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JoVE Journal Cancer Research
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Cancer Research

कार टी कोशिकाओं द्वारा एक अंडाकार आकृति हत्या परख

Published: December 12, 2018 doi: 10.3791/58785
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Department of Cellular Therapy, Department of Oncology, Oslo University Hospital-Radiumhospitalet

Summary

इस प्रोटोकॉल को वास्तविक समय में 3 डी संरचित कैंसर कोशिकाओं (spheroids) के खिलाफ immunotherapeutic अनुप्रेषित टी सेल (कार टी-सेल) cytotoxicity का आकलन करने के लिए डिज़ाइन किया गया है ।

Abstract

Immunotherapy कैंसर के खिलाफ लड़ाई में बढ़ती रुचि के एक क्षेत्र अंयथा अनुपचारित बन गया है । सभी immunotherapeutic तरीकों में, chimeric प्रतिजन रिसेप्टर (कार) टी कोशिकाओं को सबसे शानदार परिणाम प्राप्त, विशेष रूप से बाल चिकित्सा बी के साथ-एक्यूट लिम्फोब्लासटिक ल्यूकेमिया (बी-सभी). कार टी कोशिकाओं के शास्त्रीय सत्यापन तरीकों निलंबन में और xenograft मॉडल में लक्ष्य कोशिकाओं के खिलाफ कार टी कोशिकाओं की विशिष्टता और कार्यक्षमता की परख के उपयोग पर भरोसा करते हैं । दुर्भाग्य से, इन विट्रो में किए गए टिप्पणियों अक्सर vivo में प्राप्त परिणामों से जोड़े जाते हैं और प्रयास और जानवरों के एक बहुत कुछ एक और कदम जोड़कर बख्शा जा सकता है: 3 डी संस्कृति का उपयोग. संभावित लक्ष्य कोशिकाओं के बाहर spheroids का उत्पादन है कि ट्यूमर कोशिकाओं के 3 डी संरचना नकल जब वे पशु मॉडल में engrafted रहे है एक आदर्श विकल्प का प्रतिनिधित्व करता है । यहां, हम अपनाने सेल थेरेपी के लिए एक मांयता उपकरण के रूप में एक transduced कोलोरेक्टल सेल लाइन से spheroids का उत्पादन करने के लिए एक किफायती, विश्वसनीय और आसान तरीका रिपोर्ट (CD19 कार टी कोशिकाओं द्वारा यहां उदाहरण) । इस विधि एक उंनत लाइव इमेजिंग प्रणाली है कि अंडाकार आकृति विकास, प्रभाव कोशिकाओं cytotoxicity और ट्यूमर सेल apoptosis का पालन कर सकते है के साथ युग्मित है ।

Introduction

दत्तक कोशिका अंतरण (अधिनियम) अगली पीढ़ी के कैंसर के उपचार का प्रतिनिधित्व करता है । यह एक रोगी में प्रभाव कोशिकाओं (टी या NK-कोशिकाओं) के इंजेक्शन पर निर्भर करता है । इन कोशिकाओं को आनुवंशिक रूप से एक रिसेप्टर कि उनके लक्ष्य, ट्यूमर के लिए मार्गदर्शन करेंगे के साथ संशोधित किया जा सकता है, और इसे नष्ट कर । हाल ही में इस दृष्टिकोण को व्यवहार्य होना दिखाया गया है जब एक Chimeric प्रतिजन रिसेप्टर (कार) बी के खिलाफ निर्देश सेल मार्कर CD19 रोगी टी कोशिकाओं में शुरू किया गया था उसके कैंसर1को मारने के लिए । कार, जो एक कृत्रिम रिसेप्टर है के मामले में, डिजाइन विशिष्ट एंटीबॉडी टुकड़े होते हैं, प्रतिजन बाइंडिंग डोमेन एक श्रृंखला चर टुकड़ा (scFv), टी-सेल संकेतन डोमेन से जुड़े नामित इकाई को कम । हालांकि वहां कई डिजाइन, सबसे अधिक इस्तेमाल किया संस्करणों दूसरी पीढ़ी के कार डिजाइन के रूप में संदर्भित कर रहे हैं, TCR संकेतन और एक सह stimulatory डोमेन (CD28, 4-1BB, OX40, आदि के लिए CD3z से मिलकर बनता है) 1 , 2. immunotherapy क्षेत्र के अधिनियम के इस नए रूप में जब CD19 कार टी कोशिकाओं बी सेल द्रोह3,4के साथ कई रोगियों का इलाज किया efficaciously अपने ध्यान के सबसे निर्देशित । इस सफलता के बाद शोधकर्ताओं ने सीमित सफलता के साथ ठोस ट्यूमर के लिए अन्य epitopes को लक्षित करते हुए इसी तरह के डिजाइनों का दोहन करने की कोशिश की. दुर्भाग्य से, ट्यूमर विशिष्ट एंटीजन की कमी और कठोर ट्यूमर microenvironments प्रदान की कार टी कोशिकाओं ठोस ट्यूमर की दिशा में कम प्रभावी5.

