Summary
Descriviamo entrambe le analisi in vitro e in vivo di infezione che possono essere utilizzate per analizzare le attività dei fattori ospite-codifica.
Abstract
Ci sono una varietà di strategie che impiegano batteri patogeni di sopravvivere e proliferare una volta all'interno della cellula eucariotica. I cosiddetti 'citosolici' patogeni (Listeria monocytogenes, Shigella flexneri, Burkholderia pseudomallei, Francisella tularensise Rickettsia spp.) accedere al cytosol delle cellule infette da fisicamente ed enzimaticamente degradare la membrana vacuolar primaria. Una volta nel cytosol, questi agenti patogeni sia proliferano, nonché generano sufficienti forze meccaniche di penetrare la membrana plasmatica della cellula ospite al fine di infettare nuove cellule. Qui, ci mostrano come questa fase terminale del ciclo cellulare infezione di L. monocytogenes (Lm) può essere quantificata da saggi di unità formanti colonie e citometria a flusso e dare esempi di come sia effetto di fattori patogeno-ospite con codifica e questo processo. Mostriamo anche una stretta corrispondenza delle Lm dinamiche di infezione delle cellule coltivate infettate in vitro e quelli delle cellule epatiche derivate da topi infettati in vivo. Questi saggi basati sulla funzione sono relativamente semplici e possono essere facilmente scalati per schermi di alto-rendimento basata su individuazione per modulatori della funzione delle cellule eucariotiche.
Introduction
Modelli sperimentali basati su infezione sono intrinsecamente impegnativi a causa della loro dipendenza dalle condizioni di partenza dello stato di ospite e patogeno, le varie strategie di infezione del patogeno e la difficoltà di attribuzione dell'agente patogeno e host-processi basati basato sui risultati. Il batterio Listeria monocytogenes (Lm) è diventato un agente patogeno ideale per sondare le risposte di difesa ospite a causa della sua trattabilità genetiche e microbiologiche, la strategia di infezione cellulare rapida e processive e relativamente chiaro relazione tra suoi fenotipi di infezione cellulare e organismica livello. L'infezione cellulare di Lm procede attraverso quattro fasi distinte1: (i) l'invasione cellulare che si conclude con Lm essere racchiuso all'interno di un vacuolo; (ii) Lm-diretto la dissoluzione della membrana del vacuolo e rilascio di Lm nel citosol; (iii) replica intracytosolic; e (iv) penetrazione fisica della membrana plasmatica che si traduce in entrambi l'infezione delle cellule direttamente adiacenti (ad esempio in un foglio di epiteliale) o, in cellule solitarie, rilascio di Lm nell'ambiente extracellulare. Ognuna di queste fasi sono promossi da specifici Lm-codificato fattori (denominati «fattori di virulenza») che, quando eliminato, causare difetti di infezione nei modelli animali e cellulari. Questa strategia di infezione generale è stata evoluta indipendentemente da un numero del cosiddetto 'citosolico' patogeni2.
Formanti colonie (CFU) unità saggi sono largamente impiegate per valutare sia in vitro (cioè, cellulare) in vivo (cioè, organismica) esiti di infezione. Oltre alla loro alta sensibilità, specialmente per le infezioni in vivo, CFU saggi forniscono una lettura univoca per l'invasione dell'agente patogeno e sopravvivenza/proliferazione intracellulare. Saggi di CFU sono stati ampiamente utilizzati per analizzare Lm sia host determinanti delle cellule che hanno un impatto infezione. Come informativo come questi studi precedenti sono stati per analizzare l'invasione cellulare e intracytosolic replica, CFU saggi non sono, al meglio della nostra conoscenza, stati utilizzati per tenere traccia della quarta fase del processo di infezione Lm : fuga cellulare. Qui, descriviamo relativamente semplici mezzi di fuga come cellulare (in appresso denominato 'emersione') possono essere monitorati mediante analisi CFU (così come da citometria a flusso) e visualizza esempi di come entrambi fattori patogeno-ospite con codifica e regolano questa fase di Lm ciclo di infezione. L'analisi della fase terminale del ciclo cellulare Lm infezione può rendere possibile identificare l'agente patogeno supplementare e fattori di infezione specifica cellula ospite e attività.
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Protocol
Topi sono stati trattati umanamente secondo tutte le linee guida di governo appropriati per la cura e l'uso di animali da laboratorio del National Institutes of Health e il loro uso è stati approvati per questo intero studio della cura degli animali istituzionale Università di Miami e uso Comitato (protocollo 16-053).
1. preparare le celle per infezione
- Propagare la linea di macrofago-come delle cellule di topo 264,7 in terreni di coltura di tessuto DMEM completati con 10% di siero fetale di vitello (d'ora in poi denominato DMEM/FCS) utilizzando un pallone da 125 mL e un incubatore di coltura del tessuto mantenuta a 37 °C/5% CO2.
- Il giorno prima dell'infezione, utilizzare un raschietto di cella per rimuovere le cellule dal pallone di espansione e raccogliere in una provetta conica da 15 mL tappo a vite. Centrifugare le cellule a 800 x g per 10 min, decantare il supernatante e sospendere il pellet cellulare in 1 mL di DMEM/FCS (senza antibiotici) e determinarne il titolo usando un contatore automatizzato delle cellule o un emocitometro.
-
Regolare titolo a 2 x 106 cellule/mL e aggiungere 0,10 mL (2 x 105 cellule) dei pozzetti di una piastra di coltura del tessuto 48 pozzetti. Garantire che la sospensione cellulare copre l'intera superficie del pozzo.
