Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Environment
Click here for the English version

Environment

Sammensetning og distribusjon analyse av Bioaerosols Under ulike miljøforhold

Published: January 7, 2019 doi: 10.3791/58795
Automatic Translation
*1, *2, *3, 1, 1, 1, 1
1Academy of Military Medical Sciences, 2Chinese Academy of Agricultural Sciences, 3The Experimental High School Attached to Beijing Normal University
* These authors contributed equally

Summary

Forstå biologiske sammensetningen av miljømessige svevestøv er viktig for studiet av sin store virkninger på helse og sykdom spres. Her brukte vi tre typer bioaerosol Prøvetaking metoder og en biologisk analyse av luftbårne mikrober å bedre utforske luftbårne mikrobielle samfunn under ulike miljøforhold.

Abstract

Variabel mikroorganismer i svevestøv (PM) under ulike miljøforhold kan ha store virkninger på menneskers helse. I denne studien vi beskrev en protokoll for flere analyser av biologiske komposisjonene miljømessige PM. fem eksperimenter presenteres: (1) PM nummer overvåking ved hjelp av en laser partikkel teller; (2) PM samling ved hjelp av en virvlende aerosol sampler; (3) PM samling ved hjelp av en høy-volum luft sampler med filtre; (4) culturable mikrober samling av Andersen seks-trinns sampler; og (5) deteksjon av biologiske sammensetningen av miljømessige PM av bakteriell 16SrDNA og sopp sin region. Vi valgte tåkete dager og en buskap gård som to typiske eksempler på programmet i denne protokollen. I denne studien, disse to Prøvetaking metoder, virvlende aerosol sampler og filteret sampler, viste forskjellige prøveplanene effektivitet. Den virvlende aerosol sampler utført mye bedre i form av å samle bakterier, mens disse to metodene viste samme effektivitet innsamling sopp. Filteret samplere kan arbeide under lave temperaturer mens virvlende aerosol samplere har en prøvetaking begrensningen for temperaturen. En solid påvirker sampler, for eksempel en Andersen seks-trinns sampler, kan brukes til å prøve bioaerosols direkte til kultur medium, som øker overlevelse av culturable mikroorganismer. Men avhengig denne metoden hovedsakelig kultur mens mer enn 99% av mikrober kan kultivert. DNA utvunnet fra culturable bakterier samlet av Andersen seks-trinns sampler og prøver samles av virvlende aerosol sampler og filteret sampler ble oppdaget av bakteriell 16S rDNA og fungal ITS regionen sekvenser. Alle metodene ovenfor kan ha bredt program i mange felt av studien, som miljøovervåking og luftbårne patogen gjenkjenning. Fra disse resultatene, kan vi konkludere med at disse metodene kan brukes under ulike forhold, og kan hjelpe andre forskere utforske ytterligere helseeffektene av miljømessige bioaerosols.

Introduction

I naturskjønne omgivelser finnes ulike typer mikroorganismer i bioaerosols, inkludert sopp, bakterier, virus og andre mikroorganismer1. Luftbårne mikroorganismer, som kan bli utsendt fra noen menneskelige aktiviteter som dyr fôring operasjoner i husdyr gårder, er viktige innholdet av atmosfærisk miljø2. Disse mikroorganismer kan ikke bare spille en viktig rolle i atmosfæriske miljøet, men også ha viktige effekter på helse og sykdommer spre.

Som en viktig måte å spre sykdommer, mikrobielle aerosoler har tiltrukket seg bred oppmerksomhet over hele verden. I nyere studier, ble mange menneskelige sykdommer funnet for å være assosiert med komplekse sammensetningen av miljømessige svevestøv (PM) på forskjellige steder, slik som kjemiske fabrikker, husdyr gårder og smoggy byer3,4. Biologiske sammensetningen av PM kan bidra til noen luftveis- og hjerte sykdommer i PM-eksponerte mennesker5. Ulike kroppen regioner, som mucosa, hud, fordøyelseskanal og luftveier, kan være potensielle mål av mikrober knyttet til PM6,7. Økt risiko for lungekreft kan være forårsaket av langvarig eksponering for PM2.58.

Luftbårne bakterier har undersøkt på ulike steder i flere land over hele verden, inkludert i metro stasjoner veterinary sykehus, slakterier, kompostering fasiliteter, garverier, melk prosesseringsanlegg, kullgruver, tannhelsetjenesten og innendørs miljøer9,10,11,12,13,14,15,16,17, generere en stort antall rapporter om biologiske aerosoler. Overfylte steder knyttet studiestedene, husdyr gårder og storbyene disig dagene er tre spesielt viktig offentlig forhold som vi trenger å utforske sammenhengene mellom helse og hvilken virkning PM eksponering. Videre under vinterdager i nordlige byene i Kina, kan høye PM2.5 verdier påvirke menneskers helse. Selv om PM2.5 kan generere toksiske effekter av målretting åndedretts overflater og løses opp i blodet18, er det ennå ikke klart om og hvordan mikrober knyttet til PM2.5 kan påvirke menneskers helse19 ,20. Husdyr gårder er en av de viktigste kildene til PM, mikrobielle aerosoler i luften. Det store antallet patogener, som influensavirus og Brucella melitensis, som er gjennomført av aerosoler i feltene rundt husdyr gårder er viktige faktorer forårsaker luftveissykdommer både husdyr og fjørfe arbeidere.