वर्तमान में, सबसे अधिक इस्तेमाल किया इन विट्रो सत्यापन रणनीतियों पर दो आयामी (2d) सिस्टम है कि केवल पहले से ही उल्लेख किया ठोस ट्यूमर चुनौतियों का एक टुकड़ा पता निर्भर करते हैं । शास्त्रीय रूप से, 2 डी इन विट्रो प्रणालियों में कार टी कोशिकाओं और लक्ष्य कैंसर सेल लाइनों का एक मिश्रण monolayers के रूप में कार्यक्षमता और इन प्रभाव कोशिकाओं की विशिष्टता का आकलन करने के लिए शामिल है । हालांकि इन रणनीतियों महत्वपूर्ण और अध्ययन के महत्वपूर्ण भागों रहे हैं, वे ध्यान में जटिल आकृति विज्ञान और तीन आयामी (3 डी) कैंसर कोशिकाओं6की संरचना नहीं लेते हैं । कैंसर की कोशिकाओं 3d प्रणालियों में, spheroids के रूप में कहा जाता है, जीन अभिव्यक्ति प्रोफ़ाइल7में परिवर्तन के माध्यम से नए phenotypic लक्षण प्राप्त है, जो redirected प्रभाव कोशिकाओं द्वारा मांयता को प्रभावित हो सकता है । Birgersdotter और सहकर्मियों का प्रदर्शन किया है कि एक Hodgkin लिंफोमा (एचएल) सेल लाइन जब केवल एक 3d संस्कृति मॉडल में हो एक जीन अभिव्यक्ति प्रोफ़ाइल है कि प्राथमिक ट्यूमर8नमूनों के समान है प्राप्त । इसलिए, spheroids या समान 3d संस्कृति के तरीके में और अधिक प्रासंगिक की पेशकश इन विट्रो मॉडल के रूप में मानक 2d सिस्टम का विरोध किया । ऐसे सिस्टम वीवो स्टडीज में भी समान हैं जो किसी दी हुई कार की मान् यता प्रक्रिया में अंतिम चरण के रूप में देखे जाते हैं । कि 2d सिस्टम को ध्यान में रखते हुए कैंसर समूहों की आकृति विज्ञान की नकल करने में विफल, spheroids इसी तरह संरचनाओं की पेशकश करने के लिए कार टी कोशिकाओं की कार्यक्षमता का आकलन करने से पहले vivo मॉडल में । एक अध्ययन में, Pickl एट अल. की पहचान की है कि मानव एपिडर्मल वृद्धि कारक रिसेप्टर (HER2) के एक अंडाकार आकृति मॉडल कैंसर कोशिकाओं को व्यक्त करने vivo मॉडल9में समान संकेतन प्रोफाइल का प्रदर्शन किया । यह आगे का समर्थन करता है कि spheroids प्रस्ताव और अधिक प्रासंगिक और बंद करने के लिए vivo कार टी कोशिकाओं का आकलन । इसके अतिरिक्त, spheroids के विरुद्ध कार टी-सेल सत्यापन उनकी प्रभावकारिता का अधिक गंभीर आकलन करने में मदद कर सकता है और कुछ डिजाइनों को पहले से ही10से अधिक vivo अध्ययनों में ले जाने से रोकता है; इस प्रकार, कम पशुओं का त्याग करके नैतिक रूप से संबंधित अनुसंधान में योगदान । इसके अलावा, spheroids का उपयोग प्रोटोकॉल शास्त्रीय 2d सिस्टम से अधिक महंगा नहीं कर रहे है और बहुत तेजी के रूप में vivo अध्ययन में शास्त्रीय की तुलना में । एक साथ लिया, एक भविष्यवाणी कर सकते है कि अंडाकार आकृति अध्ययन का समावेश जल्द ही मानक अभ्यास बन जाएगा करने के लिए इन विट्रो में और vivo अध्ययन में लिंक ।

यहां, हम बृहदांत्र कैंसर सेल लाइन HCT ११६ से spheroids की तैयारी वर्तमान । यह सेल लाइन मानव CD19 अणु व्यक्त करने के लिए यह CD19 कार टी कोशिकाओं के प्रति संवेदनशील और एक चिकित्सकीय सत्यापित कार के निर्माण का उपयोग कर हत्या का स्पष्ट आकलन प्रदान करने के लिए संशोधित किया गया था ।

