Summary
이 프로토콜에 대 한 3 차원 구조적된 암 세포 (spheroids)에서 실시간으로 immunotherapeutic 리디렉션된 T-셀 (자동차 T-세포) 세포 독성을 평가 하기 위해 설계 되었습니다.
Abstract
Immunotherapy는 다르게 untreatable 암와의 싸움에서 성장 관심 분야를 되었다. 모든 immunotherapeutic 방법 중 공상 항 원 수용 체 (자동차) T 세포 특히 소아 B 급성 림프 구성 백혈병 (B-모두)와 함께 가장 아름 다운 결과 얻은 리디렉션됩니다. 클래식 유효성 검사 메서드가 자동차 T 세포의 특이성의 사용 정지에서 및이 종이 식 모델에서 대상 셀에 대 한 자동차 T 세포의 기능 분석에 의존합니다. 불행 하 게도, 생체 외에서 관측은 종종 vivo에서 얻은 결과에서 분리 하 고 다른 단계를 추가 하 여 많은 노력 및 동물을 아끼지 수: 3D 문화를 사용 하 여. 그들은 동물 모델에 engrafted는 때 종양 세포의 3 차원 구조를 모방 하는 잠재적인 대상 셀에서 spheroids의 생산 이상적인 대안을 나타냅니다. 여기, 우리는 (여기 CD19 자동차 T 세포에 의해 exemplified) 입양 세포 치료에 대 한 유효성 검사 도구로 불리고 장 셀 라인에서 spheroids를 생산 하는 저렴 하 고 신뢰할 수 있는 쉬운 방법 보고. 이 메서드는 회전 타원 체 성장 따를 수 있는 고급 라이브 이미징 시스템으로 결합, 이펙터 세포 세포 독성 그리고 종양 세포 apoptosis.
Introduction
입양 세포 이동 (ACT)는 다음 세대 암 치료를 나타냅니다. 그것은 환자에 효과 기 세포 (T-또는 NK-세포)의 주입에 사용합니다. 이 세포는 유전자 그들 그들의 목표는 종양을 안내 하 고 그것을 파괴 하는 수용 체와 함께 수정할 수 있습니다. 최근이 방법은 공상 항 원 수용 체 (차) B-세포 마커 CD19에 대 한 감독을 죽 일 자신의 암1환자 T 세포에 도입 되었다 때 가능한 것으로 표시 했다. 인공 수용 체 자동차의 경우 디자인 구성 특정 항 체 파편의 바인딩 도메인은 엔터티 지정 된 단일 체인 변수 조각 (scFv), 감소 하는 항 T-세포 신호 도메인에 연결. 여러 디자인을 확인 하 고는, 가장 일반적으로 사용 되는 버전 2 세대의 자동차 디자인으로 이루어져 TCR 신호에 대 한 CD3z 및 co-stimulatory 도메인 참조 (CD28, 4-1BB, OX40, 등.) 1 , 2. immunotherapy 필드 CD19 자동차-T 세포 efficaciously B 세포 악성 종양3,4수많은 환자를 치료 법의 새로운 형태에 그것의 주의의 대부분을 감독. 이 성공 연구원은 제한 된 성공 단단한 종양에 대 한 다른 epitopes를 대상으로 비슷한 디자인을 악용 하려고 합니다. 불행 하 게도, 종양 관련 항 원 및 자동차 T 렌더링 엄격한 종양 microenvironments의 부족 단단한 종양5쪽으로 더 적은 효과적인 세포.
