Forståelse af miljømæssige partikler biologiske sammensætning er vigtige for studiet af dens betydelige virkninger på menneskers sundhed og sygdom spredes. Her, brugte vi tre typer af bioaerosol prøvetagningsmetoder og en biologisk analyse af luftbårne mikrober til at bedre udforske luftbårne mikrobielle samfund under forskellige miljøforhold.
Variabel mikroorganismer partikler (PM) under forskellige miljøforhold kan have betydelige virkninger på menneskers sundhed. I denne undersøgelse, vi beskrevet en protokol for flere analyser af de biologiske kompositioner i miljømæssige PM. fem forsøg er præsenteret: (1) PM nummer overvågning ved hjælp af en laser partikel counter; (2) PM samling ved hjælp af en Cyclon aerosol sampler; (3) PM samling ved hjælp af en høj-volumen luft sampler med filtre; (4) bestemmelse mikrober samling af Andersen seks-trins sampler; og (5) påvisning af biologiske sammensætning af miljømæssige PM af bakterielle 16SrDNA og svampe ITS region sekventering. Vi udvalgte disede dage og en kvæg gård som to typiske eksempler på anvendelsen i denne protokol. I denne undersøgelse, disse to prøvetagningsmetoder, Cyclon aerosol sampler og filter sampler, viste forskellige stikprøver effektivitet. Cyclon aerosol sampler udføres meget bedre med hensyn til at indsamle bakterier, mens disse to metoder viste samme effektivitet i indsamling af svampe. Filter prøvetagere kan arbejde under lave temperaturforhold mens Cyclon aerosol prøvetagere har en prøveudtagning begrænsning for temperatur. En solid påvirker sampler, såsom en Andersen seks-trins sampler, kan bruges til at prøve bioaerosols direkte ind i substratet, hvilket øger overlevelsesraten bestemmelse af antal mikroorganismer. Men denne metode primært bygger på kultur mens mere end 99% af mikrober ikke kan være kulturperler. DNA ekstraheret fra bestemmelse bakterier indsamlet af Andersen seks-trins sampler og prøver indsamlet af Cyclon aerosol sampler og filter sampler blev opdaget af bakteriel 16S rDNA og svampe ITS region sekventering. Alle ovennævnte metoder kan har bred anvendelse inden for mange områder med, såsom miljøovervågning og luftbårne patogen detektion. Fra disse resultater, kan vi konkludere, at disse metoder kan bruges under forskellige forhold og kan hjælpe andre forskere at udforske sundhedsvirkningerne af miljømæssige bioaerosols.
I naturlige miljøer findes forskellige former for mikroorganismer i bioaerosols, herunder svampe, bakterier, virus og andre mikroorganismer1. Luftbårne mikroorganismer, der kan udledes fra nogle menneskelige aktiviteter såsom dyrs fodring operationer i husdyrbrug, er de vigtigt indhold af atmosfærisk miljø2. Disse mikroorganismer kan ikke kun spille en vigtig rolle i atmosfærisk miljø men også har betydelige virkninger på menneskers sundhed og sygdomme spredes.
Som et vigtigt middel til spredning af sygdomme, mikrobielle aerosoler har tiltrukket sig bred opmærksomhed i hele verden. I nyere undersøgelser, blev mange menneskelige sygdomme fundet for at være forbundet med den komplekse sammensætning af miljømæssige partikler (PM) forskellige steder, som kemiske fabrikker, husdyrbrug og smoggy byer3,4. Den biologiske sammensætning af PM kan bidrage til nogle luftvejssygdomme og hjerte-kar-sygdomme i PM-eksponerede mennesker5. Forskellige kroppen regioner, såsom slimhinde, huden, mave-tarmkanalen og luftveje, kan være potentielle mål af mikrober knyttet til PM6,7. En øget risiko for lungekræft kan være forårsaget af langvarig udsættelse for PM2,58.
