Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Использование бактериальных патогенов чтобы зонд для сотовых и организмический уровне принимающей ответов

Published: February 22, 2019 doi: 10.3791/58775
Automatic Translation
1, 2, 1, 1
1Department of Microbiology & Immunology, University of Miami Miller School of Medicine, 2Department of Microbiology & Immunology, University of Illinois College of Medicine

Summary

Мы опишем, как анализы в vitro и in vivo инфекции, которые могут использоваться для анализа деятельности хост кодирования факторов.

Abstract

Существует целый ряд стратегий, которые используют бактериальных патогенов выжить и размножаться раз внутри эукариотической клетки. Так называемые «цитозольной» патогенов (Listeria monocytogenes, шигеллам Флекснера, Burkholderia pseudomallei, Francisella tularensisи риккетсии spp.) получить доступ к зараженной клетки цитозоле физически и ферментативно унижающего достоинство первичной вакуолярной мембраны. Однажды в цитозоле, этих патогенов как размножаться, так и создания достаточной механических сил, чтобы проникнуть плазматической мембраны клетки-хозяина, чтобы инфицировать новые клетки. Здесь мы покажем, как этот терминал шаг цикла сотовой инфекции моноцитогенес л (Lm) может быть определена количественно, образуя колонии подразделение анализов и проточной цитометрии и привести примеры как оба возбудителя и хост кодировке факторов воздействия, это процесс. Мы также показывают, тесная связь Lm инфекции динамики культивируемых клеток, инфицированных в пробирке и тех клеток печени, производные от мышей инфицированных в естественных условиях. Эти функции на основе анализов относительно просты и могут быть легко масштабируются для обнаружения на основе экранов высокой пропускной способностью для модуляторы функции эукариотических клеток.

Introduction

Инфекции на основе экспериментальной модели изначально сложным вследствие их зависимости от начального состояния узла и возбудителя, различные стратегии возбудителя инфекции и трудности приписывая возбудителя и хост-процессов на основе результатов. Бактерией листерий (Lm) стал идеальным патогена на зонд узла обороны ответы из-за его генетических и микробиологических уступчивость, его стратегии быстрого и processive клеточных инфекции и относительно ясно связь между своей сотовой и организмический уровень инфекции фенотипов. Клеточных инфекции Lm проходит через четыре этапа1: (i) сотовых вторжения, которое заключает с Lm заключены в вакуоль; (ii) Lm-растворение мембраны вакуоль и выпуска Lm в цитозоль; (iii) intracytosolic репликации; и (iv) физического проникновения плазматической мембраны, что приводит либо инфекции непосредственно смежных ячеек (например, эпителиальные лист) или, в одиночных клетках, выпуск Lm в внеклеточной окружение. Каждый из этих этапов способствует конкретным Lm-кодировке факторов (упоминаемые как «факторы вирулентности»), при удалении, вызвать инфекции дефекты в клеточном и животных моделях. Эта стратегия общие инфекции независимо претерпела ряд так называемых «цитозольной» патогенов2.

Колония формирование подразделения (CFU) анализы широко используются для оценки как в лабораторных условиях (т.е., сотовой) также как в естественных условиях (т.е., гештальтпсихология) исходы инфекции. В дополнение к их высокая чувствительность, особенно для в-vivo инфекций CFU анализов обеспечивают недвусмысленный индикации возбудителя вторжение и внутриклеточных выживания/распространения. КОЕ анализы широко использовались для анализа Lm и принимающей ячейки определяющих влияние инфекции. Как информативным, как эти предыдущие исследования были анализировать сотовой вторжения и intracytosolic репликации, кое анализов не, в меру наших знаний, были использованы для отслеживания четвертый этап процесса инфекции Lm : сотовой побег. Здесь мы описываем относительно простые средства как сотовой побега (именуемый в дальнейшем «появление») могут контролироваться пробирного CFU (а также проточной цитометрии) и показать примеры как оба возбудителя и хост кодировке факторов регулировать этот этап лм цикл инфекции. Анализ терминала фазы клеточного цикла Lm инфекции может сделать возможным определить дополнительные возбудителя и принимающей ячейки инфекции специфические факторы и мероприятия.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Мышей обращались гуманно в соответствии с все соответствующие правительственные руководящие принципы для ухода и использования лабораторных животных из национальных институтов здравоохранения и их использовании была утверждена для этого всего исследования Университета Майами институционального ухода за животными и использование Комитета (протокол 16-053).

1. Подготовка клетки для инфекции

  1. Распространять мыши Макрофаг подобных клеток линии RAW 264.7 в среде DMEM культуры ткани СМИ с 10% сыворотки плода теленка (далее DMEM/FCS) с помощью 125 мл флакон и инкубатор культуры ткани, поддерживается на 37 °C/5% CO2.
  2. За день до инфекции, используйте скребковых ячейка удалить ячейки из расширения колбу и собирать в 15 мл колпачок Конические трубки. Центрифуга клетки на 800 x g за 10 мин, сцеживаться супернатант и приостановить Пелле клеток в 1 мл DMEM/FCS (без антибиотиков) и определяют титр, используя Горяева или счетчик автоматизированных клеток.
  3. Отрегулируйте титр 2 х 106 клеток/мл и добавьте 0,10 мл (2 x 105 клеток) скважин 48-ну тканевые культуры блюдо. Убедитесь, что суспензию клеток охватывает всю поверхность хорошо.
    1. Плита клетки в дополнительных скважин для источника позже кондиционером средств массовой информации. Также место 0,10 мл DMEM/FCS в трех дополнительных скважин в качестве «нет ячейки».
  4. Инкубируйте на ночь в инкубатор культуры ткани на 37 °C/5% CO2. Следующий день, не удаляйте из инкубатора до тех пор, пока бактерии посевным материалом, подготовлен и готов к использованию.