현재, 가장 일반적으로 사용 된 생체 외에서 유효성 검사 전략만 이미 언급 한 고체 종양도 전에 조각 하는 2 차원 (2D) 시스템에 의존 합니다. 고전적인, 2D 생체 외에서 시스템 기능 및 이러한 효과 기 세포의 특이성을 평가 하기 위해 monolayers로 차 T 세포와 대상 암 세포 라인의 혼합물을 포함 한다. 이러한 전략은 연구의 중요 하 고 중요 한 부분, 하지만 그들은 복용 하지 마십시오 고려 사항으로 복잡 한 형태와 암 세포6의 3 차원 (3D) 구조. 3D 시스템, spheroids로 배양 암 세포 유전자 식 프로필7, 리디렉션된 effector 세포에 의해 인식에 영향을 줄 수 있는 변화를 통해 새로운 phenotypic 특성을 획득 합니다. Birgersdotter와 동료 Hodgkin 림프 종 (HL) 셀 라인 3D 문화 모델에만 성장 하는 때 유전자 식 프로필 기본 종양 샘플8유사한 취득 하는 것을 설명 했다. 따라서, spheroids 또는 유사한 3D 방법론 제공 표준 2D 시스템 반대로 체 외 모델에 더 많은 관련 문화. 이러한 체계는 또한 유사한 vivo에서 연구는 특정된 자동차의 유효성 검사 과정에서 마지막 단계로 볼 수 있습니다. 2D 시스템 암 클러스터의 형태를 모방 하지 고려 spheroids 제공 하기 전에 차 T 세포의 기능을 평가 하기 위해 비슷한 형성 vivo에서 모델. 한 연구, Pickl 외. 인간 표 피 성장 인자 수용 체 (HER2) 암 세포 overexpressing의 회전 타원 체 모델 vivo에서 모델9유사한 신호 프로필 증명 확인. 이 더 더 적절 하 고 주변에-에서 비보의 평가 차 T 세포를 제공 하는 spheroids을 지원 합니다. 또한, 자동차 T-셀 유효성 검사 spheroids에 대 한 그들의 효능을 좀 더 비판적으로 평가 하 고 vivo에서 연구 중간 이동에서 일부 디자인을 방지 도움이 될 수도10; 따라서, 적은 동물을 희생 하 여 윤리적으로 관련된 연구에 기여. 또한, spheroids를 사용 하 여 프로토콜 되지 않는 더 비싼 클래식 2D 시스템 보다 훨씬 더 빨리 클래식 vivo에서 학문에 비해. 함께 촬영 한 회전 타원 체 연구의 생체 외에서 그리고 vivo에서 학문을 연결 하는 표준 연습을 곧 될 것입니다 예측할 수 있습니다.
여기, 우리는 결 장 암 세포 선 HCT 116에서에서 spheroids의 준비를 제시. 이 셀 라인 CD19 자동차 T 세포에 민감한 렌더링 임상 검증된 차 구문을 사용 하 여 살인의 명확한 평가 제공 하 고 인간의 CD19 분자를 표현 하기 위해 수정 되었습니다.
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Protocol
1. 대 장 암 세포 선에서 Spheroids의 생성
- 씻어 HCT 116 (클러스터 차별화 19 (CD19) 및 녹색 형광 단백질 (GFP)를 표현 하는 불리고 안정적) 셀 monolayers 인산 염과 식 염 수 (PBS, 25 cm2 또는 75 c m2 플라스 크에 10 mL 5 mL) 버퍼링. 트립 신 (0.5 mL 25 c m2 에 대 한 또는 75 c m2 플라스 크 1 mL)을 추가 하 고 5 분 동안 37 ° C에 세포를 품 어.
- 현미경으로 세포 분리를 확인 하 고 완전 한 로스웰 파크 기념 연구소 160 매체 (RPMI 1640)와 셀 분리 효소를 무력화 (RPMI 1640 + 10 %FCS + Gentamycin; 10 mL 25 c m2 에 대 한 또는 75 c m2 플라스 크에 대 한 20 mL).
- 5 분에 대 한 500 x g 에서 원심 분리기 세포 현 탁 액 표면에 뜨는 한 피 펫을 사용 하 여 제거 하 고 여러 번 완전 한 RPM1 1640 매체의 5 mL와 함께 아래로 pipetting으로 resuspend.
- Trypan 블루 제외 호환 셀 카운터에 사용 하 여 셀을 계산 합니다.