Luftbårne bakterier er blevet undersøgt på forskellige steder i flere lande rundt om i verden, herunder i metrostationer, veterinære hospitaler, slagterier, kompostering faciliteter, garverier, mælk behandlingsanlæg, kulminer, tandklinikker og indendørs miljøer9,10,11,12,13,14,15,16,17, generere en stort antal rapporter om biologiske aerosoler. Overfyldte steder forbundet med universiteter, husdyr gårde og storbyer under disede dage er tre særligt vigtige offentlige betingelser, skal vi undersøge forbindelserne mellem menneskers sundhed og de potentielle virkninger af PM eksponering. Desuden, i løbet af vinterdage i de nordlige byer i Kina, høj PM2.5 værdier kan påvirke menneskers sundhed. Selvom PM2.5 kan generere toksiske virkninger ved at målrette respiratorisk overflader og opløse i blod18, er det stadig ikke klart, hvorvidt og hvordan de mikrober, der er knyttet til PM2.5 potentielt kan påvirke menneskers sundhed19 ,20. Husdyrbrug er en af de vigtigste kilder til PM og mikrobielle aerosoler i luften. Det store antal af patogener, såsom influenzavirus og Brucella melitensis, der er båret af aerosoler i markerne omkring husdyrbrug er vigtige faktorer, der forårsager luftvejssygdomme i både husdyr og fjerkræ arbejdstagere.
I denne undersøgelse, vi har undersøgt flere typer af analyser af bioaerosols, herunder PM nummer overvågning, bioaerosol indsamling og biologiske sammensætning analyse. Luftprøver blev indsamlet af et Cyclon aerosol sampler, store mængder luft sampler med filtre og en Andersen seks-trins sampler. Derefter blev prøver af disse tre samplere analyseret af biologiske analyser, herunder bakteriel 16S rDNA og svampe ITS sekvensering til at bestemme deres biologiske kompositioner. Heri, viser vi repræsentative resultater fra bioaerosol prøver indsamlet under Beijing disede dage og fra bedrifter, der viser, at bioaerosols muligvis har stor indvirkning på menneskers og dyrs sundhed. Sammenligning mellem væske og filter prøvetagningsmetoder blev også undersøgt i denne undersøgelse primært baseret på data fra 16S DNA og svampe ITS sekventering.
I denne undersøgelse forudsat vi nogle repræsentative resultater, der blev indhentet under disede dage og i husdyrbrug. Resultater fra bioaerosol under Beijing disede dage udtagne lettet en bedre forståelse af de biologiske kompositioner af den biologiske sammensætning af PM uden PM stede under Beijing disede dage. Resultater fra prøver udtaget fra husdyrbrug vil også danne grundlag for miljømæssigt air quality control i svinestalde og et teoretisk fundament og teknisk støtte til sund opdræt og sikker produktion i husdyrbrug. Mange miljømæssige faktorer, såsom temperatur, luftfugtighed og vindhastighed, vil kunne bidrage til fordeling af aerosol partikler i kostalden (figur 1). Tidligere undersøgelser har afsløret, at PM i bedrifter, der hovedsagelig kommer fra foder, afføring, pels og fjer, som kan være relateret til de animalsk aktiviteter. De miljømæssige faktorer kan påvirke ikke blot dyrs aktiviteter, men også sammenlægning og diffusion af PM i et relativt lukket kostalden. Derfor opdager vi forskellige koncentrationer og størrelse distributioner af PM i fire forskellige måneder. Udover, de sanitære betingelse, fodring metode og dyr aktivitet var anderledes mellem de fire typer af svinestalde, som også kan påvirke deres Fællesskabets struktur af bestemmelse bakterier i luften (figur 4).
