Summary
我们描述了可用于分析主机编码因子活性的体外和体内感染检测。
Abstract
细菌病原体有多种策略, 一旦在真核细胞中存活和增殖。所谓的 "细胞增生李斯特菌" 病原体(单核细胞增生李斯特菌、志贺氏菌、假克氏菌、杜拉伦斯法郎和环结节) 可进入受感染的细胞溶胶。物理和酶降解的主要空泡膜。一旦进入细胞溶胶, 这些病原体既会增殖, 又会产生足够的机械力, 穿透宿主细胞的质膜, 从而感染新的细胞。在这里, 我们展示了 l . 单核细胞基因 (lm) 细胞感染周期的这一结束步骤如何通过成菌性系和流式细胞术来量化, 并举例说明病因和宿主编码因素是如何影响这一点的。过程。我们还显示了体外感染的培养细胞的 lm 感染动力学与体内感染小鼠的肝细胞的lm感染动力学的密切对应关系。这些基于功能的检测相对简单, 可以很容易地扩展到基于发现的高通量屏幕的真核细胞功能的调制器。
Introduction
基于感染的实验模型具有内在的挑战性, 因为它们依赖于宿主和病原体的起始状态条件、各种病原体感染策略以及难以归因病原和宿主驱动的过程基于结果。单核细胞增生李斯特菌(lm) 由于其遗传和微生物的可追踪性、快速和持续的细胞感染策略以及相对清晰的特性, 已成为一种理想的病原体, 可以探测宿主防御反应。其纤维素和有机水平的感染表型之间的关系。lm的细胞感染通过四个不同的阶段1: (i) 细胞入侵, 结束与lm被封闭在一个液泡内;(二) 以lm为导向溶解液泡膜, 并将lm 释放到细胞溶胶中;(iii) 组织内的复制;(iv) 质膜的物理渗透, 导致直接相邻的细胞 (如上皮细胞) 的感染, 或在单生细胞中, 将lm释放到细胞外环境中。每个阶段都是由特定的 lm编码因素 (称为 "毒力因素") 推动的, 这些因素一旦被删除, 会导致细胞和动物模型的感染缺陷。这种一般的感染策略是由一些所谓的 "细胞质" 病原体2独立进化而来的。
菌落形成单元 (cfu) 检测被广泛用于评估体外 (即细胞) 和体内 (即有机) 感染结果。除了高灵敏度, 特别是对体内感染, cfu 检测提供了一个明确的读数病原体入侵和细胞内存活/增殖。cfu 检测已被广泛用于分析影响感染的lm和宿主细胞决定因素。尽管这些先前的研究提供了丰富的信息, 以分析细胞入侵和结肠内复制, cfu 的检测, 据我们所知, 还没有被用来跟踪第四阶段的lm感染过程: 细胞逃逸。在这里, 我们描述了相对简单的方法, 如何监测细胞逃逸 (以下简称 "出现") 可以通过 cfu 分析 (以及流式细胞术), 并展示了如何病理和宿主编码的因素如何调节这个阶段的lm感染周期。对细胞lm感染周期的终末期进行分析, 可以确定更多的病原体和宿主细胞感染特有的因素和活动。
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Protocol
根据所有适当的政府关于美国国立卫生研究院实验动物护理和使用的准则, 对老鼠进行了人道的治疗, 迈阿密大学动物护理机构批准了它们的使用和使用委员会 (议定书 16-053)。
1. 准备感染细胞
- 在 dmem 组织培养基中传播小鼠巨噬细胞样细胞系 raw 264.7, 辅以10% 的胎儿小牛血清 (以下简称 dmemce/fcs), 使用125ml 瓶和组织培养孵化器保持在 37°c% co2.
