Forstå biologiske sammensetningen av miljømessige svevestøv er viktig for studiet av sin store virkninger på helse og sykdom spres. Her brukte vi tre typer bioaerosol Prøvetaking metoder og en biologisk analyse av luftbårne mikrober å bedre utforske luftbårne mikrobielle samfunn under ulike miljøforhold.
Variabel mikroorganismer i svevestøv (PM) under ulike miljøforhold kan ha store virkninger på menneskers helse. I denne studien vi beskrev en protokoll for flere analyser av biologiske komposisjonene miljømessige PM. fem eksperimenter presenteres: (1) PM nummer overvåking ved hjelp av en laser partikkel teller; (2) PM samling ved hjelp av en virvlende aerosol sampler; (3) PM samling ved hjelp av en høy-volum luft sampler med filtre; (4) culturable mikrober samling av Andersen seks-trinns sampler; og (5) deteksjon av biologiske sammensetningen av miljømessige PM av bakteriell 16SrDNA og sopp sin region. Vi valgte tåkete dager og en buskap gård som to typiske eksempler på programmet i denne protokollen. I denne studien, disse to Prøvetaking metoder, virvlende aerosol sampler og filteret sampler, viste forskjellige prøveplanene effektivitet. Den virvlende aerosol sampler utført mye bedre i form av å samle bakterier, mens disse to metodene viste samme effektivitet innsamling sopp. Filteret samplere kan arbeide under lave temperaturer mens virvlende aerosol samplere har en prøvetaking begrensningen for temperaturen. En solid påvirker sampler, for eksempel en Andersen seks-trinns sampler, kan brukes til å prøve bioaerosols direkte til kultur medium, som øker overlevelse av culturable mikroorganismer. Men avhengig denne metoden hovedsakelig kultur mens mer enn 99% av mikrober kan kultivert. DNA utvunnet fra culturable bakterier samlet av Andersen seks-trinns sampler og prøver samles av virvlende aerosol sampler og filteret sampler ble oppdaget av bakteriell 16S rDNA og fungal ITS regionen sekvenser. Alle metodene ovenfor kan ha bredt program i mange felt av studien, som miljøovervåking og luftbårne patogen gjenkjenning. Fra disse resultatene, kan vi konkludere med at disse metodene kan brukes under ulike forhold, og kan hjelpe andre forskere utforske ytterligere helseeffektene av miljømessige bioaerosols.
I naturskjønne omgivelser finnes ulike typer mikroorganismer i bioaerosols, inkludert sopp, bakterier, virus og andre mikroorganismer1. Luftbårne mikroorganismer, som kan bli utsendt fra noen menneskelige aktiviteter som dyr fôring operasjoner i husdyr gårder, er viktige innholdet av atmosfærisk miljø2. Disse mikroorganismer kan ikke bare spille en viktig rolle i atmosfæriske miljøet, men også ha viktige effekter på helse og sykdommer spre.
Som en viktig måte å spre sykdommer, mikrobielle aerosoler har tiltrukket seg bred oppmerksomhet over hele verden. I nyere studier, ble mange menneskelige sykdommer funnet for å være assosiert med komplekse sammensetningen av miljømessige svevestøv (PM) på forskjellige steder, slik som kjemiske fabrikker, husdyr gårder og smoggy byer3,4. Biologiske sammensetningen av PM kan bidra til noen luftveis- og hjerte sykdommer i PM-eksponerte mennesker5. Ulike kroppen regioner, som mucosa, hud, fordøyelseskanal og luftveier, kan være potensielle mål av mikrober knyttet til PM6,7. Økt risiko for lungekreft kan være forårsaket av langvarig eksponering for PM2.58.
Luftbårne bakterier har undersøkt på ulike steder i flere land over hele verden, inkludert i metro stasjoner veterinary sykehus, slakterier, kompostering fasiliteter, garverier, melk prosesseringsanlegg, kullgruver, tannhelsetjenesten og innendørs miljøer9,10,11,12,13,14,15,16,17, generere en stort antall rapporter om biologiske aerosoler. Overfylte steder knyttet studiestedene, husdyr gårder og storbyene disig dagene er tre spesielt viktig offentlig forhold som vi trenger å utforske sammenhengene mellom helse og hvilken virkning PM eksponering. Videre under vinterdager i nordlige byene i Kina, kan høye PM2.5 verdier påvirke menneskers helse. Selv om PM2.5 kan generere toksiske effekter av målretting åndedretts overflater og løses opp i blodet18, er det ennå ikke klart om og hvordan mikrober knyttet til PM2.5 kan påvirke menneskers helse19 ,20. Husdyr gårder er en av de viktigste kildene til PM, mikrobielle aerosoler i luften. Det store antallet patogener, som influensavirus og Brucella melitensis, som er gjennomført av aerosoler i feltene rundt husdyr gårder er viktige faktorer forårsaker luftveissykdommer både husdyr og fjørfe arbeidere.