2. Подготовка листерий (Lm) для инфекции

  1. Прививать 2 мл настоя мозга сердце (BHI) с одной колонии от пластины свежего прожилками агар (< 2 дней) из лм и инкубировать на ночь при 37 ° C при встряхивании в 130 вращ. / мин.
  2. Следующий день, добавьте 0,10 мл ночь культуры до 2 мл предварительно разогретую BHI и продолжить инкубации при 37 ° C с тряски до тех пор, пока оптической плотности (600OD) составляет 0,4 и 0,6.
  3. Определите приблизительное бактериальных титр, с помощью формулы эмпирически производного преобразования. В нашей лаборатории, экспоненциально растущего культура Lm в BHI находится примерно 1.3 x 109 колонии, образуя единиц (CFU) / OD600. Свести к минимуму количество времени, бактериальных культурах подвергаются до комнатной температуры.
  4. Просто до инфекции Отрегулируйте титр 5 x 107 кое/мл, используя подогретым DMEM/FCS в качестве разбавителя.

3. инфекции

  1. Работает быстро и точно, 20 мкл (1 х 106 CFU; кратности инфекции, MOI = 5) из свежеприготовленных Lm посевным материалом (шаг 2.4 выше) для скважин, слегка наклоняя блюдо и тщательно размещение наконечник пипетки в вышележащих СМИ;
    Примечание: не касайтесь стен скважины с кончиком пипетки.
  2. Аккуратно накапайте содержимое каждой скважины для обеспечения завершения смешивания; не поколебать или значительно наклона пластины, как это будет распространяться Lm на стены колодца. Возвращение клетки культуры блюдо в 37 °C/5% CO2 инкубатора.
  3. Приготовляют раствор гентамицина 10 мкг/мл, с использованием кондиционированного СМИ от неинфицированных скважин как разбавителя.
  4. На 30 минут пост инфекции (mpi), тщательно добавить 30 мкл раствора гентамицина (конечная концентрация 2,5 мкг/мл) и аккуратно накапайте содержимое также раньше и возвращения клетки культуры блюдо 37 °C/5% CO2 инкубатора.
  5. На 60 mpi урожай соответствующие скважин для пробирного CFU (60 mpi время точка) или анализ ТСМ (как описано ниже в разделах 4 и 5, соответственно).
  6. Для остальных скважин в разное время после этого либо урожай клетки, как раньше, или, для assay появление Lm , полностью удалить СМИ из скважины и заменить 150 мкл гентамицин свободный кондиционером средств массовой информации.

4. отбор, обработка и анализ Lm внутриклеточные и возникающим в CFU Assay

  1. Урожай, слегка наклоните блюдо и тщательно удалить весь носитель из колодца. Добавьте 0,50 мл стерильной дистиллированной воды (dsH2O) в колодец. После 30 сек, передачи результате lysate воды (100) пробки microcentrifuge 1,5 мл и вихревой энергично для 10 s.
  2. Подготовка 10-1 и 10-2 разведений путем добавления либо 4.5 мкл или 50 мкл воды lysate 450 мкл dsH2O и кратко Вортекс для обеспечения тщательного перемешивания.
  3. Распространения 50 мкл 100, 10-1 или 10-2 образцов на lysogeny плиты агара в бульон (LB).
  4. Проба для эмерджентных Lm (шаг 3,6 выше), удалить 10 мкл наложение СМИ и разделить его на два 5 мкл аликвоты: для одной Алиготе добавить 5 мкл 5 мкл DMEM/FCS и второй Алиготе DMEM/FCS, содержащий 5 мкг/мл гентамицина. Последний элемент управления различает внеклеточного Lm (гентамицин чувствительных) и внутриклеточных Lm (гентамицин устойчив) в последующих CFU пробирного.
  5. После 5 минут при комнатной температуре добавьте 90 мкл dsH2O, вихревой энергично для 10 s и распространение 50 мкл на плитах агара фунтов.
  6. Перечисление Lm колоний на плитах агара фунтов после 2 дней инкубации при температуре 37 ° C.