- 5 분에 대 한 500 x g 에서 원심 분리기 세포 현 탁 액 표면에 뜨는 한 피 펫을 사용 하 여 제거 하 고 5 x 103 셀/mL를 RPMI 매체에서 resuspend.
- 메 마른 저수지에 세포 현 탁 액을 전송 하 고 멀티 채널 피 펫을 사용 하 여 하단 플레이트 라운드 96 잘으로 200 µ L/잘 분배.
- 접시 (37 ° C, 5% CO2, 95% 습도) 인큐베이터 안에 자동된 이미징 장치에 전송.
- 수집 소프트웨어에 로그인, 일정 취득 선택 | 실행 선박 추가 | 일정 검색 | 배 만들기: 새로운.
-
선택 검사 유형: 회전 타원 체. 관심의 채널 선택: 단계 + 대물 (spheroids 성장 따르도록), 녹색 (종양 신호에 따라, 수집 속도 300 ms)와 레드 (apoptosis에 따라, 수집 속도 400 ms).
- 선택 원하는 배율: 10 배.
- 플레이트 모델과 서랍에 그것의 위치를 선택 하십시오. 이미지를 우물의 위치를 선택 합니다. 실험의 설명을 입력: 이름, 셀의 형식, 셀의 수.
- 분석 설정에 대 한 연기 분석까지 나중에 선택 합니다. 시간 표시 막대를 마우스 오른쪽 단추로 클릭 하 고 선택 스캔 그룹 간격 설정 옵션을 선택 하 고 설정 검사를 추가 모든 4 h 고 의 총 24 h.에 설정 원하는 시작 시간 (자동된 이미징 장치에 부 화 후 적어도 1 시간).
-
이미징 소프트웨어에 로그인 하 여 spheroids의 성장에 대 한 일 마다 확인 합니다.
- 보기 최근 검색 옵션을 선택 하 고 원하는 실험에는 두 번 클릭. 이미지 채널 패널에서 명시 를 선택 하 고는 spheroids의 직경을 측정 하는 측정 이미지 기능 도구 날짜를 사용 하 여. 원하는 크기에 도달 하는 회전 타원 체에 대 한 일: 0.5 m m 직경의. 하루 중 증발 효과 제한 하는 4에 잘 당 완전 한 RPMI 매체의 50 µ L를 추가 합니다.
2입니다. CD19 자동차 T 세포의 생성
-
CD19 자동차 T 세포의 확장
참고: CD19 자동차 T 세포의 안정적인 식 앞에서 설명한16PBMCs 건강 한 기증자의 대량 retroviral 변환에 의해 인수 되었다. CD19 자동차 retroviral 구문을 코딩 하는 것은 2 세대 자동차와 fmc63 scFv 체인, CD8 경첩 및 막 횡단 도메인, 4-1BB co-stimulatory 도메인 및 마지막으로 CD3ζ 도메인의 구성.- 확장, 문화 transduced T 세포 안티-CD3/28 자석 구슬의 구슬 1: 1의 비율을 셀 10-11 일. 확장, 동안 세포는 완전 한 매체에는 (X-VIVO 15, 5% 혈 청 교체, 및 100 U/mL 재조합 인간 일리노이-2).
참고: 효율적인 확장에 대 한 이상적인 밀도 1 ~ 2 x 106 셀/mL입니다. 초기 번호에 따라 셀 셀 문화 인큐베이터 (37 ° C, 5% CO2, 95% 습도)에 플라스 크 (25 c m2 플라스 크 20 ml, 40 mL 전체 볼륨을 75 c m2 플라스 크)에 확장할 수 있습니다. - 다음 분석 실험에 대 한 부정적인 컨트롤 그룹으로 불리고 비 PBMCs (Mock으로 참조 될 것 이다) CD19 차 T 세포에 병렬 확장 프로토콜을 포함 합니다.
- 당일 3 및 이후, 매일 신선한 매체를 추가 하 고 필요한 경우 더 많은 문화 플라스 크로 셀을 나눕니다.