Men i denne undersøgelse, vi primært fokuseret på de tilgængelige metoder, som vi kunne bruge til at studere sammensætning og fordeling af bioaerosols under forskellige miljøforhold. Sammenlignet med andre mikrobielle prøver, de af luftbårne mikroorganismer har meget lave koncentrationer og er blandet med et stort antal urenheder, som f.eks uorganisk støvpartikler, som indfører visse vanskeligheder under indsamling og registrering af sådanne mikroorganismer21. Derfor, passende metoder til indsamling og registrering skal vælges for mikrobielle aerosoler. Samling af mikrobielle aerosoler prøver udføres normalt ved hjælp af nedbør metode eller specialudstyr til at indsamle mikroorganismer i faste, halvfaste eller flydende prøveudtagning medium22,23,24 . Derefter er nogle tilsvarende tekniske behandling og specifikke test og analyse efterfølgende foretaget25. Prøveudtagning medium bør holde mikroorganismer intakt at reducere fejl forbundet med detektion og analyse26. Men forskellige aerosol mikroorganisme prøvetagere har forskellige effekter på integriteten af prøver på grund af deres forskellige stikprøver principper og medier. Mennesker har udviklet mange former for bioaerosol samplere, der bruger forskellige stikprøver principper, såsom inertial impaction, filtrering modstand og elektrostatisk udfældning27.
Påvirker prøvetagere kan skubbe luftbårne PM til prøveudtagning medium til høj hastighed ved hjælp af udvinding udstyr. Der er to typer af påvirker prøvetagere: faste og flydende. Solid påvirker prøvetagere kan bruges til at prøve bioaerosols på en lav koncentration og kan være næsten uigennemtrængelig for air flow28. Aerosol partikler i forskellige størrelser kan screenes foreløbigt, og mikrober kan udtages direkte ind i substratet, hvilket øger overlevelsesraten for bestemmelse mikroorganismer10. På grund af inertial indvirkning, mikrobielle aerosoler partikler kollidere nemt på samme sted, og kolonier kan overlappe nemt efter kultur. I øjeblikket er den mest almindelige solid påvirker sampler Andersen-6 mikrobielle aerosoler sampler. I denne undersøgelse brugte vi en Andersen seks-trins sampler for at studere bestemmelse bakterier fordelt i luftbårne PM af forskellige størrelser.
Cyclon aerosol samplere bruge cykloner til spiral luft med høj hastighed i en cylinder eller kegle. Bioaerosol partikler kan adskilles fra luftstrømmen af centrifugalkraften, hvilket betyder, at mikrober kan støde ind i den indre væg af sampler og derefter indsamles af prøveudtagning buffer. Denne metode er praktisk og kan bruges til lange prøveudtagning gange i store flow og prøvetagning operationer. Denne metode kan ikke gennemføres ved lave temperaturer, fordi handlingen er afhængig af væske. Cyclon aerosol sampler anvendes i denne undersøgelse er en Cyclon chloroformvædet væg aerosol sampler, der kan udtrække og overføre luftbårne patogener og partikler fra stikprøven luft ind i en lille mængde vand i analyse29.
Filter prøvetagere kan arbejde under lave temperaturforhold og kan prøve partikler over en vis størrelse. Men de har en stor virkning på den mikrobielle aktivitet og er tilbøjelig til skade, som væsentligt vil påvirke efterfølgende undersøgelser af stikprøver aktivitet. I denne undersøgelse, blev bioaerosol prøver fra Beijing disede dage indsamlet ved hjælp af både en høj-volumen luft sampler med filtre og en Cyclon aerosol sampler. Formålet med dette eksperiment var at analyserer den biologiske sammensætning af PM uden adskillelse og dyrkning af luftbårne mikrober. Derfor, disse to metoder var egnet til denne undersøgelse. For metoden Cyclon aerosol sampler luftbårne mikroorganismer på en lav koncentration kan udtrækkes nemt til de kørende buffer og derefter kan analyseres bekvemt uden yderligere behandling, der er almindeligt anvendt til filter prøver. I denne undersøgelse, disse to prøvetagningsmetoder, Cyclon aerosol sampler og filter sampler, viste forskellige stikprøver effektivitet. Den supplerende behandling, der er almindeligt anvendt til filter prøver, såsom at komme prøven fra filteret, er en af de væsentligste forskelle mellem disse to metoder. Prøverne Derudover air blev indsamlet direkte ind i den kørende buffer af Cyclon aerosol sampler mens anden metoden indsamlet prøver på filtre. Karakteristik af forskellige slags prøveudtagningsmetode kan bidrage til denne forskellige stikprøver effektivitet. Vi kan antage, at Cyclon aerosol sampler er et bedre valg for mikroorganisme samling, og denne antagelse har brug for yderligere bekræftelse.