5. отбор, обработка и анализ Lm внутриклеточные и возникающим подачей Cytometry (FCM)

  1. Подготовка сырья 264.7 клетки, как описано в шагах 1.1-4. Отрегулируйте клетки до 1 x 106 клеток/мл и добавьте 1 mL (1 х 106 клеток) для скважин 6-ну тканевые культуры блюдо.
  2. Подготовить бактерия посевным материалом, как описано в шаге 2.1-2.3 и заразить клетки с объемом посевным материалом, соответствующий MOI 50 (5 x 107 кое).
  3. На 1,5 часа пост инфекции (hpi) сбор средств массовой информации из первого набора скважин и место в 1,5 мл microcentrifuge трубка с 500 мкл параформальдегида 4% (PFA) и место на льду, пока не будут обработаны все скважины.
  4. Для сбора внутриклеточных Lm, добавьте 1 mL dsH2O колодец и после 60 s, передать результирующее воды lysate пробки microcentrifuge 1,5 мл с 500 мкл 4% PFA. Вихрь энергично для 10 s и место на льду, пока не будут обработаны все скважины. (Образец обработки описано в шаге 5.8 ниже.)
  5. Для остальных скважин Удалите СМИ и замените 1 мл DMEM/FCS с 5 мкг/мл гентамицин убить внеклеточного Lm и оперативно вернуться клетки в инкубатор.
  6. После 30 мин (2 hpi) удалите СМИ и замените DMEM/FCS без гентамицина.
  7. После 2-4 ч (4 и 6 hpi) принять второй и третий раз очков, собирая средства массовой информации и лизатов как шаги 5.3 и 5.4.
  8. Центрифуга для трубы на 10000 x g для 7 мин удалить супернатант без тревожных Пелле.
  9. Приостановить каждой гранулы в пятнать коктейль 50 мкл 4% PFA и 15 мкл Фаллоидин. Инкубируйте трубы в темноте при температуре 4 ° C для 20 мин.
  10. После инкубации добавьте 1 mL СУИМ буфера для каждой трубки и пипетки вверх и вниз, чтобы смешать.
  11. Спин трубы на 10000 x g для 7 мин удалить супернатант без тревожных Пелле.
  12. Приостановить каждой гранулы 400 мкл буфера СУИМ для немедленного использования, или 200 мкл буфера СУИМ и 200 мкл 4% PFA если хранение для последующего анализа.
  13. Выполнение примеров на проточной цитометрии и анализировать собранные данные.

6. отбор, обработка и анализ Lm колонизации и разместить ответы в печени

  1. Подготовьте Lm для инфекции, как описано в шаге 2.1-2.3.
  2. Рассчитайте необходимое количество субкультуры для желаемого титр 3 х 106 кое/мл.
  3. Просто до инфекции разбавляют количество вычисляемых бактерий с подогретым Хэнк сбалансированный соли раствора (HBSS) в окончательном объеме 1 мл. Это входной посевным материалом, который вводится в мышь.
  4. С помощью 28 G½ 100У инсулина шприца, привлечь 100 мкл (3 x 105 CFU) ввода посевным материалом и удалите любые видимые воздушные пузыри.
  5. Поместите курсор мыши (штамм C57BL/6; мужчин в возрасте от 6 до 12 недель) в холдинг сдержанность и использовать теплую воду (не более 45 ° C) для расширения вен хвост, а затем придать входной посевным материалом в Вену.
  6. Пластина 10-2 и 10-3 разведений ввода посевным материалом на LB агар 10bcm пластин и инкубировать на ночь при 37 ° C для определения фактического ввода дозы.
  7. На 18 hpi гуманно усыпить мыши (CO2 удушение следуют шейки матки дислокации) и с помощью брюшины стерильными ножницами вырезать открыть мышь для сбора лобной доли печени с помощью отдельных пар ножницы и щипчики для снаружи и внутри мыши. Место печени в 6 см Петри на льду.
  8. Печень нарезать мелкими кубиками и поместить в стеклянный флакон с магнитной перемешать бар. Добавьте 2 мл 2 мг/мл коллагеназы D воссоздана в среде DMEM без FCS. Инкубируйте флаконов при 37 ° C на магнитной мешалкой для 30−45 мин. После гомогенизации ткани, добавьте 3 мл DMEM/FCS для инактивации коллагеназы.
  9. Фильтр клетки через стрейнер ячейки 70 мкм в конической трубки, добавив больше DMEM/FCS, при необходимости.
  10. Центрифуга клетки на 800 x g окатышей на 4 ° C на 10 мин, удалить супернатант и приостановить Пелле клеток в 500 мкл буфера ACK лизируют красных кровяных клеток.
  11. Инкубируйте клетки при комнатной температуре за 5 мин в ACK буфера. Приостановите клеток в 1 мл DMEM/FCS.
  12. Центрифуга клетки на 800 x g окатышей на 4 ° C на 10 мин, удалить супернатант и приостановить в 1 мл DMEM/FCS. Затем подсчитать количество ячеек с помощью Горяева или счетчик автоматизированных клеток.
  13. Передачи 1 x 106 клеток пробки microcentrifuge 1,5 мл и спина в гранулах. Затем приостановите в 1 мл dsH2O и вихревой Лизируйте клетки. Пластины 50 мкл на ФУНТ пластин в неразбавленном и 10-2 разведений и инкубировать при 37 ° C для перечисления Lm CFU анализа.
  14. Передача 1 х 106 клеток в СУИМ трубы для каждого образца ткани согласно клеток и мыть с 1 мл буфера СУИМ.
  15. Центрифуга клетки на 800 x g окатышей на 4 ° C на 10 минут и удалить супернатант.
  16. Подготовка антител коктейль, содержащий антитела интерес, на основе рекомендуемая концентрация для каждого антитела и СУИМ буфера. Смотрите Таблицу материалы для рекомендованных сумм, используемых в анализе.
  17. Приостановить Пелле в 100 мкл антител коктейль и инкубировать и трубы в темноте при температуре 4 ° C за 30 мин.
  18. После инкубации добавить 2 мл буфера СУИМ в каждую пробирку и приостановить клетки.
  19. Центрифуга клетки на 800 x g пеллет при температуре 4 ° C и удалить супернатант. Затем приостановить гранулы 400 мкл буфера СУИМ для немедленного использования, или 200 мкл буфера СУИМ и 200 мкл 4% PFA если хранение для последующего.
  20. Анализировать клетки подачей cytometry (см. шаг 5.13).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Оценка роли возбудителя и хост кодировке факторов, влияющих на клеточном инфекции
Используя описанные выше условия инфекции, 0,15% от входного одичал типа Lm восстанавливается после 1,5 h совместно инкубации с искусственного макрофагов (рис. 1А). В последующие 1,5 h совместно инкубации (3 h пост инфекции, hpi) 4-кратное увеличение восстановления жизнеспособной Lm и от 3 до 6 hpi было увеличение дополнительных 7.5-fold в восстановлении жизнеспособных Lm. Поскольку клетки непроницаемый антибиотик гентамицин добавляется совместно культур на 1 hpi для ликвидации внеклеточного Lm, ТСО увеличение жизнеспособного Lm уровней между 1,5 и 6 hpi эксклюзивно представляет внутриклеточного распространения.

