Summary
환경 미 립 자 물질의 생물 학적 구성을 이해 하는 것은 인간의 건강과 질병 확산에 중요 한 영향의 연구에 대 한 중요 하다입니다. 여기, 우리 사용 bioaerosol 샘플링 방법의 세 가지 유형 및 공 수 미생물의 생물 학적 분석 더 나은 다른 환경 조건 하에서 공 수 미생물 지역 사회를 탐구.
Abstract
다른 환경 조건 하에서 미 립 자 물질 (PM)에 가변 미생물 인간의 건강에 중요 한 영향을 있을 수 있습니다. 이 연구에서 우리 설명 하는 프로토콜 환경 오후 5 실험에서 생물학 작곡의 여러 분석 제공 됩니다: 레이저 입자 카운터;를 사용 하 여 (1)는 오후 수 모니터링 (2) 오후 사이 클론 졸 샘플러;를 사용 하 여 컬렉션 (3) 오후 컬렉션 필터; 높은 볼륨에 어 샘플러를 사용 하 여 (4) culturable 미생물 컬렉션 안데르센 6 단계 샘플러; 그리고 세균 16SrDNA 및 곰 팡이 는 지역 시퀀싱 환경 오후의 생물학 구성의 (5) 검출. 우리는이 프로토콜에 응용 프로그램의 두 개의 일반적인 예제로 헷갈리는 일 및 가축 농장을 선택. 이 연구,이 두 가지 샘플링 방법, 사이 클론에 어로 졸 샘플러와 필터 샘플러, 다른 샘플링 효율을 보였다. 사이 클론 졸 샘플러 동안 이러한 두 가지 방법 버섯 수집 동일한 효율성을 보였다 박테리아, 수집 측면에서 훨씬 더 나은 수행 합니다. 사이 클론에 어로 졸 시료 온도 대 한 샘플링 제한 동안 필터 샘플러 낮은 온도 조건에서 일할 수 있습니다. 안데르센 6 단계 샘플러 같은 단단한 영향을 샘플러 culturable 미생물의 생존 율을 증가 하는 문화 매체에 직접 샘플 bioaerosols를 사용할 수 있습니다. 그러나,이 방법은 주로 의존 문화 동안 미생물의 99% 이상이 경작 될 수 없습니다. 안데르센 6 단계 샘플러와 샘플 수집 culturable 박테리아에서 추출한 DNA 사이 클론 졸 샘플러에 의해 수집 및 필터 샘플러 세균성 16S rDNA 및 곰 팡이 는 지역 시퀀싱에 의해 감지 되었다. 위의 모든 방법 연구, 환경 모니터링 및 공 수 병원 체 검출 등의 많은 분야에서 다양 한 응용 프로그램을 할 수 있습니다. 이러한 결과에서 우리는 이러한 방법을 다른 조건 하에서 사용 될 수 있습니다 및 다른 연구원은 더 환경 bioaerosols 건강에 미치는 영향을 탐구 도움이 될 수 있습니다 가정할 수 있습니다.
Introduction
자연적인 환경에서 다양 한 종류의 미생물 bioaerosols, 균 류, 박테리아, 바이러스와 다른 미생물1를 포함 하 여 존재 합니다. 가축 농장에서 동물 먹이 작업 등 일부 인간 활동에서 방출 될 수 있다, 공 수 미생물 대기 환경2의 중요 한 내용입니다. 이러한 미생물 뿐만 아니라 대기 환경에 중요 한 역할을 하지만 또한 인류 건강 및 질병 확산에 중요 한 영향을 미칠 수 있습니다.
질병 확산의 중요 한 방법으로 미생물에 어로 졸은 전 세계에 걸쳐 다양 한 관심을 받고 있다. 최근 연구에서 많은 인간 질병 화학 공장, 가축 농장과 smoggy 도시3,4등의 다른 위치에서 환경 미 립 자 물질 (PM)의 복잡 한 구성으로 연결을 발견 했다. 오후의 생물 학적 구성 오후-노출 인간5일부 호흡기 및 심장 혈관 질병에 기여할 수 있습니다. 점 막, 피부, 소화 관, 호흡기, 및 등의 다른 몸 지역 오후6,7에 부착 된 미생물의 잠재적인 대상이 될 수 있습니다. 폐암의 위험이 증가 오후2.58에 장기간된 노출에 의해 발생할 수 있습니다.
공 수 박테리아 퇴 비 시설, tanneries, 우유 처리 시설, 석탄 광산, 지하철 역, 동물 병원, slaughterhouses, 등 세계 여러 나라에서 다양 한 위치에서 조사 되는 치과 클리닉 실내 환경9,10,11,12,13,14,15,,1617, 생성 하 고는 생물학에 어로 졸에 대 한 보고서의 큰 수입니다. 캠퍼스, 가축 농장 연관 붐비는 장소 그리고 헷갈리는 일 동안 대도시 조건은 3 특히 중요 한 공개는 우리 인간의 건강과 오후 노출의 잠재적인 효과 사이의 연결을 탐험 필요. 또한, 중국의 북부 도시에서 겨울 시절, 높은 오후2.5 값 수 있습니다 영향을 인간의 건강. 오후2.5 호흡기 표면 대상으로 독성 효과 생성할 수 있으며 혈액18에 용 해, 그것은 아직 명확 하지 여부와 어떻게 오후2.5 에 부착 된 미생물19 인간의 건강에 영향을 줄 수 있지만 ,20. 가축 농장은 오후의 주요 소스 중 하나 및 공중에 미생물 졸. 병원 균, 인플루엔자 바이러스 등 세라 melitensis, 가축 농장 주변 분야에서에 어로 졸에 의해 수행 하는 많은 노동자 가축 및 가금류에 호흡기 질환을 일으키는 중요 한 요인이 있습니다.
