Summary
פרוטוקול זה תוכנן כדי להעריך immunotherapeutic cytotoxicity T-cell (המכונית T-cell) שנותבו מחדש נגד 3D מובנות תאים סרטניים (spheroids) בזמן אמת.
Abstract
חיסוני הפך שדה של עניין הולך וגובר במאבק נגד סרטן חשוכת אחרת. בין כל שיטות immunotherapeutic, chimeric אנטיגן קולטן (מכונית) מנותב מחדש תאי T שהושגו התוצאות המרהיבים ביותר, במיוחד עם ילדים לוקמיה לימפובלסטית חריפה-B (B-כל). שיטות אימות הקלאסית של תאי T המכונית לסמוך על השימוש היחודיות מבחני פונקציונליות של תאי T מכונית נגד התאים היעד ההשעיה, במודלים xenograft. למרבה הצער, תצפיותיו במבחנה הם לעתים קרובות decoupled מן התוצאות המתקבלות vivo, הרבה מאמץ וחיות יכולה להינצל על ידי הוספת עוד צעד: השימוש של תרבות תלת-ממד. הייצור של spheroids מחוץ לתאים יעד פוטנציאליים המחקים את מבנה תלת-ממדי של תאי הגידול כאשר הם נמצאים engrafted לתוך המודל בעלי חיים מייצג חלופה אידיאלית. כאן, אנחנו מדווחים שיטה קלה ובמחיר כדי לייצר spheroids משושלת transduced תא המעי הגס ככלי אימות עבור טיפול בתא המאמצת (כאן לידי ביטוי CD19 המכונית T תאים). שיטה זו זה משולב עם מערכת הדמיה חיה מתקדמת, ניתן לקיים צמיחה ספרואיד, אפקטור תאים אפופטוזיס תא cytotoxicity, הגידול.
Introduction
העברה לתא המאמצת (ACT) מייצג את הטיפול בסרטן הדור הבא. זה מסתמך על ההזרקה של תאים אפקטור (T - או NK-תאים) לתוך החולה. תאים אלה יכול להיות שונה גנטית עם קולטן זה להנחות אותם למטרה שלהם, הגידול, ולהרוס אותו. לאחרונה הוצגה גישה זו להיות ריאלי כאשר Chimeric אנטיגן קולטן (מכונית) נגד דה מרקר B-cell CD19 הוצג לתוך התאים החולה T להרוג סרטן /1. במקרה של המכונית, אשר קולטן מלאכותי, העיצוב מורכב מקטעי נוגדנים ספציפיים, אנטיגן מחייב תחום מופחתת למקטע ישות שרשרת יחידה ייעודית משתנה (scFv), מקושרים לתחומים איתות T-cell. למרות שיש מספר עיצובים, הגירסאות הנפוצות ביותר המכונה כמו הדור השני רכב עיצובים, מורכב CD3z עבור מערכת אזעקה TCR ובתחום co-stimulatory אחד (CD28, 4-1BB, OX40, וכו.) 1 , 2. השדה חיסוני מכוונת רוב תשומת הלב שלה צורה חדשה של מעשה כאשר CD19 רכב-T תאים efficaciously באין ספור מטופלים עם תא B-מחלות ממאירות-3,-4. בעקבות הצלחה זו, החוקרים ניסו לנצל את העיצובים דומה על ידי מיקוד אחרים epitopes עבור גידולים מוצקים עם הצלחה מוגבלת. למרבה הצער, המחסור גידול אנטיגנים ספציפיים, את microenvironments גידול קשים שניתנו המכונית T תאים פחות יעיל לקראת גידולים מוצקים5.
