Summary
Detta protokoll syftar till att bedöma immunoterapeutisk omdirigerade T-cell (bil T-cell) cytotoxicitet mot 3D strukturerad cancerceller (spheroids) i realtid.
Abstract
Immunterapi har blivit en växande intresseområde i kampen mot cancer annars behandlingsbar. Bland alla immunoterapeutisk metoder Omdirigerad chimära antigen receptorn (bil) T-celler som erhållits de mest spektakulära resultat, särskilt med pediatric B-akut lymfoblastisk leukemi (B-ALL). Klassiskt valideringsmetoder av CAR T-celler är beroende av användningen av specificitet och funktionalitet analyser av bil T-cellerna mot målceller i suspension och xenograft-modeller. Tyvärr iakttagelser in vitro-decoupleds ofta från resultat erhållna i vivo och en hel del ansträngning och djur kunde besparas genom att lägga till ytterligare ett steg: användning av 3D kultur. Produktionen av spheroids av potentiella målceller som efterliknar 3D-strukturen för tumörcellerna när de är rekonstituerades in i djurens modellen utgör ett perfekt alternativ. Här rapporterar vi en prisvärd, tillförlitlig och enkel metod för att producera spheroids från en sensorik kolorektal cellinje som ett valideringsverktyg för adoptiv cellterapi (exemplifieras här med CD19 CAR T-celler). Denna metod är tillsammans med en avancerad live imaging system som kan följa sfäroid tillväxt, effektor celler cytotoxicitet och tumör cell apoptos.
Introduction
Adoptiv cell överföring (ACT) representerar nästa generation cancerbehandling. Det bygger på en injektion av effektor celler (T - eller NK-celler) i en patient. Dessa celler kan vara genetiskt modifierade med en receptor som kommer att vägleda dem till deras mål, tumören, och förstöra den. Nyligen visade denna strategi sig vara genomförbart när en chimär Antigen receptorn (bil) riktade mot B-cell markören CD19 introducerades in i patienten T cellerna att döda sin cancer1. När det gäller bil, som är en konstgjord receptor, konstruktionen består av specifika antikroppsfragment, antigenet bindande domän minskas till en entitet utsedda enda kedja variabel fragment (scFv), kopplade till T-cell signalering domäner. Det finns flera utföranden, de vanligaste versionerna avses som andra generationens bildesign, består av CD3z för TCR signalering och en co-stimulatory domän (CD28, 4-1BB, OX40, etc.) 1 , 2. fältet immunterapi riktas de flesta av dess uppmärksamhet till denna nya form av ACT när CD19 bil-T-celler efficaciously behandlat många patienter med B-cell maligniteter3,4. Efter denna framgång, forskare försökt att utnyttja de liknande mönster genom att rikta andra epitoper för solida tumörer med begränsad framgång. Tyvärr, bristen på tumör specifika antigener och de hårdare tumör mikromiljö renderade bil T celler mindre effektivt mot solida tumörer5.
För närvarande är lita de vanligaste i vitro validering strategierna på tvådimensionell (2D) system som endast behandlar ett fragment av de redan nämnda solid tumör utmaningarna. Klassiskt, innebära 2D in vitro- system en blandning av CAR T-celler och målet cancer cellinjer som enskiktslager att bedöma funktionalitet och specificitet av dessa effektor celler. Även om dessa strategier är viktigt och avgörande delar av studierna, de inte beakta den komplexa morfologi och tredimensionella (3D) struktur av cancer celler6. Cancerceller odlade i 3D system, kallad spheroids, förvärva nya fenotypiska egenskaper genom förändringar i genen uttryck profil7, som kan påverka erkännande av omdirigerade effektor celler. Birgersdotter och kollegor har visat att en Hodgkins lymfom (HL) cell fodrar när endast odlas i 3D kultur modell förvärvar en profil av gen-uttryck som liknar primärtumör prover8. Därför kultur spheroids eller liknande 3D metoder erbjuda mer relevant i vitro modeller i motsats till vanliga 2D-system. Sådana system liknar också in vivo-studier som ses som det sista steget i valideringen av en viss bil. Med tanke på att 2D-system misslyckas med att härma morfologi av cancer kluster, spheroids erbjuda liknande formationer för att utvärdera funktionaliteten i CAR T-celler före in vivo modeller. I en studie, Pickl et al. identifierade att en sfäroid modell av human epidermal tillväxtfaktor receptor (HER2) överuttryck cancerceller visat liknande signalering profiler till i vivo modeller9. Detta stöder ytterligare att spheroids erbjuda mer relevant och nära-till-in vivo bedömning av bil T-cellerna. Dessutom bil T-cell validering mot spheroids kan hjälpa bedöma deras effekt mer kritiskt och att några av formgivningarna flyttas till studier i förtid10; således bidrar till etiskt berörda forskningen genom att offra färre djur. Dessutom är protokoll använder spheroids inte dyrare än klassiskt 2D-system och mycket snabbare jämfört med klassiska in-vivo studier. Sammantaget kan man förutse att införandet av sfäroid studier snart blir praxis att länka in vitro- och in vivo studier.