- 感染前一天, 使用细胞刮刀从膨胀瓶中取出细胞, 并收集在一个15毫升的螺帽锥形管。以 800 x克离心细胞 10分钟, 下液上清液, 并在 dmem/fcs (不含抗生素) 1 毫升中悬浮细胞颗粒, 并使用血细胞仪或自动细胞计数器测定滴度。
-
将滴度调整为 2 x10 6 cells/mL, 并在48井组织培养皿的井中加入 0.10 ml (2 x10 5 细胞)。确保细胞悬浮液覆盖了井的整个表面。
- 板细胞在另外的井为被适应的媒介的最新来源。此外, 还将 dmem任何 fcs 的 0.10 ml 放入另外三口井中, 作为 "无细胞控制"。
- 在 37°c% co-2的组织培养孵化器中孵育一夜。第二天, 在接种细菌准备好并准备使用之前, 不要从孵化器中取出。
2. 为感染准备单核细胞增生李斯特菌 (lm)
- 从lm的新鲜条纹琼脂板 (和 lt;2 天) 中接种2毫升脑心输液 (bhi), 在37°c 孵育, 在130转/分钟时晃动过夜。
- 第二天, 将0.10 毫升的隔夜培养添加到2毫升预热 bhi 中, 并在37°c 下继续孵育, 摇摇, 直到光学密度 (od600) 在0.4 至0.6 之间。
- 使用经验导出的转换公式确定近似细菌滴度。在我们的实验室中, bhi 中呈指数级增长的lm培养约为 1.3 x10 9个菌落形成单元 (cfu)/od600。最大限度地减少细菌培养在室温下的时间。
- 就在感染前, 使用预热的 dmem/fcs 作为稀释剂, 将滴度调整为 5x10 7 cfuml.
3. 感染
- 快速而精确地将新鲜制备的lm接种室 (上面第 2.4步) 加入 20μl (1 x 10 6 cfu; 感染多样性), 通过稍微倾斜盘子并小心地将管道尖端放置在覆盖介质中, 加入井中;
注:避免用管道尖端接触井壁。 - 轻轻将每口井的内容物移入, 确保完全混合;不要晃动或明显倾斜的板, 因为这将传播 lm在井壁上。将细胞培养盘返回 37°c% co2 孵化器 。
- 利用未感染井中的条件介质作为稀释剂, 制备10μgml 庆大钦溶液。
- 感染后 30分钟, 小心加入30μl 的庆大霉素溶液 (最终浓度 2.5μg/ml), 轻轻将该溶液的含量以及之前的内容物, 并将细胞培养盘返回 37°cqp% co2 孵化器.
- 在60英里时, 收获适当的井, 用于 cfu 分析 (60 英里时间点) 或 fcm 分析 (如下文第4和第5节分别介绍)。
- 对于剩余的井, 在此后的不同时间, 无论是收获细胞, 或, 对于 lm出现的试验, 完全从井中去除介质, 并替换为150μl 的无庆三蛋白的条件介质。
4. cfu 检测细胞内和紧急lm的抽样处理与分析
- 要收获, 稍微倾斜盘子, 小心地从井里取出整个介质。在井中加入0.50 毫升的蒸馏无菌水 (dsh2o)。30秒后, 将产生的水裂解物 (100)转移到 1.5 ml 微离心管中, 并大力旋涡10秒。
- 准备10-1和10-2稀释, 加入4.5μl 或50μl 的水裂解物到450微米升 dsh2o 和短暂的涡旋, 以确保彻底混合。
- 将 100、10-1 和10-2 个样品的50μl 涂在溶酶汤 (lb) 琼脂板上。
- 要测定紧急lm (上面步骤 3.6), 请去除10μl 的覆盖介质, 并将其分为两个 5μl aliquots: 添加5μl 的 dmem任何 fcs, 并将第二个 aliquots 添加 5μl dmmscs, 其中含有 5μgml ml。后者的控制区分细胞外lm (庆大霉素敏感) 和细胞内lm (庆大霉素耐药) 在随后的 cfu 检测。
