hjärnan visas i figur 4.
Figur 1. Illustration av arbetsflödet. (A) de viktigaste stegen i provberedningen visas (i pilens riktning): vibratome sektioner (i), embedding(ii), skära semi tunn och ultra-tunn sektioner (iii), och att fånga par ultratunn sektioner på koppar nät (iv). (B) användning av både Mikroskop leverantörens programvara och skräddarsydda RPS programvara skapa provtagning området koordinater som avgör inspelning webbplatser. Hörnpunkter av avsnitt lagras i programvaran Mikroskopi och ROI beskrivs (identifieras med hjälp av avsnitten semi tunna) (i); ett rutnät med provtagning områden genereras över ROI, en slumpmässig förskjutning (röd pil) introduceras i x och y. Skiftet är mindre än avståndet mellan områdena provtagning, (svarta pilar), så att istället för de svarta rutorna, som har inga SKIFT, de blå fyrkanter, som skiftas slumpmässigt, används för att bestämma de inspelning webbplatserna (ii). endast provtagning områden inom gränsar av ROI (dragna som svart och blå fyrkanter) används för inspelning. Micrographs görs både i referensavsnittet (svarta fyrkanter) och i motsvarande platser i avsnittet sökning (blå fyrkanter) (iii). (C) en mikrograf görs vid varje provtagning område vid tillräcklig förstoring; ett montage som består av flera sammanfogade bilder görs vid behov (i detta fall, 2 x 2 bilder slogs tillsammans) (i); en inventering bildruta genereras och visas som en överlagring i bilden, strukturer inom ramen och på 'Accept linjer' (streckad ram linjer) kommer att räknas, men inte de på 'förbjudna linjer' (fast ram linjer) (ii). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2 . Mäta ultrastrukturella parametrar på ett par ultra tunna snitt med en opartisk counting ram. (A) översikt av ImageJ windows används för att räkna och analysera cellulära strukturer. Vänster sida visar den elektron Mikrofotografi med counting ramen som ett överlägg. Till höger: ImageJ användargränssnittet (blå rektangel) med droppa-ned menyn (överst) och verktygsfältet (nedan); ObjectJ Objektredigerare (grön rektangel); fönstret ObjectJ verktyg (orange rektangel) där verktyg för att mäta kan väljas och fönstret ObjectJ resultat (svart rektangel) där alla mätningar dokumenteras. (B) detalj från en visar de markerade synapserna på den elektron mikrograf (synapser på båda delar - pilar, synaps endast på uppslag avsnitt-pilspetsar). De är märkta med Multipoint-verktyget (röd cirkel) i verktygsfältet i ImageJ. (C) namn och mäta parametrar synaptic funktioner definieras med hjälp av ObjectJ verktyg. Markör-verktyg och funktionen av intresse väljs och kontur dras in bilden av vänster-klick längs struktur. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3. Välja provtagning områden för elementär kartläggning inom en ROI för energi filtreras transmissionselektronmikroskopi. SerialEM används för att markera ett område av intresse och föreslå ett stort antal provtagning områden på en vanlig avstånd (rosa korsar i bilder A och B). Ett skript väljer sedan slumpmässigt stickprov områden (från dessa fördefinierade koordinater) för förvärv. Provtagning områden med dålig belysning avvisas för att undvika rutnätet barer och skriptet stannar så snart 20 väl belysta provtagning områden har valts inom ROI. (A) översikt över hela området av intresse, beskrivs av en polygon, med ett stort antal möjliga provtagning områden markerade med X. (B) detalj av A visar områdena provtagning innan slumpmässigt urval. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4. Exempel på elementär karta (EFTEM) förvärv. (A) ljusa fält TEM mikrograf av området kring förvärvet punkt. Ett slumpmässigt valt område användes för att få en elementär karta och är markerad med en svart rektangel. (B) EFTEM pre kant fönster bild gjort under slumpmässigt utvalda området. (C) EFTEM efter kant fönster bild gjord på samma område. (D) elementär karta av järn i samma område (M-edge). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Discussion
Det arbetsflöde som presenteras här kan forskaren få data på ultrastrukturella funktioner på ett opartiskt sätt. Detta är mycket mindre tidskrävande än volym utredningar från seriell avsnitt. Flera olika program används för att uppnå detta mål. Först används vår skräddarsydda RPS -programvara (för information om tillgänglighet, vänligen kontakta motsvarande författare) för att införa en slumpmässig scenen-shift för att välja provtagnings området koordinaterna. Detta tillåter en systematisk enhetliga stickprov av ROI. Nästa, för räkning av särskilda strukturer, vi anpassade den disector metoden, där 2 på varandra följande sektioner med känd distans jämförs, på ett nytt sätt jämfört med tidigare studier13,14,15 som vi använde våra skräddarsydda RPS programvara för systematisk enhetliga stickprov. Detta sparar tid jämfört med 3D-rekonstruera hela volymer från seriell avsnitt. Skräddarsydda RPS programvaran är speciellt utvecklat för en typ av Mikroskop som är en begränsande faktor för återgivning av arbetsflödet. Ett alternativ från denna specifika programvara skulle vara ett program som tillåter skriptkörning och är kompatibel med andra Mikroskop modeller.