Här presenterar vi beredning av spheroids från kolon cancer cell fodrar HCT 116. Denna cellinje ändrades för att uttrycka mänskliga CD19 molekylen att återge det känsliga för CD19 CAR T-celler och ge en tydlig bedömning av dödandet med en kliniskt validerade bil konstruktion.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. generering av Spheroids från kolorektal Cancer cellinje
- Tvätta HCT 116 (stabilt sensorik för att uttrycka kluster av differentiering 19 (CD19) och grönt fluorescerande Protein (GFP)) cell enskiktslager med fosfat buffrad koksaltlösning (PBS; 5 mL för en 25 cm2 eller 10 mL för en 75 cm2 kolv). Lägg till trypsin (0,5 mL för en 25 cm2 eller 1 mL för en 75 cm2 kolv) och inkubera cellerna vid 37 ° C i 5 min.
- Kontrollera cellen lossnar under ett mikroskop och neutralisera cell dissociation enzym med komplett Roswell Park Memorial Institute 160 medium (RPMI 1640) (RPMI 1640 + 10% FCS + Gentamycin; 10 mL för en 25 cm2 eller 20 mL för en 75 cm2 kolv).
- Centrifugera cellsuspension vid 500 x g i 5 min. ta bort supernatanten med pipett och resuspendera genom pipettering upp och ner flera gånger med 5 mL av komplett RPM1 1640 medium.
- Räkna celler med Trypan blå utanförskap på en kompatibel cell räknare.
- Centrifugera cellsuspension vid 500 x g i 5 min. ta bort supernatanten med pipett och resuspendera i RPMI medium att få 5 x 103 celler/mL.
- Överföra cellsuspensionen till en steril behållare och fördela 200 µL per brunn i en 96-väl rund botten pläterar med hjälp av en flerkanalspipett.
- Överföra plattan till automatiserad bildbehandling apparaten inuti en inkubator (37 ° C, 5% CO2, 95% luftfuktighet).
- Logga in på programvaran förvärvet, Välj Schema att förvärva | Starta Lägg till fartyg | Skanna på schema | Skapa fartyg: nya.
-
Välj Scan typ: sfäroid. Välja kanaler av intresse: fas + Brightfield (att följa spheroids tillväxt), grönt (Följ tumör signal genom förvärvet tid 300 ms) och rött (Följ apoptos genom förvärvet samtidigt 400 ms).
- Välj önskad förstoring: 10 x.
- Plocka tallriksmodellen och dess position i lådan. Välj befattning av brunnar till bild. Ange beskrivning av experimentet: namn, typ av celler, antalet celler.
- För analys setup, Välj Uppskjuta analys tills senare. Högerklicka på tidslinjen och välj Ange valt Skanna gruppen intervallalternativ och ange lägga till skannar varje till 4 h och totalt till 24 h. Ange önskad start tid (minst 1 h efter inkubation i den automatisera imaging apparaten).
-
Kontrollera varje 2 dagar för tillväxten av spheroids genom att logga in i avbildningsprogrammet.
- Välj alternativet Visa senaste sökningar och dubbelklicka på önskad experimentet. Välj Brightfield panelen bild kanaler och sedan använda verktyget åtgärd bild funktioner för att mäta diametern på spheroids. Det tar 6 dagar för en sfäroid att nå önskad storlek: 0,5 mm i diameter. Tillsätt 50 µL av komplett RPMI medium per brunn på dag 4 att begränsa medium avdunstning effekt.