이 연구에서 우리는 여러 유형의 bioaerosols, 오후 번호 모니터링, bioaerosol 수집 및 생물 학적 구성 분석 등의 분석을 탐험. 공기 샘플은 사이 클론 졸 샘플러, 필터와 높은 볼륨에 어 샘플러와 안데르센 6 단계 샘플러 수집 되었습니다. 그런 다음,이 3 명의 시료에 의해 수집 된 샘플 세균성 16S rDNA 와 자신의 생물학적 구성 결정을 곰 팡이 는 시퀀싱을 포함 한 생물 학적 분석에 의해 분석 되었다. 여기, 우리는 베이징 헷갈리는 일 동안 수집 된 bioaerosol 샘플 및 가축 농장 bioaerosols 인간과 동물 건강에 큰 영향을 미칠 수 있습니다 나타내는 대표적인 결과 보여줍니다. 액체와 필터 샘플링 방법 비교 했다 주로 16S DNA와 곰 팡이 시퀀싱 데이터에 따라이 연구에서는 또한 탐구 된다.
Protocol
1. 오후 수 모니터링
- 공 수 레이저 입자를 사용 하 여 총 분 수를 결정 ( 재료의 표참조) 카운터. 공 수 레이저 입자 카운터 상단 공기 샘플링 포트에서 오후를 수집 합니다.
참고:이 입자 카운터는 자동화 장비 이며 그것 수 있습니다 독립적으로 작동 때 샘플링 시간, 간격, 컬렉션 시간 등 프로그램, 등 그것의 터치 스크린에 설정 되었습니다.- 온도 및 상대 습도 모니터링 하는 센서와 악기를 장비. 측정 하 고 온도 및 상대 습도 데이터 동시에 5 분 마다 기록 합니다.
- 총, 측정 하 고 기록 6 다른 입자 크기 클래스 (0.3-0.5 μ m, 0.5-0.7 μ m, 0.7-2.5 μ m, 2.5-5 μ m, 5-10 μ m 및 > 10 μ m) 5 분 마다 4 다른 입자 크기 클래스를 측정 하는 동시에 (0.3-0.5 μ m, 0.5-1 μ m, 1-3 μ m 및 ≥ 3 μ m).
- 샘플러 상단 샘플링 구멍 하지만 공기 샘플을 수집 하 고 각 오후의 입자 크기를 측정 하는 샘플러 내부 테스트 모듈을 사용 하 여. 다음 데이터는 자동으로 저장 됩니다. 위의 모든 프로세스 상대 매개 변수, 시간 샘플링 등 범위를 계산 후 자동으로 수행할 수 있습니다, 그리고 하지만 공 수 레이저 입자 카운터의 미니 터치 디스플레이 설정 됩니다.
참고:이 입자 카운터는 자동화 장비 그리고 다른 입자 크기 클래스의 오후의 수를 계산 하는 테스트 모듈.
- 실험 표준 오차 평가, 다른 입자 크기 클래스 적어도 15 복제와 계산 됩니다 확인 합니다. 판독 악기의 내부 메모리에 저장 되 고 이후 분석을 확인 합니다.
- 기본 데이터의 분석 포함 각 크기 클래스에서 오후 수 농도, ANOVA 테스트와 오후의 비율을 확인 합니다. 예를 들어 그림 1A에서 같이, 12 월 (237.6 입자/cm3) 오후 번호 농도 했다 10 월에 비해 상당히 높은 (평균: 110.2 입자/c m3) (ANOVA; P-value < 0.05). 그림 1B 보여줍니다 하는 입자의 수는 총 수의 99% 이상을 차지 하는 3 μ m 보다 작은.
- 레이저 입자 카운터를 사용 하 여 오후 수 농도 모니터링 하 고 자동으로 데이터를 저장. USB 플래시 디스크를 사용 하 여 컴퓨터에서 데이터를 내보내고 ANOVA 테스트 수행.
2. 오후 사이 클론 졸 샘플러 컬렉션
- 오후 ∼2 m 지상에서 오염 소스 어떤 인근 주요 없이 빈 공간에 샘플링을 수행 합니다.
- 샘플링 사이트의 위치를 기록 합니다. 예를 들어 베이징 기술 연구소의 캠퍼스는 다음: 39 ° 57'51.0 ' N; 116 ° 19'38.5 ' E.
- 사이 클론 졸 샘플러를 사용 하 여 공기 샘플을 수집. 323 L/min, 샘플러 흐름과 6 h의 수집 시간을 사용 합니다.
참고: 샘플러 유량 고정 되 고 변경할 수 없습니다. 컬렉션에이 샘플러에만 시작 하 고 중지 버튼으로 수동 시간 유지에 의해 제어 됩니다.- 살 균 수를 사용 하 여 컬렉션, 전에 3 번 사이 클론 졸 샘플러의 내부를 세척 하 고 3 번 3 번 지속적으로 수집 버튼을 누르면 자동 청소 기능을 사용.
- 샘플링을 시작 하 고 중지 샘플링 펌프 버튼을 누르면 수집 버튼을 누릅니다. 장소에 그것을 들고 아무도 샘플러 선반 또는 바닥에 넣어.
- 이후 분석까지-20 ° C에서 어둠 속에서 모든 샘플을 유지 합니다.
3. 오후 컬렉션 필터
- 오후 ∼2 m 지상에서 오염 소스 어떤 인근 주요 없이 빈 공간에 샘플링을 수행 합니다.
- 샘플링 사이트의 위치를 기록 합니다. 예를 들어 베이징 공대의 캠퍼스는 다음과 같습니다: 39 ° 57'51.0 ' N; 116 ° 19'38.5 ' E.
- 높은 볼륨에 어 샘플러를 사용 하 여 20.32 × 25.4 cm2 필터 ( 재료의 표참조)에 오후 샘플을 수집 ( 재료의 표참조) 1000 L/분의 유량에서 상대 자동 프로그래밍 하 여 흐름 속도 컬렉션 시간 설정.