כיום, האסטרטגיות אימות הנפוצים בשימוש במבחנה להסתמך על מימדי מערכות (2D) המטפלות רק קטע מן האתגרים כאמור לעיל גידולים מוצקים. באופן קלאסי, 2D במבחנה מערכות לערב תערובת של תאי T רכב המטרה שורות תאים סרטן כמו monolayers כדי להעריך את הפונקציונליות וספציפיות של תאים אלה אפקטור. אסטרטגיות אלו הן חלקים חשוב וחיוני של המחקרים, אך הם אינם מביאים בחשבון את המבנה התלת-ממדי (3D) של תאי סרטן6ומורפולוגיה מורכבים. תאים סרטניים תרבותי במערכות תלת-ממד, המכונה spheroids, רוכשים חדשים פנוטיפי היסודיות לשינויים ג'ין ביטוי פרופיל7, אשר עשויים להשפיע על ההכרה על ידי תאים אפקטור שנותבו מחדש. Birgersdotter ועמיתיו הראו כי הודג'קין לימפומה (HL) קו תא כאשר גדל רק בדגם תלת-ממד תרבות רוכשת את פרופיל ביטוי גנטי דומה לזו דגימות הגידול העיקרי8. לכן, spheroids או 3D דומה תרבות מתודולוגיות הצעה יותר הרלוונטיים במודלים חוץ גופית לעומת תקן מערכות דו-ממדיות. מערכות אלו דומים גם מחקרים ויוו אשר נתפסים השלב הסופי בתהליך האימות של מכונית נתונה. בהתחשב בכך כי מערכות דו-ממדיות להיכשל לחקות את המורפולוגיה של סרטן אשכולות, spheroids מציעים תצורות דומות כדי להעריך את הפונקציונליות של תאי T רכב לפני ויוו מודלים. במחקר אחד, Pickl et al. זיהה כי מודל ספרואיד של קולטן האנושי גורם הגדילה באפידרמיס (HER2) overexpressing תאים סרטניים המחישו דומה פרופילים איתות מודלים ויוו9. זה תומך בהמשך כי spheroids מציעים יותר רלוונטי ולא מקרוב פנימה vivo הערכה של תאי T המכונית. בנוסף, המכונית T-cell אימות נגד spheroids עשוי לעזור להעריך את יעילותם יותר ביקורתי ולמנוע חלק מהעיצובים העברת מחקרים ויוו בטרם עת10; לפיכך, תורמים מחקר מודאג מבחינה מוסרית ע י הקרבת בעלי חיים פחות. יתר על כן, פרוטוקולים באמצעות spheroids אינם יקרים יותר מאשר מערכות דו-ממדיות קלאסית, הרבה יותר מהר לעומת לימודים קלאסיים ויוו . יחדיו, ניתן לחזות כי הכללת לימודי ספרואיד תהפוך בקרוב יאושם לקשר מחקרים במבחנה ויוו.
כאן, אנו מציגים את הכנת spheroids מתוך שורת תאים סרטן המעי הגס של HCT 116. הקו תא שונתה כדי להביע את המולקולה CD19 אנושי כדי להפוך אותה רגישות תאי T המכונית CD19 וכדי לספק הערכה ברורה של ההרג באמצעות מבנה המכונית קלינית המאומת.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. דור של Spheroids משורת תאי סרטן המעי הגס
- לשטוף 116 של HCT (stably transduced להביע את האשכול של בידול 19 (CD19) ו חלבון פלורסצנטיות ירוק (GFP)) monolayers תא עם פוספט buffered תמיסת מלח (PBS; 5 מ ל-25 ס מ2 או 10 מ"ל על בקבוקון2 75 ס מ). הוסף טריפסין (0.5 מ"ל 25 ס מ2 או 1 מ"ל על בקבוקון2 75 ס מ), דגירה תאים ב 37 מעלות צלזיוס במשך 5 דקות.
- בדוק בתא הניתוק תחת מיקרוסקופ ולנטרל תא אנזים דיסוציאציה רוזוול פארק אנדרטת המכון 160 מלאה בינונית (RPMI 1640) (FCS RPMI 1640 + 10% + Gentamycin; 10 מ"ל 25 ס מ2 או 20 מ"ל על בקבוקון2 75 ס מ).
- צנטריפוגה תא ב x 500 g עבור 5 דק להסיר supernatant באמצעות פיפטה תחליב, resuspend על ידי pipetting למעלה ולמטה מספר פעמים עם 5 מ של בינוני RPM1 1640 מלאה.
- ספירת תאים באמצעות Trypan blue הדרה על השיש במטבח תואם התא.
- צנטריפוגה תא ב x 500 g עבור 5 דק להסיר supernatant באמצעות פיפטה ובית resuspend בינוני RPMI כדי לקבל 5 x 103 תאים/מ ל....
- להעביר את המתלים תא מאגר סטרילי, לוותר על µL 200/באר לבאר 96-סיבוב צלחות התחתון באמצעות פיפטה רב-ערוצי.
- להעביר את הצלחת המנגנון הדמיה אוטומטית בתוך אינקובטור (37 מעלות צלזיוס, 5% CO2, 95% לחות).
- להיכנס לתוך רכישת התוכנה, בחר את לוח הזמנים כדי לרכוש | ההשקה להוסיף כלי | סריקה בלוח הזמנים | ליצור כלי: חדש.