2. generering av CD19 bil T celler
-
Expansion av CD19 CAR T-celler
Obs: Stabilt uttryck av CD19 CAR T-celler förvärvades av bulk retrovirala transduktion friska givarens PBMC som tidigare beskrivits16. Retrovirala konstruera kodning för CD19 bil är en andra generationens bil och består av fmc63 scFv kedja, CD8 gångjärn och transmembrana domän, en 4-1BB co-stimulatory domän och slutligen en CD3ζ domän.- För att expandera, kultur transduced T-celler i närvaro av anti-CD3/28 magnetiska pärlor med en cell att pärla förhållandet 1:1 för 10 – 11 dagar. Under expansionen, cellerna är i komplett medium (VIVO-X 15, 5% Serum byte och 100 U/mL rekombinant humant IL-2).
Obs: Idealisk är för en effektiv expansion 1 till 2 x 106 celler/mL. Beroende på det ursprungliga antalet, kan celler utökas i kolvarna (25 cm2 kolvar till 20 mL, 75 cm2 kolvar till 40 mL av total volym) i en cell kultur inkubator (37 ° C, 5% CO2, 95% luftfuktighet). - Som en negativ kontrollgrupp för de följande analyserna, inkludera icke-sensorik PBMC (kommer att kallas Mock) till protokollet expansion parallellt CD19 bil T-cellerna.
- På dag 3 och framåt, Lägg färska medium varje dag och dela upp celler i mer kultur kolvar vid behov.
- Dag 10 – 11, centrifug celler vid 500 x g i 5 min. ta bort supernatanten och kombinera alla celler i en 50 mL tub och resuspendera cellerna i ~ 30 mL färsk komplett media.
- Placera 50 mL röret som innehåller återsuspenderade celler på en magnetisk stå att separera de magnetiska pärlorna från odlingssubstratet.
- Vänta 2-3 min för pärlor för att samla på sidan av röret.
- Ta bort odlingssubstratet med en pipett och överföring till en ny tub utan att röra de magnetiska pärla samling zonerna.
- Upprepa steg angående pärla borttagning (2.1.5–2.1.7) att begränsa antalet pärlor i det slutliga odlingsmediet.
- Återsuspendera och räkna cellerna, justera densiteten till 1 till 2 x 106 celler/mL i komplett medium.
- Vila cellerna för minst 4 h upp till övernattning. Sedan direkt frysa dem ner vid-80 ° C och överföra flaskorna till en flytande kväve tank på följande dag för långsiktig lagring. Alternativt kan en förlänga resten upp till över natten för omedelbar användning.
- För att expandera, kultur transduced T-celler i närvaro av anti-CD3/28 magnetiska pärlor med en cell att pärla förhållandet 1:1 för 10 – 11 dagar. Under expansionen, cellerna är i komplett medium (VIVO-X 15, 5% Serum byte och 100 U/mL rekombinant humant IL-2).
-
CD19 bil uttryck kontroll på primära T-celler
- Räkna antalet expanderade T celler som siffrorna kan variera något efter övernattning kultur eller måttligt efter frysning/upptining.
- Överföra 5 x 105 från båda CD19 bil och Mock primära T celler att separera flöde flödescytometri rör.
- Tvätta cellerna med 200 μL av Flow buffert (2% FBS i PBS) och centrifugera rören vid 500 x g för 5 min. Upprepa tvätt steg för att bli av med alla artefakter som orsakas av odlingssubstratet.
- Förbereda den primär antikroppen (Biotin get antimus IgG, F(ab') ₂ Fragment specifika) genom att utföra 1: 200 utspädning i Flow buffert.
- Att resuspendera cellerna i 100 μL av antikropp mix per rör och inkubera på is för 15 min. Upprepa detta tvätt två gånger för att ta bort överflödig antikropp.
- Förbereda den sekundära antikroppen (streptividin-PE) som 1: 400 utspädning i Flow buffert.
- Att resuspendera cellerna i 100 μL av antikropp mix per rör och inkubera på is för 15 min. Upprepa detta tvätt två gånger för att bli av med överflödigt antikropp.
- Att resuspendera cellerna i 200 μL av flöde buffert per rör och analysera den på en flödescytometer.
- Användning håna T-celler att ställa upp negativa och positiva grinden och analysera CD19 bil sensorik T-celler med detta.