- 이후 분석까지-20 ° C에서 어둠 속에서 모든 샘플된 필터를 유지 합니다.
4. 생물 학적 구성 분석
- 생물 학적 성분 분석을 위해 샘플 사용 하 여 각 액체 사이 클론 졸 샘플러 또는 필터 샘플에서 multisource DNA 추출 키트에 의해 DNA 추출에 대 한 ( 재료의 표참조) 제조 업체의 프로토콜에 따라.
- 필터와 높은 볼륨에 어 샘플러에서 샘플에 대 한 DNA 추출에 대 한 각 필터 샘플의 1/8을 사용 합니다. 필터를 안쪽으로 향하게 하는 샘플 및 튜브 벽 쪽으로 직면 하 고 다시 50 mL 튜브에 넣어. 10 구슬 샘플을 포함 하는 필터의 측으로 중앙 사이트에 추가 합니다.
- 실 온에서 15 분 동안 튜브 소용돌이. DNA 추출 과정을 계속 하려면 깨끗 한 50 mL 원심 분리기 관으로 관에 있는 액체 플라스틱.
- 다음과 같이 프로세스에 의해 샘플에서 DNA를 추출 합니다.
- 5 분 동안 2000 x g에서 박테리아 샘플을 원심, 상쾌한, 제거 하 고 살 균 PBS 버퍼의 2 mL에 박테리아를 중단.
- 2 mL 원심 분리기 튜브에서 박테리아의 정지를 수집 하 고 5 분 표면에 뜨는 솔루션 삭제 2000 x g에서 원심.
- 솔루션에 일시 중단 된 박테리아를 포함 하는 메 마른 PBS 버퍼의 350 μ를 추가 합니다.
- RNase a.의 0.8 mL을 추가
- 버퍼 CL의 150 μ와 8 μ K, 성분의 추가 하 고 1 분 동안 흔들어 소용돌이 의해 즉시 혼합. 1000 x g 30에 짧은 원심 분리 후 s (벽에 잔류물), 10 분 동안 56 ° C 물에 원심 튜브를 넣어.
- 12000 x g에서 버퍼 PD, 그리고 30에 대 한 믹스와 다음 10 분 동안 원심 분리기의 350 μ를 추가 합니다.
- 2 mL 원심 분리기 튜브에 DNA 준비 튜브를 놓고 준비 관에 단계 4.2.6에서에서 만든 혼합물을 전송 합니다. 12000 x g에서 1 분 동안 원심 다음.
- 여과 액을 삭제 하 고 다시 넣어 준비 튜브의 내용을 원래 2 mL 원심 분리기 튜브 버퍼 W1의 50 μ를 추가 합니다. 12000 x g에서 1 분 동안 혼합 원심
- 여과 액을 삭제 하 고 다시 넣어 준비 튜브의 내용을 원래 2 mL 원심 분리기 튜브 버퍼 W2의 700 μ를 추가 합니다. 12000 x g.에 1 분 동안 원심 분리기는 혼합물의 버퍼 W2 700 μ와 다시 세척 하이 단계를 반복 합니다.
- 폐기물 액체를 삭제 하 고 다시 넣어 준비 튜브의 내용을 원래 2 mL 원심 분리기 튜브. 12000 x g에서 1 분 동안 혼합 원심
- DNA 준비 튜브의 내용을 다른 깨끗 한 1.5 mL 원심 분리기 튜브에 넣고 준비 관에서 막의 중간에 추가할 eluent 또는 이온된 수 100 μ (이온을 제거 된 물 또는 eluent가 열 되었다 65 ° c). 1 분 동안 실내 온도에 서 서 혼합물을 허용 하 고 12000 x g에서 1 분 동안 혼합물을 원심.
- 정량 실시간 중 합 효소 연쇄 반응 (Q-RT-PCR) 박테리아와 샘플링 필터에 곰 팡이의 상대 나타났는데 척도를 수행 합니다.
- 프라이 머를 사용 하 여 다음과 같습니다: 세균성 16S rDNA, 515F에 대 한 (5'-GTG CCA GCM GCC GCG GTA A-3') 및 806R (5'-GGA CTA CHV GGG TWT CTA AT-3'); 그리고 곰 팡이 , ITS1 (5'-TCC GTA GGT GAA CCT GCG G-3')와 ITS1 (5'-GCT GCG TTC TTC ATC GAT GC-3').
- 실시간 PCR 시스템에서 Q-RT-PCR 분석 실험을 실행 ( 재료의 표참조). RT-PCR 조건: predegeneration, 95 ° C, 10 분; 변성, 95 ° C, 15 s; anneal 및 확장, 60 ℃, 1 분; 40 사이클 anneal에 변성 및 확장에서.
- 세균과 곰 팡이 커뮤니티 구조 분석에 대 한 세균의 16S rDNA 의 V1-V3 영역과 PCR에 의해 곰 팡이 rRNA 오 페론의 ITS 영역 증폭.
- 다음과 같이 뇌관을 사용 하 여: 박테리아, V1-9F (5 '-CCT ATC CCC TGT GTG CCT TGG CAG TCT CAG ACG AGT TTG ATC MTG GCT CAG-3) 및 V3-541R (5 '-CCA TCT 고양이 CCC TGC GTG TCT CCG 법 CAG-바코드-ACW TTA CCG CGG CTG CTG G-3); 그리고 버섯, ITS 3 층 (5'-CCT ATC CCC TGT GTG CCT TGG CAG TCT CAG CAC ATC GAT GAA GAA CGC AGC-3') 및 ITS-4R (5'-CCA TCT 고양이 CCC TGC GTG TCT CCG 법 CAG-바코드-GCT CCT CCG CTT ATT GAT ATG C-3').
- PCRs의 20 μ 혼합물 포함 2.5 m m dNTPs의 2 μ, 5 × FastPfu 버퍼, 각 뇌관 (5 μ M), FastPfu 중 합 효소의 0.4 μ의 0.8 μ의 4 μ와 10 템플릿 DNA의 ng ( 재료의 표참조).