LM быстро получает доступ к цитозоль после интернализации в рамках эукариотических клеток (см. Введение). Цитозольный Lm связывает с механизмом полимеризации актина, что означает, он продвигает себя способны проникать плазматической мембраны. В assay в vitro инфекцию описанных выше, если гентамицин удаляется из скважин на 6 hpi, внеклеточная Lm могут быть легко обнаружены 1 h позже (7 ИНН) в вышележащих СМИ (рис. 1Б). Не CFUs были оправилась от контроля скважин, которые не были посеяны с макрофагами, но которые в противном случае относились одинаково в сеяный скважины, тем самым показывая, что появление внеклеточного Lm было полностью зависит от наличия макрофагов и не в результате неполного антибиотик убийства (не показан).

Возможность Lm выжить и размножаться внутриклеточно в значительной степени зависит набор генов, экспрессия которых находятся под контролем транскрипционный фактор положительным фактором регулирования (PrfA)1. Изначально, есть сопоставимых восстановления напряжения Lm одичал типа и Lm мутантный штамм, опустить на этот фактор (ΔprfA) (рис. 1A). Однако есть последующее сокращение в восстановлении штаммprfA Δ после длительного сотрудничества инкубации, таким образом, что восстановление на 6 hpi 3 раза меньше, чем восстановление на 1,5 hpi. В этой связи и следовало ожидать ΔprfA бактерии не были обнаружены в вышележащих СМИ на 7 hpi (рис. 1Б).

Деятельность PrfA регулируется на нескольких уровнях. Количество конститутивно активных PrfA вариантов, кодируемых гипер вирулентные prfA * аллелей, были изолированы3. Lm штамм, обладающие prfA * имеет профиль первичной инфекции, что сопоставимо с isogenic одичал тип деформации на 1,5 и 3 hpi (рис. 1А). Однако между 3 и 6 hpi, раз увеличение штамма prfA * значительно отличается от дикого штамма. Опять же, в этой связи и следовало ожидать prfA * штамм легко был обнаружен в вышележащих СМИ на 7 Инн на уровнях, которые значительно превышали которые наблюдали для напряжения Lm одичал типа (рис. 1Б).

После его выпуска в цитозоль Lm связывает с сотовой актина полимеризации механизм, который приводит к бактерии окруженная полимеризованной актина. Чтобы подтвердить, что внеклеточного Lm является производным от актин богатые цитозоль клетки зараженного компьютера, макрофаги были либо покинули неинфицированных или зараженные с GFP-выражая prfA * штамм и вышележащих СМИ была собрана в 1,5, 4 и 6 hpi, Витражи с Фаллоидин, который связывает полимеризованной актина и проанализированы проточной цитометрии. СМИ, наложение неинфицированных и зараженные макрофаги содержится светорассеивающего бактерия размера твердых частиц(рис. 2), однако, только средства массовой информации от зараженные макрофаги обладал GFP-позитивных сигналов в этот размер стробирования (Рис. 2B; левой панели). Там было время зависимых, увеличение появление Фаллоидин позитивных Lm в СМИ наложение зараженные макрофаги (рис. 2B; сразу три панели). Фаллоидин положительных GFP-выражая Lm были также обнаружены в лизатов, приготовленный из зараженных макрофагов (рис. 2C; левая панель). Однако не Фаллоидин позитивных Lm был обнаружен в лизатов, приготовленный из макрофагов, инфицированных GFP-выражая Lm мутантный штамм, который не хватало фактор вирулентности ActA, который требуется для актин полимеризации машины завербовать на внешней поверхности Lm после его выпуска в цитозоль (рис. 2C; правой панели). Поддержка этих данных, сценарий, который в инфекцию в пробирке модель «эмерджентных» внеклеточного Lm являются производными от инфицированной клетки цитозоль.