- 날 10-11, 5 분에 대 한 500 x g 에서 원심 분리기 세포에 상쾌한 제거 하 고 모든 셀을 결합 하 여 하나의 50 mL 튜브에 resuspend ~ 30 ml 신선한 완전 한 미디어의 셀.
- 장소 문화 매체에서 자석 구슬 분리 마그네틱 스탠드에 resuspended 셀을 포함 하는 50 mL 튜브.
- 튜브 측에 수집을 구슬에 대 한 2-3 분까지 기다립니다.
- 마그네틱 비드 컬렉션 영역을 건드리지 않고 피 펫과 새로운 튜브에 문화 매체를 제거 합니다.
- 한 번 더 최종 문화 매체에서 구슬의 수를 제한 하는 비드 제거 (2.1.5–2.1.7)에 대 한 단계를 반복 합니다.
- Resuspend는 셀의 개수, 1 완전 한 매체에서 2 x 106 셀/mL로 밀도 조정.
- 적어도 하룻밤까지 h 4 셀 나머지. 그런 다음 직접-80 ° C에 아래로 그들을 멈추게 하 고 액체 질소 탱크 장기 저장에 대 한 다음 날에 튜브를 전송. 또는 한 연장할 수 있습니다 나머지 최대 하룻밤 즉각적인 사용을 위해.
- 확장, 문화 transduced T 세포 안티-CD3/28 자석 구슬의 구슬 1: 1의 비율을 셀 10-11 일. 확장, 동안 세포는 완전 한 매체에는 (X-VIVO 15, 5% 혈 청 교체, 및 100 U/mL 재조합 인간 일리노이-2).
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기본 T 세포에 CD19 자동차 식 제어
- 야간 문화 또는 동결/동결 해제 후 적당히 숫자 약간 달라질 수 있습니다으로 확장 된 T 세포의 수를 계산 하 고
- 5 x 10 두 CD19 자동차에서5 세포와 모의 기본 T 세포의 흐름 cytometry 튜브를 분리 전송.
- 흐름 버퍼의 200 μ로 세포 세척 (2% FBS PBS에) 및 원심 분리기 문화 매체에 의해 발생 하는 모든 아티팩트를 제거 세척 단계를 반복 하는 500 x g 5 분에 튜브.
- 1: 200 희석 흐름 버퍼에서 수행 하 여 1 차적인 항 체 (Biotin 염소 반대로 마우스 IgG, 조각 특정 F(ab') ₂)를 준비 합니다.
- 튜브 당 항 체 혼합의 100 μ 셀 resuspend 그리고 15 분 이전 세척 단계 초과 항 체를 제거를 두 번 반복에 대 한 얼음에 품 어.
- 흐름 버퍼에서 1:400 희석으로 이차 항 체 (Streptavidin-PE)를 준비 합니다.
- 튜브 당 항 체 혼합의 100 μ 셀 resuspend 그리고 15 분 이전 세척 단계 초과 항 체의 제거를 두 번 반복에 대 한 얼음에 품 어.
- 셀의 흐름 버퍼 튜브 당 200 μ에 resuspend 및 교류 cytometer에서 분석.
- 부정적이 고 긍정적인 게이트 설정 및 분석 CD19 자동차 사용 모의 T 세포 T 세포를 적절 하 게 불리고.
3. 3D 종양 회전 타원 체 살인 분석 결과
-
6 일 또는 한 번 spheroids 후 원하는 크기에 도달, 인큐베이터에서 제거 하십시오. 회전 타원 체 격판덮개에서 완전 한 RMPI 1640 매체의 100 µ L/잘 제거 부드럽게 멀티 채널 피 펫을 사용 하 여.
- 이 단계에 대 한 내부 쪽으로 팁 각도 spheroids의 교란을 최소화 하기 위해 우물의 바닥 접촉을 피하고 96-웰 플레이트의 벽. 볼륨에 남은 약 100 µ L 이어야 한다.