- PCR 프로그램을 사용 하 여 다음과 같습니다: 94 ° C 5 분; 30 대 94 ° C의 10 주기 다음 45 55-60 ° C, s, s, 및 72 ° C 90에 대 한 s; 30 대 94 ° C의 20 주기 s, 45 55 ° C s와 90 위한 72 ° C s; 그리고 5 분 동안 72 ° C에서 최종 확장.
- DNA 정제, DNA 정량화 및 pyrosequencing 이전 연구 21에 설명 된 대로 수행 합니다.
5. Bioaerosol 샘플링 및 재배
- 국제 표준 안데르센 6 단계 샘플러를 사용 하 여 ( 재료의 표참조) culturable 공 수 박테리아 및 균 류 사용 35 분의 샘플링 시간 28.3 L/분의 유량에 샘플러의 각 단계에서 문화 접시를 넣어. 각 샘플링 후 75% 에틸 알코올로 샘플러를 충분히 소독.
참고: 샘플러 유량은 고정 하 고 수집 시간 수동 시간 유지에 의해 제어 됩니다.- 공 수 입자의 공기 역학적 직경에 의해 정의 된 안데르센 6 단계 샘플러와 샘플 6 단계 6 단계를 포함 하 여 (0.65-1.1 μ m), V (1.1-2.1 μ m) 무대, 무대 IV (2.1-3.3 μ m), 단계 III (3.3-4.7 μ m), II (4.7-7.0 µ m) 단계와 단계 I (≥7.0 μ m)입니다.
- 세균성 입자를 수집 하 고 콩 카 세 인 소화 Agar를 포함 하는 각 단계에서 문화 접시에 입금 ( 재료의 표참조). 샘플러의 각 단계에는 상단에 많은 공기 섭취와 함께 컨테이너가입니다.
- 24-48 h; 37 ° C에서 공 수 박테리아 컬렉션 판 문화 그런 다음, 각 단계에 대 한 샘플 접시에 박테리아의 식민지 숫자를 계산 합니다.
- 중복에서 안데르센 6 단계 샘플러에 의해 수집 된 입자를 방지 하기 위해, 다음 공식에 의해 각 샘플러 수준에서 식민지의 수를 수정:
여기서 Pr: 각 수준에서 식민지의 수를 수정
N: 모든 수준 (400), 샘플러의 구멍을 샘플링의 번호와
r: 식민지의 실제 수입니다. - 공기의 m3 당 식민지의 단위를 다음과 같이 계산.
여기서 c: 농도 (CFU/m3),
N1-N6: 각 수준에서 식민지의 수정된 번호
T: 샘플링 시간 (분), 그리고
F: 샘플링 흐름 속도 (28.3 L/분)입니다. - 단계 5.1-5.3 piggeries의 4 개의 종류를 포함 하 여 가축 농장에서 bioaerosol를 공부 하는 방법을 사용 합니다.
참고: 가축 농장은 장 춘, 중국에 위치 해 있습니다. 중앙 위치에서 각 양 지상 2m로 선정 되었습니다 위치를 샘플링.) 박테리아의 문화, 후 단계 6.1-6.2에에서 설명 된 대로 접시에 모든 식민지 취급.
6입니다. Culturable 박테리아의 식별
- 48 h 또는 경작의 72 h, 후 2 mL 원심 분리기 관으로 박테리아를 놓습니다. Multisource DNA 추출 키트를 사용 하 여 이러한 박테리아 또는 균의 DNA를 추출 ( 재료의 표참조). DNA 추출 과정 섹션 4.2에에서 설명 되어 있습니다.
- 16S rDNA 시퀀싱에 대 한 200 μ DNA 추출 샘플을 사용 합니다. 단계 4.2, 4.3 및 4.4 생물 학적 구성 분석. 에 설명 된 대로 동일한 프로세스를 사용 하 여
Representative Results
이 연구에서 우리는 수행 전체 오후 분포의 평가 및 낙농 농장에서 bioaerosols의 포괄적인 분석 9 월부터 12 월. 많은 환경 요인에 어로 졸 입자의 분포에 기여 한다. 우리는 TSI 레이저 입자 카운터를 사용 하 여 소 집에서 오후의 농도 및 크기 분포를 공부 했습니다. 그림 1A에서 같이, 12 월에 최고 및 최저 온도 습도 (표 1)의 변화에 의해 발생할 수 있는 10 월에서 연 무질 입자의 농도가 이었다. 흡입 가능에 어로 졸 입자의 농도 (0.3-3.0 µ m) 총 입자 농도 (그림 1B)의 99% 이상을 차지 하 고이 범위에 있는 입자는 깊은 호흡기, 인 간에 대 한 심각한 위험을 일으키는 도달할 수 및 동물입니다.
DNA 추출, 세균성 16SrDNA 및 미생물 문화 대신 곰 팡이 는 지역 시퀀싱에 의해 샘플의 생물 학적 구성 분석을 수행할 수 있습니다. Bioaerosol 샘플 필터 사이 클론 졸 샘플러 또는 높은 볼륨에 어 샘플러를 사용 하 여 수집의 생물 학적 분석에서 우리 예비 박테리아와 곰 팡이 수집에서 이러한 두 가지 방법의 효율성을 비교할 수 있습니다. 그림 2 는 2016 년 12 월 20 일 베이징 공대의 캠퍼스에서 베이징 헷갈리는 일 동안 수집 된 bioaerosol 샘플의 분석 결과 보여주었다. 박테리아 컬렉션에 대 한 결과 표시 사이 클론 졸 샘플러 필터 (그림 2A)와 높은 볼륨에 어 샘플러 보다 많은 더 많은 속 수집. 곰 팡이 컬렉션에 대 한 이러한 샘플러 같은 컬렉션 효율성과 속 같은 나타났는데 (그림 2B)에 거의 보였다. 그림 2에 결과에서 박테리아와 곰 팡이 대 한 이러한 두 가지 방법의 다른 수집 효율성을 측정 하기 위해 수 있었습니다. 박테리아 컬렉션에 대 한 사이 클론 졸 샘플러는 샘플 전자에서 보여주었다 (그림 2A) 더 높은 속 풍부 하기 때문에 높은 볼륨 필터 샘플러를 공기 보다 훨씬 더 수행. 그러나, 다른 샘플링 방법에서 두 샘플의 곰 팡이 시퀀싱 분석 거의 동일한 지역 사회 구조 (그림 2B) 보여주었다.