I denne undersøgelse, blev bakteriel 16S rDNA og svampe ITS region sekventering brugt til at udføre den biologiske analyse af bioaerosols. 16SrDNA sekventering er bestemmelse af 16S rDNA segmenter i den mikrobielle genom30. 16s rDNA findes bredt i prokaryoter med høj bevarelse og specificitet, som gør det nyttigt for identifikationen af mikrobielle arter31. Hele-genome sequencing kræver kun udpakningen genomisk DNA og efterfølgende sekvensering. Ud over at producere en stor mængde af data, denne proces også giver mulighed for en mere omfattende analyse af mikrobielle samfund struktur. Metagenomics kan desuden også bruges i dette fagområde ved at give flere oplysninger i fremtiden. Handelsman et al. først foreslået idéen om metagenome i 1998 papir på mikrober i jord32. I efterfølgende undersøgelser, begrebet metagenome blev gradvis accepteret og megen forskning blev udført på de mikrober, der er inkluderet i den menneskelige gut, hav og jord33,34,35. Med støtte fra høj overførselshastighed sekventering teknologi, metagenomics har udviklet sig hurtigt, og det spiller en stadig vigtigere rolle i studiet af patogen detektion. Traditionelle mikrobielle forskningsmetoder er hovedsageligt afhængige kultur for adskillelse og rensning. Dog mange undersøgelser kan ikke udføres fordi mere end 99% af mikrober ikke kan være kulturperler. I modsætning til traditionelle metoder, kan metagenomics tage de genetiske oplysninger for alle mikrober i miljøet som helhed uden at skulle adskille individuelle organismer36. En omfattende analyse af alle de deraf følgende mikroorganismer kan foretages direkte.
I Resumé, denne undersøgelse viste flere påvisning, prøveudtagning og analysemetoder, der kunne bruges til undersøgelser af den biologiske sammensætning af miljømæssige PM, herunder PM overvågning; PM prøveudtagning af en Andersen seks-trins sampler, store mængder luft sampler med filtre eller Cyclon aerosol sampler; og efterfølgende biologiske analyse baseret på DNA-sekventering. I praksis, kan disse metoder anvendes under forskellige miljøforhold, som mange typer af husdyrbrug. Vores protokoller og resultaterne kan hjælpe andre forskere over hele verden at udforske sundhedsvirkningerne af svampe- og bakterielle bioaerosols i miljøet.
The authors have nothing to disclose.
Finansiel støtte til denne undersøgelse kom fra den National Natural Science Foundation of China (nr. 41775148). Finansieringskilderne spillede ingen rolle i undersøgelse design, dataindsamling og analyse, beslutningen om at offentliggøre eller forberedelse af manuskriptet.
airborne laser particle counter | TSI Inc, MN, USA | model 9306 | |
Andersen six-stage sampler | Tisch Inc, USA | TE-20-600 | |
AxyPrep multisource DNA Miniprep Kit | Axygen, NY, USA | AP-MN-MIS-GDNA-50G | |
FastPfu Polymerase | TransGen Inc., Beijing, China | AP221-01 | |
High-volume air sampler | Beijing HuaRui HeAn Technology Co., Ltd., China | HH02-LS120 | |
Real-Time PCR System | Thermo Fisher Scientific, USA | Applied Biosystems® 7500 | |
Soybean-Casein Digest Agar | Becton, Dickinson and company, MD, USA | 211043 | |
Tissuquartz filters | Pall, NY, USA | 7204 | |
Wetted-Wall Air Sampler | Research International, Inc. 17161 Beaton Road SE Monroe, Washington 98272-1034 USA |
SASS 2300 |