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Protocol

1. कोलोरेक्टल कैंसर सेल लाइन से Spheroids की जनरेशन

  1. धो HCT ११६ (छुरा transduced भेदभाव के क्लस्टर 19 (CD19) और ग्रीन प्रतिदीप्ति प्रोटीन (GFP)) फॉस्फेट बफर खारा के साथ सेल monolayers (पंजाब; एक 25 सेमी2 या 10 मिलीलीटर के लिए एक ७५ सेमी2 कुप्पी के लिए 5 मिलीलीटर) । trypsin जोड़ें (एक 25 सेमी2 या एक ७५ सेमी2 कुप्पी के लिए 1 मिलीलीटर के लिए ०.५ मिलीलीटर) और 5 मिनट के लिए ३७ ° c पर कोशिकाओं की मशीन ।
  2. एक खुर्दबीन के नीचे सेल टुकड़ी की जांच करें और पूरा रोसवेल पार्क मेमोरियल संस्थान १६० मध्यम (RPMI १६४०) (RPMI १६४० + 10% FCS + गेन्तमयसीं के साथ सेल पृथक्करण एंजाइम बेअसर, एक 25 सेमी2 या एक ७५ सेमी2 कुप्पी के लिए 20 मिलीलीटर के लिए 10 मिलीलीटर) ।
  3. 5 मिनट के लिए ५०० x g पर सेल निलंबन केंद्रापसारक एक पिपेट का उपयोग कर supernatant निकालें और ऊपर और नीचे pipetting द्वारा resuspend 5 पूर्ण RPM1 १६४० मध्यम के मिलीलीटर के साथ कई बार ।
  4. एक संगत सेल काउंटर पर Trypan नीले अपवर्जन का उपयोग कर कोशिकाओं की गणना ।
  5. केंद्रापसारक सेल निलंबन के लिए ५०० x g पर 5 min. पिपेट का उपयोग कर supernatant निकालें और 5 x 103 कोशिकाओं/एमएल प्राप्त करने के लिए RPMI माध्यम में resuspend ।
  6. एक बाँझ जलाशय के लिए सेल निलंबन स्थानांतरण और एक ९६-अच्छी तरह से गोल नीचे प्लेटों में एक मल्टीचैनल पिपेट का उपयोग कर २०० µ एल/
  7. एक मशीन के अंदर स्वचालित इमेजिंग उपकरण के लिए प्लेट स्थानांतरण (३७ ° c, 5% CO2, ९५% आर्द्रता).
  8. अधिग्रहण सॉफ्टवेयर में प्रवेश करें, चुनें अनुसूची प्राप्त करने के लिए । प्रक्षेपण जोड़ें पोत । स्कैन पर अनुसूची । पोत बनाएं: नई।
  9. स्कैन प्रकार का चयन करें: अंडाकार आकृति । ब्याज के चैनलों का चयन करें: चरण + Brightfield (spheroids वृद्धि का पालन करने के लिए), हरे (ट्यूमर संकेत का पालन करने के लिए, अधिग्रहण समय ३०० ms) और लाल (apoptosis का पालन करने के लिए, अधिग्रहण समय ४०० ms).
    1. वांछित आवर्धन का चयन करें: 10x ।
    2. थाली मॉडल और दराज में अपनी स्थिति उठाओ । छवि के लिए कुओं की स्थिति का चयन करें । प्रयोग: नाम, कक्षों का प्रकार, कक्षों की संख्या का विवरण दर्ज करें ।
  10. विश्लेषण सेटअप के लिए, बाद में विश्लेषण रोकेंका चयन करें । समयरेखा पर दायाँ क्लिक करें और चयनित स्कैन समूह अंतराल विकल्प सेट करें और स्कैन जोड़ें सेट करने के लिए हर 4 ज और के लिए कुल के लिए 24 ज. इच्छित प्रारंभ समय सेट करें (स्वचालित इमेजिंग उपकरण में मशीनीकरण के बाद कम से 1 ज).
  11. इमेजिंग सॉफ्टवेयर में प्रवेश करके spheroids की वृद्धि के लिए हर 2 दिन की जांच करें ।
    1. दृश्य हाल ही में स्कैन विकल्प उठाओ और वांछित प्रयोग पर डबल क्लिक करें । छवि चैनल पैनल में Brightfield का चयन करें और फिर spheroids के व्यास को मापने के लिए माप छवि सुविधाओं उपकरण का उपयोग करें । यह एक अंडाकार आकृति के लिए 6 दिन लगते है वांछित आकार तक पहुंचने के लिए: व्यास के ०.५ मिमी । मध्यम वाष्पीकरण प्रभाव को सीमित करने के लिए 4 दिन में अच्छी तरह से प्रति पूर्ण RPMI मध्यम के ५० µ जोड़ें ।