우리는 안데르센 6 단계 샘플러를 사용 하 여 공 수 culturable 박테리아를 공부 했습니다. 그림 3에서 보듯이, 무대-VI 입자에 대 한 culturable 박테리아의 식민지 숫자 감소 되었다. 단계 I 입자 (입자 크기 > 8.2 µ m) culturable 박테리아 식민지의 가장 높은 숫자를 했다. 비율의 단계 I piggeries, 임신 암 퇘 지 집 농기구 등의 4 개의 종류에 있는 식민지, 살 찐 집과 이유 집 33%, 30%, 26% 및 34%, 각각. Piggeries의 4 개의 종류에 있는 단계 II 식민지의 비율이 각각 20%, 22%, 19%와 20% 이었다. Piggeries의 4 개의 종류에 있는 단계 III 식민지의 비율 18%, 18%, 18%와 19%를 각각 했다. Piggeries의 4 개의 종류에서 단계 IV 식민지의 비율이 각각 17%, 16%, 16%, 16% 이었다. Piggeries의 4 개의 종류에서 단계 V 식민지의 비율 10%, 10%, 14%와 6%를 각각 했다. 6 단계 입자 (입자 크기 < 1.0 µ m) culturable 박테리아 식민지의 가장 낮은 번호를 했다. Piggeries의 4 개의 종류에서 단계 6 식민지의 비율 3%, 5%, 6%와 5%, 각각 이었다.
공기 샘플 안데르센 6 단계 샘플러를 사용 하 여 piggeries의 4 개의 종류에서 수집 된 고 적당 한 조건 하에서 경작. 각 입자 단계에서 수집 된 culturable 박테리아의 전체 게놈 DNA 추출 하 고 세균성 16S rDNA 및 곰 팡이 는 지역 시퀀싱에 의해 감지 되었다. 총 91 장군과 158 종의 박테리아는 piggeries에 culturable 박테리아에서 확인 되었다. Piggeries, 집, 임신 농기구 등의 4 개의 종류에서 culturable 박테리아 커뮤니티 구조 뿌리 집, 살 찐 집 이유 집과는 그림 4 에 나와 무대에서 데이터와 내가 6 단계로. 다른 주된 세균 속의 내용을 다른 piggeries 사이에서 동일 하지 않습니다.
그림 1: 4 개의 다른 달에서 오후의 농도 및 크기 분포. (A) Boxplot 연구 기간 동안 오후 수의. 각 boxplot 최대, 최소, 중간, 두 quartiles 및 데이터베이스의 비정상적인 값을 포함합니다. (B) 오후의 평균 크기 분포 지도. 9 월과 12 월 집에서 80 소 했다. 오후의 비율 (≥ 3 µ m) 4 개월에서 (9 월, 10 월, 11 월, 12 월)은 0.005, 0.005, 0.002 0.002 각각. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2: 두 명의 시료에 의해 수집 된 bioaerosol 샘플의 생물 학적 분석. (A)와 (B) 다른 수집 방법으로 얻은 bioaerosol 샘플에 세균 이나 곰 팡이 속의 나타났는데 표시. 젖는 벽 공기 샘플러를 사이 클론 졸 샘플러를 나타냅니다. 석 영 필터 필터 하가 볼륨에 어 샘플러를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3: 평균 piggeries의 4 개의 종류에서 culturable 박테리아의 계층적 분포 지도. Piggeries의 4 개의 종류, 임신 암 퇘 지 집 농기구, 쪄 집 이며 집 이유. S6에 S1 안데르센 6 단계 샘플러에 의해 수집 된 입자 6 단계를 (나 VI를) 나타냅니다. 단계에서 6 단계를 포함 하 여 공 수 입자의 공기 역학적 직경에 의해 정의 된 (0.65-1.1 µ m), V (1.1-2.1 µ m) 무대, 무대 IV (2.1-3.3 µ m), 단계 III (3.3-4.7 µ m), II (4.7-7.0 µ m) 단계와 단계 I (7.0 µ m). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 4: 세균성 지역 사회 구조와 공기 샘플에서 다른 나타났는데. 공기 샘플 안데르센 6 단계 샘플러를 사용 하 여 piggeries의 4 개의 종류에서 수집 된 고 적당 한 조건 하에서 경작. 각 입자 단계 안데르센 6 단계 샘플러에 의해 수집 된에 culturable 박테리아의 전체 게놈 DNA 추출 하 고 세균성 16S rDNA 시퀀싱에 의해 감지 되었다. 숫자 1 ~ 6 각 유형의 양 안데르센 6 단계 샘플러에 의해 VI를 측정 하는 입자 단계를 나타냅니다. 오른쪽에 텍스트 각 박테리아에 대 한 속 이름을 포함합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
Discussion
이 연구에서 우리는 헷갈리는 일 동안 및 가축 농장에서 가져온 몇 가지 대표적인 결과 제공. 베이징 헷갈리는 일 중 bioaerosol 샘플에서 결과 오후 동안 베이징 헷갈리는 일 없이 오후의 생물 학적 구성의 생물 학적 구성의 더 나은 이해를 촉진. 가축 농장에서 가져온 샘플에서 결과 또한 공기 quality control piggeries 및 이론적 토대와 건강 한 사육에 대 한 기술 지원 및 가축 농장에 안전 생산에 대 한 기본 데이터를 제공 합니다. 온도, 습도, 풍속, 등 많은 환경 요인, 외양 (그림 1)에서 연 무질 입자의 분포에 기여할 수 있습니다. 이전 연구는 가축 농장에서 오후 사료, 배설물, 모피, 깃털, 동물 활동에 관련이 있을 수 있습니다에서 주로 오는 것 밝혀 있다. 환경 요인 동물 활동 뿐만 아니라 집계 및 상대적으로 닫힌된 암소 집에서 오후의 확산에 영향을 수 있습니다. 따라서, 4 개의 다른 달에서 오후의 다른 농도 크기를 감지 우리. 게다가, 위생 상태, 수 유 방법 및 동물 활동 piggeries, 공기 (그림 4)에 culturable 박테리아의 그들의 지역 사회 구조에도 영향을 줄 수 있는 네 가지 유형의 사이 달랐다.