В дополнение к Lm-кодирования факторов, ряда принимающих факторы были определены ассиметричности Lm сотовой инфекции (см. обсуждение). Недавно принимающей фактор Перфорины-2 (P2) доказано быть важным компонентом клеток уровень защиты против ряда бактериальных патогенов. Перитонеального экссудата макрофагов (PEMs) изолированы от дикого типа (P2+/ +) и P2- / - мышей первоначально соответствующе заражены Lm как измеряется пробирного кое в 1 hpi (рисA). В P2+/ + количество CFUs найдены на 6 hpi PEMs является 10 раз больше по сравнению с уровнями, восстановлены на 1 hpi. Похож на ранее опубликованные результаты, в P2- / - количество CFUs найдены на 6 hpi PEMs 80-fold больше по сравнению с уровнями, восстановлены на 1 hpi4. Расширение Lm внутриклеточного распространения в P2- / - PEMs сопровождалось более высокие уровни жизнеспособных Lm обнаружены в вышележащих СМИ, по сравнению с уровнями, обнаруженных в P2+/ + пем ( Рисунок 3B). Эти данные показывают, что в в пробирке assay что появление эмерджентных внеклеточного Lm могут также сообщать о хост факторов что влияние инфекции.

In vivo инфекции и анализ печени
Помимо анализов в vitro инфекцию, описанных выше относительная инфективности одичал тип, ослабленных и гипер вирулентные штаммы Lm может также оцениваться анализов в естественных условиях инфекции. Мышей были внутривенно сочетанной с равными смесь одичал типа и ΔprfALm штаммов и 18 h позже были гуманно euthanized, печень подакцизным и одну ячейку препараты были сделаны. Были лизированы изолированных клеток печени и результирующая лизатов подвергается CFU assay, который мог различить междуprfALm штаммов дикого типа и Δ. По сравнению с 1:1 отношение этих двух штаммов в оригинальной посевным материалом («вход»), ΔprfA/wild type отношение в 18 hpi («выход») был значительно меньше, чем единство (6 мышей диапазоне 0,001 для 0.330; означает 0,100) (Рисунок 4). В отличие от мышей Co-зараженных с равными смесь одичал типа и prfA * Lm штаммов prfA */wild type коэффициенты варьировались от 2.4 до 10,2 (означает 7.1). Этот эксперимент показывает, что относительная инфективности этих трех Lm штаммов (дикого типа, ΔprfAи prfA *) в организме нетронутыми напоминает, что наблюдается в анализов в vitro инфекцию.

Узел может также контролироваться для определения ли различные уровень инфекционности одичал типа, ΔprfAи prfA * штаммов связаны с соответствующей градации врожденный иммунный ответ. Ранее было показано, что резидентов макрофаги (Küpffer клеток) и воспалительных моноцитов и нейтрофилов играть важных и взаимосвязанных ролей в деле защиты печени при Lm инфекции5,6, 7,8. Клетки, приготовленных из незараженных мышей и мышей, инфицированных GFP-выражая одичал типа Lm деформации для 18 h были витражи с маркерами определенного типа клеток и проанализированы проточной цитометрии. С точки зрения-иммунных клеток печени (гепатоцитов и эндотелиальных клеток), были не обнаружить различия между инфицированными и неинфицированными мышей. Напротив, там были заметные изменения, связанные с инфекцией в печени с точки зрения доля иммунных клеток, которые положительно витражи для лейкоцитарный антиген общий CD45 (рис. 5A). В частности, мышей, инфицированных штаммов дикого типа и prfA*Lm имел значительно более высокий уровень CD45+ клеток в печени, по сравнению с неинфицированным мышей, тогда как уровень CD45+ клеток печени в мышах инфицированных штаммprfALm ослабленных Δ были не особенно отличаются от уровней, наблюдаемых в незараженных мышей. Для дальнейшей характеризации обе резидентов и инфильтрирующие иммунных клеток популяции CD45+ клетки может быть ускорена подклассами. Как было отмечено другими9, заметный сдвиг с инфекцией является почти полное исчезновение резидентов Küpffer клеток (CD11bсередине F4/80+в печени) и сопутствующей появление различных населения CD11bПривет клетки, представляющие, проникнув нейтрофилов (рис. 5B; ниже средняя группа). Также появляется в печени в 18 hpi, являются CD11bсередине F4/80– клетки появляются, что, поскольку они также являются Ly6CПривет, представляют проникновения воспалительных моноцитов (рис. 5B; ниже средней и правой панели). В зараженных мышей эти последние клетки являются единственной клетки, в которых заметно GFP сигнал был обнаружен после 18 hs-инфекции (рис. 5C). Этот последний вывод аналогичен недавно сообщил Джонс и D'Orazio, который показал, что у мышей, Lm главным образом связан с Ly6CПривет моноцитов, проникнуть в кишечнике после пищевого заражения10. Профиль CD45Привет клеток печени мышей, инфицированных штаммprfA Δ Lm напоминала что неинфицированных мышей, тогда как мышей, инфицированных с гипер вирулентного штамма LmprfA * скромно повысили уровень проникновения нейтрофилов и моноцитов воспалительных, по сравнению с мышей, инфицированных одичал типа Lm штамм (данные не показаны).