- 완전 한 RPMI 1640 매체의 9.95 mL와 빨간 Annexin V의 50 µ L를 혼합 하 여 Annexin V 빨강의 1: 200 솔루션을 준비 합니다.
- 추가 1: 200 Annexin V 붉은 솔루션 100 µ L/잘.
- 15 분 동안 인큐베이터 (37 ° C, 5% CO2, 95% 습도)에 접시를 전송.
- 수확 15 mL 튜브에 500 x g 5 분에서 상쾌한 한 피 펫을 사용 하 여 제거 하 고 여러 번 완전 한 RPM1 1640 매체의 2 mL와 함께 아래로 pipetting으로 resuspend 원심 분리기 transduced 자동차 CD19 T 세포.
- Trypan 블루 제외 호환 셀 카운터에 사용 하 여 셀을 계산 합니다.
- 5 분에 대 한 500 x g 에서 원심 분리기 세포 현 탁 액 표면에 뜨는 한 피 펫을 사용 하 여 제거 하 고 2 x 105 셀/mL를 RPMI 매체에서 resuspend.
- 메 마른 저수지에 세포 현 탁 액을 전송 하 고 멀티 채널 피 펫을 사용 하 여 회전 타원 체 바닥판 라운드 96 잘으로 100 µ L/잘 분배.
- (37 ° C, 5% CO2, 95% 습도) 인큐베이터 안에 자동된 이미징 장치 다시 접시를 전송.
-
수집 소프트웨어에 로깅합니다를 취득 일정을 선택 합니다.
- 스캔 타임 라인에서 마우스 하 고 일정 편집을 선택 합니다. 검사 그룹에서 마우스 하 고 그것을 삭제 합니다. 타임 라인에서 마우스 오른쪽 단추로 클릭 하 고 선택 스캔 그룹 간격 설정 옵션을 선택 하 고 설정 검사를 추가 모든 를 1.5 h 의 총 24 h.
- 원하는 시작 시간 (자동된 이미징 장치에 부 화 후 적어도 1 시간)을 설정 합니다. 일정 검색 저장을 선택 합니다.
4. 자동화 된 이미지 분석
- 수집에 로깅합니다, 그리고 보기 최근 검색 옵션을 선택 하 고 시작 분석 옵션을 선택. 새로운 분석 정의 만들기 선택 | 분석 유형: 회전 타원 체. 체크 이미지 채널 분석 (단계 + 대물, 녹색 및 빨강).
- 적어도 10 대표 이미지 선택: 일반적으로, 조건 및 적어도 3 시간 포인트 (시작, 중간 및 취득의 끝) 1.
- 미리 보기 기본 분석 전체 이미지 스택에 절차.
- 대물 마스크에 대 한 매개 변수를 수정 합니다. 일반 매개 변수는: 감도 10, 구멍 채우기 1000 µ m2분 지역 1000 µ m2. 전체 이미지 스택 미리 보기와 선택 된 매개 변수는 spheroids를 정확 하 게 감지 하는 확인 하십시오.
- 녹색 마스크 (GFP)에 대 한 매개 변수를 수정 합니다. 일반 매개 변수는: 반경 200 µ m와 임계값 3 모자 세분화 GCU, 가장자리 분리, 구멍 채우기 5000 µ m2, 조정 크기-2 픽셀, 지역 분 3000 μ m2. 전체 이미지 스택 미리 보기와 선택 된 매개 변수는 spheroids를 정확 하 게 감지 하는 확인 하십시오.
- 빨간 마스크 (Annexin V)에 대 한 매개 변수를 수정 합니다. 일반 매개 변수는: 반경 150 µ m와 임계값 2 모자 세분화 GCU, 가장자리 분리, 구멍 채우기 5000 µ m2, 조정 크기 0 픽셀, 지역 분 1000 µ m2. 전체 이미지 스택 미리 보기와 선택 된 매개 변수는 spheroids를 정확 하 게 감지 하는 확인 하십시오.