그러나,이 연구에서 우리 주로 우리가 구성과 다른 환경 조건에서 bioaerosols의 분포를 연구 하는 데 사용할 수 사용할 수 있는 방법에 집중. 다른 미생물 샘플에 비해, 공 수 미생물의 매우 낮은 농도 있고 불순물, 수집 및 검색 하는 동안 특정 어려움을 소개 하는 무기 먼지 입자 등의 많은 수로 혼합 이러한 미생물21. 따라서, 미생물에 어로 졸에 대 한 수집 및 탐지의 적절 한 메서드를 선택 합니다. 미생물 졸 샘플 컬렉션은 일반적으로 액체, 반 고체 또는 고체 샘플링 중간22,23,24에에서 미생물을 수집 하는 강수량 메서드 또는 전문된 장비를 사용 하 여 수행 . 그런 다음 몇 가지 해당 기술 치료 및 특정 테스트와 분석 이후에 실행 된다25. 샘플링 매체는 미생물 검출 및 분석26와 관련 된 오류를 줄이기 위해 그대로 유지 해야 합니다. 그러나, 다른 졸 미생물 샘플러 그들의 다른 샘플링 원리와 미디어 샘플의 무결성에 다른 영향을 미칠. 사람들이 다른 샘플링 원리, 관성 impaction, 여과 저항, 정전기 강 수27등을 사용 하는 bioaerosol 샘플의 많은 종류를 디자인 했다.
샘플러 영향을 밀 수 있다 공 수 오후 고속 샘플링 매체로 추출 장비를 사용 하 여. 샘플러 영향의 두 유형이 있다: 고체와 액체. 고체 시료에 영향을 낮은 농도에서 샘플 bioaerosols에 사용 될 수 있고 공기를 거의 안타 수28흐름. 다양 한 크기의에 어로 졸 입자 예비 상영 될 수 있다, 그리고 culturable 미생물10의 생존 율을 증가 하는 문화 매체에 직접 미생물을 샘플링할 수 있다. 관성의 영향으로 인해 미생물 연 무질 입자는 쉽게 동일한 사이트에서 충돌 하 고 식민지 문화 후 쉽게 겹칠 수 있습니다. 현재, 가장 일반적인 고체 영향을 샘플러 안데르센-6 미생물 졸 샘플러가입니다. 이 연구에서 우리는 다양 한 크기의 공 수 오후에 배포 하는 culturable 박테리아 연구 안데르센 6 단계 샘플러를 사용.
사이 클론에 어로 졸 시료 고속 나선형 공기 사이 클론을 사용 하 여 실린더 또는 원뿔에. Bioaerosol 입자는 원심력, 즉 미생물 샘플러의 내부 벽에 충돌 수 있습니다 및 다음 샘플링 버퍼에 의해 수집 된 수에 의해 공기에서 분리 수 있습니다. 이 방법은 편리 하 고 오래 큰 흐름에는 시간을 샘플링 하 고 샘플링 작업에 사용할 수 있습니다. 그러나,이 방법은 작업이 액체에 의존 하기 때문에 낮은 온도에서 구현할 수 없습니다. 이 연구에 사용 된 사이 클론 졸 샘플러 추출 하 고 분석29물의 작은 볼륨으로 샘플링된 공기에서 공 수 병원 체와 입자를 전송 수 있는 사이 클론 젖는 벽 졸 샘플러가입니다.
필터 샘플러 낮은 온도 조건에서 작업할 수 있으며 특정 크기 이상의 입자를 샘플링할 수 있습니다. 그러나, 그들은 미생물 활동에 큰 영향을가지고 되며, 손상 하는 경향이 크게 활동 샘플링에 대 한 후속 연구를 좌우할 것 이다. 이 연구에서는 베이징 헷갈리는 일에서 bioaerosol 샘플 필터와 높은 볼륨에 어 샘플러와 사이 클론 졸 샘플러를 사용 하 여 수집 되었다. 이 실험의 목적은 분리 없이 오후의 생물 학적 구성 및 공 수 미생물의 경작을 분석 하는 것 이었다. 따라서,이 두 가지 샘플링 방법이이 연구에 적합 했다. 사이 클론 졸 샘플러 방법에 대 한 낮은 농도에서 공 수 미생물 실행 버퍼에 쉽게 추출 될 수 있다 고 필터 샘플에 대 한 일반적으로 사용 되는 추가적인 처리 없이 편리 하 게 분석할 수 있습니다. 이 연구,이 두 가지 샘플링 방법, 사이 클론에 어로 졸 샘플러와 필터 샘플러, 다른 샘플링 효율을 보였다. 견본을 위해 필터, 필터에서 샘플을 복구 하는 등 일반적으로 사용 되는 추가 치료는 이러한 두 가지 방법 사이의 주요 차이점 중 하나입니다. 게다가, 공기 샘플 수집 했다 실행 버퍼에 직접 클론 졸 샘플러에 의해 다른 방법은 필터에 샘플을 수집 하는 동안. 샘플링 방법의 다른 종류의 특성이 다른 샘플링 효율성에 기여할 수 있습니다. 우리 사이 클론 졸 샘플러는 미생물 컬렉션에 대 한 더 나은 선택이이 가정 추가 확인 필요 가정 수 있습니다.