- 室温下5分钟后, 加入90μl 的 dsh2o,强烈旋涡 10秒, 并在 lb 琼脂板上扩散50μl。
- 在 37°c 孵育2天后, 在 lb 琼脂板上列举 lm 菌落。
5. 流式细胞仪 (fcm) 对细胞内和紧急lm的采样处理和分析
- 按照步骤 1.1-4 中的说明准备 raw 264.7 单元格。将细胞调整为 1 x10 6细胞, 并在6井组织培养皿的井中添加1毫升 (1 x10 6 细胞)。
- 按照步骤 2.1-2.3 中所述制备接种菌, 并以相当于 50 moi (5 x10 7 cfu ) 的接种体积感染细胞。
- 在感染后1.5 小时 (hpi), 从第一套井中收集介质, 并将其放置在含有500μl 的 4% 甲醛 (pfa) 的 1.5 ml 微离心管中, 并放置在冰上, 直到所有油井都经过加工。
- 为了收集细胞内lm, 在井中加入1毫升 dsh2o,在60秒后, 将产生的水裂解物转移到含有500μl 为 4% pfa 的 1.5 ml 微离心管中。涡旋大力 10 s, 并放置在冰上, 直到所有的井都被处理。(下面的步骤5.8 描述了示例处理。
- 对于剩余的油井, 取出培养基, 用1ml 的 dmml fcs 代替5μgml 庆大辛, 杀死细胞外lm , 并及时将细胞返回孵化器。
- 30分钟 (2 hpi) 后取出培养基, 在没有庆大霉素的情况下更换 dmmcf。
- 在2和 4小时 (4 和 6 hpi) 后, 通过收集介质和裂解物作为步骤5.3 和 5.4, 获取第二和第三时间点。
- 以 10, 000 x g离心管 7分钟, 在不干扰颗粒的情况下去除上清液。
- 将每个颗粒悬浮在50μl 的 4% pfa 和15μl 的 phalloidin 的染色鸡尾酒中。在4°c 的黑暗中孵化管20分钟。
- 孵育后, 将流式细胞仪缓冲液添加1毫升到每个管中, 上下混合移液器。
- 旋转管在 10, 000 x g 下7分钟. 去除上清液, 而不干扰颗粒。
- 将400μl 的流式细胞仪缓冲液中的每个颗粒挂在一起立即使用, 如果储存以供以后分析, 则悬挂200μl 的流式细胞仪缓冲液和200μl 的 4% pfa。
- 在流式细胞仪上运行样品并分析收集到的数据。
6.肝脏中 lm殖民和宿主反应的抽样处理与分析
- 按照步骤 2.1-2.3 中的说明, 为感染准备lm 。
- 计算所需的亚培养量, 以达到 3 x10 6 chuml 的所需滴度。
- 就在感染之前, 用预热汉克的平衡盐溶液 (hbss) 将计算出的细菌量稀释为1毫升的最终体积。这是注入鼠标的输入接种器。
- 使用 28 g半100u 胰岛素注射器, 绘制 100μl (3 x10 5 cfu ) 的输入接种器, 并去除任何可见的气泡。
- 将小鼠 (c57bl6 菌株; 6至12周的雄性) 放入保持约束中, 使用温水 (不超过 45°c) 扩张尾静脉, 然后将输入接种注入静脉。
- 将投入接种器的板10-2 和10-3稀释到 lb 琼脂10bcm 板上, 并在37°c 下孵育过夜, 以确定实际输入剂量。
- 在 18 hpi, 人道安乐死小鼠 (co2窒息, 然后颈椎脱位), 并使用无菌剪刀切开小鼠腹膜, 以收集肝脏的额叶使用单独的对推子和剪刀的外部和内部鼠标。将肝脏放入6厘米的培养皿中。
- 将肝脏切成小块, 放入一个带有磁性搅拌棒的玻璃瓶中。在没有 fcs 的情况下, 在 dmem 中重组 2 mgml 胶原酶 d 的2毫升。在37°c 的磁力搅拌器上培育小瓶30-45分钟。一旦组织同质化, 加入3毫升的 dmemmafcs 来灭活胶原酶。