-
분석기를 시작 합니다.
- 분석 완료 되 면, 관심의 측정을 추출 합니다. 분석 된 파일 그리고 그래프 통계 옵션을 선택 합니다. 관심, 검사 및 우물의 통계를 선택 합니다. 일반적으로, 대물 경계 내 총 빨강과 녹색 강도 spheroids 경계 명시 마스크 (그림 3)에 의해 결정 하는 형광 신호를 제한 하 여 가장 정확한 측정을 제공 합니다. "데이터 내보내기"를 클릭 하 여 여러 파일 형식에서 선택한 통계를 추출 합니다.
- 이미지 및 동영상의 추출 분석된 파일을 선택 하 여 이동 합니다 고 내보내기 이미지 및 동영상 옵션을 선택 합니다. 두 옵션 중 "으로 표시" 검색 이미지와 영화 중 하나 "로 저장" 타사 소프트웨어를 통해 외부 분석에 대 한 원시 데이터를 검색 하는 이미징 소프트웨어 (일반적으로 복합 이미지)에 사용할 수 있습니다.
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Representative Results
그림 1에서 볼 수 있듯이 그것은 cytometry에 의해 T 세포 (그림 1A)에 CD19 자동차의 표현과 HCT116 종양 세포 라인 (그림 1B)에 CD19의 레벨의 수준을 확인 중요 합니다. 그림 2 는 전형적인 회전 타원 체 실험 결과 예로 보여주. 자동화 된 이미징 장치는 4 개의 다른 채널에서 사진을 찍는: 밝은 분야, 위상, 녹색과 적색 형광. 단계 채널 spheroids (회전 타원 체 형성의 표시에는) 근처 높은 대조 경계를 표시 하 여 spheroids의 형성을 주장 하는 데 사용 됩니다. 밝은 필드는 spheroids의 크기를 감지 하 여 상기 경계에 녹색 신호 (종양)과 빨간색 신호 (apoptosis)를 제한 분석 과정에서 사용 됩니다. 하나 직접 관련이 없는 spheroids (예를 들어 격리 된 종양 세포와 그들의 apoptosis) 이벤트를 고려 하지 않을 수 있습니다. 녹색과 빨간색 윤곽선 메트릭 계산에서 고려 하는 각각 녹색과 적색 신호를 나타냅니다. 반면 복합 "으로 표시" 옵션을 통해 추출 된 영상과 그림 3에 표시 하는 통계의 대표 그림 2, 밝은 분야, 위상, 녹색, 빨강 채널 "로 저장" 옵션을 통해 추출 되었다. 모의 T 세포와 달리 그림 2에서 볼 수 있듯이 CD19 자동차 T 세포를 구체적으로 spheroids를 죽이고 라이브 종양 세포의 수를 크게 감소 수 있었다.
그림 3 녹색 총의 진화를 표시 하 고 시간이 지남에 회전 타원 체 경계 내의 빨간색 신호 측정. 볼 수 있듯이 곧 CD19 자동차 T 세포 주입 후 spheroids의 크기 축소 (녹색 형광 신호에 의해 측정)로 신속 하 게 그리고는 apoptosis 신호 증가 신속 하 게 (로 붉은 형광 신호에 의해 측정).