이 연구에서 세균성 16S rDNA 와 곰 팡이 는 지역 시퀀싱 bioaerosols의 생물 학적 분석을 수행 하기 위해 사용 되었다. 16SrDNA 연속 미생물 게놈30에 16S rDNA 세그먼트의 결정 이다. 16S rDNA 널리 높은 보존 및 미생물 종31의 식별에 유용 하 게 만드는 특이성 원핵생물에 존재 합니다. 전체 게놈 시퀀싱 genomic DNA와 후속 시퀀싱의 추출을만 필요합니다. 많은 양의 데이터를 생성 하는 것 외에도이 과정은 또한 미생물 지역 사회 구조에 대 한 보다 포괄적인 분석에 대 한 수 있습니다. 게다가, metagenomics 또한 사용할 수 있습니다 연구의이 분야에서 미래에 더 많은 정보를 제공 하 여. Handelsman 외. 먼저 미생물 토양32에 1998 종이에 metagenome의 개념을 제안 했다. 후속 연구는 metagenome의 개념은 점차적으로 허용 하 고, 그리고 많은 연구는 인간의 직감, 바다와 토양33,,3435에 포함 된 미생물에 실시 되었다. 높은 처리량 시퀀싱의 지원으로 기술에 metagenomics 빠르게 개발 하 고 병원 체 탐지의 연구에 점점 중요 한 역할을 재생 합니다. 전통 미생물 연구 방법 분리 및 정화에 대 한 문화에 주로 의존합니다. 그러나, 많은 연구 수 없습니다 수행할 수 있기 때문에 미생물의 99% 이상이 경작 될 수 없습니다. 전통적인 방법, 달리 metagenomics 개별 유기 체36를 분리 하는 필요 없이 전체로 서 환경에서 모든 미생물의 유전 정보를 걸릴 수 있습니다. 결과 모든 미생물에 대 한 포괄적인 분석을 직접 수행할 수 있습니다.
요약 하자면,이 학문은 보여주었다 여러 검색, 샘플링 및 분석 방법 연구 환경 오후, 오후 모니터링;를 포함 하 여의 생물 학적 구성에 사용할 수 있는 오후는 안데르센 6 단계 샘플러, 필터와 높은 볼륨에 어 샘플러 또는 사이 클론 졸 샘플러; 샘플링 그리고 DNA 시퀀싱에 따라 이후 생물 학적 분석입니다. 실제로, 많은 유형의 가축 농장 등 다른 환경 조건 하에서 이러한 메서드를 사용할 수 있습니다. 우리의 프로토콜 및 결과 추가 환경에서 곰 팡이 및 세균 bioaerosols 건강에 미치는 영향을 탐구 하는 전세계 다른 연구자를 도울 수 있다.
Disclosures
저자는 공개 없다.
Acknowledgments
이 연구에 대 한 재정 지원 국가 자연 과학 재단의 중국 (No. 41775148)에서 왔다. Funders 연구 설계, 데이터 수집 및 분석, 결정 게시 또는 원고의 준비에 전혀 역할을 했다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| airborne laser particle counter | TSI Inc, MN, USA | model 9306 | |
| Andersen six-stage sampler | Tisch Inc, USA | TE-20-600 | |
| AxyPrep multisource DNA Miniprep Kit | Axygen, NY, USA | AP-MN-MIS-GDNA-50G | |
| FastPfu Polymerase | TransGen Inc., Beijing, China | AP221-01 | |
| High-volume air sampler | Beijing HuaRui HeAn Technology Co., Ltd., China | HH02-LS120 | |
| Real-Time PCR System | Thermo Fisher Scientific, USA | Applied Biosystems® 7500 | |
| Soybean-Casein Digest Agar | Becton, Dickinson and company, MD, USA | 211043 | |
| Tissuquartz filters | Pall, NY, USA | 7204 | |
| Wetted-Wall Air Sampler | Research International, Inc. 17161 Beaton Road SE Monroe, Washington 98272-1034 USA |
SASS 2300 |
References
- Jones, A. M., Harrison, R. M. The effects of meteorological factors on atmospheric bioaerosol concentrations--a review. The Science of the total environment. 326 (1-3), 151-180 (2004).
- Ko, G., et al. Investigation of bioaerosols released from swine farms using conventional and alternative waste treatment and management technologies. Environmental science & technology. 42 (23), 8849-8857 (2008).
- Seagrave, J., et al. Lung toxicity of ambient particulate matter from southeastern U.S. sites with different contributing sources: relationships between composition and effects. Environmental health perspectives. 114 (9), 1387-1393 (2006).
- Janssen, N. A., et al. Black carbon as an additional indicator of the adverse health effects of airborne particles compared with PM10 and PM2.5. Environmental health perspectives. 119 (12), 1691-1699 (2011).
- Langrish, J. P., et al. Reducing personal exposure to particulate air pollution improves cardiovascular health in patients with coronary heart disease. Environmental health perspectives. 120 (3), 367-372 (2012).
- Haas, D., et al. The concentrations of culturable microorganisms in relation to particulate matter in urban air. Atmospheric Environment. 65 (Supplement C), 215-222 (2013).
- Stahlhofen, W., Gebhart, J., Heyder, J. Experimental determination of the regional deposition of aerosol particles in the human respiratory tract. American Industrial Hygiene Association. 41 (6), 385-398 (1980).
- Abba, E. J., Unnikrishnan, S., Kumar, R., Yeole, B., Chowdhury, Z. Fine aerosol and PAH carcinogenicity estimation in outdoor environment of Mumbai City, India. International journal of environmental health research. 22 (2), 134-149 (2012).