- Cellule di piastra in ulteriori pozzi per una fonte successiva dei media condizionati. Inoltre posizionare 0,10 mL di DMEM/FCS in ulteriori tre pozzi per servire come un 'nessun controllo di cella'.
- Incubare per una notte in un incubatore di coltura del tessuto a 37 °C/5% CO2. Il giorno successivo, non rimuovere dalla incubatrice fino a quando l'inoculo del batterio è preparato e pronto all'uso.
2. preparazione Listeria monocytogenes (Lm) per infezione
- Inoculare 2 mL di infusione cervello-cuore (BHI) con una singola Colonia da una piastra di agar appena striato (< 2 giorni) di Lm e incubare per una notte a 37 ° C con agitazione a 130 rotazioni/min.
- Il giorno successivo, aggiungere 0,10 mL di coltura durante la notte a 2 mL pre-riscaldati BHI e continuare fino a quando la densità ottica (OD600) è compreso fra 0,4 e 0,6 in incubazione a 37 ° C con agitazione.
- Determinarne approssimativo titolo batterica utilizzando una formula di conversione empiricamente derivati. Nel nostro laboratorio, una cultura di Lm in crescita esponenziale in BHI è circa 1.3 x 109 Colonia formando unità (CFU) /OD600. Ridurre al minimo la quantità di tempo le colture batteriche sono esposti a temperatura ambiente.
- Appena prima dell'infezione è necessario regolare il titolo a 5 x 107 CFU/mL utilizzando pre-riscaldato DMEM/FCS come diluente.
3. infezione
- Lavorare rapidamente e con precisione, aggiungere 20 µ l (1 x 106 CFU; molteplicità di infezione, MOI = 5) dell'inoculo da Lm preparata (passaggio 2.4 sopra) ai pozzetti inclinando leggermente il piatto e posizionando accuratamente il puntale in media sovrastanti;
Nota: evitare di toccare le pareti del pozzo con il puntale. - Delicatamente dispensare il contenuto di ogni pozzetto per garantire la completa miscelazione; non agitare o significativamente inclinare il piatto come questo si diffonderà Lm sopra le pareti del pozzo. 37 °C/5% CO2 incubator, tornare piastra di coltura delle cellule.
- Preparare una soluzione di gentamicina 10 µ g/mL usando media condizionati da pozzi non infetti come diluente.
- A 30 minuti post infezione (mpi), attentamente aggiungere 30 µ l della soluzione di gentamicina (concentrazione finale di 2,5 µ g/mL) e delicatamente dispensare il contenuto del bene come prima e piastra di coltura cellulare ritorno all'incubatore a 37 °C/5% CO2 .
- A 60 mpi, vendemmia appositi pozzetti per analisi di CFU (60 mpi punto di tempo) o analisi FCM (come descritto di seguito nelle sezioni 4 e 5, rispettivamente).
- Per pozzetti rimanenti, in tempi diversi da allora in poi sia raccogliere le cellule come prima o, per il dosaggio di emersione Lm , interamente di rimuovere il supporto dal pozzo e sostituire con 150 µ l di gentamicina-free media condizionati.
4. elaborazione ed analisi di intracellulare ed emergente Lm dall'analisi di CFU di campionamento
- Per raccogliere, inclinando leggermente il piatto e rimuovere con attenzione il supporto intero dal pozzo. Aggiungere 0,50 mL di acqua distillata sterile (dsH2O). Dopo 30 s, trasferire l'acqua risultante lisato (100) in una provetta per microcentrifuga da 1,5 mL e agitare vigorosamente per 10 s.
- Preparare 10-1 e 10-2 diluizioni aggiungendo o 4,5 µ l o 50 µ l di acqua lisato a 450 µ l di dsH2O e brevemente vortex per garantire la completa miscelazione.
- Diffusione di 50 µ l del 100, 10-1 e/o 10-2 campioni su piastre di agar Lisogenesi brodo (LB).
- Dosaggio per emergente Lm (passo 3.6 sopra), rimuovere 10 µ l di media sovrapposizione e dividerlo in aliquote di due 5 µ l: ad un'aliquota aggiungere 5 µ l di DMEM/FCS e per la seconda aliquota aggiungere 5 µ l di DMEM/FCS contenente 5 µ g/mL Gentamicina. Il controllo di quest'ultimo distingue tra extracellulare Lm (gentamicina sensibile) e intracellulare Lm (gentamicina resistente) nel CFU successivo analisi.
- Dopo 5 min a temperatura ambiente, aggiungere 90 µ l di dsH2O, vortexare vigorosamente per 10 s e diffusione 50 µ l su piastre di agar LB.
- Enumerare Lm colonie su piastre di agar LB dopo 2 giorni di incubazione a 37 ° C.
5. campionamento di elaborazione ed analisi di intracellulare ed emergente Lm da citometria a flusso (FCM)
- Preparare 264.7 celle grezze come descritto ai punti 1.1-4. Regolare le cellule a 1 x 106 cellule/mL e aggiungere 1 mL (1 x 106 cellule) dei pozzetti di una piastra di coltura del tessuto 6 pozzetti.
- Preparare l'inoculo del batterio come descritto al punto 2.1-2.3 e infettare le cellule con volume di inoculo corrispondente a un MOI di 50 (5 x 107 CFU).
- A 1,5 ore post infezione (hpi), raccogliere media dalla prima serie di pozzi e mettere in una provetta da microcentrifuga da 1,5 mL con 500 µ l di paraformaldeide al 4% (PFA) e posto sul ghiaccio fino a quando tutti i pozzetti sono stati elaborati.