I denne studien utforsket vi flere typer analyser av bioaerosols, inkludert PM nummer overvåking, bioaerosol innsamling og biologiske komposisjon analyse. Air prøvene ble samlet av en virvlende aerosol sampler, en høy-volum luft sampler med filtre og en Andersen seks-trinns sampler. Deretter ble prøver innsamlet av disse tre samplere analysert av biologiske analyse inkludert bakteriell 16S rDNA og fungal ITS sekvenser å bestemme sine biologiske komposisjoner. Her viser vi representant resultater fra bioaerosol prøvene samlet under Beijing tåkete dager og husdyr gårder som angir at bioaerosols kan ha stor innvirkning på mennesker og dyr sunnhet. Sammenligningen mellom flytende og filter Prøvetaking metoder var også utforsket i denne studien hovedsakelig basert på data fra 16S DNA og fungal ITS sekvenser.
I denne studien gitt vi noen representant resultatene som ble oppnådd under tåkete dager og husdyr gårder. Resultatene fra bioaerosol prøver tatt under Beijing tåkete dager tilrettelagt en bedre forståelse av biologisk komposisjonene biologiske sammensetningen av PM uten PM under Beijing tåkete dager. Resultatene fra prøver tatt fra husdyr gårder vil også gi grunnleggende data for miljømessige luft quality control i piggeries og teoretisk fundament og kundestøtte for sunn formering og trygg produksjon i husdyr gårder. Mange miljømessige faktorer, som temperatur og fuktighet, vindhastighet, kan bidra til distribusjon av aerosol partikler i ku huset (figur 1). Tidligere studier har avdekket at PM i husdyr gårder hovedsakelig kommer fra fôr, avføring, pels og fjær, som kan være relatert til dyr aktiviteter. Miljømessige faktorer kan påvirke ikke bare dyr aktiviteter, men også aggregering og spredningen av PM i et relativt lukket ku hus. Derfor merker vi ulike konsentrasjoner og størrelse distribusjoner av PM i fire ulike måneder. Dessuten sanitære tilstanden, fôring metoden og dyr aktivitet var annerledes mellom fire typer piggeries, som kan også påvirke samfunnet strukturen av culturable bakterier i luften (Figur 4).
Men i denne studien fokusert vi hovedsakelig på de tilgjengelige metodene vi kan bruke til å studere komposisjon og distribusjon av bioaerosols under ulike miljøforhold. Sammenlignet med andre mikrobiell prøver, de av luftbårne mikroorganismer har svært lave konsentrasjoner og er blandet med mange urenheter, for eksempel uorganisk støvpartikler, som innføre visse problemer under innsamling og registrering av slike mikroorganismer21. Aktuelle metoder for innsamling og gjenkjenning skal derfor velges for mikrobiell aerosoler. Samlingen av mikrobielle aerosol prøver utføres vanligvis ved hjelp av nedbør metoden eller spesialisert utstyr for å samle mikroorganismer i flytende, halvfaste eller robust utvalg middels22,23,24 . Så, noen tilsvarende teknisk behandling og bestemt testing og analyse senere utføres25. Prøvetaking medium bør holde mikroorganismer intakt å redusere forbundet med oppdagelsen og analyse26. Men har forskjellige aerosol microorganism samplere ulike effekter på integriteten til prøver deres forskjellige prøveplanene prinsipper og media. Folk har utviklet mange typer bioaerosol samplere som bruker forskjellige prøveplanene prinsipper, som treghet impaction, filtrering motstand og elektrostatiske nedbør27.
Påvirker samplere kan presse luftbårne PM til prøvetaking medium i høy hastighet ved hjelp av utvinning utstyr. Det finnes to typer påvirker samplere: faste og flytende. Solid påvirker samplere kan brukes til å prøve bioaerosols på en lav konsentrasjon og kan være nesten ugjennomtrengelig til luft strømme28. Aerosol partikler av forskjellige størrelser kan screenes foreløpig, og mikrober kan prøves direkte til kultur medium, som øker overlevelse culturable mikroorganismer10. På grunn av treghet innvirkning, mikrobielle aerosol partikler kolliderer lett på samme sted, og koloniene kan overlappe lett etter kultur. I dag er den vanligste solid påvirker sampler Andersen-6 mikrobiell aerosol sampler. I denne studien brukte vi en Andersen seks-trinns sampler for å studere culturable bakterier distribuert i luftbårne PM av forskjellige størrelser.
Virvlende aerosol samplere bruk sykloner til spiral luft i høy hastighet i en sylinder eller kjegle. Bioaerosol partikler kan skilles fra luftstrømmen av sentrifugalkraften, som betyr at mikrober kan støte inn i indre veggen av sampler og deretter samles inn av prøvetaking bufferen. Denne metoden er praktisk og kan brukes for lenge prøvetaking ganger i store flyten og prøvetaking operasjoner. Men kan ikke denne metoden implementeres ved lave temperaturer fordi operasjonen er avhengig av flytende. Den virvlende aerosol sampler brukt i denne studien er en virvlende wetted vegg aerosol sampler som kan trekke og overføre luftbårne patogener og partikler fra samplet luft inn i en liten mengde vann analyse29.