3. 3D tumör sfäroid dödande Assay
-
Efter 6 dagar eller en gång spheroids når önskad storlek, avlägsna plattan från inkubatorn. Med hjälp av en flerkanalspipett, ta försiktigt bort 100 µL per brunn av komplett RMPI 1640 medium från sfäroid plattorna.
- I detta steg måste vinkla tips mot insidan vägg av 96-wells plattan, undvika kontakt med botten av brunnen för att minimera störning av spheroids. Återstående volym bör vara runt 100 µL.
- Bered en 1: 200 av Annexin V röd genom att blanda 50 µL av Annexin V röd med 9.95 mL komplett RPMI 1640 medium.
- Tillsätt 100 µL per brunn av den 1: 200 Annexin V röd lösning.
- Överföra plattan till en inkubator (37° C, 5% CO2, 95% luftfuktighet) för 15 min.
- Skörda de transduced bil CD19 T-cellerna i en 15 mL rör och centrifugera dem vid 500 x g för 5 min. avlägsna supernatanten med pipett och resuspendera genom pipettering upp och ner flera gånger med 2 mL av komplett RPM1 1640 medium.
- Räkna celler med Trypan blå utanförskap på en kompatibel cell räknare.
- Centrifugera cellsuspension vid 500 x g i 5 min. ta bort supernatanten med pipett och resuspendera i RPMI medium att få 2 x 105 celler/mL.
- Överföra cellsuspensionen till en steril behållare och dosera 100 µL per brunn i en 96-väl runda sfäroid bottenplattan med hjälp av en flerkanalspipett.
- Överföra plattan tillbaka till automatiserad bildbehandling apparaten inuti en inkubator (37 ° C, 5% CO2, 95% luftfuktighet).
-
Logga in på programvaran förvärvet, Välj schema att förvärva.
- Högerklicka på Scan tidslinjen och välj Redigera tidslinjen. Högerklicka på gruppen scan och ta bort den. Högerklicka på tidslinjen och välj Ange valt Skanna gruppen intervallalternativ och ange lägga till skannar varje till 1,5 h och totalt 24 h.
- Ställ in önskad starttid (minst 1 h efter inkubation i den automatisera imaging apparaten). Välj Spara schema skanningar.
4. automatiserad bildanalys
- Logga in på förvärv, Välj alternativet Visa senaste sökningar och alternativet Starta analys . Välj Skapa ny analys Definition | Analystyp: sfäroid. Markera de bild kanalerna för att analysera (fas + Brightfield, grön och röd).
- Välj minst 10 representativa bilder: normalt 1 per skick och minst 3 tidpunkter (början, mitten och slutet av förvärvet).
- Förhandsgranska standard analysera förfarandet på hela bilden stacken.
- Ändra parametrarna för brightfield mask. Typiska parametrar är: känslighet 10, hål fylla 1000 µm2, min område 1000 µm2. Förhandsgranska på hela bilden stacken och kontrollera att de valda parametrarna upptäcker spheroids exakt.
- Ändra parametrarna för grön mask (GFP). Typiska parametrar är: Top hat segmentering med radie 200 µm och tröskel 3 GCU, Edge avstyckades, hål fylla 5 000 µm2, justera storlek -2 pixlar, området min 3 000 µm2. Förhandsgranska på hela bilden stacken och kontrollera att de valda parametrarna upptäcker spheroids exakt.
- Ändra parametrarna för röd mask (Annexin V). Typiska parametrar är: Top hat segmentering med radie 150 µm och tröskel 2 GCU, Edge avstyckades, hål fylla 5 000 µm2, justera storleken 0 pixlar, området min 1000 µm2. Förhandsgranska på hela bilden stacken och kontrollera att de valda parametrarna upptäcker spheroids exakt.
-
Starta analysatorn.
- När analysen är klar, extrahera mätning av intresse. Välj filen analyseras och sedan alternativet Graf mätvärden . Välj måtten av intresse, skanna och brunnen. Vanligtvis, totala röda och gröna intensitet inom brightfield gränser ge de mest exakta mätningarna genom att begränsa signalen av fluorescens spheroids gränser bestäms av brightfield masken (figur 3). Extrahera valda mätvärden i flera format genom att klicka på ”Export Data”.