-
בחר סוג סריקה: ספרואיד. בחר את ערוצי עניין: שלב + Brightfield (לעקוב אחרי הגדילה spheroids), ירוק (לעקוב אחר הגידול אות, רכישת זמן 300 ms) ואדום (בהמשך אפופטוזיס, רכישת זמן 400 ms).
- בחר את רמת ההגדלה הרצויה: 10 x.
- לקחת את הדגם צלחת מעמדה במגירה. בחר את המיקום של בארות לשיקוף. הזן את התיאור של הניסוי: שם, סוג של תאים, מספר התאים.
- עבור הגדרת ניתוח, בחר באפשרות דחה ניתוח עד מאוחר יותר. לחץ לחיצה ימנית על ציר הזמן, בחר באפשרות להגדיר שנבחר סריקה מרווח קבוצה ולהגדיר להוסיף סריקות כל 4 שעות, עבור סכום כולל של עד 24h. לקבוע שעת ההתחלה הרצויה (לפחות שעה לאחר דגירה במנגנון הדמיה אוטומטית).
-
לבדוק כל יומיים לצמיחה של spheroids על-ידי כניסה לתוך התוכנה הדמיה.
- בחר באפשרות התצוגה האחרונות סורק ולחץ פעמיים על הניסוי הרצוי. בחר Brightfield בחלונית ' ערוצים ' התמונה ולאחר מכן השתמש בכלי תכונות תמונה מדידה כדי למדוד את הקוטר של spheroids. זה לוקח 6 ימים עבור ספרואיד להגיע לגודל הרצוי: 0.5 מ מ קוטר. להוסיף 50 µL בינוני RPMI מלאה בכל טוב בכל יום 4 להגביל השפעה בינונית אידוי.
2. דור של תאי T המכונית CD19
-
הרחבה של תאי T המכונית CD19
הערה: ביטוי יציב של תאי T המכונית CD19 נרכשה על ידי בצובר retroviral התמרה חושית של התורם בריא PBMCs כפי שתואר לעיל16. קידוד retroviral לבנות המכונית CD19 מכונית הדור השני והיא מורכבת fmc63 scFv שרשרת, ציר CD8, תחום transmembrane, תחום co-stimulatory 4-1BB, ולבסוף תחום CD3ζ.- כדי להרחיב, תרבות ה-T transduced תאים בנוכחות אנטי-CD3/28 beads מגנטי עם תא חרוז יחס של 1:1 10-11 ימים. במהלך ההרחבה, תאים הם בינוני מלא (X-VIVO 15, 5% סרום, ו 100 U/mL רקומביננטי האנושי il-2).
הערה: צפיפות אידיאלי הרחבה יעילה היא 1 ל 2 x 106 תאים למ"ל. בהתאם למספר הראשונית, ניתן להרחיב תאים ב מבחנות (25 ס מ2 מבחנות עד 20 מ"ל, 75 ס מ2 מבחנות עד 40 מ"ל של הנפח הכולל) בחממה תרבות התא (37 מעלות צלזיוס, 5% CO2, 95% לחות). - כקבוצת בקרה שלילית עבור מבחני הבאים כוללים הלא-transduced PBMCs (יטופלו כמו מעושה) בפרוטוקול הרחבה מקבילה בתאי T המכונית CD19.
- ביום השלישי ואילך, להוסיף בינוני טריים כל יום ואני מתחלקים התאים מבחנות תרבות נוספים במידת הצורך.
- יום 10 – 11, צנטריפוגה תאים ב 500 x g עבור 5 דק. להסיר את תגובת שיקוע לשלב כל התאים לתוך שפופרת 50 מ ל אחת, resuspend תאי ~ 30 מ"ל של התקשורת מלאה טריים.
- מקם את הצינור 50 מ ל המכילות את התאים resuspended על דוכן המגנטי להפריד את החרוזים מגנטי המדיום תרבות.
- להמתין 2-3 דקות על החרוזים לאסוף בצד של הצינור.
- הסר את המדיום תרבות עם פיפטה, העברת צינור מבלי לגעת אזורי אוסף חרוז מגנטי.
- חזור על שלבים לגבי הסרת חרוז (2.1.5–2.1.7) עוד פעם כדי להגביל את מספר חרוזים במדיום תרבות הסופי.
- Resuspend, לספור את התאים, להתאים את הצפיפות ל 1 ל 2 x 106 תאים למ"ל במדיום מלאה.