그림 1: 표면 CD19 자동차와 CD19 표현. (A) 불리고 retrovirally T-세포에 CD19 자동차의 표면 표현. 세포는 1 차 및 2 차 항 체로 안티 Streptavidin PE로 안티 mouse 팹 biotinylated 통해 회전 타원 체 분석 결과 이전 cytometry에 의해 분석 되었다. (B) retrovirally 불리고 HCT116 세포에 CD19의 표면 표현. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2: CD19 차 T-세포 세포 독성 종양 spheroids에 대 한 평가. 시간 경과의 HCT116 회전 타원 체 성장; t = 138 h, 모의 또는 CD19 차 T 세포의 20000 셀/밀도에 도입 되었다. 녹색 신호 HCT116 GFP + 셀에 해당 하며 검색 된 회전 타원 체에 해당 하는 녹색 개요. Annexin V에 의해 모니터링으로 빨간 신호 apoptosis에 해당 하 고 빨강 윤곽선 검출된 apoptosis 이벤트에 해당 합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3: 명시 내 총 빨강과 녹색 신호 측정 시간이 지남에 경계 마스크. 총 빨간색 및 녹색 신호 명시 마스크 통계 분석 및 시간의 기능으로 음모를 꾸민 후 얻은 했다. 파선 효과 기 세포 (CD19CAR 또는 모의 T-세포)의 도입에 해당합니다. 평균 ± SEM에 해당 하는 측정 (n = 12). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
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Discussion
미래의 암 치료의 유효성을 검사 하는 혁신적인 도구 spheroids 사용 하 여 지난 몇 년 동안에서 성장 관심 분야 되고있다. Spheroids 클래식 2D 생체 외 분석과 생체 조건 평가 사이의 중간 단계를 나타냅니다. 추가 방법은 종양 미세 환경 유전자 프로 파일링7뿐만 아니라 흉내 낸 측면에서 그들의 힘에 관한 약속을 많이 보유 하고있다. 이 책에서 제시 하는 프로토콜은 Saheen에서 적응 Incucyte s 3 외.11 장 셀 라인에서 3D 종양 spheroids를 생산 하는 저렴 하 고 쉬운 방법을 나타냅니다. 높은 처리량 이미징 장치에 회전 타원 체 세대 커플링 안정적이 고 빠른 안티 종양 에이전트가의 광범위의 검열을 허용 하 고 종양 구조를 불안정 하 게 하는 상기 에이전트의 능력 모니터링.
이 프로토콜에 관한 고려 몇 가지 중요 한 단계가 있습니다. 첫째, 종양 세포의 시작 번호는 정확 하 게 조정 될 필요가 있다. 셀 PLL을 떨어뜨릴 것입니다 시작 셀 밀도 너무 높은 경우에, 급속 하 게 코팅 하 고 부착 단층을 형성 하기 시작 합니다. 다른 한편으로, 셀의 낮은 수는 회전 타원 체 크기 면에서 높은 변화와 잘 당 spheroids의 수를 소개 합니다. 둘째, 자동화 된 이미징 장치를 사용 하 여 노출 셀 잠재적인 phototoxicity (특히 여러 형광 채널 사용 되는 경우); spheroids에 피해를 최소화 하기 위해 이미지 주파수를 조정 하는 것이 좋습니다. 그것은 안정적으로 관심 이벤트를 캡처하기 위해 고려해 야 할 중요 한 매개 변수 (4 시간 마다 이미지 이펙터 셀 소개 및 한 전에 모든 90 분 후 우리의 지식 최고의 타협을 나타냅니다). 셋째, 특히 이펙터 셀 소개 후에 몇 일을 발생할 수 있는 중간 증발 되지 않도록 주의 하면서 하는 것이 좋습니다. 넷째, 이펙터의 수 정확 하 게 조정 될 필요가 또한 세포: 원하는 번호를 죽이고 종양 spheroids 효율적으로 뿐만 아니라 낮은 가능한 최적의 이미징 프로세스에 대 한 최고의 잠재력을 수 있도록 충분히 높은 해야. 다섯째, 일반 실험에 잘 포함; 하나로 합체 수 2 ~ 4 spheroids 이 이벤트 다음과 같은 통계에서 분화 할 수 있습니다 잠재적인 스파이크에 관심을 지불 하 고 그들을 무시 하는 것이 좋습니다. 6, 96 잘 접시에 평균 20 ~ 50 스에서 포함 원하는 번호와 크기; spheroids 그것은 계산 시간을 절약할 것 이다 하는 효과 기 세포의 도입 하기 전에 분석에 대 한 간주 우물을 확인 하는 것이 좋습니다. 마지막으로, 분석은 부분적으로 자동화 된 하지만 몇 가지 다른 매개 변수에 대 한 사용자 입력을 필요로. 그것은이 단계에서 특정 돌 및 감도 특이성 사이의 균형에 초점을 좋습니다. 이펙터 셀/약물 치료의 유형 1 개의 실험에서 널리 경우, 가장 적합 한 하나를 선택 하는 분석의 종류를 실행 하는 데 필요한 수 있습니다.