Vi har framgångsrikt använt denna metod för vår jämförande studier4,5. På ultra-tunn sektioner av neuronal vävnad, området av intresse skissades och bilder togs av systematisk enhetliga stickprov inom detta område. Det måste noteras att området av intresse, polymorph lagret av dentate gyrus, är ett ganska litet område att undersöka vilket kan vara fördelaktigt för vår strategi. Inom ett slumpmässigt placerade disector, vi utvärderat antalet DCV och flera ultrastrukturella funktioner av synapser i DGpl av vuxna möss inrymt i SE och EE samt vuxen WT möss kontra vuxna NPY knockoutmöss. Insamlade data med våra förhållningssätt, och visade förändringar i några av de undersökta parametrarna. Fynden bekräftade de från andra liknande studier på unga djur2.
En nackdel med den experimentella användningen av detta arbetsflöde kan vara att denna multi-application-strategi inte är perfekt när det gäller användarvänlighet, eftersom användarna måste få bekväm med olika användargränssnitt (i vårt fall, användargränssnittet, TEM seriell avsnitt RPS programvaran och SerialEM programvara). Lära sig att hantera alla ansökningar på ett effektivt sätt är tidskrävande och bör beaktas. Investera tid i att lära sig att använda det här arbetsflödet är dock fortfarande klart gynnsamt under den tid som behövs för att analysera hela volymer med seriell avsnitt TEM. Metoden att använda en disector som placeras genom systematisk enhetliga stickprov i området av intresse är tillräckligt att presentera tillförlitlig data1 utan att behöva undersöka en hög mängd sektioner/volym.
För att maximera resultatet i våra studier, var det viktigt att ta god vård under Provberedning, som bevarandet av vävnaden och strukturer inte är bara avgörande för att utvärdera strukturella funktioner, men också för att identifiera det intresse otvetydigt. En avgörande faktor, och kanske en annan nackdel med denna metod, är att det krävs en hög kvalitet på ultra tunna snitt par: det måste finnas några hål eller rynkor som täcker området under utredning i någon av punkterna och snittjockleken måste vara underhålls homogen. Forskaren måste vara välutbildade i ultramicrotomy. Vård har också vidtas när imaging avsnitten i TEM, eftersom avsnitten är känsliga för electron beam skador och kan enkelt riva isär. Dessutom är det viktigt att välja rätt antal provtagning områden i ROI. Beroende på syftet experimentella måste förstoringen av elektronmikrografier ställas in noggrant. För våra experiment specifikt är räknar synapser i centrala nervsystemet, 20 regioner av intresse på ett avsnitt med området av 30.25 µm2 optimal. Det rekommenderas att utbilda personal väl i erkänner funktionerna som är i fråga (i vårt fall synapser, synaptic funktioner och DCV) att få tillförlitliga resultat. För att identifiera synapser, de synaptiska vesikler måste vara identifierbar och detta kräver en upplösning på minst 10 nm. För detta, en förstoring på 5000 X var optimal, men det måste noteras att förstoringen beror på hårdvara parametrar såsom typ och position av kameror och skulle behöva anpassas för andra Mikroskop eller kamera typer. Det måste också noteras att protokollet använder program som är specifika för en TEM och att användare med andra modeller har att beakta skillnaderna i installationen.
Vi tror att vårt arbetsflöde kan anpassas för många andra tillämpningar inte bara i neurovetenskap men i ett brett fält av biologisk vetenskap och även materialvetenskap (när den höga upplösningen av en TEM behövs) närhelst forskningsfrågan kräver en systematisk uniform stickprov och antalet prover som skall undersökas frågar efter en tid effektivt sätt för analys. Vi är till exempel för närvarande intresserade lokalisera järnförråd i den mänskliga hjärnan. För detta har vi nyligen anpassat vårt arbetsflöde, om du vill aktivera elementaranalys på ultra-tunn sektioner i slumpvis utvalda områden. För att minimera antalet program som behövs för arbetsflödet, syftar vi till att tillämpas med hjälp av SerialEM-programvara bara, eftersom den kan programmeras att flytta scenen till förutbestämda punkter som kan väljas på ett slumpmässigt sätt. Vi skapade anpassade skript för att styra TEM, med målet att automatizing arbetsflödet helt. Detta visade sig vara genomförbart utom autofokus i filtrerade imaging läge, vilket inte ger tillfredsställande resultat. Vi använde därmed DM programvara för fokusering och för att få energi-filtrerad bilder.
Sammanfattningsvis presentera vi lösningar som hjälper att få elektronmikrografier på ett opartiskt sätt.
Disclosures
Författarna har något att avslöja.