Figure 1
Рисунок 1 : Инфекции культивированный макрофагов, листерий (Lm). Линии клетки макрофагального мыши RAW 264.7 были инфицированы в пробирке с либо одичал типа Lm (wt; заполненные круги), ослабленных лм (ΔprfA; кружков) или гипер вирулентные (prfA *; открыть квадратов) Lm штаммов (см. текст для подробной информации). (A) на 1,5, 3 и 6 часов пост инфекции (hpi), были лизированы макрофагов и клеточного содержания были проанализированы, образуя колонии пробирного блок (CFU). (B) зараженные макрофаги кратко рассматриваются антибиотик гентамицин для устранения не учитываются Lm и на 6 hpi наложение СМИ была собрана и проанализирована путем CFU пробирного. Пунктирная линия представляет собой предел обнаружения assay. Каждая точка данных представляет собой независимый хорошо/инфекции и были определены значения P t-критерия Стьюдента. Показаны результаты одного представителя эксперимента выполняются три раза с аналогичными результатами. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 2
Рисунок 2 : Актин прыгните Lm анализируемой проточной цитометрии. Линии клетки макрофагального мыши, RAW 264.7 либо остались неинфицированных или инфицированных в пробирке с GFP-выражая Lm. Вышележащих СМИ был удален, центрифугируют, и собранный материал витражи с Фаллоидин актин привязки. Цветного материала был проанализирован проточной цитометрии и показано светорассеивающего участки (A) указывает стробирования используется для связанных с GFP - и Фаллоидин уровня внеклеточной (то есть, СМИ производных) Lm показано в пункте (B). (B) указанной области представляет GFP/актина двойной положительный Lm и их обилие в процентах от общего события в рамках светорассеивающего ворота. (C) мыши макрофаги были заражены GFP-выражая Lm или отсутствует ген кодирования ActA (actAΔ) которые новобранцев актин полимеризации машины клетки-хозяина в штамм GFP-выражая Lm LM клеточной поверхности. На 6 hpi инфицированные клетки были лизированы выпустила Сотовые содержимое, включая внутриклеточных Lm, были и витражи для актина анализируемой проточной цитометрии. Показаны результаты одного представителя эксперимента выполняются три раза с аналогичными результатами. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 3
Рисунок 3 : Инфекции одичал типа и макрофаги нокаут Перфорины-2 , л. Перитонеальные макрофаги изолированы от либо одичал тип (P2+/ +; заполнены круги) или нокаут (P2- / -; пунктирная круги) были инфицированы в пробирке с Lm. (A) на 1 и 6 hpi, были лизированы макрофагов и клеточных содержимое анализируются CFU пробирного. (B) зараженные перитонеальных макрофагов кратко рассматриваются антибиотик гентамицин и на 2,5 и 6 hpi наложение СМИ была собрана и проанализирована путем CFU пробирного. Каждая точка данных представляет собой независимый хорошо/инфекции и были определены значения P t-критерия Стьюдента. Показаны результаты одного представителя эксперимента выполняются три раза с аналогичными результатами. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 4
Рисунок 4: Lm заражения мыши. Группы 6 мышей были инфицированы с равными смесь или одичал типа Lm (wt) и ослабленных штаммов лм (ΔprfA) или равными смесь дикого типа Lm и гипер вирулентные (prfA *) штаммов. На 18 hpi мышей Lm бремя в печени определяется CFU assay. В этом эксперименте одичал типа Lm штамм обладает антибиотик сопротивление ген, который позволяет ей следует отличать от антибиотик чувствительных Lm мутантных штаммов. Гомогенатах печени были покрытием на обеих антибиотик содержащих и были нанесены антибиотик свободных СМИ и соотношение мутантов и одичал типа Lm . Пунктирная линия представляет собой соотношение мутант/одичал типа заражение дозы. Абсолютные уровни одичал типа Lm в двух когортных группах мышей были 12 и 15 CFU/106 печени клеток, соответственно. Показаны результаты одного представителя эксперимента выполняются два раза с аналогичными результатами. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 5
Рисунок 5 : Иммунологический ответ Lm инфекции в мыши печени. Мышей были либо неинфицированных зараженных или системно с 2 x 105 кое GFP-выражая Lm штаммов для 18 ч одноклеточных препаратов печень были проанализированы проточной цитометрии для выражения иммунной и миелоидного специфических маркеров. (A) доля клеток окрашивание положительный для иммунной специфичных клеток поверхности маркер CD45+ за 106 изолированных всего живой клетки печени показана для неинфицированных мышей и мышей, инфицированных или одичал типа (wt Lm), Ослабленный (ΔprfA), или гипер вирулентные (prfA *) Lm штаммов. Среднее трех мышей на группу и были определены значения P t-критерия Стьюдента. (B) показано в левой панели являются окрашивание профиль печени CD45-окрашивание клеток от индивидуальных неинфицированных мыши (вверху) и отдельных wt Lm- инфицированных (внизу); в средней панели показано выражение уровня миелоидного специфические маркеры CD11b и F4/80 CD45+ клетки; и на правой панели отображается Ly6C выражение уровня указано закрытом клеток. В правой панели показано наложение Ly6C+ клетки от инфицированных и неинфицированных мышей, в том числе процент и интенсивностью флюоресценции среднее (MFI) CD11b+ F4/80– клетки позитивные для указанных Ly6C ворот. Видно представитель мыши от 3 мышей на группу. (C) Ly6C+ клетки, полученные из печени мышей, инфицированных и неинфицированных (описал (B); средней и правой панели) были проанализированы для экспрессия гена GFP в проточной цитометрии. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Из-за его быстрого и processive клеточных инфекции программа Lm является идеальным возбудителя зонда клеточной деятельности, влияющих инфекции. Были определены ряд принимающих факторов, положительно или отрицательно влияют на Lm сотовой инфекции11,12,,1314. Два таких принимающей факторы характерны в нашей лаборатории, Перфорины-2 и АБС битор регулируется гема (P2 и Привет), регулируют характерных особенностей процесса инфекции Lm . Как показано на рисунке 3, P2 несовершенным клетки очень чувствительны к Lm и это повышение восприимчивости также верно P2 нокаут мышей4. Подробные сравнительные исследования P2-выражая и P2-недостаточным макрофагов показал, что последний клеток образуется весьма подкисленных Lm-содержащих phagosomes, которые привели к усиленной экспрессии генов вирулентности. Гипотеза, что выражение гена вирулентности дифференциального способствует повышение восприимчивости P2-недостаточным макрофаги был поддержан вывод, что гипер вирулентные prfA * штамм, что, как упоминалось ранее, выражает вирулентности гены конститутивно высокого уровня, инфицированных, выражая P2 и P2-недостаточным макрофаги одинаково хорошо4. Таким образом наличие гипер вирулентного штамма Lm стало возможным проверить гипотезу, что P2 принимающей фактор негативно регулирует развертывания фактор вирулентности возбудителя. Для Привет, мы показали, что этот фактор хост регулирует внутриклеточный торговлей Lm таким образом, что его появление от инфицированной клетки является ограниченным; Этот клеточную активность, вероятно, основания для повышения восприимчивости мышей-недостаточным для Lm инфекции15,16.