- Per raccogliere intracellulare Lm, aggiungere 1 mL di dsH2O al pozzo e dopo 60 s, trasferire l'acqua risultante lisato di una provetta da microcentrifuga da 1,5 mL con 500 µ l di 4% PFA. Vortexare vigorosamente per 10 s e posto su ghiaccio fino a quando tutti i pozzetti sono stati elaborati. (Elaborazione del campione è descritta nel passaggio 5.8 qui sotto).
- Per pozzetti rimanenti, rimuovere i supporti e sostituire con 1 mL di DMEM/FCS con 5 gentamicina µ g/mL per uccidere extracellulare Lm e restituire immediatamente le cellule a incubatore.
- Dopo 30 min (2 hpi) rimuovere i supporti e sostituire con DMEM/FCS senza gentamicina.
- Dopo 2 e 4 h (4 e 6 hpi) prendere la seconda e la terza volta punti raccogliendo media e lisati come punti 5.3 e 5.4.
- Centrifugare le provette a 10.000 x g per 7 min. Remove surnatante senza pellet inquietante.
- Sospendere ogni pallina nella macchiatura cocktail di 50 µ l di 4% PFA e 15 µ l di falloidina. Incubare le provette al buio a 4 ° C per 20 min.
- Dopo incubazione aggiungere 1 mL di tampone di FACS a ciascuna provetta e pipetta su e giù per mescolare.
- Gira tubi a 10.000 x g per 7 min. Remove surnatante senza pellet inquietante.
- Sospendere ogni pellet in 400 µ l di tampone di FACS per uso immediato, o 200 µ l di tampone di FACS e 200 µ l di 4% PFA se per un'analisi successiva.
- Eseguire i campioni su un flusso cytometry e analizzare i dati raccolti.
6. elaborazione ed analisi di colonizzazione di Lm e risposte dell'ospite nel fegato di campionamento
- Preparare Lm per infezione come descritto al punto 2.1-2.3.
- Calcolare la quantità necessaria di sottocultura per titolo desiderato di 3 x 106 CFU/mL.
- Appena prima dell'infezione diluire la quantità di batteri calcolati con pre-riscaldato di Hank bilanciato sale soluzione (HBSS) in un volume finale di 1 mL. Questo è l'inoculo di input che viene iniettato nel mouse.
- Usando una siringa da insulina 100U g ½ 28, disegnare 100 µ l (3 x 105 CFU) di ingresso dell'inoculo e rimuovere eventuali bolle d'aria visibili.
- Inserire il mouse (ceppo C57BL/6; maschi tra 6 e 12 settimane) il sistema di ritenuta della holding e utilizzare acqua tiepida (non più di 45 ° C) per dilatare la vena della coda, quindi iniettare l'inoculo ingresso nella vena.
- Piastra 10-2 e 10-3 diluizioni dell'inoculo ingresso su piastre LB agar 10bcm e incubare per una notte a 37 ° C per determinare il dosaggio di ingresso effettivo.
- Alle 18 hpi, umanamente eutanasia mouse (CO2 asfissia seguita da dislocazione cervicale) e usando il peritoneo del mouse Apri taglio forbici sterili per raccogliere del lobo frontale del fegato utilizzando singole paia di forbici e pinzette per l'esterno e all'interno di il mouse. Posizionare il fegato in un 6cm di Petri sul ghiaccio.
- Tagliare il fegato a dadini e inserire in un flaconcino di vetro con un'ancoretta magnetica. Aggiungere 2 mL di collagenasi di 2 mg/mL D ricostituito in DMEM senza FCS. Incubare le fiale a 37 ° C su un agitatore magnetico per 30−45 min. Una volta che il tessuto è omogeneizzato, aggiungere 3 mL di DMEM/FCS per inattivare la collagenosi.
- Filtrare le cellule attraverso un colino di cella di 70 µm in un tubo conico, eventualmente aggiungendo ulteriori DMEM/FCS.
- Centrifugare le cellule a 800 x g per pellet a 4 ° C per 10 min, rimuovere il surnatante e sospendere il pellet cellulare in 500 µ l di tampone ACK per lisare cellule rosse del sangue.
- Incubare le cellule a temperatura ambiente per 5 min nel buffer di ACK. Sospendere le cellule in 1 mL di DMEM/FCS.
- Centrifugare le cellule a 800 x g per pellet a 4 ° C per 10 min, rimuovere il surnatante e sospendere in 1 mL di DMEM/FCS. Quindi, contare le celle utilizzando un contatore automatizzato delle cellule o un emocitometro.
- Trasferimento 1 x 106 cellule in provetta per microcentrifuga da 1,5 mL e spin a pellet. Quindi sospendere in 1 mL di dsH2O e vortexare per lisare le cellule. Piastra 50 µ l su piastre LB a non diluito e 10-2 diluizioni e incubare a 37 ° C per enumerare Lm per analisi CFU.
- 1 x 106 cellule di trasferimento nelle provette di FACS per ogni campione di tessuto secondo i conteggi delle cellule e lavare con 1 mL di tampone di FACS.
- Centrifugare le cellule a 800 x g a pellet a 4 ° C per 10 minuti e rimuovere il surnatante.
- Preparare un cocktail di anticorpi che contiene gli anticorpi di interesse basato sulla concentrazione consigliata per ogni anticorpo e FACS buffer. Vedi Tabella materiali per gli importi raccomandati utilizzati nell'analisi.
- Sospendere il pellet in 100 µ l di anticorpo cocktail e incubare le provette al buio a 4 ° C per 30 min.