- Vidare till utvinning av bilder och filmer genom att välja analyserade filen och välj sedan alternativet Exportera bilder och filmer . Finns två alternativ, antingen ”som visas” att hämta bilder och filmer som ses på avbildningsprogrammet (oftast sammansatta bilder), antingen ”som lagrad” att hämta rådata för extern analys genom tredje delen programvara.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Som kan ses i figur 1, är det viktigt att kontrollera av flödescytometri graden av uttryck av CD19 bil på T-celler (figur 1A) och nivån av CD19 på HCT116 tumör cellinjer (figur 1B). Figur 2 exemplifierar resultatet av en typisk sfäroid experiment. Automatiserad bildbehandling apparaten tar bilder i fyra olika kanaler: ljusa fält, fas, grön och röd fluorescens. Fas kanalen används för att hävda bildandet av spheroids genom att Visa starkt kontrasterade gränser nära de spheroids (vilket är ett tecken på sfäroid bildandet). Ljusa fält används under analysprocessen för att identifiera storleken på spheroids och begränsa grön signal (tumör) och röd signal (apoptos) till ovan nämnda gränser. Det gör att man inte överväga evenemang utan direkt samband med spheroids (till exempel isolerade tumörceller och deras apoptos). Gröna och röda konturer representerar respektive gröna och röda signaler som beaktas vid beräkningen av mätvärden. I figur 2, ljusa fält, utvanns fas, grön och röd kanaler via alternativet ”som lagrad” sammansatta bilder utvanns via alternativet ”så visas” och är representativa mätvärden visas i figur 3. Som kan ses i figur 2, till skillnad från håna T-celler, kunde CD19 CAR T-celler specifikt döda spheroids och kraftigt minska antalet levande tumörceller.
Figur 3 visar utvecklingen av totalt grön och röd signal som mäts inom sfäroid gränser över tid. Som kan ses, strax efter CD19 bil T cell injektionen, de spheroids' storlek krymper snabbt (mätt som grön fluorescens signal) och apoptos signal ökar snabbt (mätt som röd fluorescens signal).
Figur 1: yta uttryck av CD19 bil och CD19. (A) ytan uttryck av CD19 bil på retrovirally sensorik T-celler. Celler analyserades av flödescytometri före sfäroid analysen via anti-mouse-Fab biotinylerade som primär- och anti-streptividin-PE som sekundär antikropp. (B) ytan uttryck för CD19 på retrovirally sensorik HCT116-celler. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: bedömning av CD19 CAR T-celler cytotoxicitet mot tumören spheroids. Tidsfördröjning för HCT116 sfäroid tillväxt. vid t = 138 h, Mock eller CD19 bil T celler infördes vid en densitet av 20000 celler per brunn. Grön signal motsvarar HCT116 GFP + celler och grön kontur motsvarar den upptäckta sfäroid. Röd signal motsvarar apoptos som övervakas av Annexin V och röd kontur motsvarar upptäckta apoptos händelser. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: mätningar av total röd och grön signal inom brightfield mask gränser över tiden. Totala röda och gröna signaler inom brightfield mask mätvärden erhölls efter analyseras och ritas som en funktion av tiden. Streckad linje motsvarar införandet av effektor celler (CD19CAR eller Mock T-celler). Måttet motsvarar det medelvärde ± SEM (n = 12). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Användningen av spheroids som ett innovativt verktyg för att validera framtida cancerbehandling har blivit en växande intresseområde under de senaste åren. Spheroids utgör ett mellansteg mellan klassisk 2D in vitro-analys och i vivo bedömning. Metoden ytterligare rymmer en hel del löfte angående deras styrka i form av tumör mikro-miljö härma samt gen profilering7. Det protokoll som presenteras i denna publikation var anpassad från Saheen et al.11 till Incucyte S3 och representerar en prisvärd och enkel metod för att producera 3D tumör spheroids från kolorektal cellinjer. Koppling sfäroid generation till en hög genomströmning bildenhet möjliggör tillförlitlig och snabb screening av ett brett utbud av anti-tumor agenter och övervaka nämnda agenten förmåga att destabilisera tumör struktur.