2. CD19 कार टी कोशिकाओं की जनरेशन

  1. CD19 कार टी कोशिकाओं का विस्तार
    नोट: CD19 कार टी कोशिकाओं के स्थिर अभिव्यक्ति स्वस्थ दाता PBMCs के थोक retroviral transduction द्वारा अधिग्रहीत किया गया था के रूप में पहले16वर्णित है । retroviral CD19 कार के लिए कोडिंग का निर्माण एक दूसरी पीढ़ी की कार है और fmc63 scFv श्रृंखला, सीडी 8 काज और transmembrane डोमेन, एक 4-1BB सह stimulatory डोमेन और अंत में एक CD3ζ डोमेन के होते हैं ।
    1. विस्तार करने के लिए, संस्कृति विरोधी की उपस्थिति में transduced टी कोशिकाओं-CD3/28 10-11 दिनों के लिए 1:1 की मनका अनुपात के लिए एक सेल के साथ चुंबकीय मोती । विस्तार के दौरान, कोशिकाओं को पूरा मध्यम (एक्स-VIVO 15, 5% सीरम प्रतिस्थापन, और १०० यू/एमएल रिकॉमबिनेंट मानव आईएल-2) में हैं ।
      नोट: एक कुशल विस्तार के लिए आदर्श घनत्व 1 से 2 x 106 कोशिकाओं/एमएल है । प्रारंभिक संख्या के आधार पर, कोशिकाओं कुप्पी में विस्तारित किया जा सकता है (25 सेमी2 कुप्पी करने के लिए 20 मिलीलीटर, ७५ सेमी2 कुप्पी कुल मात्रा के ४० मिलीलीटर करने के लिए) एक कोशिका संस्कृति मशीन में (३७ ° c, 5% CO2, ९५% आर्द्रता).
    2. निम्नलिखित परख के लिए एक नकारात्मक नियंत्रण समूह के रूप में, CD19 कार टी कोशिकाओं के समानांतर विस्तार प्रोटोकॉल के लिए गैर transduced PBMCs (नकली के रूप में भेजा जाएगा) शामिल हैं ।
    3. 3 दिन और उसके बाद, ताजा माध्यम हर दिन जोड़ने के लिए और अधिक संस्कृति कुप्पी में कोशिकाओं को विभाजित अगर आवश्यक है ।
    4. 10 दिन पर-11, 5 मिनट के लिए ५०० x g पर कोशिकाओं के केंद्रापसारक । supernatant निकालें और १ ५० मिलीलीटर ट्यूब में सभी कोशिकाओं को गठबंधन और में कोशिकाओं resuspend ~ ताजा पूरा मीडिया के 30 मिलीलीटर ।
    5. संस्कृति माध्यम से चुंबकीय मोतियों को अलग करने के लिए एक चुंबकीय स्टैंड पर रिसस्पेंडेड कोशिकाओं से युक्त ५० एमएल ट्यूब लगाएं ।
    6. 2 के लिए रुको-मोती के लिए 3 मिनट के लिए ट्यूब की ओर इकट्ठा ।
    7. एक पिपेट के साथ संस्कृति माध्यम निकालें और चुंबकीय मनका संग्रह क्षेत्रों को छूने के बिना एक नई ट्यूब के लिए स्थानांतरण ।
    8. दोहराएं मनका हटाने के बारे में कदम (2.1.5-2.1.7) एक बार और अंतिम संस्कृति माध्यम में मोतियों की संख्या को सीमित करने के लिए ।
    9. resuspend और कोशिकाओं की गणना, घनत्व को समायोजित 1 करने के लिए 2 x 106 कोशिकाओं/
    10. रात भर के लिए कम से 4 घंटे के लिए कोशिकाओं को आराम । फिर सीधे-८० डिग्री सेल्सियस पर उन्हें नीचे फ्रीज और लंबी अवधि के भंडारण के लिए अगले दिन पर एक तरल नाइट्रोजन टैंक के लिए शीशियों हस्तांतरण. वैकल्पिक रूप से, एक तत्काल उपयोग के लिए रात भर के लिए आराम को लम्बा कर सकते हैं ।
  2. प्राथमिक टी कोशिकाओं पर CD19 कार अभिव्यक्ति नियंत्रण
    1. विस्तारित टी कोशिकाओं की संख्या गिनती के रूप में संख्या थोड़ी रात के बाद अलग हो सकता है संस्कृति या मध्यम फ्रीज/
    2. दोनों CD19 कार और नकली प्राथमिक टी कोशिकाओं से 5 एक्स 105 कोशिकाओं को अलग प्रवाह cytometry ट्यूबों के लिए स्थानांतरण ।
    3. प्रवाह बफर के २०० μL (पंजाब में 2% FBS) के साथ कोशिकाओं को धो और 5 मिनट के लिए ५०० x g पर ट्यूबों केंद्रापसारक । संस्कृति माध्यम की वजह से किसी भी कलाकृतियों से छुटकारा पाने के लिए वाशिंग स्टेप्स को दोहराएँ.
    4. प्रवाह बफर में 1:200 कमजोर पड़ने से प्रदर्शन करके प्राथमिक एंटीबॉडी (बायोटिन बकरी विरोधी माउस आईजीजी, एफ (ab ') ₂ अंश विशिष्ट) तैयार करें ।
    5. ट्यूब प्रति एंटीबॉडी मिश्रण के १०० μL में कोशिकाओं को resuspend और बर्फ पर 15 मिनट के लिए गर्मी के लिए अतिरिक्त एंटीबॉडी को हटाने के लिए दो बार पिछले धुलाई कदम दोहराएं ।
    6. द्वितीयक एंटीबॉडी (Streptavidin-PE) प्रवाह बफ़र में 1:400 कमजोर पड़ने के रूप में तैयार करें ।
    7. ट्यूब प्रति एंटीबॉडी मिश्रण के १०० μL में कोशिकाओं resuspend और बर्फ पर 15 मिनट के लिए गर्मी को दोहराने के लिए अतिरिक्त एंटीबॉडी से छुटकारा पाने के लिए दो बार पिछले धुलाई कदम दोहराएं ।
    8. ट्यूब प्रति प्रवाह बफर के २०० μL में कोशिकाओं resuspend और एक प्रवाह cytometer पर यह विश्लेषण ।
    9. नकारात्मक और सकारात्मक गेट स्थापित करने और तदनुसार CD19 कार transduced टी कोशिकाओं का विश्लेषण करने के लिए नकली टी कोशिकाओं का उपयोग करें ।

3.3d ट्यूमर अंडाकार आकृति हत्या की परख

  1. 6 दिनों के बाद या एक बार spheroids वांछित आकार तक पहुंचने के बाद, मशीन से प्लेट हटा दें । एक मल्टीचैनल पिपेट का उपयोग कर, धीरे अंडाकार आकृति प्लेटों से पूरी RMPI १६४० माध्यम के १०० µ एल/
    1. इस कदम के लिए, ९६-वेल्स प्लेट के अंदर की दीवार की ओर युक्तियों का कोण, spheroids की अशांति को कम करने के क्रम में अच्छी तरह से नीचे के साथ संपर्क से परहेज । शेष मात्रा १०० µ के आसपास होनी चाहिए l
  2. Annexin वी रेड के ५० µ l को पूरा RPMI १६४० मीडियम के ९.९५ मिलीलीटर के साथ मिलाकर Annexin v red का 1:200 सॉल्यूशन तैयार करें ।
  3. जोड़ें 1:200 Annexin V लाल समाधान के १०० µ l/
  4. 15 मिनट के लिए एक मशीन (37 ° c, 5% सह2, ९५% आर्द्रता) के लिए प्लेट स्थानांतरण ।
  5. फसल एक 15 मिलीलीटर ट्यूब में transduced कार CD19 टी कोशिकाओं और उंहें ५०० x g पर 5 मिनट के लिए केंद्रापसारक । एक पिपेट का उपयोग कर supernatant निकालें और pipetting द्वारा resuspend ऊपर और नीचे के साथ कई बार पूरा RPM1 १६४० मध्यम के 2 मिलीलीटर ।
  6. एक संगत सेल काउंटर पर Trypan नीले अपवर्जन का उपयोग कर कोशिकाओं की गणना ।
  7. केंद्रापसारक सेल निलंबन के लिए ५०० x g पर 5 min. पिपेट का उपयोग कर supernatant निकालें और 2 x 105 कोशिकाओं/एमएल प्राप्त करने के लिए RPMI माध्यम में resuspend ।
  8. एक बाँझ जलाशय के लिए सेल निलंबन स्थानांतरण और १०० µ एल/अच्छी तरह से एक ९६-अच्छी तरह से गोल नीचे अंडाकार आकृति प्लेट एक मल्टीचैनल पिपेट का उपयोग कर वितरण ।
  9. एक मशीन के अंदर स्वचालित इमेजिंग उपकरण के लिए थाली वापस स्थानांतरण (३७ ° c, 5% CO2, ९५% आर्द्रता) ।
  10. अधिग्रहण सॉफ़्टवेयर में लॉग इन करें, प्राप्त करने के लिए शेड्यूल चुनें ।
    1. स्कैन समयरेखा पर राइट-क्लिक करें और समयरेखा संपादितकरेंका चयन करें । स्कैन समूह पर राइट-क्लिक करें और उसे हटाएँ । समयरेखा पर राइट-क्लिक करें और चयनित स्कैन समूह अंतराल सेट करेंका चयन करें और प्रत्येक १.५ h के लिए और 24 ज के कुल के लिए स्कैन जोड़ें सेट करेंचुनें ।
    2. वांछित प्रारंभिक समय निर्धारित करें (स्वचालित इमेजिंग उपकरण में कम 1 मशीन के बाद) । शेड्यूल स्कैन सहेजेंका चयन करें ।