- Dopo l'incubazione, aggiungere 2 mL di buffer di FACS in ogni provetta e sospendere le cellule.
- Centrifugare le cellule a 800 x g a pellet a 4 ° C e scartare il surnatante. Quindi sospendere il pellet in 400 µ l di tampone di FACS per uso immediato, o 200 µ l di tampone di FACS e 200 µ l di 4% PFA se per più tardi.
- Analizzare le cellule tramite flusso cytometry (Vedi punto 5.13).
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Representative Results
Valutare il ruolo dell'agente patogeno e codificata in host fattori che incidono infezione cellulare
Utilizzando le condizioni di infezione sopra descritte, 0,15% del selvaggio-tipo ingresso Lm viene recuperato dopo 1,5 h di co-incubazione con macrofagi coltivati (Figura 1A). Nei successivi 1,5 h di co-incubazione (3h post infezione, hpi), c'era un aumento di 4 volte nel recupero di vitali Lm e da 3 a 6 hpi c'era un ulteriore aumento di 7.5-fold nel recupero di vitali Lm. Poiché la cella-impermeabile antibiotico Gentamicina viene aggiunto alle co-culture a 1 hpi per eliminare extracellulare Lm, il 30-fold aumento livelli sostenibili di Lm tra 1,5 e 6 hpi rappresenta esclusivamente proliferazione intracellulare.
LM accede rapidamente al cytosol seguendo l'internalizzazione all'interno delle cellule eucariotiche (Vedi Introduzione). Citosolico Lm associa con il macchinario di polimerizzazione dell'actina con quali mezzi aziona sé capace di penetrare la membrana plasmatica. Nell'analisi della infezione in vitro descritto sopra, se la gentamicina viene rimosso dai pozzi alle 6 hpi, extracellulare Lm può essere facilmente individuata 1 h più successivamente (7 hpi) nei media sovrastanti (Figura 1B). Nessun CFUs sono stati recuperati da pozzetti di controllo che non sono state seminate con macrofagi ma che altrimenti sono stati trattati in modo identico come teste di serie pozzi, mostrando così che l'aspetto di extracellulare Lm dipendeva interamente la presenza di macrofagi e non un risultato incompleto abbattimento antibiotico (non mostrato).
La capacità di Lm per sopravvivere e proliferare intracellulare dipende in larga misura da una suite di geni la cui espressione sono controllati dal fattore di trascrizione fattore regolatore positivo (PrfA)1. Inizialmente, c'è un recupero comparabile dello sforzo selvaggio-tipo Lm e un ceppo mutante di Lm eliminato per questo fattore (ΔprfA) (Figura 1A). Tuttavia, c'è una successiva riduzione nel recupero del ceppoprfA Δ dopo co-incubazione prolungata tale che il recupero alle 6 hpi è 3 volte di meno che il recupero a 1,5 hpi. Tale proposito e come previsto, i batteri ΔprfA non sono stati rilevati nei media sovrastanti alle 7 hpi (Figura 1B).
L'attività di PrfA è regolata a più livelli. Un numero di varianti di PrfA costitutivamente attivi, codificati da iper-virulento prfA * alleli, è stati isolati3. Un ceppo di Lm che possiede un prfA * ha un profilo di infezione iniziale che è paragonabile al ceppo selvaggio-tipo isogeniche con 1,5 e 3 hpi (Figura 1A). Tuttavia, tra 3 e 6 hpi, l'aumento di volte dello sforzo di prfA significativamente diversa da quella del ceppo selvaggio-tipo. Ancora una volta, tale proposito e come previsto, il ceppo di prfA è stato rilevato prontamente nei media sovrastanti alle 7 hpi a livelli che significativamente superiore a quello osservato per il ceppo di Lm di selvaggio-tipo (Figura 1B).
Dopo il suo rilascio nel citosol, Lm si associa con il macchinario di polimerizzazione dell'actina cellulare che si traduce nel batterio lasciarsi avvolto da actina polimerizzata. Per confermare che extracellulare Lm è derivato dal cytosol actina-ricchi della cellula ospite infetto, macrofagi erano verso sinistra non infetti o infetti con un ceppo di GFP-esprimendo prfA * e i media sovrastanti è stato raccolto a 1.5, 4 e 6 hpi, macchiato con falloidina che lega actina polimerizzata e analizzati tramite flusso cytometry. Media sovrapponendo i macrofagi infetti e non infetti contenute dimensioni batterio luce-dispersione di polveri sottili (Figura 2A), tuttavia, media solo da macrofagi infetti posseduto segnali di GFP-positivi all'interno di questa dimensione gating (Figura 2B; pannello di sinistra). C'era un aumento dipendente dal tempo nell'aspetto dei macrofagi di Lm nei media sovrapponendo infettati falloidina-positivi (Figura 2B; in tre pannelli). Falloidina-positive che esprimono GFP Lm inoltre sono stati rilevati nei lysates preparato da macrofagi infetti (Figura 2C; pannello di sinistra). Tuttavia, nessun falloidina-positivi Lm è stato rilevato nei lysates preparato dai macrofagi infettati con un ceppo mutante che esprimono GFP Lm che mancava il fattore di virulenza ActA che è necessaria per reclutare i macchinari di polimerizzazione dell'actina per la superficie esterna del Lm dopo il suo rilascio nel citosol (Figura 2C; pannello di destra). Questi dati sostengono uno scenario che in un'infezione in vitro modello 'emergente' extracellulare Lm sono derivati dal cytosol delle cellule infette.