- שאר התאים לפחות 4 שעות עד לילה. לאחר מכן ישירות להקפיא אותם למטה ב-80 מעלות צלזיוס, להעביר את הבקבוקונים מיכל חנקן נוזלי למחרת לאחסון לטווח ארוך. לחלופין, אחד יכול להאריך את השאר עד לילה לשימוש מיידי.
- כדי להרחיב, תרבות ה-T transduced תאים בנוכחות אנטי-CD3/28 beads מגנטי עם תא חרוז יחס של 1:1 10-11 ימים. במהלך ההרחבה, תאים הם בינוני מלא (X-VIVO 15, 5% סרום, ו 100 U/mL רקומביננטי האנושי il-2).
-
המכונית CD19 בקרת ביטוי בתאי T ראשי
- ספירת מספר התאים T מורחב כמו המספרים עשוי להשתנות מעט לאחר לילה תרבות או בינוני לאחר ההקפאה/ההפשרה.
- להעביר 5 x 105 תאים מן המכונית CD19 שני, ואימץ העיקרי בתאי T כדי להפריד בין צינורות cytometry זרימה.
- לשטוף את התאים עם 200 μL מאגר לזרום (2% FBS ב- PBS), צנטריפוגה הצינורות ב x 500 g עבור 5 דק. חזור על השלבים כביסה כדי להיפטר פריטים הנגרמת על-ידי המדיום תרבות.
- להכין נוגדן ראשוני (ביוטין עז העכבר אנטי אג, ₂ F(ab') קטע ספציפי) על-ידי ביצוע דילול 1:200 במאגר לזרום.
- Resuspend תאי μL 100 של נוגדן מיקס למחזור, דגירה על קרח במשך 15 דקות חזרו על הצעד הקודם כביסה פעמיים כדי להסיר עודפי נוגדנים.
- להכין נוגדן המשני (Streptavidin-PE) כמו 1:400 דילול במאגר לזרום.
- Resuspend תאי μL 100 של נוגדן מיקס למחזור, דגירה על קרח במשך 15 דקות חזרו על הצעד הקודם כביסה פעמיים כדי להיפטר עודף נוגדן.
- Resuspend תאי μL 200 זרימה מאגר למחזור ולנתח אותו על cytometer זרימה.
- שימוש בתאי T ללעוג להגדיר את השער ואתאיזם ולנתח CD19 המכונית transduced תאי T בהתאם.
3. תלת-ממדי הגידול ספרואיד הרג Assay
-
לאחר 6 ימים או פעם אחת spheroids להגיע לגודל הרצוי, הסר את הלוחית של החממה. באמצעות פיפטה רב-ערוצי, להסיר בעדינות µL 100/טוב של בינוני RMPI 1640 להשלים הצלחות ספרואיד.
- בשלב זה, זווית הטיפים לקראת הבתוך קיר של צלחת 96-ולס, הימנעות ממגע בתחתית הבאר כדי למזער הפרעה של spheroids. הנותרים נפח צריך להיות בסביבות 100 µL.
- הכן פתרון 1:200 של Annexin V אדום על ידי ערבוב 50 µL של Annexin V אדום עם mL 9.95 בינוני RPMI 1640 מלאה.
- להוסיף 100 µL/טוב של 1:200 פתרון Annexin V אדום.
- להעביר את הצלחת אינקובטור (37 מעלות צלזיוס, 5% CO2, 95% לחות) למשך 15 דקות.
- לקצור תאי T CD19 המכונית transduced צינור 15 מ"ל, צנטריפוגה אותם ב x 500 g עבור 5 דק. להסיר את תגובת שיקוע באמצעות פיפטה ואת resuspend על ידי pipetting למעלה ולמטה מספר פעמים עם 2 מ"ל של מדיום RPM1 1640 מלאה.
- ספירת תאים באמצעות Trypan blue הדרה על השיש במטבח תואם התא.
- צנטריפוגה תא ב x 500 g עבור 5 דק להסיר supernatant באמצעות פיפטה ובית resuspend בינוני RPMI להשיג 2 x 105 תאים/מ ל....
- להעביר את המתלים תא מאגר סטרילי, לוותר על µL 100/באר לבאר 96-סיבוב צלחת ספרואיד התחתון בעזרת פיפטה רב-ערוצי.
- להעביר את הצלחת חזרה למכשירים הדמיה אוטומטית בתוך אינקובטור (37 מעלות צלזיוס, 5% CO2, 95% לחות).
-
להיכנס לתוך רכישת התוכנה, בחר את לוח הזמנים כדי לרכוש.