4. स्वचालित छवि विश्लेषण

  1. अधिग्रहण में प्रवेश करें, हाल ही में देखें स्कैन विकल्प चुनें और विश्लेषण लांच विकल्प का चयन करें । नई विश्लेषण परिभाषा बनाएं का चयन करें । विश्लेषण प्रकार: अंडाकार आकृति। (चरण + Brightfield, हरे और लाल) का विश्लेषण करने के लिए छवि चैनल टिक.
  2. न्यूनतम 10 प्रतिनिधि छवियों का चयन करें: आमतौर पर, 1 प्रति शर्त और कम से कम 3 समय अंक (शुरुआत, मध्य और अंत में अधिग्रहण).
  3. पूर्वावलोकन डिफ़ॉल्ट पूरी छवि स्टैक पर कार्यविधि का विश्लेषण करें ।
  4. brightfield मास्क के लिए पैरामीटर्स को संशोधित करें । ठेठ पैरामीटर हैं: संवेदनशीलता 10, होल भरण १,००० µm2, न्यूनतम क्षेत्र १,००० µm2. पूरे छवि स्टैक पर पूर्वावलोकन करें और जांचें कि चयनित पैरामीटर्स spheroids सही का पता लगाते हैं ।
  5. ग्रीन मास्क (GFP) के लिए पैरामीटर्स को संशोधित करें । ठेठ पैरामीटर हैं: त्रिज्या के साथ शीर्ष टोपी विभाजन २०० µm और दहलीज 3 GCU, एज भाजित बंद, छेद भरें ५,००० µm2, आकार समायोजित करें-2 पिक्सल, क्षेत्र ंयूनतम ३,००० µm2। पूरे छवि स्टैक पर पूर्वावलोकन करें और जांचें कि चयनित पैरामीटर्स spheroids सही का पता लगाते हैं ।
  6. (Annexin V) लाल मास्क के लिए पैरामीटर्स को संशोधित करें । ठेठ पैरामीटर हैं: त्रिज्या के साथ शीर्ष टोपी विभाजन १५० µm और दहलीज 2 GCU, एज भाजित बंद, छेद भरें ५,००० µm2, आकार 0 पिक्सल, क्षेत्र ंयूनतम १,००० µm2समायोजित करें । पूरे छवि स्टैक पर पूर्वावलोकन करें और जांचें कि चयनित पैरामीटर्स spheroids सही का पता लगाते हैं ।
  7. विश्लेषक लॉंच ।
    1. एक बार विश्लेषण किया है, ब्याज की माप निकालने । विश्लेषण फ़ाइल और फिर ग्राफ मैट्रिक्स विकल्प का चयन करें । ब्याज की मीट्रिक का चयन करें, स्कैन और अच्छी तरह से. आमतौर पर, brightfield सीमाओं के भीतर कुल लाल और हरे रंग की तीव्रता brightfield मास्क (चित्रा 3) द्वारा निर्धारित spheroids सीमाओं के लिए प्रतिदीप्ति के संकेत सीमित द्वारा सबसे सटीक माप दे । "डेटा निर्यातकरें" पर क्लिक करके कई फ़ाइल स्वरूप में चयनित मीट्रिक निकालें ।
  8. विश्लेषित फ़ाइल का चयन करके छवियों और फिल्मों की निकासी के लिए आगे बढ़ें और फिर छवियों और फिल्मों के निर्यात विकल्प का चयन करें । दो विकल्प उपलब्ध हैं, या तो "के रूप में प्रदर्शित" छवियों और इमेजिंग सॉफ्टवेयर (आमतौर पर समग्र छवियों) पर देखा के रूप में फिल्मों को पुनः प्राप्त करने के लिए, या तो "के रूप में संग्रहीत" तीसरे भाग सॉफ्टवेयर के माध्यम से बाहरी विश्लेषण के लिए कच्चे डेटा को पुनः प्राप्त ।