Oltre Lm-che codificano per fattori, un numero di host fattori sono stati identificati che impatto infezione cellulare Lm (Vedi discussione). Recentemente, il fattore di host perforina-2 (P2) ha dimostrato di essere una componente critica del cellula-livello difese contro un numero di batteri patogeni. Macrofagi peritoneali dell'essudato (PEMs) isolati da wild-type (P2+ +) e P2- / - topi inizialmente in modo paragonabile sono infettati da Lm come misurata dall'analisi CFU a 1 hpi (Figura 3A). In P2+ + PEMs recuperato il numero di CFU alle 6 hpi è 10 volte maggiore rispetto ai livelli del recuperato a 1 hpi. Simile ai risultati precedentemente pubblicati, in P2- / - PEMs recuperato il numero di CFU alle 6 hpi è 80-fold maggiore rispetto ai livelli del recuperato a 1 hpi4. Enhanced Lm proliferazione intracellulare in P2- / - PEMs è stata accompagnata con maggiori livelli di vitali Lm rilevato nei media sovrastanti rispetto ai livelli rilevati in P2+ + PEMs ( Figura 3B). Questi dati mostrano che in un'analisi in vitro che la comparsa di emergente extracellulare Lm può inoltre segnalare su fattori dell'ospite che l'infezione di impatto.
Analisi del fegato e infezione in vivo
Oltre i saggi di infezione in vitro sopra descritti, l'infettività relativa dei ceppi Lm wild-type, attenuati e iper-virulento può essere valutato anche dalle analisi di infezione in vivo. I topi erano per via endovenosa co-infetti con una miscela uguale di wild-type e ΔprfALm ceppi e 18 h più successivamente sono stati eutanasizzati umanamente, fegati cellulare asportato e singole preparazioni sono state fatte. Le cellule di fegato isolate sono state lisate e i lisati risultanti sottoposti ad un'analisi CFU che potrebbero distinguere fra i ceppi diprfALm wild-type e Δ. Rispetto al rapporto di 1:1 tra questi due ceppi nell'inoculo originale ('input'), il rapporto di /wild type diprfAΔ alle 18 hpi (il ' output') era considerevolmente di meno che l'unità (per 6 topi gamma era 0,001 a 0.330; media 0.100) (Figura 4). Al contrario, topi co-infetti con una miscela uguale di wild-type e prfA * Lm ceppi i rapporti /wild type prfA *ha variati da 2,4 a 10.2 (media 7.1). Questo esperimento mostra che l'infettività relativa di questi tre ceppi di Lm (wild-type, ΔprfAe prfA *) in un organismo intatto è simile a quella osservata nelle analisi di infezione in vitro.
L'host può anche essere controllata per determinare se il variabile livello di infettività del selvaggio-tipo, ΔprfAe ceppi di prfA sono associati con una gradazione corrispondente della risposta immunitaria innata. Precedentemente è stato indicato quello residente macrofagi (cellule Küpffer) e infiltrazione infiammatori monociti e neutrofili giocare ruoli critici e interdipendenti nella protezione del fegato durante Lm infezione5,6, 7,8. Le cellule preparate da topi non infetti e topi infettati con il ceppo di Lm che esprimono GFP wild type per 18 h erano macchiate con indicatori specifici del tipo delle cellule e analizzate tramite flusso cytometry. In termini non immune cellule del fegato (ad es., epatociti e cellule endoteliali), non c'erano differenze rilevabili tra topi infetti e non infetti. Al contrario, c'erano notevoli cambiamenti legati all'infezione nel fegato in termini di proporzione di cellule immuni che ha macchiato positivamente per l'antigene comune del leucocita CD45 (Figura 5A). In particolare, i topi infettati con i ceppi wild-type e prfA*Lm ha avuto livelli elevati significativamente di CD45+ cellule nel fegato rispetto ai topi non infetti, considerando che i livelli di CD45+ le cellule di fegato in topi infettati con il ceppo diprfALm Δ attenuato non erano notevolmente diverso rispetto ai livelli osservati nei topi non infetti. Per più ulteriormente caratterizzare entrambe le popolazioni residenti e infiltrazione delle cellule immuni, CD45+ cellule possono essere promosso subtyped. Come osservato da altri9, uno spostamento notevole con l'infezione è la quasi completa scomparsa delle cellule di Küpffer residenti (CD11bmetà F4/80+nel fegato) e la concomitante comparsa di una popolazione distinta di CD11bCiao che rappresentano i neutrofili di infiltrazione di cellule (Figura 5B; pannello centrale inferiore). Apparendo anche nel fegato al 18 hpi, sono CD11bmetà F4/80– cellule appaiono che, dal momento che sono anche Ly6CCiao, rappresentano infiltrazione infiammatori monociti (Figura 5B; pannelli inferiori centrali e di destro). In topi infettati queste cellule posteriori sono il solo le celle in cui apprezzabile GFP segnale è stato rilevato dopo 18 hs di infezione (Figura 5C). Ciò che trova quest'ultimo è simile a quella recentemente segnalato da Jones e d'Orazio che ha mostrato che nei topi, Lm è principalmente associato con Ly6CCiao monociti che infiltrano l'intestino dopo infezione alimentare10. Il profilo di CD45Ciao delle cellule di fegato dei topi infettati con il ceppo diprfA Δ Lm ha assomigliato a quello di topi non infetti mentre i topi infettati con il ceppo LmprfA * iper-virulento modestamente avevano migliorato i livelli di infiltrazione di neutrofili e monociti infiammatori rispetto ai topi infettati con il ceppo di Lm di selvaggio-tipo (dati non mostrati).