I området i närheten finns det flera kritiska steg att beakta angående detta protokoll. Det första behöver startnummer tumörceller justeras exakt. Om start cell densiteten är för hög, cellerna kommer att försämra PLL beläggning snabbt och börjar att bilda en vidhäftande enskiktslager. Däremot, kommer att ett lågt antal celler införa en hög variabilitet sfäroid storleksmässigt och antalet spheroids per brunn. För det andra, användning av en automatiserad bildenhet är utsätta celler till potentiella fototoxicitet (speciellt om flera fluorescens kanaler används); Det rekommenderas att justera bilden frekvensen för att minimera skadorna på spheroids. Det är en kritisk parameter att beakta för att fånga händelserna av intresse på ett tillförlitligt sätt (en bild var 4 timmar före effektor celler introduktion och en representerar varje 90 min efter den bästa kompromissen till vår kunskap). För det tredje rekommenderar vi att vara särskilt noga med att undvika medium avdunstning som kan uppstå några dagar efter effektor celler introduktion. Fjärde, antalet effektor celler behöver också justeras exakt: önskat nummer måste vara tillräckligt hög för att döda tumör spheroids effektivt men också så lågt som möjligt för att den största potentialen för optimal avbildningsprocessen. För det femte, i en typisk experiment, en brunn innehåller 2 till 4 spheroids som kan smälter samman till en; Det rekommenderas att uppmärksamma potentiella spikar som kan blossa upp i mätvärden efter denna händelse och att bortse från dem. Det sjätte på en plattan med 96 brunnar, i genomsnitt 20 till 50 brunnar innehåller spheroids i önskat antal och storlek. Vi rekommenderar att du kontrollerar brunnarna beaktas för analys innan införandet av effektor cellerna eftersom det kommer att spara beräkningstiden. Slutligen analys är delvis automatiserad men kräver vissa indata från användaren angående de olika parametrarna. Det rekommenderas starkt att ta särskild omsorg i det här steget och att fokusera på en balans mellan sensitivitet och specificitet. Om typ av effektor celler/missbruksbehandling varierar stort inom ett experiment, kan det vara nödvändigt att köra olika typer av analys att välja den som passar bäst.
Denna metod är hittills bara begränsat till en viss typ av fastsittande cell fodrar (i denna publikation HCT 116); att generalisera detta protokoll till varje cancer cellinje krävs ytterligare utveckling. Även om en rad olika metoder är redan tillgänglig för ett större antal mål celler12,13,14,15, de flesta av dem förlita sig på dyra och/eller komplexa förfaranden. Vår metod, är begränsad till ett fåtal typer av målceller hittills, men intressant eftersom det kräver mycket begränsade insatsvaror från försöksledaren och tillåter en snabb och enkel skärm av olika droger och/eller immunterapi behandlingar (här bil CD19 celler). Dess tillförlitlighet och dess förmåga att anpassas till olika typer av behandlingar gör denna metod ett kraftfullt verktyg i samband med cancerbehandling valideringsprocessen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har något att avslöja.
Acknowledgments
Detta arbete stöds av det norska forskningsrådet under bidrag #244388, #254817 och #284983; Norska Cancerföreningen (#6829007); Norska hälsa regionen Sydöstra enligt Grant nr 17/00264-6 och #2016006.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline | SIGMA-ALDRICH | D8537-500ML | Lot Number: RNBG7037 |
| 75 cm² growth area flasks | VWR | 430639 | Lot Number: 2218002 |
| 75 cm² growth area flasks | VWR | 734-2705 | Lot Number: 3718006 |
| Trypsin-EDTA | SIGM-ALDRICH | T3924-100ml | Lot Number: SLBTO777 |
| RPMI 1640 med L-glutamin, 10 x 500 mL | Life Technology (Gibco) | 21875-091 | Lot Number: 1926384 |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 10500064 | Lot Number: 08Q3066K |
| Gentamicin | Thermo Fischer | 15750060 | Lot Number: 1904924A |
| Trypan Blue Solution, 0.4% | Thermo Fischer | 15250061 | Lot Number: 1886513 |
| 96 well plate, round bottom | VWR | 734-1797 | Lot Number: 33117036 |
| Dynabeads Human T-Activator CD3/CD28 | Thermo Fischer | 11132D | - |
| X-VIVO 15 with Gentamicin L-Gln, Phenol Red, 1 L | BioNordika | BE02-060Q | Lot Number: 8MB036 |
| CTS Immune Cell Serum Replacement | Thermo Fischer | A2596102 | Lot Number: 1939319 |
| IL-2 Proleukin | Novartis | Lot Number: 505938M | |
| IncuCyte Annexin V Red Reagent | Essen Bioscience | 4641 | Lot Number: 17A1025-122117 |
| Reagent Reservoir | VWR | 89094-672 | Lot Number: 89094-672 |
| 15 mL tubes | VWR | 734-1867 | Lot Number: 19317044 |
| anti-human CD19-PE | BD Biosciences | 555413 | Lot Number: 4016990 RRID: AB_395813 |
| Biotin-SP (long spacer) AffiniPure F(ab')2 Fragment Goat Anti-Mouse IgG | Jackson ImmunoResearch | 115-066-072 | Lot Number: 129474: RRID: AB_2338583 |
| Streptavidin-PE | BD Biosciences | 554061 | Lot Number: 5191579: RRID: AB_10053328 |
| HCT 116 Colorectal Carcinoma Line | ATCC | CCL-247 | - |
| Incucyte S3 | Essen Bioscience |
References
- Porter, D. L., Levine, B. L., Kalos, M., Bagg, A., June, C. H. Chimeric antigen receptor-modified T cells in chronic lymphoid leukemia. New England Journal of Medicine. 365 (8), 725-733 (2011).