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Representative Results

के रूप में चित्रा 1में देखा जा सकता है, यह टी कोशिकाओं पर CD19 कार की अभिव्यक्ति के स्तर cytometry प्रवाह द्वारा जांच करने के लिए महत्वपूर्ण है (आंकड़ा 1a) और HCT116 ट्यूमर सेल लाइनों पर CD19 के स्तर (आंकड़ा 1b). चित्रा 2 एक ठेठ अंडाकार आकृति प्रयोग के परिणाम मिसाल । स्वचालित इमेजिंग उपकरण चार विभिंन चैनलों में तस्वीरें लेता है: उज्ज्वल क्षेत्र, चरण, हरे और लाल प्रतिदीप्ति । चरण चैनल spheroids (जो अंडाकार आकृति गठन का संकेत है) के पास अत्यधिक विषम सीमाओं को प्रदर्शित करके spheroids के गठन पर जोर दिया जाता है । उज्ज्वल क्षेत्र विश्लेषण प्रक्रिया के दौरान spheroids के आकार का पता लगाने और ग्रीन सिग्नल (ट्यूमर) और aforementioned सीमाओं के लिए लाल संकेत (apoptosis) को प्रतिबंधित करने के लिए उपयोग किया जाता है । यह एक की अनुमति देता है घटनाओं पर विचार नहीं करने के लिए सीधे असंबंधित spheroids (उदाहरण के लिए अलग ट्यूमर कोशिकाओं और उनके apoptosis) । हरी और लाल रूपरेखाएं मैट्रिक्स गणना में क्रमशः हरे और लाल संकेतों का प्रतिनिधित्व करती हैं । चित्रा 2में, उज्ज्वल क्षेत्र, चरण, हरे और लाल चैनल "के रूप में संग्रहीत" विकल्प के माध्यम से निकाले गए थे जबकि समग्र छवियों "के रूप में प्रदर्शित" विकल्प के माध्यम से निकाले गए थे और चित्रा 3में प्रदर्शित मैट्रिक्स के प्रतिनिधि हैं । के रूप में चित्रा 2में देखा जा सकता है, नकली टी कोशिकाओं के विपरीत, CD19 कार टी कोशिकाओं को विशेष रूप से spheroids को मारने और बहुत जीवित ट्यूमर कोशिकाओं की संख्या कम करने में सक्षम थे ।

चित्रा 3 समय के साथ अंडाकार आकृति सीमाओं के भीतर मापा कुल हरे और लाल संकेत के विकास को प्रदर्शित करता है. के रूप में देखा जा सकता है, शीघ्र ही CD19 कार टी सेल इंजेक्शन के बाद, spheroids ' आकार जल्दी सिकुड़ती (के रूप में ग्रीन प्रतिदीप्ति सिग्नल द्वारा मापा) और apoptosis संकेत जल्दी से बढ़ जाती है (के रूप में लाल प्रतिदीप्ति संकेत द्वारा मापा).

Figure 1
चित्रा 1: CD19 कार और CD19 की सतह अभिव्यक्ति । (क) retrovirally transduced टी-कोशिकाओं पर CD19 कार की सतह अभिव्यक्ति. कोशिकाओं प्रवाह cytometry द्वारा विरोधी माउस-प्राथमिक और विरोधी के रूप में फैब biotinylated-Streptavidin-माध्यमिक एंटीबॉडी के रूप में पीई के माध्यम से पहले अंडाकार आकृति परख से विश्लेषण किया गया । (ख) retrovirally transduced HCT116 कोशिकाओं पर CD19 की सतह की अभिव्यक्ति. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्रा 2: ट्यूमर spheroids के खिलाफ CD19 कार टी-सेल cytotoxicity का आकलन । HCT116 अंडाकार आकृति वृद्धि का समय चूक; पर टी = 138 एच, नकली या CD19 कार टी कोशिकाओं २०००० कोशिकाओं की सघनता से पेश किया गया/ ग्रीन सिग्नल से मेल खाती है HCT116 GFP + कोशिकाओं और हरे रंग की रूपरेखा पता अंडाकार आकृति करने के लिए संगत । लाल संकेत apoptosis के रूप में Annexin वी और लाल द्वारा निगरानी की रूपरेखा के अनुरूप पता चला apoptosis घटनाओं से मेल खाती है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्रा 3: समय के साथ brightfield मुखौटा सीमाओं के भीतर कुल लाल और हरे संकेत की माप. brightfield मास्क मैट्रिक्स के भीतर कुल लाल और हरे रंग का संकेत विश्लेषण के बाद प्राप्त किया गया और समय के एक समारोह के रूप में साजिश रची । डैश्ड रेखा (CD19CAR या नकली टी-कोशिकाओं) प्रभाव कोशिकाओं का परिचय करने के लिए संगत । उपाय मतलब ± SEM से मेल खाती है (एन = 12) । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

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Discussion

भविष्य के कैंसर के इलाज को मान्य करने के लिए एक अभिनव उपकरण के रूप में spheroids का उपयोग पिछले वर्षों में बढ़ती रुचि का एक क्षेत्र बन गया है । Spheroids में शास्त्रीय 2d के बीच एक मध्यवर्ती कदम का प्रतिनिधित्व करते है इन विट्रो विश्लेषण और vivo आकलन में । विधि और ट्यूमर सूक्ष्म पर्यावरण नकल उतार के रूप में के रूप में अच्छी तरह से7जीन की रूपरेखा के संदर्भ में अपनी शक्ति के बारे में वादा की एक बहुत रखती है । इस प्रकाशन में प्रस्तुत प्रोटोकॉल Saheen एट अल.11 से Incucyte S3 के लिए अनुकूलित किया गया था और एक किफायती और आसान तरीका कोलोरेक्टल सेल लाइनों से 3 डी ट्यूमर spheroids का उत्पादन करने के लिए । युग्मन अंडाकार आकृति जनरेशन एक उच्च प्रवाह इमेजिंग डिवाइस के लिए विरोधी ट्यूमर एजेंटों की एक विस्तृत श्रृंखला के विश्वसनीय और तेजी से स्क्रीनिंग परमिट और aforementioned एजेंट की क्षमता ट्यूमर संरचना को अस्थिर करने के लिए निगरानी ।