- 通过70μm 的电池过滤器将细胞过滤到锥形管中, 必要时添加更多的 dmm传递 fcs。
- 在 800 x克离心细胞, 在4°c 下进行10分钟的颗粒, 去除上清液, 并在500μl 的 ack 缓冲液中悬浮细胞颗粒, 以裂解红血球。
- 在室温下在 ack 缓冲液中培养细胞5分钟。悬浮细胞在1毫升的 dmmsof fcs。
- 在 800 x克离心细胞, 在4°c 下进行颗粒化 10分钟, 去除上清液并悬浮在 dmem任何 fcs 的1毫升中。然后, 使用血细胞计或自动细胞计数器对细胞进行计数。
- 将 1 x 106个细胞转移到 1.5 ml 微离心管, 然后转接到颗粒。然后悬浮在1毫升的 dsh 2o和涡旋中裂解细胞。在未稀释的 lb 板上的板50μl 和在37°c 下孵育的 lb 板 50μl, 以枚举 lm 进行 cfu 分析。
- 根据细胞计数,将每个组织样本的 1 x 10 6个细胞转移到流式细胞仪管中, 并用1毫升的流式细胞仪缓冲液清洗。
- 在 800 x克离心细胞, 在4°c 下进行颗粒化 10分钟, 并去除上清液。
- 根据每个抗体和流式细胞仪缓冲液的推荐浓度, 准备一种含有感兴趣抗体的抗体。有关分析中使用的建议数量, 请参阅材料表。
- 悬浮在100μl 抗体鸡尾酒中的颗粒, 在4°c 的黑暗中孵育管30分钟。
- 孵育后, 在每个管中加入2毫升的流式细胞仪缓冲液, 并悬浮细胞。
- 在 800 x克离心细胞, 在4°c 时进行颗粒, 并丢弃上清液。然后将颗粒悬浮在400μl 的流式细胞仪缓冲液中立即使用, 如果储存后, 则将200μl 的流式细胞仪缓冲液和200μl 的 4% pfa 悬浮在一起。
- 流式细胞仪分析细胞 (见步骤 5.13)。
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Representative Results
评估病原体和宿主编码因素对细胞感染的影响
使用上述感染条件, 在与培养的巨噬细胞共同培养1.5 小时后, 将有0.15 的输入野生类型lm恢复 (图 1a)。在随后的1.5 小时共同孵化 (感染后 3小时, hpi) 中, 可行的lm的恢复增加了 4倍, 从 3 hpi 增加了4倍到 6 hpi, 存活可行的lm的恢复又增加了7.5倍。由于细胞不溶于细胞的抗生素庆相in 在 1 hpi 的共培养中被添加, 以消除细胞外的lm, 因此1.5 到 6 hpi 之间的活lm水平增加了 30倍, 这完全代表细胞内的增殖。
lm在真核细胞内化后迅速获得对细胞溶胶的访问 (见导言)。胞嘧啶与肌动蛋白聚合机械相关联, 这意味着它能推动自身穿透质膜。在上述体外感染试验中, 如果庆大霉素在 6 hpi 的时候从井中取出, 细胞外lm可以在1小时后 (7 hpi) 在覆盖介质中很容易被检测到 (图 1b)。没有从没有用巨噬细胞播种的控制井中找到 cfu, 但在其他方面被当作种子井处理, 从而表明细胞外lm的出现完全依赖于巨噬细胞的存在,不是不完全抗生素杀灭的结果 (未显示)。
lm在细胞内存活和增殖的能力在很大程度上取决于一组基因, 这些基因的表达受转录因子阳性调节因子 a (pr法)1的控制。最初, 野生类型的 lm菌株和 lm 突变菌株的恢复是相当的, 因为这个因素 (pr法) (图 1a)。然而, 经过长时间的共同孵化后,pr法菌株的回收率也随之降低, 因此 6 hpi 的回收率比 1.5 hpi 的回收率低3倍。在 7 hpi 的上覆介质中没有检测到 prfa 细菌 (图 1b).