- לחץ לחיצה ימנית על ציר הזמן הסריקה ובחר ערוך ציר הזמן. לחץ לחיצה ימנית על קבוצת סריקה ומחק אותו. לחץ לחיצה ימנית על ציר הזמן, בחר באפשרות להגדיר שנבחר סריקה מרווח קבוצה ולהגדיר להוסיף סריקות כל 1.5 h, עבור סכום כולל של עד 24 שעות.
- לקבוע את שעת ההתחלה הרצויה (לפחות שעה לאחר דגירה במנגנון הדמיה אוטומטית). בחר להציל את לוח הזמנים סריקות.
4. ניתוח תמונות אוטומטית
- להיכנס רכישה, בחר באפשרות התצוגה האחרונות סורק ובחר באפשרות ' ניתוח ההשקה . בחר ליצור הגדרה חדשה של ניתוח | ניתוח מסוג: ספרואיד. סמן את הערוצים התמונה כדי לנתח (שלב + Brightfield, ירוק ואדום).
- בחר לפחות 10 להחליפן בתמונות: בדרך כלל, 1 לכל תנאי ולפחות 3 נקודות זמן (התחלה, אמצע, סוף הרכישה).
- תצוגה מקדימה של ברירת המחדל לנתח את הליך במחסנית התמונה כולה.
- לשנות את הפרמטרים עבור מסכת brightfield. פרמטרים אופייניים הם: רגישות 10, חור מילוי 1,000 מיקרומטר2, מין אזור 1,000 מיקרומטר2. תצוגה מקדימה במחסנית התמונה כולה ולבדוק הפרמטרים שנבחרו לזהות במדויק את spheroids.
- לשנות את הפרמטרים עבור מסכת ירוק (GFP). פרמטרים אופייניים הם: פילוח מגבעת עם רדיוס 200 מיקרומטר, סף 3 GCU, קצה לעזוב, חור למלא 5,000 מיקרומטר2, התאם גודל-2 פיקסלים, אזור מינימום 3,000 מיקרומטר2. תצוגה מקדימה במחסנית התמונה כולה ולבדוק הפרמטרים שנבחרו לזהות במדויק את spheroids.
- לשנות את הפרמטרים עבור מסכת אדום (Annexin V). פרמטרים אופייניים הם: פילוח מגבעת עם רדיוס 150 מיקרומטר, סף 2 GCU, קצה לעזוב, חור למלא 5,000 מיקרומטר2, התאם גודל 0 פיקסלים, אזור מינימום 1,000 מיקרומטר2. תצוגה מקדימה במחסנית התמונה כולה ולבדוק הפרמטרים שנבחרו לזהות במדויק את spheroids.
-
להפעיל את מנתח.
- לאחר הניתוח נעשה, לחלץ את המדידה של ריבית. בחר את הקובץ שנותחה ולאחר מכן באפשרות גרף מדדים . בחר את המדדים של עניין, לסרוק את הבאר. בדרך כלל, עוצמת אדום וירוק הכולל בגבולות brightfield לתת את המידות המדויקות ביותר על-ידי הגבלת את האות של קרינה פלואורסצנטית לגבולות spheroids נקבע על-ידי המסיכה brightfield (איור 3). תמצית מדדים שנבחר בתבנית קובץ מספר על ידי לחיצה על "ייצוא נתונים".
- להמשיך החילוץ של תמונות, סרטים על-ידי בחירת הקובץ שנותחה ולאחר מכן בחר באפשרות ייצוא תמונות וסרטים . שתי אפשרויות זמינות, גם "כמו להציג" כדי לאחזר תמונות וסרטים ראיתי על תוכנת הדמיה (תמונות בדרך כלל ללא הפרדות צבע), או "כמו מאוחסן" כדי לאחזר נתונים גולמיים עבור ניתוח חיצוני דרך התוכנה השלישית-חלק.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
כפי שניתן לראות באיור1, זה הכרחי לבדוק את רמת הביטוי של המכונית CD19 על תאי T (איור 1 א') ואת רמת CD19 על שורות תאים סרטניים HCT116 (איור 1B) cytometry זרימה. איור 2 מדגימה את התוצאה של ניסוי ספרואיד טיפוסי. הדמיה המנגנון האוטומטי לוקח תמונות ב-4 ערוצים שונים: שדה בהיר, קרינה פלואורסצנטית שלב, ירוק ואדום. שלב ערוץ משמש לאשש את היווצרות spheroids על-ידי הצגת גבולות מאוד בניגוד ליד spheroids (וזה סימן של היווצרות ספרואיד). שדה בהיר משמש במהלך תהליך ניתוח כדי לזהות את הגודל של spheroids ולהגביל את אות ירוק (גידול) ושידור אדום (אפופטוזיס) לגבולות הנ. היא מאפשרת לאדם אינם מחשיבים את האירועים שאינן קשורות ישירות spheroids (תאים סרטניים לדוגמה מבודד, שלהם אפופטוזיס). קווי מתאר של ירוק ואדום מייצגים אותות אדום וירוק בהתאמה בחשבון בחישוב מדדים. איור 2, שדה בהיר, שלב, ירוק ואדום ערוצי חולצו באמצעות האפשרות "כפי שהם מאוחסנים" בעוד תמונות ללא הפרדות צבע חולצו באמצעות האפשרות "כפי שמוצג" מייצגים המדדים המוצגים באיור3. כפי שניתן לראות באיור 2, בשונה תאי T ללעוג, תאי T המכונית CD19 הצליחו במיוחד להרוג את spheroids, לצמצם מאוד את מספר תאים סרטניים בשידור חי.