Filteret samplere kan arbeide under lave temperaturer og kan smake partikler over en viss størrelse. Men de har en stor innvirkning på mikrobiell aktivitet og er utsatt for skade, som vil sterkt påvirke studier på prøvetaking aktivitet. I denne studien innhentet bioaerosol prøver fra Beijing tåkete dager ved hjelp en høyt volum luft sampler med filtre og en virvlende aerosol sampler. Målet med dette eksperimentet skulle analyserer biologiske sammensetningen av PM uten separasjon og dyrking av luftbårne mikrober. Derfor var disse to Prøvetaking metoder egnet for denne studien. For metoden virvlende aerosol sampler luftbårne mikrober på en lav konsentrasjon kan lett ut inn i kjører buffer og deretter kan analyseres beleilig uten ekstra behandling som vanligvis brukes for filteret prøver. I denne studien, disse to Prøvetaking metoder, virvlende aerosol sampler og filteret sampler, viste forskjellige prøveplanene effektivitet. Ekstra behandling som er brukt for filteret utvalgene, for eksempel gjenopprette prøven fra filteret, er en av hovedforskjellene mellom disse to metodene. Dessuten ble luft prøvene samlet direkte inn i kjører buffer av virvlende aerosol sampler mens den andre metoden samlet prøver på filtre. Egenskapene til ulike typer sampling metoden kan bidra til dette forskjellige prøveplanene effektivitet. Vi kan anta at den virvlende aerosol sampler er det beste valget for microorganism samling, og forutsetningen må videre bekreftelse.
I denne studien ble bakteriell 16S rDNA og fungal ITS regionen sekvenser brukt til å utføre biologiske analyse av bioaerosols. 16SrDNA sekvensering er fastsettelse av 16S rDNA segmenter i mikrobiell genomet30. Det finnes mye 16S rDNA i prokaryoter med høy bevaring og spesifisitet, som gjør det nyttig for identifikasjon av mikrobielle arter31. Hele-genome sekvensering krever bare utvinning av genomisk DNA og påfølgende sekvensering. I tillegg produserer en stor mengde data, gir denne prosessen også for en mer omfattende analyse av mikrobielle samfunn struktur. Dessuten kan metagenomics også brukes i dette feltet studium ved å gi mer informasjon i fremtiden. Handelsman et al. først foreslått begrepet metagenome i en 1998 papir på mikrober i jord32. I studier, begrepet metagenome ble gradvis akseptert og mye forskning ble gjennomført på mikrober i den menneskelige tarmen, hav og jord33,34,35. Med støtte fra høy gjennomstrømming sekvensering teknologi, metagenomics har utviklet seg raskt, og det spiller en stadig viktigere rolle i studiet av patogen gjenkjenning. Tradisjonelle mikrobiell forskningsmetoder i hovedsak stole på kultur for separasjon og rensing. Men mange studier kan ikke utføres fordi mer enn 99% av mikrober kan kultivert. I motsetning til tradisjonelle metoder, kan metagenomics ta den genetiske informasjonen av alle mikrober i miljøet som helhet uten behovet å skille individuelle organismer36. En omfattende analyse av alle resulterende mikroorganismer kan utføres direkte.
I sammendraget, denne studien viste flere deteksjon, prøvetaking og analyse metoder som kan brukes til studier av biologisk sammensetningen av miljømessige PM, inkludert PM overvåking; PM prøvetaking med en Andersen seks-trinns sampler, en høy-volum luft sampler med filtre eller virvlende aerosol sampler; og påfølgende biologiske analyse basert på DNA sekvensering. I praksis, kan disse metodene brukes under ulike miljøforhold, som mange typer av husdyr gårder. Våre protokoller og resultatene kan hjelpe andre forskere over hele verden utforske ytterligere helseeffektene av sopp og bakteriell bioaerosols i miljøet.
The authors have nothing to disclose.
Økonomisk støtte til denne studien kom fra National Natural Science Foundation av Kina (nr. 41775148). Fond ikke hadde noen rolle i studien design, innsamling og analyse, beslutningen om å publisere eller utarbeidelse av manuskriptet.
airborne laser particle counter | TSI Inc, MN, USA | model 9306 | |
Andersen six-stage sampler | Tisch Inc, USA | TE-20-600 | |
AxyPrep multisource DNA Miniprep Kit | Axygen, NY, USA | AP-MN-MIS-GDNA-50G | |
FastPfu Polymerase | TransGen Inc., Beijing, China | AP221-01 | |
High-volume air sampler | Beijing HuaRui HeAn Technology Co., Ltd., China | HH02-LS120 | |
Real-Time PCR System | Thermo Fisher Scientific, USA | Applied Biosystems® 7500 | |
Soybean-Casein Digest Agar | Becton, Dickinson and company, MD, USA | 211043 | |
Tissuquartz filters | Pall, NY, USA | 7204 | |
Wetted-Wall Air Sampler | Research International, Inc. 17161 Beaton Road SE Monroe, Washington 98272-1034 USA |
SASS 2300 |