इस प्रोटोकॉल के बारे में ध्यान में रखने के लिए कई महत्वपूर्ण चरण हैं । सबसे पहले, ट्यूमर कोशिकाओं की प्रारंभिक संख्या ठीक समायोजित करने की जरूरत है । यदि प्रारंभिक कोशिका घनत्व बहुत अधिक है, कोशिकाओं पीएलएल कोटिंग तेजी से नीचा और एक अनुयाई monolayer के रूप में शुरू होगा । दूसरी ओर, कोशिकाओं की एक कम संख्या अंडाकार आकृति आकार और प्रति अच्छी तरह से spheroids की संख्या के मामले में एक उच्च परिवर्तनशीलता का परिचय देंगे । दूसरा, एक स्वचालित इमेजिंग डिवाइस के उपयोग संभावित phototoxicity के लिए कोशिकाओं को उजागर है (खासकर यदि कई प्रतिदीप्ति चैनलों का उपयोग किया जाता है); यह spheroids को नुकसान को कम करने के लिए छवि आवृत्ति को समायोजित करने के लिए सिफारिश की है । यह एक महत्वपूर्ण पैरामीटर के लिए ब्याज की घटनाओं पर कब्जा करने के लिए मज़बूती से (एक छवि हर 4 घंटे पहले प्रभाव सेल परिचय और एक हर ९० मिनट के बाद हमारे ज्ञान के लिए सबसे अच्छा समझौता का प्रतिनिधित्व करता है) पर विचार करने के लिए है । तीसरा, हम विशेष रूप से सावधान किया जा रहा है मध्यम वाष्पीकरण कि प्रभाव सेल परिचय के बाद कुछ दिनों में हो सकता से बचने की सलाह देते हैं । चौथा, प्रभाव कोशिकाओं की संख्या भी ठीक समायोजित किया जा करने की जरूरत है: वांछित संख्या काफी उच्च करने के लिए ट्यूमर spheroids को मारने के लिए कुशलतापूर्वक लेकिन यह भी संभव के रूप में इष्टतम इमेजिंग प्रक्रिया के लिए उच्चतम क्षमता की अनुमति के रूप में कम की जरूरत है । पांचवां, एक ठेठ प्रयोग में, एक अच्छी तरह से 2 से 4 spheroids है कि एक में शामिल कर सकते हैं; यह संभावित spikes है कि इस घटना के बाद मैट्रिक्स में विस्फोट और उंहें उपेक्षा कर सकते है पर ध्यान देने की सिफारिश की है । छठा, एक ९६-अच्छी प्लेट पर, औसतन 20 से ५० कुओं में वांछित संख्या और आकार में spheroids होते हैं; हम कुओं की जांच करने के लिए प्रभाव कोशिकाओं की शुरूआत से पहले विश्लेषण के लिए विचार के रूप में यह अभिकलन समय की बचत होगी सलाह देते हैं । अंत में, विश्लेषण आंशिक रूप से स्वचालित है, लेकिन विभिन्न मापदंडों के बारे में उपयोगकर्ता से कुछ आदानों आवश्यक. यह अत्यधिक इस कदम में विशेष रूप से ध्यान रखने के लिए और संवेदनशीलता और विशिष्टता के बीच एक संतुलन पर ध्यान केंद्रित करने के लिए सिफारिश की है । यदि प्रभाव कोशिकाओं के प्रकार/दवा उपचार एक प्रयोग के भीतर व्यापक रूप से अलग है, यह विश्लेषण के विभिंन प्रकार चलाने के लिए एक है कि सबसे अच्छा सूट का चयन करने के लिए आवश्यक हो सकता है ।

इस विधि अभी तक केवल अनुयाई सेल लाइन (इस प्रकाशन HCT ११६ में) के एक निश्चित प्रकार तक ही सीमित है; आगे के विकास के लिए हर कैंसर सेल लाइन के लिए इस प्रोटोकॉल के सामांयीकरण की आवश्यकता है । हालांकि विधियों की एक विस्तृत श्रृंखला पहले से ही लक्ष्य कोशिकाओं की एक बड़ी संख्या के लिए उपलब्ध है12,13,14,15, उनमें से ज्यादातर के उपयोग पर भरोसा करते है और महंगी/ हमारे विधि, हालांकि लक्ष्य कोशिकाओं के कुछ प्रकार के लिए अभी तक सीमित है, दिलचस्प के रूप में यह प्रयोगकर्ता से बहुत ही सीमित जानकारी की आवश्यकता है और विभिंन दवाओं और/या immunotherapy उपचार (यहां कार CD19 कोशिकाओं) के एक तेज और आसान स्क्रीन परमिट । अपनी विश्वसनीयता और उपचार के विभिंन प्रकार के लिए अनुकूलित किया जा करने की क्षमता इस विधि विरोधी कैंसर उपचार सत्यापन प्रक्रिया के संदर्भ में एक शक्तिशाली उपकरण बनाते हैं ।

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Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