pr法的活动在多个层面上受到规范。一些本构活跃的 pr法变种, 编码的超毒 prfa *等位基因, 已被分离 3.具有prfa * 的 lm菌株的初始感染特征与1.5 和 3 hpi 的同源野生型菌株相当 (图 1a)。然而, 在3到 6 hpi 之间, prfa *菌株的折叠增加与野生类型菌株有显著的差异。同样, 相对和预期, prfa *菌株很容易在覆盖介质中检测到 7 hpi 的水平, 大大超过了野生类型lm菌株的观察值 (图 1b)。
在其释放到细胞溶胶后, lm与细胞肌动蛋白聚合机制联系在一起, 导致细菌被聚合肌动蛋白包裹。为了证实细胞外lm来自受感染宿主细胞的富含体内素的细胞溶胶, 巨噬细胞要么没有感染, 要么感染了 prfA表达 pr法* 菌株, 并在1.5、4和 6 hpi 收集覆盖培养基,用结合聚合活性动蛋白的 phalloidin 染色, 流式细胞仪分析。培养基覆盖未感染和受感染的巨噬细胞含有光散射细菌大小的颗粒物 (图 2a), 然而, 只有来自受感染巨噬细胞的培养基在这个大小的门控范围内拥有 gfp 阳性信号(图 2b; 左面板)。在覆盖受感染巨噬细胞的介质中, 药物蛋白阳性lm的出现与时间有关的增加 (图 2b; 右三板)。在受感染巨噬细胞制备的裂解物中也检测到了非均地定阳性 gfp 表达 lm (图 2c; 左面板)。然而, 在巨噬细胞中培养的溶栓物中没有检测到 ph无关 idin 阳性 lm, 这种裂解液中含有 gfp 表达的 lm 突变体菌株, 缺乏诱导作用蛋白聚合机械所需的毒力因子 acta 在 lm释放到细胞溶胶后的外表面 (图 2c; 右面板)。这些数据支持一种情况, 即在体外感染模型 "紧急" 细胞外lm来自受感染的细胞细胞溶胶。
除了lm编码因素外, 还确定了一些影响lm细胞感染的宿主因素 (见讨论)。最近, 宿主因子 perforin-2 (p2) 已被证明是细胞级防御一些细菌病原体的关键组成部分。从野生类型(p2+/+) 和p2-/小鼠中分离的腹腔渗出巨噬细胞 (pem) 最初可与在 1 hpi 下的 cfu 检测相比较 (图 3a)。在p2+/+ pom中, 在 6 hpi 时回收的 cfu 数量比在 1 hpi 时回收的数量增加10倍。与先前公布的研究结果类似, 在p2-/pom中, 在 6 hpi 时回收的 cfu 数量比在 1 hpi4处回收的数量高80倍。与 p2+/+ pem中检测到的水平相比, 在覆盖介质中检测到的活lm水平增强了 p2/ /-pem中的细胞内增殖 (图 3b)。这些数据表明, 在体外检测中, 突发性细胞外lm的出现也可以报告影响感染的宿主因素。
肝脏的体内感染与分析
除了上述体外感染检测外, 还可以通过体内感染检测来评估野生型、减毒株和超毒性lm菌株的相对传染性。小鼠通过静脉共感染的野性和野性菌株的相等的混合物, 18小时后被人道地安乐死, 切除肝脏, 并进行单细胞制剂。分离的肝细胞被裂解, 由此产生的裂解物进行 cfu 检测, 可以区分野生类型和普尔普拉姆菌株。与原接种器中这两个菌株的1:1 比 ("输入") 相比, 18 hpi ("输出") 的野生类型比大大小于统一 (6个小鼠的范围为0.001 至 0.001; 平均 0.001) (图 4)。相反, 与野生类型和pr法 * lm 相同混合物共同感染的小鼠株, prfa*/野生类型比率从2.4 到 10.2 (平均 7.1) 不等。本实验表明, 这三种lm菌株 (野生型、pr法和prva *) 在完整生物体中的相对传染性与体外感染检测中观察到的相似。