Figura 1 : Infezione di macrofagi coltivati da Listeria monocytogenes (Lm). La linea cellulare del macrofago di topo 264,7 sono state infettate in vitro con selvaggio-tipo Lm (wt; cerchi pieni), attenuato Lm (ΔprfA; cerchi aperti) o iper-virulento (prfA *; si aprono piazze) Lm ceppi (Vedi testo per maggiori dettagli). (A) a 1.5, 3 e 6 ore post infezione (hpi), i macrofagi sono stati lisati e il contenuto cellulare sono stato analizzato dall'analisi di formanti colonie (CFU) unità. (B) i macrofagi infetti brevemente sono stati trattati con l'antibiotico Gentamicina per eliminare non interiorizzato Lm e alle 6 hpi overlaying media era raccolti e analizzati dall'analisi di CFU. Linea tratteggiata rappresenta il limite di rilevamento del test. Ogni punto di dati rappresenta una pozzo indipendente/infezione e valori di P sono stati determinati mediante test t di Student. Mostrati sono i risultati di un singolo esperimento rappresentanza eseguiti tre volte con risultati simili. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2 : Associazione actina Lm analizzate tramite flusso cytometry. La linea cellulare del macrofago topo 264,7 o sono stati lasciati non infetti o infettate in vitro con GFP-esprimendo Lm. I media sovrastanti è stato rimosso, centrifugato, e il materiale raccolto macchiato con falloidina leganti l'actina. Il materiale colorato è stato analizzato mediante citometria a flusso e mostrato le trame di luce-dispersione (A) indica il gating utilizzata per i livelli di GFP e falloidina associati di extracellulare (cioè, media-derivate) Lm illustrata in (B). (B), l'area indicata rappresenta la GFP/actina doppio positivo Lm e la loro abbondanza in percentuale degli eventi totale all'interno dei cancelli di luce-dispersione. (C) i macrofagi del topo sono stati infettati con GFP-esprimendo Lm o un ceppo che esprimono GFP Lm privi del gene che codifica ActA (ΔactA) che recluta i macchinari di polimerizzazione dell'actina della cellula ospite per la Superficie delle cellule di LM . Alle 6 hpi, cellule infettate sono state lisate e il contenuto cellulare rilasciato, compreso l' intracellulare Lm, era macchiato per l'actina e analizzato tramite flusso cytometry. Mostrati sono i risultati di un singolo esperimento rappresentanza eseguiti tre volte con risultati simili. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3 : Infezione di wild-type e macrofagi di knockout di perforina-2 da Lm. Macrofagi peritoneali isolati sia da un selvaggio-tipo (P2+ +; riempito cerchi) o ad eliminazione diretta (P2- / -; cerchi punteggiati) sono state infettate in vitro con Lm. (A) a 1 e 6 hpi, i macrofagi sono stati lisati e il contenuto cellulare analizzata dall'analisi CFU. (B) macrofagi peritoneali Infected brevemente sono stati trattati con l'antibiotico Gentamicina e a 2,5 e 6 hpi overlaying media era raccolti e analizzati dall'analisi di CFU. Ogni punto di dati rappresenta una pozzo indipendente/infezione e valori di P sono stati determinati mediante test t di Student. Mostrati sono i risultati di un singolo esperimento rappresentanza eseguiti tre volte con risultati simili. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Lm infezione del mouse. Gruppi di 6 topi sono stati infettati con una miscela uguale di entrambi il selvaggio-tipo Lm (wt) e attenuato Lm (ΔprfA) ceppi o una miscela uguale di selvaggio-tipo Lm e iper-virulento (prfA *) ceppi. Alle 18 hpi topi Lm onere nel fegato è stata determinata mediante analisi di CFU. In questo esperimento il ceppo di Lm di selvaggio-tipo possiede un gene di antibiotico-resistenza che permette di distinguerlo da ceppi mutanti Lm antibiotico-sensibili. Gli omogeneati del fegato erano placcati su entrambe contenenti Antibiotico e media senza antibiotico ed il rapporto di mutanti e wild-type Lm sono state tracciate. La linea tratteggiata rappresenta il rapporto mutante/selvaggio-tipo della dose infetta. I livelli assoluti del selvaggio-tipo Lm nelle due coorti di topi erano 12 e 15 CFU/106 fegato cellule, rispettivamente. Mostrati sono i risultati di un singolo esperimento rappresentanza eseguiti due volte con risultati simili. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5 : Risposta immunitaria all'infezione di Lm in fegato del topo. I topi erano che entrambi non infetti o sistemica infetti con 2 x 105 CFU di GFP-esprimendo Lm ceppi per 18 h. cella singola preparazioni di fegati sono stati analizzati mediante citometria a flusso per l'espressione di marcatori specifici immunitario e mieloidi. (A) la percentuale di cellule macchiatura positiva per il marcatore di superficie delle cellule immunitarie specifiche CD45+ per 106 isolato totale diretta del fegato cellule mostrato per topi non infetti e topi infettati con il selvaggio-tipo (wt Lm), attenuato (ΔprfA), o iper-virulento (prfA *) Lm ceppi. Tracciati è la media di tre topi per ogni gruppo e i valori di P sono stati determinati mediante test t di Student. (B) mostrato nei pannelli a sinistra sono il profilo di macchiatura di CD45-macchie fegato cellule da un mouse non infetto individuo (in alto) e un singolo wt Lm- infettati (basso); nei pannelli centrali è mostrato livelli di espressione di marcatori mieloidi-specifici CD11b e F4/80 del CD45+ celle; e sui pannelli di destro è mostrato i livelli di espressione di Ly6C delle cellule con cancello indicate. Nel pannello di destro è mostrato un overlay della Ly6C+ cellule dai topi infetti e non infetti tra cui la percentuale e l'intensità media di fluorescenza (MFI) del CD11b+ F4/80– cellule positive per il cancello di Ly6C indicato. Viene mostrato un rappresentanza mouse da 3 topi per ogni gruppo. (C) Ly6C+ cellule derivate da fegati di topi infetti e non infetti (descritto (B); pannelli di centrali e di destro) sono stati analizzati per l'espressione della GFP mediante citometria a flusso. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Grazie al suo programma di infezione cellulare rapida e processive, Lm è un patogeno ideale per sondare le attività cellulari che hanno un impatto infezione. È stata identificata una serie di fattori dell'ospite che positivamente o negativamente influenzare Lm infezione cellulare11,12,13,14. Due tali host fattori caratterizzati nel nostro laboratorio, perforina-2 e l'inibitore di regolato di Heme (P2 e Ciao), regolano le caratteristiche distinte del processo di infezione di Lm . Come mostrato nella Figura 3, cellule carenti P2 sono altamente suscettibili di Lm e questa suscettibilità migliorata è anche vera di topi knockout P24. Dettagliati studi comparativi dei macrofagi che esprimono P2 e P2-carenti hanno mostrato che le cellule di quest'ultime formano altamente acidificato Lm-contenente fagosomi che ha provocato ha migliorato l'espressione di gene di virulenza. L'ipotesi che espressione genica differenziale virulenza contribuisce alla maggiore suscettibilità dei macrofagi P2-carenti era sostenuta dall'individuazione che l'iper-virulento prfA * ceppo, che, come accennato in precedenza, esprime virulenza geni costitutivamente elevato, infetto che esprimono P2 e macrofagi P2-carenti ugualmente bene4. Così, la disponibilità di un iper-virulento ceppo di Lm ha permesso di verificare l'ipotesi che il fattore di host P2 regola negativamente la distribuzione di fattore virulenza dell'agente patogeno. Per Ciao, abbiamo dimostrato che questo fattore ospite regola il traffico intracellulare di Lm , tale che la relativa emersione dalla cellula infettata è limitato; Questa attività cellulare è probabilmente le basi per la suscettibilità migliorata dei topi di Ciao-carenti per Lm infezione15,16.
In studi che hanno documentato le attività cellulari che si verificano all'interno di minuti di infezione, è fondamentale che prima del loro co-incubazione, che sia i batteri e le cellule dell'ospite non sono eccessivamente esposto a sbalzi di temperatura o altri ambientali condizioni che possono attivare le risposte di sforzo che si sovrappongono (e confondere) attività indotta da infezione. Per gli studi sopra descritti, questo include tali punti apparentemente semplice come minimizzare il tempo di movimentazione di Lm appena prima dell'inizio dell'infezione. Ad esempio, se una coltura batterica viene rimosso da un incubatore a 37 ° C agitando e permesso di sedere sulla cima di una panchina, variazioni nella disponibilità di temperatura e di ossigeno (tra le altre cose) attiverà gli adattamenti che possono influenzare la fase iniziale della successiva interazione con la cellula ospite. Allo stesso modo, cellule dell'ospite anche sono sensibili alle variazioni di temperatura e media che possono influenzare le risposte di infezione iniziale. Anche se in pratica è Impossibile completamente eliminare tutte le fluttuazioni in batterico e cellula ospite coltura condizioni, riducendo per quanto possibile e che istituisce un piano operativo standard, variazione fra gli esperimenti sarà minimizzato.
Un'ulteriore variabile, che a nostro parere la cui importanza è anche poco apprezzata, è quello dell'uso di antibiotici in modelli di infezione di coltura cellulare. La gentamicina è spesso l'antibiotico di scelta perché è relativamente impermeabile alla membrana plasmatica eucariotica. Nella letteratura sia attuale che precedente, esso è generalmente usato a 50 µ g/mL per uccidere extracellulare (cioè, non-interiorizzato) batteri. Recentemente è stato dimostrato direttamente che quando presenti a 25 µ g/mL, c'è sufficiente diffusione di gentamicina attraverso la membrana eucariotica per uccidere intracellulare Lm17. Nella nostra esperienza, questo livello di gentamicina uccide Lm immediatamente al contatto, considerando che livelli molto più bassi, in uccidere gamma 2-5 µ g/mL > 99,9% Lm in meno di 5 min4. Lawrenz e colleghi hanno dimostrato che le concentrazioni di gentamicina ampiamente usato di 25 – 50 µ g/mL sono anche sufficienti per uccidere intracellulare Yersinia pestis18. Interessante, questo gruppo inoltre ha mostrato notevoli differenze tra i tipi in termini di permeabilizzazione gentamicina evidenziando che condizioni ottimali dovrebbero essere determinati per ogni associazione di agente patogeno-ospite delle cellule delle cellule.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ACK Lysing Buffer | Gibco | A1049201 | |