В исследованиях, которые документально клеточной деятельности, происходят в течение нескольких минут инфекции важно, что до их совместного инкубации, что бактерии и клетки хозяина не чрезмерно подвергаются воздействию колебаний температуры или других экологических условия, которые могут активировать стресс ответы, которые будут перекрывать (и смешаем) инфекции индуцированной деятельности. Для исследований, описанных выше это включает в себя такие казалось бы простые точки, как свести к минимуму время обработки Lm только до начала инфекции. Например если бактериальная культура удаляется из пожимая инкубатора 37 ° C и разрешалось сидеть на вершине скамейке, сдвиги в температуры и кислорода доступности (среди прочего) будет активировать адаптации, которые могут повлиять на начальном этапе последующего взаимодействие с принимающей ячейки. Аналогичным образом клетки хозяина также чувствительны к температуре и СМИ сдвиги, которые могут повлиять на первоначальной инфекции ответы. Хотя на практике невозможно полностью устранить все колебания в бактериальных и клетки-хозяина культивирования условий, путем сокращения их как можно больше и установления стандартных оперативный план, различия между эксперименты будут минимизированы.

Дополнительная переменная, которая на наш взгляд, важное значение которых также недооценивается, что использования антибиотиков, в ячейки культуры инфекции моделей. Гентамицин является часто антибиотика выбора, потому что это относительно непроницаемы для eukaryotic плазматической мембраны. Как старые, так и текущей литературе, он обычно используется в 50 мкг/мл убить внеклеточно (то есть, не внутреннюю) бактерий. Недавно было непосредственно продемонстрировал, что когда присутствующие на 25 мкг/мл, есть достаточно диффузии гентамицина через мембрану эукариотической убить внутриклеточных Lm17. По нашему опыту, этот уровень гентамицина убивает Lm сразу после контакта, в то время как значительно ниже уровней, в 2-5 мкг/мл диапазон убить > 99.9% Lm менее чем за 5 минут4. Лоренц и коллеги показали, что широко используется гентамицина концентрации 25-50 мкг/мл, также достаточно, чтобы убить внутриклеточных Yersinia pestis18. Интересно, что эта группа также показали значительные различия между клеток, которые типы с точки зрения permeabilization гентамицин, подчеркнув, что оптимальные условия должны определяться для каждого возбудителя хост сопряжения клеток.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторы не имеют ничего сообщать.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
ACK Lysing Buffer Gibco  A1049201
ArC Amine Reactive Compensation Beads  Life Technologies A10346
BHI (Brain Heart Infusion) broth EMD Milipore 110493
Cell Strainer, 70 µm VWR 10199-656
Collagenase D Roche 11088858001
DMEM media  Gibco  11965-092
FACS tubes  BD Falcon 352054
FBS - Heat Inactivated  Sigma-Aldrich F4135-500ML
Hanks’ Balanced Salt solution Sigma-Aldrich H6648-6X500ML
LB agar Grow Cells MS MBPE-4040
LIVE/DEAD Fixable Yellow Dead Cell Stain kit  Life Technologies L349S9
Rhodamine Phalloidin  Thermo Fischer R415
SP6800 Spectral Analyzer Sony
Syringe 28 G 1/2" 1cc BD 329461
TPP Tissue Culture 48 Well Plates  MIDSCI TP92048
TPP Tissue Culture 6 Well Plates  MIDSCI TP92406
UltraComp eBeads eBioscience 01-2222-42
Antigen
CD11b  Biolegend Flurochrome = PE Cy5, Dilution = 1/100, Clone = M1/70
CD11c Biolegend Flurochrome = AF 647, Dilution = 1/100, Clone = N418
CD45 Biolegend Flurochrome = APC Cy7, Dilution = 1/100, Clone = 30-F11
F4/80 Biolegend Flurochrome = PE, Dilution = 1/100, Clone = BM8
Live/Dead Invitrogen Flurochrome = AmCyN, Dilution = 1/100
Ly6C Biolegend Flurochrome = PacBlue, Dilution = 1/200, Clone = HK1.4
MHC II Biolegend Flurochrome = AF 700, Dilution = 1/200, Clone = M5/114.15.2
NK 1.1 Biolegend Flurochrome = BV 605, Dilution = 1/100, Clone = PK136