还可以对宿主进行监测, 以确定野生类型、pr法和pr法* 菌株的不同传染性水平是否与先天免疫反应的相应等级有关。此前已经证明, 常驻巨噬细胞 (库弗细胞) 和浸润炎症单核细胞和中性粒细胞在保护肝脏在lm 感染 5,6, 7,8。用细胞类型特异性标记对未感染的小鼠和感染gfp表达野生 lm 菌株18小时的小鼠进行染色, 并通过流式细胞仪进行分析。就肝脏的非免疫细胞 (如肝细胞和内皮细胞) 而言, 未感染的小鼠和受感染的小鼠之间没有可检测到的差异。与此形成对照的是, 在白细胞共同抗原 cd45 的免疫细胞中, 免疫细胞的比例发生了显著的感染相关变化 (图 5a)。具体而言, 感染野生类型和prfa * lm菌株的小鼠肝脏中 cd45 + 细胞的水平明显高于未感染的小鼠, 而感染的小鼠的 cd45 + 肝细胞水平减毒的株与未感染小鼠的水平无明显差异。为了进一步描述常驻和浸润免疫细胞群, cd45+细胞可以进一步亚型。正如其他人所观察到的, 感染的一个显著变化是居住在 küpffer 细胞 (cd11b中fn 80+) 在肝脏中几乎完全消失, 同时出现了明显的 cd11bhi 群体代表浸润中性粒细胞的细胞 (图 5b; 中下部面板)。也出现在肝脏 18 hpi, 是 cd11b中fn 80-细胞出现, 因为他们也是 ly6chi,代表浸润炎症单核细胞 (图 5b; 下中部和右面板)。在受感染的小鼠中, 后一种细胞是感染 18 hs 后检测到明显 gfp 信号的唯一细胞 (图 5c)。后一种发现与琼斯和德拉齐奥最近报告的结果相似, 后者表明, 在小鼠中, lm主要与在食源性感染后渗入肠道的 ly6chi 单核细胞有关.感染 lm的小鼠肝脏 cd45 喜 细胞的分布类似于未感染的小鼠, 而感染剧毒lmprfa *菌株的小鼠的维度略有提高。与感染野生类型lm菌株的小鼠相比, 浸润中性粒细胞和炎症性单核细胞 (数据未显示)。
图 1:单核细胞增生李斯特菌 (lm) 感染巨噬细胞.小鼠巨噬细胞系 raw 264.7 在体外感染了野生类型的 lm (wt; 填充的圈子)、衰减的 lm (pra; 开放的圆圈) 或剧毒的毒力 (pra *; 开放的方块) lm菌株(有关详细信息, 请参阅文本)。(a) 在感染后1.5、3和 6小时 (hpi) 时, 对巨噬细胞进行裂解, 并通过菌落形成单元 (cfu) 分析细胞含量。(b) 用抗生素庆大霉素对感染巨噬细胞进行简要处理, 以消除非内化lm , 并在 6 hpi 时, 用 cfu 法收集和分析覆盖介质。虚线表示检测的检测极限。每个数据点代表一个独立的井感染, p 值由学生的 t 检验确定。显示的是一次具有代表性的实验的结果, 实验进行了三次, 结果相似。请点击这里查看此图的较大版本.
图 2: 流式细胞仪分析的压音结合 lm。小鼠巨噬细胞系 raw 264.7 要么未感染, 要么体外感染gfp表达 lm。覆盖介质被去除, 离心, 并收集的材料染色的阿克素结合法洛伊丁。流式细胞仪对染色材料进行了分析, 显示的是光散射图 (a), 用于 gfp 和 phalloidin-associated 相关的细胞外 (即介质衍生) lm (b)中显示的门控.(b) 所示区域代表 gfpn 双正lm及其丰度占光散射门内总事件的百分比。(c)小鼠巨噬细胞感染 gfp 表达lm或 gfp 表达 lm 菌株 , 缺乏编码 acta (acta) 的基因, 将宿主细胞的位致实反应机制招募到lm细胞表面。在 6 hpi 时, 对受感染的细胞进行裂解, 并对包括细胞内lm在内的释放细胞内容物进行肌动蛋白染色, 并采用流式细胞仪进行分析。显示的是一次具有代表性的实验的结果, 实验进行了三次, 结果相似。请点击这里查看此图的较大版本.
图 3: 野生型和环素-2 敲除巨噬细胞的感染。从野生类型 (p2+/+;填充环) 或敲除 (p2-/;点状圆圈) 中分离出的腹腔巨噬细胞在体外被 lm 感染. (a) 在1和 6 hpi 时, 用 cfu 法对巨噬细胞进行裂解, 并对细胞含量进行分析。(b) 用抗生素庆大霉素对感染的腹腔巨噬细胞进行了简要治疗, 并在2.5 和 6 hpi 时, 用 cfu 法收集和分析了覆盖介质。每个数据点代表一个独立的井感染, p 值由学生的 t 检验确定。显示的是一次具有代表性的实验的结果, 实验进行了三次, 结果相似。请点击这里查看此图的较大版本.
图 4: 鼠标的lm 感染.由6只小鼠组成的群体感染了野生类型的 lm (wt) 和衰减lm (prf) 菌株的相等混合物, 或者是野生类型lm和剧毒菌株 (pra *) 的相等混合物。采用 cfu 法测定了 18 hpi 小鼠肝脏中的lm负荷。在这个实验中, 野生型lm菌株拥有一种抗生素耐药基因, 使其能够区别于抗生素敏感的lm突变菌株。在含抗生素和不含抗生素培养基上进行了肝脏同质体的镀膜, 并绘制了突变体和野生lm的比例。虚线表示感染剂量的 mutant/野生类型比率。两组小鼠野生 lm 的绝对水平分别为12和 15 cfue10 6个肝细胞.显示的是一次具有代表性的实验的结果, 结果相似。请点击这里查看此图的较大版本.
图 5: 小鼠肝脏lm感染的免疫反应.小鼠在18小时内被 fp 表达 lm 株 2 x 10 5 cfu 感染, 并采用流式细胞仪分析肝脏单细胞制剂的免疫和骨髓特异性标记表达。(a) 免疫特异性细胞表面标记 cd45 + 的细胞染色百分比, 每 10个6个孤立的活肝细胞总数, 用于未感染的小鼠和感染野生类型 (wt lm) 的小鼠,减毒 (prfa), 或剧毒 (pra *) lm菌株。绘制的是每组3只小鼠的平均值, p 值是由学生的 t 检验确定的。(b) 左侧面板上显示的是单个未感染的小鼠 (上图) 和单个wt lm感染 (下) 的 cd45 染色肝细胞的染色特征;在中间板显示了骨髓特异性标记 cd11b 和 f480的表达水平;在右侧面板上显示指示门控单元的 ly6c 表达水平。在最右边的面板显示 ly6c+细胞的覆盖物从未被传染和被传染的小鼠包括百分比和平均荧光强度 (mfi) cd11b+ f480-细胞正面为表明的 ly6c 门。显示的是每组3只老鼠的代表性鼠标。(c) 采用流式细胞术分析了未感染和感染小鼠肝脏中产生的 ly6c + 细胞 (描述 (b); 中、右面板) 对 gfp表达的影响。请点击这里查看此图的较大版本.
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Discussion
由于其快速和持续的细胞感染计划, lm是一个理想的病原体, 探索细胞活动, 影响感染。已经确定了一些对lm细胞感染 11、12、13、14的积极或消极影响的宿主因素。在我们的实验室中表征的两个这样的宿主因子, 即 Perforin-2 和 heme 管制抑制剂 (p2 和 hi), 调节了 lm感染过程的显著特征。如图 3所示, p2 缺乏细胞对lm极易受到影响, 这种增强的敏感性也适用于 p2 敲除小鼠4。对 p2 表达和缺乏 p2 的巨噬细胞进行的详细比较研究表明, 后者形成了高度酸化的含lm的噬菌体, 从而增强了毒力基因的表达。差异毒力基因表达有助于增强 p2 缺乏巨噬细胞易感性的假设得到了支持, 发现超毒性prf *菌株, 如前所述, 表达毒力基因在一个构成上高水平, 被传染的 p2 表达和 p2 缺乏的巨噬细胞同样好4。因此, 由于超毒性lm菌株的可用性, 有可能检验 p2 宿主因子对病原体毒力因子的部署有负面调节的假设。对于 hi, 我们表明, 这个宿主因子调节细胞内贩运的lm , 使其从受感染的细胞的出现受到限制;这种细胞活性可能是 hi 缺乏小鼠对 lm感染的敏感性增强的基础,15, 16.
在记录感染后几分钟内发生的细胞活动的研究中, 至关重要的是, 在共同培养之前, 细菌和宿主细胞都不能过度暴露在波动的温度或其他环境中可能激活压力反应的条件, 将重叠 (和混淆) 感染引起的活动。对于上述研究, 这包括一些看似简单的问题, 比如在开始感染之前尽量减少lm的处理时间。例如, 如果细菌培养物从晃动的37°c 孵化器中取出, 并允许坐在板凳顶部, 温度和氧气供应量的变化 (除其他外) 都会激活可能影响随后初始阶段的适应与宿主单元的交互。同样, 宿主细胞也对温度和介质变化敏感, 这些变化可能会影响最初的感染反应。虽然在实践中不可能完全消除细菌和宿主细胞培养条件的所有波动, 但通过尽可能地减少这些波动和制定标准的作业计划, 将最大限度地减少实验之间的差异。
另一个变量, 在我们看来, 其重要性也没有得到充分重视, 是在细胞培养感染模型中使用抗生素的变量。庆达霉素通常是首选抗生素, 因为它对真核质膜相对不透。在较旧和当前的文献中, 它通常以50μgml 的形式用于杀死细胞外 (即非内化) 细菌。最近已经直接证明, 当存在于25μgml 时, 庆大霉素在真核膜上有足够的扩散, 可以杀死细胞内lm17。根据我们的经验, 这种水平的庆大霉素在接触后立即杀死lm , 而在2至5μgml 范围内, 这种水平会立即杀死 lm, 在不到 5分钟的4分钟内杀死 & gt;99.9% lm. 劳伦茨和他的同事已经证明, 广泛使用的庆大霉素浓度为25–50μg/ml 也足以杀死细胞内鼠疫耶尔森菌18。有趣的是, 该组还显示了细胞类型之间在庆大霉素渗透率方面的显著差异, 突出表明, 每个病原体-宿主细胞配对都应确定最佳条件。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ACK Lysing Buffer | Gibco | A1049201 | |
| ArC Amine Reactive Compensation Beads | Life Technologies | A10346 | |
| BHI (Brain Heart Infusion) broth | EMD Milipore | 110493 | |
| Cell Strainer, 70 µm | VWR | 10199-656 | |
| Collagenase D | Roche | 11088858001 | |
| DMEM media | Gibco | 11965-092 | |
| FACS tubes | BD Falcon | 352054 | |
| FBS - Heat Inactivated | Sigma-Aldrich | F4135-500ML | |
| Hanks’ Balanced Salt solution | Sigma-Aldrich | H6648-6X500ML | |
| LB agar | Grow Cells MS | MBPE-4040 | |
| LIVE/DEAD Fixable Yellow Dead Cell Stain kit | Life Technologies | L349S9 | |
| Rhodamine Phalloidin | Thermo Fischer | R415 | |
| SP6800 Spectral Analyzer | Sony | ||
| Syringe 28 G 1/2" 1cc | BD | 329461 | |
| TPP Tissue Culture 48 Well Plates | MIDSCI | TP92048 | |
| TPP Tissue Culture 6 Well Plates | MIDSCI | TP92406 | |
| UltraComp eBeads | eBioscience | 01-2222-42 | |
| Antigen | |||
| CD11b | Biolegend | Flurochrome = PE Cy5, Dilution = 1/100, Clone = M1/70 | |
| CD11c | Biolegend | Flurochrome = AF 647, Dilution = 1/100, Clone = N418 | |
| CD45 | Biolegend | Flurochrome = APC Cy7, Dilution = 1/100, Clone = 30-F11 | |
| F4/80 | Biolegend | Flurochrome = PE, Dilution = 1/100, Clone = BM8 | |
| Live/Dead | Invitrogen | Flurochrome = AmCyN, Dilution = 1/100 | |
| Ly6C | Biolegend | Flurochrome = PacBlue, Dilution = 1/200, Clone = HK1.4 | |
| MHC II | Biolegend | Flurochrome = AF 700, Dilution = 1/200, Clone = M5/114.15.2 | |
| NK 1.1 | Biolegend | Flurochrome = BV 605, Dilution = 1/100, Clone = PK136 |
References
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