- Dybwad, M., Skogan, G., Martha Blatny, J. Temporal Variability of the Bioaerosol Background at a Subway Station. Concentration Level, Size Distribution, and Diversity of Airborne Bacteria. 80, (2013).
- Harper, T. A., et al. Bioaerosol sampling for airborne bacteria in a small animal veterinary teaching hospital. Infection ecology & epidemiology. 3, (2013).
- Hall, R. J., et al. Metagenomic detection of viruses in aerosol samples from workers in animal slaughterhouses. PloS one. 8 (8), e72226 (2013).
- Wery, N. Bioaerosols from composting facilities--a review. Frontiers in cellular and infection microbiology. 4, 42 (2014).
- Skora, J., Gutarowska, B., Stepien, L., Otlewska, A., Pielech-Przybylska, K. The evaluation of microbial contamination in the working environment of tanneries. Medycyna pracy. 65 (1), 15-32 (2014).
- Brandl, H., et al. Distribution and identification of culturable airborne microorganisms in a Swiss milk processing facility. Journal of dairy science. 97 (1), 240-246 (2014).
- Wei, M., Yu, Z., Zhang, H. Molecular characterization of microbial communities in bioaerosols of a coal mine by 454 pyrosequencing and real-time PCR. Journal of environmental sciences. 30, 241-251 (2015).
- Polednik, B. Aerosol and bioaerosol particles in a dental office. Environmental research. 134, 405-409 (2014).
- Veillette, M., et al. Microbial contents of vacuum cleaner bag dust and emitted bioaerosols and their implications for human exposure indoors. Applied and environmental microbiology. 79 (20), 6331-6336 (2013).
- Cao, C., et al. Inhalable microorganisms in Beijing's PM2.5 and PM10 pollutants during a severe smog event. Environmental science & technology. 48 (3), 1499-1507 (2014).
- Lippmann, M., Chen, L. C. Health effects of concentrated ambient air particulate matter (CAPs) and its components. Critical reviews in toxicology. 39 (10), 865-913 (2009).
- Kunzli, N., et al. Comparison of oxidative properties, light absorbance, total and elemental mass concentration of ambient PM2.5 collected at 20 European sites. Environmental health perspectives. 114 (5), 684-690 (2006).
- Wei, K., et al. Ambient bioaerosol particle dynamics observed during haze and sunny days in Beijing. The Science of the total environment. 550, 751-759 (2016).
- Nehme, B., Letourneau, V., Forster, R. J., Veillette, M., Duchaine, C. Culture-independent approach of the bacterial bioaerosol diversity in the standard swine confinement buildings, and assessment of the seasonal effect. Environmental microbiology. 10 (3), 665-675 (2008).
- Riemenschneider, L., et al. Characterization of reaerosolization from impingers in an effort to improve airborne virus sampling. Journal of applied microbiology. 108 (1), 315-324 (2010).
- Mehta, S. K., Bell-Robinson, D. M., Groves, T. O., Stetzenbach, L. D., Pierson, D. L. Evaluation of portable air samplers for monitoring airborne culturable bacteria. AIHAJ : a journal for the science of occupational and environmental health and safety. 61 (6), 850-854 (2000).
- Sun, Z., Mu, Y., Liu, Y., Shao, L. A comparison study on airborne particles during haze days and non-haze days in Beijing. The Science of the total environment. , 1-8 (2013).
- Lednicky, J., et al. Highly efficient collection of infectious pandemic Influenza H1N1 virus (2009) through laminar-flow water based condensation. 50, (2016).
- Verreault, D., Moineau, S., Duchaine, C. Methods for sampling of airborne viruses. Microbiology and molecular biology reviews : MMBR. 72 (3), 413-444 (2008).
- Dybwad, M., Skogan, G., Blatny, J. M. Temporal variability of the bioaerosol background at a subway station: concentration level, size distribution, and diversity of airborne bacteria. Applied and environmental microbiology. 80 (1), 257-270 (2014).
- Hietala, S. K., Hullinger, P. J., Crossley, B. M., Kinde, H., Ardans, A. A. Environmental air sampling to detect exotic Newcastle disease virus in two California commercial poultry flocks. Journal of veterinary diagnostic investigation: official publication of the American Association of Veterinary Laboratory Diagnosticians, Inc. 17 (2), 198-200 (2005).
- Logares, R., et al. Metagenomic 16S rDNA Illumina tags are a powerful alternative to amplicon sequencing to explore diversity and structure of microbial communities. Environmental microbiology. 16 (9), 2659-2671 (2014).
- Kogawa, M., Hosokawa, M., Nishikawa, Y., Mori, K., Takeyama, H. Obtaining high-quality draft genomes- from uncultured microbes by cleaning and co-assembly of single-cell amplified genomes. Scientific reports. 8 (1), 2059 (2018).
- Handelsman, J., Rondon, M. R., Brady, S. F., Clardy, J., Goodman, R. M. Molecular biological access to the chemistry of unknown soil microbes: a new frontier for natural products. Chemistry & biology. 5 (10), R245-R249 (1998).
- Moon, C. D., Young, W. Metagenomic insights into the roles of Proteobacteria in the gastrointestinal microbiomes of healthy dogs and cats. MicrobiologyOpen. , e00677 (2018).
- Ribicic, D., et al. Microbial community and metagenome dynamics during biodegradation of dispersed oil reveals potential key-players in cold Norwegian seawater. Marine pollution bulletin. 129 (1), 370-378 (2018).
- Vera-Gargallo, B., Navarro-Sampedro, L., Carballo, M., Ventosa, A. Metagenome Sequencing of Prokaryotic Microbiota from Two Hypersaline Soils of the Odiel Salt Marshes in Huelva, Southwestern Spain. Genome announcements. 6 (9), (2018).
- Lloyd-Price, J., et al. Strains, functions and dynamics in the expanded Human Microbiome Project. Nature. 550 (7674), 61-66 (2017).