यह काम नार्वे अनुसंधान परिषद द्वारा अनुदान के तहत समर्थन किया गया था #244388, #254817 और #284983; नार्वे कैंसर सोसायटी (#6829007); नार्वे स्वास्थ्य क्षेत्र दक्षिण पूर्व के तहत अनुदान #17/00264-6 और #2016006 ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline SIGMA-ALDRICH D8537-500ML Lot Number: RNBG7037
75 cm² growth area flasks VWR 430639 Lot Number: 2218002
75 cm² growth area flasks VWR 734-2705 Lot Number: 3718006
Trypsin-EDTA SIGM-ALDRICH T3924-100ml Lot Number: SLBTO777
RPMI 1640 med L-glutamin, 10 x 500 mL Life Technology (Gibco) 21875-091 Lot Number: 1926384
Fetal Bovine Serum Gibco 10500064 Lot Number: 08Q3066K
Gentamicin Thermo Fischer 15750060 Lot Number: 1904924A
Trypan Blue Solution, 0.4% Thermo Fischer 15250061 Lot Number: 1886513
96 well plate, round bottom VWR 734-1797 Lot Number: 33117036
Dynabeads Human T-Activator CD3/CD28 Thermo Fischer 11132D -
X-VIVO 15 with Gentamicin L-Gln, Phenol Red, 1 L BioNordika BE02-060Q Lot Number: 8MB036
CTS Immune Cell Serum Replacement Thermo Fischer A2596102 Lot Number: 1939319
IL-2 Proleukin Novartis Lot Number: 505938M
IncuCyte Annexin V Red Reagent Essen Bioscience 4641 Lot Number: 17A1025-122117
Reagent Reservoir VWR 89094-672 Lot Number: 89094-672
15 mL tubes VWR 734-1867 Lot Number: 19317044
anti-human CD19-PE BD Biosciences 555413 Lot Number: 4016990
RRID: AB_395813
Biotin-SP (long spacer) AffiniPure F(ab')2 Fragment Goat Anti-Mouse IgG Jackson ImmunoResearch 115-066-072 Lot Number: 129474:
RRID: AB_2338583
Streptavidin-PE BD Biosciences 554061 Lot Number: 5191579:
RRID: AB_10053328
HCT 116 Colorectal Carcinoma Line ATCC CCL-247 -
Incucyte S3 Essen Bioscience

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References

  1. Porter, D. L., Levine, B. L., Kalos, M., Bagg, A., June, C. H. Chimeric antigen receptor-modified T cells in chronic lymphoid leukemia. New England Journal of Medicine. 365 (8), 725-733 (2011).
  2. Kochenderfer, J. N., et al. Eradication of B-lineage cells and regression of lymphoma in a patient treated with autologous T cells genetically engineered to recognize CD19. Blood. 116 (20), 4099-4102 (2010).
  3. Brentjens, R. J., et al. CD19-targeted T cells rapidly induce molecular remissions in adults with chemotherapy-refractory acute lymphoblastic leukemia. Science Translational Medicine. 5 (177), 177ra138 (2013).
  4. Grupp, S. A., et al. Chimeric antigen receptor-modified T cells for acute lymphoid leukemia. New England Journal of Medicine. 368 (16), 1509-1518 (2013).
  5. D'Aloia, M. M., Zizzari, I. G., Sacchetti, B., Pierelli, L., Alimandi, M. CAR-T cells: the long and winding road to solid tumors. Cell Death & Disease. 9 (3), 282 (2018).
  6. Amann, A., et al. Development of an innovative 3D cell culture system to study tumour--stroma interactions in non-small cell lung cancer cells. PLoS One. 9 (3), e92511 (2014).
  7. Enzerink, A., Salmenpera, P., Kankuri, E., Vaheri, A. Clustering of fibroblasts induces proinflammatory chemokine secretion promoting leukocyte migration. Molecular Immunology. 46 (8-9), 1787-1795 (2009).
  8. Birgersdotter, A., et al. Three-dimensional culturing of the Hodgkin lymphoma cell-line L1236 induces a HL tissue-like gene expression pattern. Leukemia & Lymphoma. 48 (10), 2042-2053 (2007).
  9. Pickl, M., Ries, C. H. Comparison of 3D and 2D tumor models reveals enhanced HER2 activation in 3D associated with an increased response to trastuzumab. Oncogene. 28 (3), 461-468 (2009).
  10. Galateanu, B., et al. Impact of multicellular tumor spheroids as an in vivo-like tumor model on anticancer drug response. International Journal of Oncology. 48 (6), 2295-2302 (2016).
  11. Shaheen, S., Ahmed, M., Lorenzi, F., Nateri, A. S. Spheroid-Formation (Colonosphere) Assay for in Vitro Assessment and Expansion of Stem Cells in Colon Cancer. Stem Cell Reviews and Reports. 12 (4), 492-499 (2016).
  12. Izraely, S., et al. The Metastatic Microenvironment: Melanoma-Microglia Cross-Talk Promotes the Malignant Phenotype of Melanoma Cells. International Journal of Cancer. , (2018).
  13. Khawar, I. A., et al. Three Dimensional Mixed-Cell Spheroids Mimic Stroma-Mediated Chemoresistance and Invasive Migration in hepatocellular carcinoma. Neoplasia. 20 (8), 800-812 (2018).
  14. Merker, M., et al. Generation and characterization of ErbB2-CAR-engineered cytokine-induced killer cells for the treatment of high-risk soft tissue sarcoma in children. Oncotarget. 8 (39), 66137-66153 (2017).
  15. Mittler, F., et al. High-Content Monitoring of Drug Effects in a 3D Spheroid Model. Frontiers in Oncolology. 7, 293 (2017).
  16. X Tadesse, F. G., Mensali, N., et al. Unpredicted phenotypes of two mutants of the TcR DMF5. Journal of Immunological Methods. 425, 37-44 (2015).

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कैंसर अनुसंधान अंक १४२ Immunotherapy कार टी कोशिकाओं Spheroids माइक्रोस्कोपी Cytotoxicity कैंसर
कार टी कोशिकाओं द्वारा एक अंडाकार आकृति हत्या परख
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Dillard, P., Köksal, H.,… More

Dillard, P., Köksal, H., Inderberg, E. M., Wälchli, S. A Spheroid Killing Assay by CAR T Cells. J. Vis. Exp. (142), e58785, doi:10.3791/58785 (2018).

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