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Freitag, N. E., Port, G. C., Miner, M. D. Listeria monocytogenes - from saprophyte to intracellular pathogen. Nature Review Microbiology. 7 (9), 623-628 (2009).
  2. Ray, K., Marteyn, B., Sansonetti, P. J., Tang, C. M. Life on the inside: the intracellular lifestyle of cytosolic bacteria. Nature Review Microbiology. 7 (5), 333-340 (2009).
  3. Miner, M. D., Port, G. C., Freitag, N. E. Functional impact of mutational activation on the Listeria monocytogenes central virulence regulator PrfA. Microbiology. 154, 3579-3589 (2008).
  4. McCormack, R., et al. Perforin-2 Protects Host Cells and Mice by Restricting the Vacuole to Cytosol Transitioning of a Bacterial Pathogen. Infection and Immunity. 84, 1083-1091 (2016).
  5. Gregory, S. H., et al. Complementary adhesion molecules promote neutrophil-Kupffer cell interaction and the elimination of bacteria taken up by the liver. Journal of Immunology. 168, 308-315 (2002).
  6. Shi, C., et al. Monocyte trafficking to hepatic sites of bacterial infection is chemokine independent and directed by focal intercellular adhesion molecule-1 expression. Journal of Immunology. 184, 6266-6274 (2010).
  7. Pitts, M. G., Combs, T. A., D'Orazio, S. E. F. Neutrophils from Both Susceptible and Resistant Mice Efficiently Kill Opsonized Listeria monocytogenes. Infection and Immunity. 86, 00085 (2018).
  8. Carr, K. D., et al. Specific depletion reveals a novel role for neutrophil-mediated protection in the liver during Listeria monocytogenes infection. European Journal of Immunology. 41 (9), 2666-2676 (2011).
  9. Blériot, C., et al. Liver-resident macrophage necroptosis orchestrates type 1 microbicidal inflammation and type-2-mediated tissue repair during bacterial infection. Immunity. 42 (1), 145-158 (2015).
  10. Jones, G. S., D'Orazio, S. E. F. Monocytes are the predominant cell type associated with Listeria monocytogenes in the gut, but they do not serve as an intracellular growth niche. Journal of Immunology. 198, 2796-2804 (2017).
  11. Agaisse, H., et al. Genome-wide RNAi screen for host factors required for intracellular bacterial infection. Science. 309, 1248-1251 (2005).
  12. Cheng, L. W., et al. Use of RNA interference in Drosophila S2 cells to identify host pathways controlling compartmentalization of an intracellular pathogen. Proceedings of the National Academy of Science U S A. 102, 13646-13651 (2005).
  13. Singh, R., Jamieson, A., Cresswell, P. GILT is a critical host factor for Listeria monocytogenes infection. Nature. 455, 1244-1247 (2008).
  14. Burrack, L. S., Harper, J. W., Higgins, D. E. Perturbation of vacuolar maturation promotes listeriolysin O-independent vacuolar escape during Listeria monocytogenes infection of human cells. Cellular Microbiology. 11, 1382-1398 (2009).
  15. Shrestha, N., et al. The host-encoded Heme Regulated Inhibitor (HRI) facilitates virulence-associated activities of bacterial pathogens. PLoS One. 8, 68754 (2013).
  16. Bahnan, W. The eIF2α Kinase Heme-Regulated Inhibitor Protects the Host from Infection by Regulating Intracellular Pathogen Trafficking. Infection and Immunity. 20, 00707 (2018).
  17. Kortebi, M., et al. Listeria monocytogenes switches from dissemination to persistence by adopting a vacuolar lifestyle in epithelial cells. PLoS Pathogen. 13, 1006734 (2017).
  18. VanCleave, T. T., Pulsifer, A. R., Connor, M. G., Warawa, J. M., Lawrenz, M. B. Impact of Gentamicin Concentration and Exposure Time on Intracellular Yersinia pestis. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 7, 505 (2017).

Tags

Иммунология и инфекции выпуск 144 инфекции мышей патогенных микроорганизмов Listeria monocytogenes проточной цитометрии клеточной биологии
Использование бактериальных патогенов чтобы зонд для сотовых и организмический уровне принимающей ответов
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Gayle, P., Freitag, N. E., Strbo,… More

Gayle, P., Freitag, N. E., Strbo, N., Schesser, K. Using a Bacterial Pathogen to Probe for Cellular and Organismic-level Host Responses. J. Vis. Exp. (144), e58775, doi:10.3791/58775 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter