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JoVE Journal Immunology and Infection
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Immunology and Infection

À l’aide d’un bactérie pathogène à sonde pour réponses cellulaires et organismique au niveau de l’hôte

Published: February 22, 2019 doi: 10.3791/58775
Automatic Translation
1, 2, 1, 1
1Department of Microbiology & Immunology, University of Miami Miller School of Medicine, 2Department of Microbiology & Immunology, University of Illinois College of Medicine

Summary

Nous décrivons les deux tests in vitro et in vivo de l’infection qui peuvent être utilisés pour analyser les activités des facteurs de l’hôte-codage.

Abstract

Il existe une variété de stratégies de bactéries pathogènes emploient pour survivre et proliférer une fois à l’intérieur de la cellule eucaryote. Les pathogènes dits « cytosoliques » (monocytogenes de Listeria, Shigella flexneri, Burkholderia pseudomallei, Francisella tularensiset Rickettsia SPP.) avoir accès dans le cytosol des cellules infectées par physiquement et par voie enzymatique dégrade la membrane vacuolaire primaire. Une fois dans le cytosol, ces agents pathogènes se multiplient tant que génèrent des forces mécaniques suffisantes pour pénétrer la membrane plasmique de la cellule hôte afin d’infecter de nouvelles cellules. Ici, nous montrons comment cette étape terminale du cycle cellulaire infection de L. monocytogenes (Lm) peut être quantifié par les dosages d’unité formant colonie et cytométrie en flux et donner des exemples de comment les deux effets de facteurs encodés en agent pathogène et hôte ceci processus. Nous montrons également une correspondance étroite de Lm dynamique de l’infection des cellules cultivées infectés in vitro et celles des cellules hépatiques provenant de souris infectés in vivo. Ces dosages selon les fonctions sont relativement simples et peuvent être facilement transposés pour écrans de haut débit basé sur la découverte de modulateurs de la fonction des cellules eucaryotes.

Introduction

Axée sur l’infection des modèles expérimentaux sont intrinsèquement difficiles en raison de leur dépendance sur les conditions initiales d’état de l’hôte et pathogène, les différentes stratégies d’infection pathogène et la difficulté d’attribuer pathogène et hôte-processus axés sur basé sur les résultats. La bactérie Listeria monocytogenes (Lm) est devenu un pathogène idéal pour sonder les réactions de défense de l’hôte en raison de sa traçabilité génétique et microbiologique, sa stratégie d’infection cellulaire rapide et processive et le relativement claire relation entre les phénotypes de ses niveaux cellulaires et organismique infection. L’infection cellulaire de Lm passe par quatre phases distinctes1: (i) invasion cellulaire qui se termine par Lm être enfermé dans une vacuole ; (ii) Lm-a ordonné la dissolution de la membrane de la vacuole et libération de Lm dans le cytosol ; (iii) réplication d’intracytosolic ; et (iv) la pénétration physique de la membrane plasmique qui entraîne soit l’infection des cellules directement adjacentes (par exemple dans une feuille épithéliale) ou, dans les cellules solitaires, libération de Lm dans le milieu extracellulaire. Chacune de ces phases sont promus par spécifique Lm-codé facteurs (appelés « facteurs de virulence ») qui, lors de la suppression, causer des infections congénitales chez modèles cellulaires et animaux. Cette stratégie d’infection générale a évolué indépendamment par un certain nombre des dits pathogènes « cytosolique »2.

Tests d’unité (CFU) formatrices sont largement utilisés pour évaluer les deux études in vitro (c.-à-d., cellulaire) ainsi qu’in vivo (c.-à-d. organismique) résultats infection. En plus de leur grande sensibilité, notamment pour les infections in vivo, UFC essais fournissent un affichage sans ambiguïté l’invasion de l’agent pathogène et survie intracellulaire/prolifération. CFU dosages ont été largement utilisées pour analyser fois Lm et hôte déterminants de cellules qui ont une incidence d’infection. Aussi instructif que ces études préalables ont été d’analyser l’invasion cellulaire et réplication intracytosolic, UFC dosages ont pas, au meilleur de notre connaissance, été utilisés pour suivre la quatrième phase du processus d’infection Lm : évasion cellulaire. Nous décrivons ici relativement simples moyens d’évacuation comment cellulaire (ci-après dénommée « émergence ») peuvent être contrôlés par dosage de l’UFC (ainsi que par cytométrie en flux) et voir l’exemples de comment ces deux facteurs encodés en agent pathogène et hôte réglementent cette phase de la Lm cycle d’infection. L’analyse de la phase terminale du cycle cellulaire Lm infection peut rendre possible d’identifier l’agent pathogène supplémentaire et des activités et des facteurs d’infection spécifique cellule hôte.

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Protocol

Souris ont été traitées avec humanité conformément à toutes les directives gouvernementales appropriées pour le soin et l’utilisation des animaux de laboratoire de la National Institutes of Health et leur utilisation a été approuvées pour cet ensemble de l’étude par les soins animaux institutionnel de l’Université de Miami et le Comité de l’urbanisme (protocole 16-053).

1. préparer des cellules pour une Infection

  1. Propager la lignée de macrophage-comme cellules de souris RAW 264.7 dans les milieux de culture de tissu DMEM additionnés de sérum de veau foetal de 10 % (désormais dénommé DMEM/FCS) à l’aide d’un flacon de 125 mL et un incubateur de culture tissulaire maintenue à 37 °C/5% CO2.
  2. La veille de l’infection, utilisez un grattoir de cellules pour éliminer les cellules de la fiole d’expansion et de s’accumuler dans un tube conique de 15 mL bouchon à vis. Centrifuger les cellules à 800 x g pendant 10 min, décanter le liquide surnageant et suspendre le culot dans 1 mL de DMEM/FCS (sans antibiotiques) et déterminer le titre à l’aide d’un hémocytomètre ou un compteur de cellules automatisées.
  3. Ajuster le titre à 2 x 106 cellules/mL et ajouter 0,10 mL (2 x 105 cellules) dans les puits d’un plat de 48 puits vitroplants. S’assurer que la suspension cellulaire couvre toute la surface du puits.
    1. Cellules de plaque dans les puits supplémentaires pour une source plus tard des milieux conditionnés. Aussi placer 0,10 mL de DMEM/FCS dans trois puits supplémentaires pour servir en tant que « aucune cellule contrôle ».
  4. Incuber pendant la nuit dans un incubateur de culture tissulaire à 37 °C/5% CO2. Le lendemain, ne pas retirer de l’incubateur, jusqu'à ce que l’inoculum de la bactérie est préparé et prêt à l’emploi.

2. préparation de Listeria monocytogenes (Lm) pour l’infection

  1. Inoculer les 2 mL d’infusion de cerveau-cœur (BHI) avec une seule colonie d’une gélose fraîchement strié (< 2 jours) de Lm et incuber une nuit à 37 ° C sous agitation à 130 tours/min.
  2. Le lendemain, ajouter 0,10 mL de culture durant la nuit à 2 mL préchauffée BHI et continuer en incubation à 37 ° C sous agitation, jusqu'à ce que la densité optique (OD600) se situe entre 0,4 et 0,6.
  3. Définir son titre bactérienne approximative à l’aide d’une formule de conversion empiriquement. Dans notre laboratoire, une culture exponentiellement croissante de Lm en BHI est d’environ 1,3 x 109 colonies formant des unités (UFC) / OD600. Minimiser la durée des cultures bactériennes sont exposés à la température ambiante.
  4. Juste avant l’infection ajuster le titre à 5 x 107 UFC/mL à l’aide de DMEM/FCS préchauffé comme diluant.

3. infection

  1. Travailler rapidement et avec précision, ajouter 20 µL (1 x 106 UFC ; multiplicité d’infection, MOI = 5) de l’inoculum de Lm fraîchement préparés (étape 2.4 ci-dessus) à Herbert George wells en inclinant légèrement le plat et soigneusement en plaçant l’embout de la pipette dans les médias sus-jacente ;
    Remarque : ne pas toucher les parois du puits avec l’embout de la pipette.
  2. Doucement pipette le contenu de chaque puits pour mélange complet ; ne pas secouer ou inclinez significativement la plaque comme cela écartera Lm sur les parois du puits. Retour de Petri cellule à 37 °C/5% CO2 incubateur.
  3. Préparer une solution de gentamicine 10 µg/mL à l’aide de milieux conditionnés des puits non infectés comme diluant.
  4. À 30 minutes après l’infection (mpi), ajouter avec précaution 30 µL de la solution de gentamicine (concentration finale 2,5 µg/mL) et doucement la pipette le contenu de l’avant ainsi que de Petri cellule retour à 37 °C/5% CO2 incubateur.
  5. À 60 mpi, récolter des puits appropriés pour un essai CFU (point de temps de 60 mpi) ou sur analyse FCM (comme décrit ci-dessous dans les sections 4 et 5, respectivement).
  6. Pour les autres cupules, à diverses reprises par la suite soit récolter les cellules comme avant ou, pour le dosage d’émergence de Lm , entièrement supprimer media du puits et le remplacer avec 150 µL de milieux conditionnés sans gentamicine.

4. traitement et analyse des intracellulaire et émergente Lm par UFC dosage de l’échantillonnage

  1. Pour récolter, incliner légèrement le plat et retirez délicatement les médias tout le puits. Ajouter 0,50 mL de l’eau distillée stérile (dsH2O) dans le puits. Après 30 s, l’eau de lysat de transfert (100) à un tube de microtubes de 1,5 mL et vortex vigoureusement pendant 10 s.
  2. Préparer 10-1 et 10-2 dilutions en ajoutant soit 4,5 µL ou 50 µL d’eau lysat de 450 µL de dsH2O et brièvement vortex afin d’assurer un mélange complet.
  3. Répartis 50 µL de la 100, 10-1 ou 10-2 échantillons sur plaques de gélose lysogénie bouillon (LB).
  4. Dosage pour emergent Lm (étape 3.6 ci-dessus), de retirer 10 µL des superposition de médias et de diviser en deux 5 µL d’extraits : une partie aliquote, ajouter 5 µL de DMEM/FCS et à la deuxième portion ajouter 5 µL de DMEM/FCS contenant 5 gentamicine µg/mL. Le contrôle de ce dernier fait la distinction entre extracellulaire Lm (gentamicine sensible) et intracellulaire Lm (gentamicine résistant) dans l’UFC ultérieur de dosage.
  5. Après 5 min à température ambiante, ajouter 90 µL de dsH2O, vortex vigoureusement pendant 10 s et propagation 50 µL sur plaques de gélose LB.
  6. Énumérer les colonies Lm sur plaques de gélose LB après 2 jours d’incubation à 37 ° C.

5. échantillonnage traitement et analyse des intracellulaire et émergente Lm par cytométrie en flux (FCM)

  1. Préparer les 264.7 cellules crues comme décrit aux points 1.1 à 4. Ajuster les cellules à 1 x 106 cellules/mL et ajouter 1 mL (1 x 106 cellules) dans le puits d’un plat de 6 puits culture de tissus.
  2. Préparation des inoculum de bactérie comme indiqué au point 2.1 à 2.3 et infecter les cellules avec le volume d’inoculum correspondant à un MOI de 50 (5 x 107 UFC).
  3. En 1,5 heures après l’infection (hpi), recueillir des médias de la première série de puits et placez dans un tube de microtubes de 1,5 mL avec 500 µL de paraformaldéhyde à 4 % (PFA) et le déposer sur la glace jusqu'à ce que tous les puits ont été traitées.
  4. Pour collecter les intracellulaire Lm, ajouter 1 mL de dsH2O au puits et après 60 s, transférer l’eau de lysat pour un tube de microtubes de 1,5 mL avec 500 µL de 4 % PFA. Vortex vigoureusement pendant 10 s et le déposer sur la glace jusqu'à ce que tous les puits ont été traitées. (Traitement de l’échantillon est décrit à l’étape 5.8 ci-dessous.)
  5. Pour les puits restants, retirez les supports et remplacer par 1 mL de DMEM/FCS avec 5 gentamicine µg/mL de tuer extracellulaire Lm et renvoyez les cellules à l’incubateur.
  6. Après 30 min (2 hpi) Retirez les supports et remplacer par DMEM/FCS sans gentamicine.
  7. Après 2 et 4 h (4 à 6 hpi) prendre des deuxième et troisième fois points en recueillant des médias et des lysats sous forme de mesures 5.3 et 5.4.
  8. Centrifuger les tubes à 10 000 x g pendant 7 min. enlever le surnageant sans culot inquiétante.
  9. Suspendre chaque diabolo cocktail de 50 µL de 4 % de coloration PFA et 15 µL de phalloïdine. Incuber les tubes dans l’obscurité à 4 ° C pendant 20 min.
  10. Après l’incubation, ajouter 1 mL de tampon de FACS à chaque tube et la pipette de haut en bas pour mélanger.
  11. Tissent des tubes à 10 000 x g pendant 7 min. enlever le surnageant sans culot inquiétante.
  12. Suspendre chaque boulette dans 400 µL de tampon de FACS pour une utilisation immédiate, ou 200 µL de tampon de FACS et 200 µL de 4 % PFA si vous entreposez pour une analyse ultérieure.
  13. Exécuter des échantillons sur un écoulement cytometry et analyser les données recueillies.

6. traitement et analyse de la colonisation de la Lm et réactions de l’hôte dans le foie de l’échantillonnage

  1. Préparer le Lm pour l’infection comme indiqué au point 2.1 à 2.3.
  2. Calculer la quantité nécessaire de repiquer pour titre désiré de 3 x 106 UFC/mL.
  3. Juste avant l’infection diluer la quantité de bactéries calculées avec de Hank préchauffé Balanced Salt Solution (HBSS) dans un volume final de 1 mL. Il s’agit de l’inoculum d’entrée qui est injecté dans la souris.
  4. À l’aide d’une seringue à insuline 28 G½ 100U, tirer 100 µL (3 x 105 UFC) d’inoculum d’entrée et éliminez les bulles d’air visibles.
  5. Placez la souris (souche C57BL/6 ; les hommes entre 6 et 12 semaines) dans le dispositif de retenue de tenue et utilisez l’eau chaude (pas plus de 45 ° C) pour dilater la veine caudale, puis injecter l’inoculum d’entrée dans la veine.
  6. Plaque 10-2 et 10-3 dilutions de l’inoculum d’entrée sur des plaques de 10bcm LB agar et incuber une nuit à 37 ° C, afin de déterminer la posologie d’entrée réelle.
  7. À 18 hpi, humainement euthanasier souris (CO2 asphyxie suivie par dislocation cervicale) et à l’aide de péritoine souris ouvert coupe ciseaux stériles pour recueillir le lobe frontal du foie à l’aide de paires distinctes des pinces et ciseaux pour l’extérieur et l’intérieur de la souris. Placer le foie dans une boîte de pétri sur glace de 6 cm.
  8. Couper le foie en petits cubes et les placer dans un flacon en verre avec un bar d’agitation magnétique. Ajouter 2 mL de collagénase de 2 mg/mL D reconstituée en DMEM sans FCS. Incuber les flacons à 37 ° C dans un agitateur magnétique pendant 30−45 min. Une fois que le tissu soit homogène, ajouter 3 mL de DMEM/FCS pour inactiver la collagénase.
  9. Filtrer les cellules à travers un tamis de cellule de 70 µm dans un tube conique, ajoutant plus de DMEM/FCS si nécessaire.
  10. Centrifuger les cellules à 800 g de granulés à 4 ° C pendant 10 min, éliminer le surnageant et suspendre le culot cellulaire dans 500 µL de tampon ACK à lyser les globules rouges.
  11. Incuber les cellules à température ambiante pendant 5 min dans un tampon ACK. Suspendre les cellules dans 1 mL de DMEM/FCS.
  12. Centrifuger les cellules à 800 g de granulés à 4 ° C pendant 10 min, éliminer le surnageant et suspendre dans 1 mL de DMEM/FCS. Ensuite, compter les cellules à l’aide d’un hémocytomètre ou un compteur de cellules automatisées.
  13. 1 x 106 cellules de transfert à tube microtubes de 1,5 mL et un essorage pour granuler. Puis suspendre dans 1 mL de dsH2O et vortex à lyser les cellules. Plaque 50 µL sur plaques de LB à non dilué et 10-2 dilutions et incuber à 37 ° C, pour énumérer les Lm pour l’analyse de l’UFC.
  14. 1 x 106 cellules de transfert dans des tubes de FACS pour chaque échantillon de tissu selon le nombre de cellules et laver avec 1 mL de tampon de FACS.
  15. Centrifuger les cellules à 800 x g granulés à 4 ° C pendant 10 min et éliminer le surnageant.
  16. Préparer un cocktail d’anticorps contenant les anticorps d’intérêt basé sur la concentration recommandée pour chaque anticorps et le tampon de FACS. Pour les quantités recommandées utilisées dans l’analyse, consultez la Table des matières .
  17. Suspendre le culot dans 100 µL d’anticorps cocktail et incuber les tubes dans l’obscurité à 4 ° C pendant 30 min.
  18. Après incubation, ajouter 2 mL de tampon de FACS dans chaque tube et suspendre les cellules.
  19. Centrifuger les cellules à 800 g de granulés à 4 ° C et éliminer le surnageant. Puis suspendre le culot de 400 µL de tampon de FACS pour une utilisation immédiate, ou 200 µL de tampon de FACS et 200 µL de 4 % PFA si stocker pour plus tard.
  20. Analyser les cellules par cytométrie en flux (voir étape 5.13).

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Representative Results

Évaluation du rôle de l’agent pathogène et l’hôte codé des facteurs ayant une incidence de l’infection cellulaire
En utilisant les conditions de l’infection décrites ci-dessus, 0,15 % du type sauvage d’entrée Lm est récupéré après 1,5 h d’incubation co avec les macrophages (Figure 1A). Dans le h 1,5 subséquentes d’incubation co (3 h après l’infection, hpi), on observe une augmentation de 4 fois dans la récupération de viable Lm et de 3 à 6 hpi, il y avait une augmentation supplémentaire de 7.5-fold dans la récupération de viable Lm. Puisque l’antibiotique gentamicine cellule-imperméable est ajouté aux cultures co à 1 hpi pour éliminer extracellulaire Lm, 30 fois l’augmentation des niveaux de Lm viables entre 1,5 et 6 hpi représente exclusivement la prolifération intracellulaire.

LM accède rapidement dans le cytosol après son internalisation dans les cellules eucaryotes (voir Introduction). Cytosolique Lm s’associe avec le mécanisme de polymérisation d’actine moyen par lequel il propulse lui-même capable de pénétrer la membrane plasmique. Dans le test d’infection in vitro décrit ci-dessus, si la gentamicine est enlevé par les puits à 6 hpi, extracellulaire Lm peuvent être facilement détectés 1 h plus tard (7 hpi) dans les médias sus-jacente (Figure 1B). Aucune UFC ont été récupérés dans les puits de contrôle qui ont été ensemencés pas avec les macrophages, mais qui ont été autrement traités identiquement comme puits ensemencés, montrant ainsi que l’apparition d’extracellulaire Lm était entièrement dépendante de la présence de macrophages et pas un résultat incomplet assassinat antibiotique (non illustré).

La capacité de Lm pour survivre et proliférer dans les cellules dépend en grande partie d’une suite de gènes dont l’expression est contrôlée par le facteur de transcription facteur régulateur positif A (ont)1. Au départ, il y a une récupération comparable de la souche de Lm de type sauvage et une souche mutante de Lm supprimé pour ce facteur (ΔPig23) (Figure 1A). Cependant, il y a une réduction ultérieure dans la récupération de la souche deont Δ après une incubation prolongée co telle que la récupération à 6 hpi est 3 fois moins que le recouvrement à 1.5 hpi. À ce propos et supposée, les bactériesont Δ n’ont pas été détectés dans les médias sus-jacente à 7 hpi (Figure 1B).

L’activité de Pig23 est réglée sur plusieurs niveaux. De nombreuses variantes d’ont constitutivement actifs, codée par hyper virulentes ont * allèles, ont été isolés3. Une souche de Lm possédant un Pig23 * a un profil de l’infection initiale qui est comparable à la souche sauvage isogénique à 1,5 et 3 hpi (Figure 1A). Cependant, entre 3 et 6 hpi, la multiplication de la souche ont * significativement différente de celle de la souche sauvage. Encore une fois, à ce propos et supposée, la souche Pig23 * a été facilement détectée dans les médias sus-jacente à 7 hpi à des niveaux significativement supérieure à celle observée pour la souche de Lm de type sauvage (Figure 1B).

Après sa publication dans le cytosol, Lm associe le mécanisme de polymérisation d’actine cellulaire qui se traduit par la bactérie étant enveloppée par l’actine polymérisée. Pour confirmer qu’extracellulaire Lm provient du cytosol de la cellule hôte infectée riche en actine, les macrophages ont été soit quitté sains ou infectés par une souche ont * exprimant le GFP et les médias sus-jacente ont été récoltés à 1.5, 4 et 6 hpi, colorés à la phalloïdine qui se lie à l’actine polymérisée et analysés par cytométrie en flux. Médias qui vient se superposer des macrophages non infectés et infectés contenait des particules de taille bactérie dispersion de la lumière (Figure 2A), cependant, seuls les médias de macrophages infectés possédaient des signaux de GFP-positif dans ce blocage de taille (Figure 2B; panneau de gauche). Il y avait une augmentation dépendant du temps de l’apparition des macrophages de Lm dans les médias qui vient se superposer infectés phalloïdine-positive (Figure 2B; droite trois panneaux). Phalloïdine-positif exprimant le GFP Lm ont aussi été détectés dans les lysats préparés à partir des macrophages infectés (Figure 2C; panneau de gauche). Cependant, aucun positif phalloïdine Lm a été détecté dans les lysats préparés à partir de macrophages infectés par une souche mutante de GFP exprimant Lm qui n’avait pas le facteur de virulence ActA requis pour recruter le mécanisme de polymérisation de l’actine à la surface extérieure du Lm après sa publication dans le cytosol (Figure 2C; panneau de droite). Ces données de soutien un scénario qui, dans une infection in vitro, modèle « émergente » extracellulaire Lm proviennent du cytosol de la cellule infectée.

En plus de Lm-codant des facteurs, un certain nombre de facteurs ont été d’accueil identifié cet impact Lm infection cellulaire (voir Discussion). Récemment, le facteur d’hôte perforine-2 (P2) s’est avéré être un élément essentiel des défenses cellulaires contre un certain nombre de bactéries pathogènes. Macrophages de l’exsudat péritonéal (SEMP) isolés de type sauvage (P2+ / +) et P2- / - souris sont initialement comparable infectées par Lm telle que mesurée par dosage de l’UFC à 1 hpi (Figure 3A). Dans P2+ / + SEMP, le nombre d’UFC récupéré à hpi 6 est 10 fois supérieure par rapport aux niveaux récupérés à 1 hpi. Semblable aux résultats publiés antérieurement, en P2- / - SEMP, le nombre d’UFC récupéré à 6 hpi est 80 fois plus grande par rapport aux niveaux récupérés à 1 hpi4. Enhanced Lm prolifération intracellulaire en P2- / - SEMP a été accompagnée par des niveaux plus élevés de viable Lm détecté dans les médias sus-jacente par rapport aux niveaux détectés dans P2+ / + SEMP ( Figure 3B). Ces données montrent que, dans un essai in vitro que l’apparence d’emergent extracellulaire Lm peut également signaler sur les facteurs de l’hôte que l’infection impact.

Infection in vivo et l’analyse du foie
Outre les tests d’infection in vitro décrits ci-dessus, l’infectivité relative des souches de type sauvage, atténués et hyper virulentes Lm aussi peut être évaluée que par des essais in vivo de l’infection. Souris sont co-infectés par voie intraveineuse avec un mélange égal de la souche sauvage et souches deprfALm Δ et 18 h plus tard ont été euthanasiés humainement, foies excisées et unique cellule préparations ont été faites. Les cellules hépatiques isolées ont été lysées et les lysats résultantes soumis à un essai d’UFC qui pouvait faire la distinction entre les souches de type sauvage et ΔprfALm . Par rapport au ratio 1:1 de ces deux souches dans l’inoculum original (les « entrée »), le ratio de /wild typeontΔ à 18 hpi (la « sortie ») était considérablement inférieur à l’unité (pour 6 souris se situait 0,001 à 0,330 ; moyenne 0,100) (Figure 4). En revanche, les souris infectées conjointement avec un mélange égal de la souche sauvage et ont * Lm souches les ratios de /wild type ont *varies entre 2,4 et 10.2 (moyenne de 7.1). Cette expérience montre que l’infectivité relative de ces trois souches de Lm (type sauvage, ΔPig23et Pig23 *) dans un organisme intact ressemble à celui observé dans les essais d’infection in vitro.

L’hôte peut également être surveillé pour déterminer si le niveau variable d’infectiosité de la sauvage, ΔPig23et souches de Pig23 sont associées à une gradation correspondante de la réponse immunitaire innée. Auparavant, il a été démontré que résident les macrophages (cellules de Küpffer) et infiltration inflammatoires monocytes et les neutrophiles jouent des rôles essentiels et interdépendants dans la protection du foie lors Lm infection5,6, 7,8. Cellules préparés à partir de souris non infectés et des souris infectées par la souche de Lm du type sauvage exprimant le GFP pendant 18 h ont été colorés avec des marqueurs spécifiques au type de cellule et analysés par cytométrie en flux. En ce qui concerne les cellules non immuns du foie (p. ex., les hépatocytes et les cellules endothéliales), il n’y a aucune différence détectable entre souris non infectés et infectés. Par contre, il y a des changements notables liées à une infection dans le foie en ce qui concerne la proportion de cellules immunitaires qui maculait positive pour l’antigène commun CD45 (Figure 5A). Plus précisément, chez des souris infectées avec des souches de type sauvage et ont*Lm avaient des taux significativement plus élevés de CD45+ des cellules du foie par rapport à des souris infectées, tandis que les niveaux de CD45+ des cellules du foie chez des souris infectées avec la soucheprfALm Δ atténué n’étaient pas particulièrement différente que les concentrations observées chez les souris infectées. Afin de caractériser davantage les deux populations résidentes et infiltrer les cellules immunitaires, CD45+ des cellules peuvent être favorisés sous-typés. Tel qu’observé par d’autres9, une progression notable avec l’infection est la disparition quasi-complète des cellules de Küpffer résident (CD11bmilieu F4/80+dans le foie) et l’apparition concomitante d’une population distincte de CD11bSalut cellules qui représentent l’infiltration de neutrophiles (Figure 5B; panneau central inférieur). Également présente dans le foie à 18 hpi, sont CD11bmilieu F4/80– cellules apparaissent qui, puisqu’ils sont aussi Ly6CSalut, représentent l’infiltration de monocytes inflammatoires (Figure 5B; inférieur des panneaux de milieu et de droite). Chez les souris infectées, ces cellules ce dernier sont les seules cellules dans lesquelles appréciable GFP signal a été détecté suite à 18 hs de l’infection (Figure 5C). Cette dernière constatation est similaire à celle rapportée récemment par Jones et D'Orazio qui a montré que chez les souris, Lm est principalement associé à Ly6CSalut monocytes qui infiltrent l’intestin suite à une infection d’origine alimentaire10. Le profil de CD45Salut hépatocytes de souris infectées par la souche deont Δ Lm ressemble à celle des souris infectées, alors que chez des souris infectées par la souche LmprfA * hyper virulentes avaient modestement augmenté des niveaux de infiltration de neutrophiles et des monocytes inflammatoires par rapport à des souris infectées par la souche de Lm de type sauvage (données non présentées).

Figure 1
Figure 1 : Infection des macrophages cultivées par Listeria monocytogenes (Lm). La lignée de cellules macrophages de souris RAW 264.7 étaient infectés in vitro avec soit sauvage Lm (wt; cercles pleins), atténué Lm (ΔPig23; cercles vides) ou hyper virulentes (Pig23 *; ouvrir carrés) des souches de Lm (voir le texte pour plus de détails). (A) à 1.5, 3 et 6 heures après l’infection (hpi), les macrophages ont été lysées et le contenu cellulaire ont été analysé par le test d’unité (CFU) formant des colonies. (B) les macrophages infectés ont été brièvement traités avec l’antibiotique gentamicine à éliminer non intériorisé Lm et à 6 hpi les médias de superposition a été recueillies et analysées par dosage de l’UFC. Ligne pointillée représente la limite de détection du test. Chaque point de données représente une puits indépendante/infection et P valeurs ont été déterminées par le test t de Student. Montré sont les résultats d’une seule expérience représentative effectués trois fois avec des résultats similaires. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 2
Figure 2 : Liaison actine Lm analysés par cytométrie en flux. La lignée de cellules macrophages de souris RAW 264.7 restaient soit non infectées ou infectés in vitro avec GFP exprimant Lm. Les médias sus-jacente a été supprimé, centrifugé, et le matériel collecté tachée de liaison de l’actine phalloïdine. Le matériel souillé a été analysé par cytométrie en flux et montré les parcelles de la dispersion de la lumière (A) indique le processus de blocage utilisé pour les GFP et la phalloïdine-associées à des niveaux d’extracellulaire (c.-à-d. dérivé médias) Lm montré dans (B). (B), le secteur indiqué représente le positif double GFP/actine Lm et leur abondance sous forme de pourcentage des événements totales intérieur des portes de la dispersion de la lumière. (C) les macrophages de souris ont été infectés avec GFP exprimant Lm ou une souche exprimant le GFP Lm dépourvues du gène codant l’ActA (actAΔ) qui recrute le mécanisme de polymérisation de l’actine de la cellule hôte à la Surface de la cellule LM . À 6 hpi, cellules infectées ont été lysées et le contenu cellulaire libéré, y compris l' intracellulaire Lm, ont été coloré pour l’actine et analysé par cytométrie en flux. Montré sont les résultats d’une seule expérience représentative effectués trois fois avec des résultats similaires. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 3
Figure 3 : Infection de type sauvage et macrophages knockout perforine-2 par Lm. Macrophages péritonéaux prélevés soit un sauvage (P2+ / +; rempli de cercles) ou knockout (P2- / -; cercles en pointillés) étaient infectés in vitro avec Lm. (A) à 1 et 6 hpi, macrophages sont lysées et le contenu cellulaire analysés par dosage de l’UFC. (B) macrophages péritonéaux infectés ont été brièvement traités avec l’antibiotique gentamicine et à 2,5 et 6 hpi les médias de superposition a été recueillies et analysées par dosage de l’UFC. Chaque point de données représente une puits indépendante/infection et P valeurs ont été déterminées par le test t de Student. Montré sont les résultats d’une seule expérience représentative effectués trois fois avec des résultats similaires. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 4
Figure 4: Lm infection de la souris. Groupes de 6 souris infectées avec un mélange égal de soit le sauvage Lm (wt) et atténué souches de Lm (ΔPig23) ou un mélange égal de la sauvage Lm et les souches hyper virulentes (Pig23 *). À 18 hpi souris le Lm fardeau dans le foie a été déterminée par dosage de l’UFC. Dans cette expérience, la souche de Lm sauvage possède un gène de résistance aux antibiotiques qui lui permet de distinguer les souches mutantes de Lm antibiotiques sensibles. Homogénats de foie ont été cultivées sur les deux contenant des antibiotiques et médias sans antibiotique et le ratio de mutants et de type sauvage Lm ont été tracées. La ligne pointillée représente le rapport entre la dose infectant mutant/sauvage. Les niveaux absolus du type sauvage Lm dans les deux cohortes de souris étaient respectivement de 12 et 15 UFC/106 foie cellules. Montré sont les résultats d’une expérience représentative unique exécutées deux fois avec des résultats similaires. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 5
Figure 5 : Une réponse immunitaire à l’infection de Lm dans le foie de souris. Les souris étaient que soit non infecté ou systémiquement infectées avec 2 x 105 exprimant l’UFC de GFP Lm souches pour les préparations unicellulaires 18 h de foies ont été analysés par cytométrie de flux pour l’expression des marqueurs spécifiques immunitaire et myéloïde. (A), le pourcentage de cellules coloration positif pour le marqueur de surface de cellules immunitaires spécifiques CD45+ par 106 isolé total du foie cellules vivantes montré pour souris sains et chez des souris infectées avec soit du type sauvage (wt Lm), atténué (ΔPig23), ou Lm souches hyper virulentes (Pig23 *). Tracé est la moyenne des trois souris par groupe et P valeurs ont été déterminées par le test t de Student. (B) montré dans les panneaux de gauche sont le profil coloration coloration CD45 foie cellules d’une souris non infectée individuelle (en haut) et une individuelle wt Lm- infectés (en bas) ; dans les panneaux du milieu montre les niveaux d’expression des marqueurs myéloïdes spécifiques CD11b et F4/80 de la CD45+ cellules ; et sur les panneaux de droite montre les niveaux d’expression de Ly6C des cellules fermées indiquées. Dans le panneau de droite montre une superposition de le Ly6C+ les cellules des souris non infectés et infectés, y compris le pourcentage et les intensités de fluorescence moyenne (IFM) de la CD11b+ – de F4/80 cellules positives pour la porte de Ly6C indiquée. Montré est une souris représentative de 3 souris par groupe. (C) Ly6C+ les cellules dérivées de foie de souris non infectés et infectés (décrite (B) ; panneaux de milieu et de droite) ont été analysés pour l’expression de la GFP par cytométrie en flux. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

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Discussion

En raison de son programme d’infection cellulaire rapide et processive, Lm est un pathogène idéal pour sonder les activités cellulaires qui ont une incidence de l’infection. Un certain nombre de facteurs de l’hôte ont été identifié qui soit positivement, soit négativement affecter Lm infection cellulaire11,12,13,14. Deux de ces facteurs caractérisés dans notre laboratoire, perforine-2 et l’hème réglementés inhibiteur l’hôte (P2 et salut), réglementer les caractéristiques distinctes du processus d’infection Lm . Comme illustré à la Figure 3, les cellules déficientes P2 sont très susceptibles à Lm et cette sensibilité accrue est également vraie des souris knockout P24. Des études comparatives détaillées des macrophages exprimant le P2 et P2-deficient a montré que les cellules de cette dernière forment fortement acidifié Lm-contenant des phagosomes qui a abouti à amélioré expression de gènes de virulence. L’hypothèse selon laquelle l’expression de gènes de virulence différentielle contribue à la sensibilité accrue des macrophages P2-deficient reposait sur la constatation que l’hyper virulentes ont * souche, que, comme mentionné précédemment, exprime sa virulence gènes à un niveau élevé de façon constitutive, infecté exprimant le P2 et macrophages P2-deficient aussi bien4. Ainsi, la disponibilité d’une souche de Lm hyper virulentes ont permis de vérifier l’hypothèse que le facteur d’hôte P2 régule négativement le déploiement de facteur virulence pathogène. De Salut, nous a montré que ce facteur hôte régule le trafic intracellulaire de Lm telle que son émergence de la cellule infectée est limité ; cette activité cellulaire est probablement les bases de la sensibilité accrue des souris déficientes en salut pour Lm infection15,16.

Dans les études qui décrit les activités cellulaires survenant dans les minutes de l’infection, il est crucial que, avant leur incubation co, qu’aussi bien les bactéries et les cellules de l’hôte ne sont pas trop exposés aux variations de température ou autre environnement conditions qui peuvent activer les réactions de stress qui se chevauchent (et confondre) activités induits par l’infection. Dans les études décrites ci-dessus, ceci inclut des points apparemment simples tels que réduire le temps de manipulation de Lm juste avant l’ouverture de l’infection. Par exemple, si une culture bactérienne est extraite d’un incubateur à 37 ° C secouant et autorisée à se présenter sur une paillasse, changements dans la disponibilité de la température et l’oxygène (entre autres) activera les adaptations qui peuvent influer sur la phase initiale de la suite interaction avec la cellule hôte. De même, les cellules hôtes sont également sensibles aux fluctuations de température et les médias qui peuvent influer sur les réponses de l’infection initiale. Même si en pratique il est impossible de complètement éliminer tous les fluctuations bactérienne et cellule de l’hôte, des conditions de culture en réduisant autant que possible et en établissant un plan d’exploitation standard, la variation entre les expériences est minimisé.

Une variable supplémentaire, qui, à notre avis, dont l’importance est également sous-estimé, est celui de l’utilisation des antibiotiques dans les modèles d’infection de culture cellulaire. La gentamicine est souvent l’antibiotique de choix parce qu’il est relativement imperméable à la membrane plasmique eucaryote. Dans la littérature tant ancienne et actuelle, il est généralement utilisé à 50 µg/mL pour tuer extracellulaire (c.-à-d., non-internalisé) bactéries. Récemment il a été directement démontré que lorsqu’il est présent à 25 µg/mL, il y a une diffusion suffisante de gentamicine à travers la membrane eucaryote pour tuer intracellulaire Lm17. Dans notre expérience, ce niveau de gentamicine tue Lm immédiatement au contact, alors que les niveaux beaucoup plus bas, dans la tuer de gamme de 2 à 5 µg/mL > 99,9 % Lm en moins de 5 min4. Lawrenz et ses collègues ont montré que les concentrations de gentamicine répandu de 25 à 50 µg/mL suffisent également à tuer intracellulaire Yersinia pestis18. Fait intéressant, ce groupe a également montré des différences considérables entre les cellules types en ce qui concerne la perméabilisation de gentamicine en soulignant que les conditions optimale doivent être déterminées pour chaque appariement de cellule hôte-pathogène.

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Disclosures

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
ACK Lysing Buffer Gibco  A1049201
ArC Amine Reactive Compensation Beads  Life Technologies A10346
BHI (Brain Heart Infusion) broth EMD Milipore 110493
Cell Strainer, 70 µm VWR 10199-656
Collagenase D Roche 11088858001
DMEM media  Gibco  11965-092
FACS tubes  BD Falcon 352054
FBS - Heat Inactivated  Sigma-Aldrich F4135-500ML
Hanks’ Balanced Salt solution Sigma-Aldrich H6648-6X500ML
LB agar Grow Cells MS MBPE-4040
LIVE/DEAD Fixable Yellow Dead Cell Stain kit  Life Technologies L349S9
Rhodamine Phalloidin  Thermo Fischer R415
SP6800 Spectral Analyzer Sony
Syringe 28 G 1/2" 1cc BD 329461
TPP Tissue Culture 48 Well Plates  MIDSCI TP92048
TPP Tissue Culture 6 Well Plates  MIDSCI TP92406
UltraComp eBeads eBioscience 01-2222-42
Antigen
CD11b  Biolegend Flurochrome = PE Cy5, Dilution = 1/100, Clone = M1/70
CD11c Biolegend Flurochrome = AF 647, Dilution = 1/100, Clone = N418
CD45 Biolegend Flurochrome = APC Cy7, Dilution = 1/100, Clone = 30-F11
F4/80 Biolegend Flurochrome = PE, Dilution = 1/100, Clone = BM8
Live/Dead Invitrogen Flurochrome = AmCyN, Dilution = 1/100
Ly6C Biolegend Flurochrome = PacBlue, Dilution = 1/200, Clone = HK1.4
MHC II Biolegend Flurochrome = AF 700, Dilution = 1/200, Clone = M5/114.15.2
NK 1.1 Biolegend Flurochrome = BV 605, Dilution = 1/100, Clone = PK136

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References

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  2. Ray, K., Marteyn, B., Sansonetti, P. J., Tang, C. M. Life on the inside: the intracellular lifestyle of cytosolic bacteria. Nature Review Microbiology. 7 (5), 333-340 (2009).
  3. Miner, M. D., Port, G. C., Freitag, N. E. Functional impact of mutational activation on the Listeria monocytogenes central virulence regulator PrfA. Microbiology. 154, 3579-3589 (2008).
  4. McCormack, R., et al. Perforin-2 Protects Host Cells and Mice by Restricting the Vacuole to Cytosol Transitioning of a Bacterial Pathogen. Infection and Immunity. 84, 1083-1091 (2016).
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  6. Shi, C., et al. Monocyte trafficking to hepatic sites of bacterial infection is chemokine independent and directed by focal intercellular adhesion molecule-1 expression. Journal of Immunology. 184, 6266-6274 (2010).
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  16. Bahnan, W. The eIF2α Kinase Heme-Regulated Inhibitor Protects the Host from Infection by Regulating Intracellular Pathogen Trafficking. Infection and Immunity. 20, 00707 (2018).
  17. Kortebi, M., et al. Listeria monocytogenes switches from dissemination to persistence by adopting a vacuolar lifestyle in epithelial cells. PLoS Pathogen. 13, 1006734 (2017).
  18. VanCleave, T. T., Pulsifer, A. R., Connor, M. G., Warawa, J. M., Lawrenz, M. B. Impact of Gentamicin Concentration and Exposure Time on Intracellular Yersinia pestis. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 7, 505 (2017).

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Immunologie et Infection numéro 144 Infection les souris les agents pathogènes microbiens Listeria monocytogenes cytométrie en flux biologie cellulaire
À l’aide d’un bactérie pathogène à sonde pour réponses cellulaires et organismique au niveau de l’hôte
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Gayle, P., Freitag, N. E., Strbo, N., Schesser, K. Using a Bacterial Pathogen to Probe for Cellular and Organismic-level Host Responses. J. Vis. Exp. (144), e58775, doi:10.3791/58775 (2019).

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