- Kochenderfer, J. N., et al. Eradication of B-lineage cells and regression of lymphoma in a patient treated with autologous T cells genetically engineered to recognize CD19. Blood. 116 (20), 4099-4102 (2010).
- Brentjens, R. J., et al. CD19-targeted T cells rapidly induce molecular remissions in adults with chemotherapy-refractory acute lymphoblastic leukemia. Science Translational Medicine. 5 (177), 177ra138 (2013).
- Grupp, S. A., et al. Chimeric antigen receptor-modified T cells for acute lymphoid leukemia. New England Journal of Medicine. 368 (16), 1509-1518 (2013).
- D'Aloia, M. M., Zizzari, I. G., Sacchetti, B., Pierelli, L., Alimandi, M. CAR-T cells: the long and winding road to solid tumors. Cell Death & Disease. 9 (3), 282 (2018).
- Amann, A., et al. Development of an innovative 3D cell culture system to study tumour--stroma interactions in non-small cell lung cancer cells. PLoS One. 9 (3), e92511 (2014).
- Enzerink, A., Salmenpera, P., Kankuri, E., Vaheri, A. Clustering of fibroblasts induces proinflammatory chemokine secretion promoting leukocyte migration. Molecular Immunology. 46 (8-9), 1787-1795 (2009).
- Birgersdotter, A., et al. Three-dimensional culturing of the Hodgkin lymphoma cell-line L1236 induces a HL tissue-like gene expression pattern. Leukemia & Lymphoma. 48 (10), 2042-2053 (2007).
- Pickl, M., Ries, C. H. Comparison of 3D and 2D tumor models reveals enhanced HER2 activation in 3D associated with an increased response to trastuzumab. Oncogene. 28 (3), 461-468 (2009).
- Galateanu, B., et al. Impact of multicellular tumor spheroids as an in vivo-like tumor model on anticancer drug response. International Journal of Oncology. 48 (6), 2295-2302 (2016).
- Shaheen, S., Ahmed, M., Lorenzi, F., Nateri, A. S. Spheroid-Formation (Colonosphere) Assay for in Vitro Assessment and Expansion of Stem Cells in Colon Cancer. Stem Cell Reviews and Reports. 12 (4), 492-499 (2016).
- Izraely, S., et al. The Metastatic Microenvironment: Melanoma-Microglia Cross-Talk Promotes the Malignant Phenotype of Melanoma Cells. International Journal of Cancer. , (2018).
- Khawar, I. A., et al. Three Dimensional Mixed-Cell Spheroids Mimic Stroma-Mediated Chemoresistance and Invasive Migration in hepatocellular carcinoma. Neoplasia. 20 (8), 800-812 (2018).
- Merker, M., et al. Generation and characterization of ErbB2-CAR-engineered cytokine-induced killer cells for the treatment of high-risk soft tissue sarcoma in children. Oncotarget. 8 (39), 66137-66153 (2017).
- Mittler, F., et al. High-Content Monitoring of Drug Effects in a 3D Spheroid Model. Frontiers in Oncolology. 7, 293 (2017).
- X Tadesse, F. G., Mensali, N., et al. Unpredicted phenotypes of two mutants of the TcR DMF5. Journal of Immunological Methods. 425, 37-44 (2015).