이 방법은 지금까지 (이 책에서 HCT 116); 부착 셀 라인의 특정 종류 제한 추가 개발이이 프로토콜 모든 암 세포 라인을 일반화 해야 합니다. 방법의 광범위는 이미 대상 셀12,,1314,의 큰 숫자에 대 한 사용할 수 있지만15, 그들의 대부분 비싼 및 복잡 한 절차의 사용에 의존 합니다. 우리의 방법은 지금까지, 몇 종류의 대상 세포에 제한 되지만 흥미롭습니다 그것은 실험에서 매우 제한 된 입력이 필요 하며 다양 한 약물 및/또는 immunotherapy 치료 (여기 자동차 CD19 셀)의 신속 하 고 쉽게 화면으로. 그것의 안정성과 치료의 다른 종류에 적응 하는 능력 확인이 방법은 강력한 도구 항 암 치료 유효성 검사 프로세스의 맥락에서.
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Disclosures
저자는 공개 없다.
Acknowledgments
이 작품에서 보조금 #244388, #254817 그리고 #284983; 노르웨이 연구 위원회에 의해 지원 되었다 노르웨이 암 협회 (#6829007); 노르웨이 건강 지역 남쪽 동쪽 그랜트 #17/00264-6와 #2016006.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline | SIGMA-ALDRICH | D8537-500ML | Lot Number: RNBG7037 |
| 75 cm² growth area flasks | VWR | 430639 | Lot Number: 2218002 |
| 75 cm² growth area flasks | VWR | 734-2705 | Lot Number: 3718006 |
| Trypsin-EDTA | SIGM-ALDRICH | T3924-100ml | Lot Number: SLBTO777 |
| RPMI 1640 med L-glutamin, 10 x 500 mL | Life Technology (Gibco) | 21875-091 | Lot Number: 1926384 |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 10500064 | Lot Number: 08Q3066K |
| Gentamicin | Thermo Fischer | 15750060 | Lot Number: 1904924A |
| Trypan Blue Solution, 0.4% | Thermo Fischer | 15250061 | Lot Number: 1886513 |
| 96 well plate, round bottom | VWR | 734-1797 | Lot Number: 33117036 |
| Dynabeads Human T-Activator CD3/CD28 | Thermo Fischer | 11132D | - |
| X-VIVO 15 with Gentamicin L-Gln, Phenol Red, 1 L | BioNordika | BE02-060Q | Lot Number: 8MB036 |
| CTS Immune Cell Serum Replacement | Thermo Fischer | A2596102 | Lot Number: 1939319 |
| IL-2 Proleukin | Novartis | Lot Number: 505938M | |
| IncuCyte Annexin V Red Reagent | Essen Bioscience | 4641 | Lot Number: 17A1025-122117 |
| Reagent Reservoir | VWR | 89094-672 | Lot Number: 89094-672 |
| 15 mL tubes | VWR | 734-1867 | Lot Number: 19317044 |
| anti-human CD19-PE | BD Biosciences | 555413 | Lot Number: 4016990 RRID: AB_395813 |
| Biotin-SP (long spacer) AffiniPure F(ab')2 Fragment Goat Anti-Mouse IgG | Jackson ImmunoResearch | 115-066-072 | Lot Number: 129474: RRID: AB_2338583 |
| Streptavidin-PE | BD Biosciences | 554061 | Lot Number: 5191579: RRID: AB_10053328 |
| HCT 116 Colorectal Carcinoma Line | ATCC | CCL-247 | - |
| Incucyte S3 | Essen Bioscience |
References
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