| ArC Amine Reactive Compensation Beads | Life Technologies | A10346 | |
| BHI (Brain Heart Infusion) broth | EMD Milipore | 110493 | |
| Cell Strainer, 70 µm | VWR | 10199-656 | |
| Collagenase D | Roche | 11088858001 | |
| DMEM media | Gibco | 11965-092 | |
| FACS tubes | BD Falcon | 352054 | |
| FBS - Heat Inactivated | Sigma-Aldrich | F4135-500ML | |
| Hanks’ Balanced Salt solution | Sigma-Aldrich | H6648-6X500ML | |
| LB agar | Grow Cells MS | MBPE-4040 | |
| LIVE/DEAD Fixable Yellow Dead Cell Stain kit | Life Technologies | L349S9 | |
| Rhodamine Phalloidin | Thermo Fischer | R415 | |
| SP6800 Spectral Analyzer | Sony | ||
| Syringe 28 G 1/2" 1cc | BD | 329461 | |
| TPP Tissue Culture 48 Well Plates | MIDSCI | TP92048 | |
| TPP Tissue Culture 6 Well Plates | MIDSCI | TP92406 | |
| UltraComp eBeads | eBioscience | 01-2222-42 | |
| Antigen | |||
| CD11b | Biolegend | Flurochrome = PE Cy5, Dilution = 1/100, Clone = M1/70 | |
| CD11c | Biolegend | Flurochrome = AF 647, Dilution = 1/100, Clone = N418 | |
| CD45 | Biolegend | Flurochrome = APC Cy7, Dilution = 1/100, Clone = 30-F11 | |
| F4/80 | Biolegend | Flurochrome = PE, Dilution = 1/100, Clone = BM8 | |
| Live/Dead | Invitrogen | Flurochrome = AmCyN, Dilution = 1/100 | |
| Ly6C | Biolegend | Flurochrome = PacBlue, Dilution = 1/200, Clone = HK1.4 | |
| MHC II | Biolegend | Flurochrome = AF 700, Dilution = 1/200, Clone = M5/114.15.2 | |
| NK 1.1 | Biolegend | Flurochrome = BV 605, Dilution = 1/100, Clone = PK136 |
References
- Freitag, N. E., Port, G. C., Miner, M. D. Listeria monocytogenes - from saprophyte to intracellular pathogen. Nature Review Microbiology. 7 (9), 623-628 (2009).
- Ray, K., Marteyn, B., Sansonetti, P. J., Tang, C. M. Life on the inside: the intracellular lifestyle of cytosolic bacteria. Nature Review Microbiology. 7 (5), 333-340 (2009).
- Miner, M. D., Port, G. C., Freitag, N. E. Functional impact of mutational activation on the Listeria monocytogenes central virulence regulator PrfA. Microbiology. 154, 3579-3589 (2008).
- McCormack, R., et al. Perforin-2 Protects Host Cells and Mice by Restricting the Vacuole to Cytosol Transitioning of a Bacterial Pathogen. Infection and Immunity. 84, 1083-1091 (2016).
- Gregory, S. H., et al. Complementary adhesion molecules promote neutrophil-Kupffer cell interaction and the elimination of bacteria taken up by the liver. Journal of Immunology. 168, 308-315 (2002).
- Shi, C., et al. Monocyte trafficking to hepatic sites of bacterial infection is chemokine independent and directed by focal intercellular adhesion molecule-1 expression. Journal of Immunology. 184, 6266-6274 (2010).
- Pitts, M. G., Combs, T. A., D'Orazio, S. E. F. Neutrophils from Both Susceptible and Resistant Mice Efficiently Kill Opsonized Listeria monocytogenes. Infection and Immunity. 86, 00085 (2018).
- Carr, K. D., et al. Specific depletion reveals a novel role for neutrophil-mediated protection in the liver during Listeria monocytogenes infection. European Journal of Immunology. 41 (9), 2666-2676 (2011).
- Blériot, C., et al. Liver-resident macrophage necroptosis orchestrates type 1 microbicidal inflammation and type-2-mediated tissue repair during bacterial infection. Immunity. 42 (1), 145-158 (2015).
- Jones, G. S., D'Orazio, S. E. F. Monocytes are the predominant cell type associated with Listeria monocytogenes in the gut, but they do not serve as an intracellular growth niche. Journal of Immunology. 198, 2796-2804 (2017).
- Agaisse, H., et al. Genome-wide RNAi screen for host factors required for intracellular bacterial infection. Science. 309, 1248-1251 (2005).
- Cheng, L. W., et al. Use of RNA interference in Drosophila S2 cells to identify host pathways controlling compartmentalization of an intracellular pathogen. Proceedings of the National Academy of Science U S A. 102, 13646-13651 (2005).
- Singh, R., Jamieson, A., Cresswell, P. GILT is a critical host factor for Listeria monocytogenes infection. Nature. 455, 1244-1247 (2008).
- Burrack, L. S., Harper, J. W., Higgins, D. E. Perturbation of vacuolar maturation promotes listeriolysin O-independent vacuolar escape during Listeria monocytogenes infection of human cells. Cellular Microbiology. 11, 1382-1398 (2009).
- Shrestha, N., et al. The host-encoded Heme Regulated Inhibitor (HRI) facilitates virulence-associated activities of bacterial pathogens. PLoS One. 8, 68754 (2013).
- Bahnan, W. The eIF2α Kinase Heme-Regulated Inhibitor Protects the Host from Infection by Regulating Intracellular Pathogen Trafficking. Infection and Immunity. 20, 00707 (2018).
- Kortebi, M., et al. Listeria monocytogenes switches from dissemination to persistence by adopting a vacuolar lifestyle in epithelial cells. PLoS Pathogen. 13, 1006734 (2017).
- VanCleave, T. T., Pulsifer, A. R., Connor, M. G., Warawa, J. M., Lawrenz, M. B. Impact of Gentamicin Concentration and Exposure Time on Intracellular Yersinia pestis. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 7, 505 (2017).