איור 3 מציגה את האבולוציה של סך הכל ירוק, אדום האות נמדד בגבולות ספרואיד לאורך זמן. כפי שניתן לראות, זמן קצר לאחר ההזרקה תא T המכונית CD19, בגודל של spheroids מתכווץ במהירות (כפי שהיא נמדדת על ידי קרינה פלואורסצנטית ירוק אות), אפופטוזיס אותות גדל במהירות (כפי שהוא נמדד האות פלואורסצנטי אדום).
איור 1: ביטוי של המכונית CD19 CD19 על פני השטח. (א) השטח ביטוי CD19 המכונית על תאי-T retrovirally transduced. תאים נותחו על ידי cytometry זרימה לפני וזמינותו ספרואיד ויה biotinylated אנטי-mouse-Fab כמו ראשי ו anti-Streptavidin-PE כמו נוגדנים משניים. (B) ביטוי משטח CD19 על תאים HCT116 retrovirally transduced. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 2: הערכה של המכונית CD19 T-cell cytotoxicity נגד גידול spheroids. זמן לשגות HCT116 ספרואיד הצמיחה; ב t = 138 h, מעושה או CD19 המכונית T תאים הוכנסו על צפיפות של תאים 20000/טוב. אות ירוק תואם לתאים HCT116 GFP +, קו המתאר ירוק מתייחס ספרואיד שזוהו. אדום תואם אפופטוזיס כפי בפיקוח Annexin V, בקו מתאר אדום מתאים לאירועים אפופטוזיס שזוהו. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 3: מדידות סימן אדום וירוק הכולל בתוך brightfield מסכה גבולות לאורך זמן. אותות אדום וירוק הכולל בתוך brightfield מסיכת מדדים התקבלו לאחר ניתח המותווים כפונקציה של הזמן. קו מקווקו מקביל המבוא של תאים אפקטור (CD19CAR או מעושה תאי-T). מדד מקביל זאת אומרת ± SEM (n = 12). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
השימוש spheroids ככלי חדשניים כדי לאמת את הטיפול בסרטן בעתיד הפך שדה של עניין הולך וגובר בשנים האחרונות. Spheroids מייצגים שלב ביניים בין קלאסי 2D ניתוח במבחנה בהערכת vivo. השיטה עוד מחזיקה הרבה הבטחה לגבי מחוזקה במובן של הגידול סביבת מיקרו מחקה כמו גם גנים פרופילים7. פרוטוקול מוצג בפרסום זה הותאם מן Saheen et al.11 כדי Incucyte S3 מייצג שיטה חסכונית ונוחה לייצר גידול 3D spheroids של שורות תאים המעי הגס. צימוד ספרואיד לדור מכשיר הדמיה תפוקה גבוהה מאפשרת אמינה ומהירה ההקרנה של מגוון רחב של סוכנים אנטי הגידול ונטר את היכולת של הסוכן הנ ל יציבות מבנה הגידול.
ישנם מספר שלבים קריטיים לקחת בחשבון לגבי פרוטוקול זה. ראשית, המספר ההתחלתי של תאים סרטניים צריך להיות מותאם במדויק. אם הצפיפות התא ההתחלתי הוא גבוה מדי, התאים לבזות את PLL ציפוי במהירות ויחלו ליצור טפט של חסיד. מצד שני, מספר נמוך של תאים תציג השתנות גבוהה מבחינת גודל ספרואיד ואת מספר spheroids לכל טוב. שנית, השימוש של התקן דימות אוטומטיות חושפת לתאים phototoxicity פוטנציאליים (במיוחד אם מספר ערוצים פלורסצנטיות משמשים); מומלץ להתאים את תדירות התמונה כדי למזער את הנזק spheroids. זה פרמטר קריטי לשקול, כדי לתפוס את האירועים עניין באופן אמין (תמונה כל 4 שעות לפני אפקטור תא מבוא ואחד מייצג כל 90 דקות לאחר הפשרה המיטבית לידע שלנו). שלישית, מומלץ להיות זהירים במיוחד למנוע אידוי בינוני יכול להתרחש מספר ימים לאחר הקדמה תא אפקטור. רביעית, מספר אפקטור תאים צריך גם להיות מותאם בדיוק: המספר הרצוי צריך להיות גבוה מספיק כדי להרוג את הגידול spheroids ביעילות, אלא גם בתור נמוך ככל האפשר לאפשר את הפוטנציאל הגבוה ביותר עבור תהליך ההדמיה אופטימלית. חמישית, בניסוי טיפוסי, גם מכיל spheroids 2-4 זה יכול מזג לתוך אחד; מומלץ להקדיש תשומת לב פוטנציאלי קוצים לכיתה במדדים בעקבות אירוע זה וכדי להתעלם מהם. שישית, על צלחת 96-ובכן, בבארות ממוצע של 20 עד 50 מכילים spheroids מספר שיופיעו וגודל; אנו ממליצים לבדוק את בארות כדי להיחשב לניתוח לפני כניסתה של התאים אפקטור כפי בכדי לחסוך בזמן חישוב. לבסוף, הניתוח היא אוטומטית חלקית אך מחייבת כמה קלט מהמשתמש לגבי הפרמטרים השונים. מומלץ מאוד לקחת את הטיפול בפרט בשלב זה וכדי להתמקד על איזון בין רגישות. אם סוג הטיפול תאים/סמים אפקטור שונה נרחב במסגרת ניסוי אחד, ייתכן צורך להפעיל סוגים שונים של ניתוח כדי לבחור את האחד שמתאים הטוב ביותר.
שיטה זו היא כל-כך רחוק רק מוגבלת לסוג מסוים של שורת התאים חסיד (בפרסום זה של HCT 116); בהמשך פיתוח נדרש להכליל את פרוטוקול זה לכל שורה תאים סרטניים. למרות מגוון רחב של שיטות כבר זמין עבור מספר רב יותר של היעד תאים12,13,14,15, רובם נסמכים על השימוש של הליכים יקרים ו/או מורכבות. השיטה שלנו, למרות מוגבל עד כה, לא מעט סוגים של התאים היעד הוא מעניין כמו זה דורשת תשומות מוגבלת מאוד של הנסיין וההיתרים מסך מהיר וקל של שונות סמים ו/או טיפול חיסוני (תאים CD19 המכונית כאן). את המהימנות ואת יכולתו להתאים סוגים שונים של טיפולים להפוך שיטה זו כלי רב עוצמה בהקשר של תהליך האימות טיפול נגד סרטן.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים אין לחשוף.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכה על ידי המועצה למחקר נורבגי תחת מענקים #244388, #254817, #284983; האגודה למלחמה בסרטן נורווגי (#6829007); נורווגית-בריאות באזור דרום-מזרח תחת גרנט #17/00264-6 ו- #2016006.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline | SIGMA-ALDRICH | D8537-500ML | Lot Number: RNBG7037 |
| 75 cm² growth area flasks | VWR | 430639 | Lot Number: 2218002 |
| 75 cm² growth area flasks | VWR | 734-2705 | Lot Number: 3718006 |
| Trypsin-EDTA | SIGM-ALDRICH | T3924-100ml | Lot Number: SLBTO777 |
| RPMI 1640 med L-glutamin, 10 x 500 mL | Life Technology (Gibco) | 21875-091 | Lot Number: 1926384 |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 10500064 | Lot Number: 08Q3066K |
| Gentamicin | Thermo Fischer | 15750060 | Lot Number: 1904924A |
| Trypan Blue Solution, 0.4% | Thermo Fischer | 15250061 | Lot Number: 1886513 |
| 96 well plate, round bottom | VWR | 734-1797 | Lot Number: 33117036 |
| Dynabeads Human T-Activator CD3/CD28 | Thermo Fischer | 11132D | - |
| X-VIVO 15 with Gentamicin L-Gln, Phenol Red, 1 L | BioNordika | BE02-060Q | Lot Number: 8MB036 |
| CTS Immune Cell Serum Replacement | Thermo Fischer | A2596102 | Lot Number: 1939319 |
| IL-2 Proleukin | Novartis | Lot Number: 505938M | |
| IncuCyte Annexin V Red Reagent | Essen Bioscience | 4641 | Lot Number: 17A1025-122117 |
| Reagent Reservoir | VWR | 89094-672 | Lot Number: 89094-672 |
| 15 mL tubes | VWR | 734-1867 | Lot Number: 19317044 |
| anti-human CD19-PE | BD Biosciences | 555413 | Lot Number: 4016990 RRID: AB_395813 |
| Biotin-SP (long spacer) AffiniPure F(ab')2 Fragment Goat Anti-Mouse IgG | Jackson ImmunoResearch | 115-066-072 | Lot Number: 129474: RRID: AB_2338583 |
| Streptavidin-PE | BD Biosciences | 554061 | Lot Number: 5191579: RRID: AB_10053328 |
| HCT 116 Colorectal Carcinoma Line | ATCC | CCL-247 | - |
| Incucyte S3 | Essen Bioscience |
References
- Porter, D. L., Levine, B. L., Kalos, M., Bagg, A., June, C. H. Chimeric antigen receptor-modified T cells in chronic lymphoid leukemia. New England Journal of Medicine. 365 (8), 725-733 (2011).
- Kochenderfer, J. N., et al. Eradication of B-lineage cells and regression of lymphoma in a patient treated with autologous T cells genetically engineered to recognize CD19. Blood. 116 (20), 4099-4102 (2010).
- Brentjens, R. J., et al. CD19-targeted T cells rapidly induce molecular remissions in adults with chemotherapy-refractory acute lymphoblastic leukemia. Science Translational Medicine. 5 (177), 177ra138 (2013).
- Grupp, S. A., et al. Chimeric antigen receptor-modified T cells for acute lymphoid leukemia. New England Journal of Medicine. 368 (16), 1509-1518 (2013).
- D'Aloia, M. M., Zizzari, I. G., Sacchetti, B., Pierelli, L., Alimandi, M. CAR-T cells: the long and winding road to solid tumors. Cell Death & Disease. 9 (3), 282 (2018).
- Amann, A., et al. Development of an innovative 3D cell culture system to study tumour--stroma interactions in non-small cell lung cancer cells. PLoS One. 9 (3), e92511 (2014).
- Enzerink, A., Salmenpera, P., Kankuri, E., Vaheri, A. Clustering of fibroblasts induces proinflammatory chemokine secretion promoting leukocyte migration. Molecular Immunology. 46 (8-9), 1787-1795 (2009).
- Birgersdotter, A., et al. Three-dimensional culturing of the Hodgkin lymphoma cell-line L1236 induces a HL tissue-like gene expression pattern. Leukemia & Lymphoma. 48 (10), 2042-2053 (2007).
- Pickl, M., Ries, C. H. Comparison of 3D and 2D tumor models reveals enhanced HER2 activation in 3D associated with an increased response to trastuzumab. Oncogene. 28 (3), 461-468 (2009).
- Galateanu, B., et al. Impact of multicellular tumor spheroids as an in vivo-like tumor model on anticancer drug response. International Journal of Oncology. 48 (6), 2295-2302 (2016).
- Shaheen, S., Ahmed, M., Lorenzi, F., Nateri, A. S. Spheroid-Formation (Colonosphere) Assay for in Vitro Assessment and Expansion of Stem Cells in Colon Cancer. Stem Cell Reviews and Reports. 12 (4), 492-499 (2016).
- Izraely, S., et al. The Metastatic Microenvironment: Melanoma-Microglia Cross-Talk Promotes the Malignant Phenotype of Melanoma Cells. International Journal of Cancer. , (2018).
- Khawar, I. A., et al. Three Dimensional Mixed-Cell Spheroids Mimic Stroma-Mediated Chemoresistance and Invasive Migration in hepatocellular carcinoma. Neoplasia. 20 (8), 800-812 (2018).
- Merker, M., et al. Generation and characterization of ErbB2-CAR-engineered cytokine-induced killer cells for the treatment of high-risk soft tissue sarcoma in children. Oncotarget. 8 (39), 66137-66153 (2017).
- Mittler, F., et al. High-Content Monitoring of Drug Effects in a 3D Spheroid Model. Frontiers in Oncolology. 7, 293 (2017).
- X Tadesse, F. G., Mensali, N., et al. Unpredicted phenotypes of two mutants of the TcR DMF5. Journal of Immunological Methods. 425, 37-44 (2015).