Acknowledgments
Finansieras av det österrikiska Science fond, FWF, projektnumret P 29370 B27
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Pentobarbital | SigmaAldrich | P3761 | |
| Formaldehyde | Merck | 1040051000 | 1kg |
| Glutardialdehyde | Science Services | E 16210 | 25%; 100ml; EM grade |
| cacodylate buffer | Merck | C4945 | 250g; Dimethylarsinic acid sodium trihydrate |
| Thionine acetate/Ceristain | Merck | 861340 | |
| acetic acid | Merck | 1000631000 | 1 L |
| Sodium hydroxide | Merck | 1064951000 | 1 kg, pellets |
| osmium tetraoxide | Science Services | E 19110 | 10x1g |
| TAAB embedding resin | Science Services | TAT001 | 500g |
| DMP-30 | Science Services | TAD024 | 100g |
| DDSA | Science Services | TAD025 | 500g |
| Uranyl acetate dihydrate | Plano GmbH | 19481 | depleted, 25g |
| Ultrastain 2 | Leica | 16707235 | Lead citrate |
| Toluidine blue solution | Agar Scientific | AGR1727 | 10g |
| Pioloform | Plano GmbH | R1275 | 10g Powder |
| Proylenoxide | SigmaAldrich | 82320-1L | 1L |
| DPX embedding medium | Plano GmbH | R1320 | embedding medium for semi-thin sections on glass slide, 50 ml |
| Vibratome, Leica VT 1000 | Leica Microsystems, Vienna, Austria | ||
| Leica Ultracut UCT, ultramicrotom | Leica Microsystems, Wetzlar, Germany | ||
| Tecnai G2 20 | FEI,Eindhoven, Netherlands | ||
| Megaview wide angle camera | Olympus Soft Imaging Solution, Münster, Germany | ||
| US 1000 digital camera | Gatan, Pleasanton, USA | ||
| TEM Imaging Analysis Software | FEI,Eindhoven, Netherlands | ||
| FEI Serial Section Software | FEI,Eindhoven, Netherlands | ||
| Fiji, ImageJ 1.52e | National Institute of Health, USA | ||
| SPSS 20.0 | SPSS Inc., Chicago, IL, USA | ||
| SerialEM | Regents of the University of Colorado | ||
| RPS (random point sampling) software 0.9a | custom-made | ||
| Disector v1.0.2 (ImageJ macro) | custom-made | ||
| EFTEMSerialEM (SerialEM script) | custom-made |
References
- Howard, V., Reed, M. Unbiased Stereology: Three-Dimensional Measurement in Microscopy. , BIOS Scientific Publishers. Oxford. (1998).
- Nakamura, H., Kobayashi, S., Ohashi, Y., Ando, S. Age-changes of brain synapses and synaptic plasticity in response to an enriched environment. Journal of Neuroscience Research. 56 (3), 307-315 (1999).
- Landers, M. S., Knott, G. W., Lipp, H. P., Poletaeva, I., Welker, E. Synapse formation in adult barrel cortex following naturalistic environmental enrichment. Neuroscience. 199, 143-152 (2011).
- Reichmann, F., et al. A novel unbiased counting method for the quantification of synapses in the mouse brain. Journal of Neuroscience Methods. 240, 13-21 (2015).
- Reichmann, F., et al. Environmental enrichment induces behavioural disturbances in neuropeptide Y knockout mice. Scientific Report. 6, 28182 (2016).
- Mayhew, T. M. Taking Tissue Samples from the Placenta: An Illustration of Principles and Strategies. Placenta. 29, 1-14 (2008).
- Ferguson, S., Steyer, A. M., Mayhew, T. M., Schwab, Y., Lucocq, J. M. Quantifying Golgi structure using EM: combing volume-SEM and stereology for higher throughput. Histochemistry and Cell Biology. 147, 653-669 (2017).
- Sterio, D. C. The unbiased estimation of number and sizes of arbitrary particles using the disector. Journal of Microscopy. 134 (2), 127-136 (1984).
- Gundersen, H. J., et al. The new stereological tools: disector, fractionator, nucleator and point sampled intercepts and their use in pathological research and diagnosis. APMIS. 96 (10), 857-881 (1988).
- Franklin, K. B. J., Paxinos, G. The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates. , Elsevier/Academic Press. (2008).
- Lewis, P. R., Knight, D. P. Staining Methods for Sectioned Material. , Elsevier/North-Holland Biomedical Press. (1988).
- Mastronarde, D. N. Automated electron microscope tomography using robust prediction of specimen movements. J Struct Biol. 152 (1), can be downloaded from http://bio3d.colorado.edu/SerialEM 36-51 (2005).
- Rampon, C., Tang, Y. P., Goodhouse, J., Shimizu, E., Kyin, M., Tsien, J. Z. Enrichment induces structural changes and recovery from nonspatial memory deficits in CA1 NMDAR1-knockout mice. Nature Neuroscience. 3 (3), 238-244 (2000).
- Xu, X., Ye, L., Ruan, Q. Environmental enrichment induces synaptic structural modification after transient focal cerebral ischemia in rats. Experimental Biology and Medicine. 234 (3), 296-305 (2009).
- Lonetti, G., et al. Early environmental enrichment moderates the behavioral and synaptic phenotype of MeCP2 null mice. Biological Psychiatry. 67 (7), 657-665 (2010).