I denne studien utforsket vi flere typer analyser av bioaerosols, inkludert PM nummer overvåking, bioaerosol innsamling og biologiske komposisjon analyse. Air prøvene ble samlet av en virvlende aerosol sampler, en høy-volum luft sampler med filtre og en Andersen seks-trinns sampler. Deretter ble prøver innsamlet av disse tre samplere analysert av biologiske analyse inkludert bakteriell 16S rDNA og fungal ITS sekvenser å bestemme sine biologiske komposisjoner. Her viser vi representant resultater fra bioaerosol prøvene samlet under Beijing tåkete dager og husdyr gårder som angir at bioaerosols kan ha stor innvirkning på mennesker og dyr sunnhet. Sammenligningen mellom flytende og filter Prøvetaking metoder var også utforsket i denne studien hovedsakelig basert på data fra 16S DNA og fungal ITS sekvenser.

Protocol

1. PM nummer overvåking

  1. Bruke en luftbåren laser partikkel counter (se Tabell for materiale) for å finne PM antall. Samle PM av luften prøvetaking porten på luftbåren laser partikkel telleren.
    Merk: Telleren partikkel er en automasjonsutstyr det kan arbeide uavhengig når programmet inkludert prøvetidspunkt, intervall, samling ganger, etc. er satt på sin berøringsskjerm.
    1. Utstyre instrumentet med en sensor å overvåke temperatur og relativ luftfuktighet. Måler og registrerer temperatur og relativ luftfuktighet samtidig hver 5 min.
    2. Totalt måler og registrerer 6 ulike partikkelstørrelse størrelse klasser (0,3 til 0.5 μm, 0,5-0,7 μm, 0,7-2.5 μm, 2.5-5 μm, 5-10 μm og > 10 μm) samtidig hver 5 min. måle 4 andre partikkel størrelse klasser (0,3 til 0.5 μm, 0,5-1 μm, 1-3 μm og ≥ 3 μm).
    3. Samle luft prøvene skjønt prøvetaking hullet på sampler og bruke test moduler inni sampler måle partikkelstørrelse på hver PM. Deretter lagres dataene automatisk. Alle prosessene ovenfor kan utføres automatisk etter de relative parameterne, inkludert prøvetidspunktet og teller området, satt selv mini touch fremviser luftbåren laser partikkel tellerverdien.
      Merk: Telleren partikkel er en automasjonsutstyr har test moduler som antall PM av ulike partikkelstørrelse størrelse klasser.
  2. For å vurdere eksperimentelle standardfeil, sikrer du at ulike partikkelstørrelse størrelse klasser telles med minst 15 replikeringer. Kontroller at målinger er lagret i det interne minnet på maskinen og deretter analysert.
    1. Kontroller at analyse av primærdataene inkluderer PM nummer konsentrasjon, ANOVA test og prosentandelen av PM i hver størrelsesklasse. For eksempel, som vist i figur 1A, PM nummer konsentrasjonen i desember (237.6 partikler/cm3) var betydelig høyere enn i oktober (gjennomsnittlig: 110.2 partikler/cm3) (ANOVA; P-Value < 0,05). Figur 1B viser at antall partikler mindre enn 3 μm sto for mer enn 99% av det totale antallet.
    2. Bruke laser partikkel telleren å overvåke PM nummer konsentrasjonen og lagre dataene automatisk. Bruke en USB flash-disk til å eksportere data i datamaskinen ANOVA test.

2. PM samling av virvlende Aerosol samplere

  1. Utføre PM prøvetaking i et åpent område uten noen nærliggende store Forurensningskilder ∼2 meter over bakken.
    1. Registrere plasseringen av webområdet prøvetaking. For eksempel campus ved Beijing Institute of Technology er følgende: 39 ° 57'51.0 '' N; 116 ° 19' 38,5 '' E.
  2. Bruk en virvlende aerosol sampler for oppsamling luft. Bruk en sampler flyt av 323 L/min, og en samling tid 6 h.
    Merk: Sampler infusjonshastigheten er fast og kan ikke endres. Samling tiden styres av manuell holder som er bare en Start og Stopp -knappen på denne sampler.
    1. Bruk sterilt vann vask innsiden av den virvlende aerosol sampler 3 ganger før samlingen, og bruk funksjonen for automatisk rengjøring 3 ganger ved kontinuerlig å trykke knappen samle 3 ganger.
    2. Trykk samle å starte prøvetaking og trykk på pumpen for å stoppe prøvetaking. Sette sampler på en hylle eller gulv med ingen holder den på plass.
    3. Bevare alle prøvene i mørket på 20 ° C til de påfølgende analysene.

3. PM samling av filtre

  1. Utføre PM prøvetaking i et åpent område uten noen nærliggende store Forurensningskilder ∼2 meter over bakken.
    1. Registrere plasseringen av webområdet prøvetaking. For eksempel campus ved Beijing Institute of Technology er som følger: 39 ° 57'51.0 '' N; 116 ° 19' 38,5 '' E.
  2. Samle PM eksemplene på 20.32 × 25,4 cm2 filtre (se Tabell for materiale) ved hjelp av en høy-volum luft sampler (se Tabell for materiale) på en strømningshastighet på 1000 L/min. stilles flow rate og samling av relativ auto-programmering.
    1. Bevare alle samplet filtre i mørket på 20 ° C til de påfølgende analysene.

4. biologisk komposisjon analyse

  1. Biologiske komposisjon analyse, bruker hvert flytende utvalg fra virvlende aerosol sampler eller filter eksempel for DNA utvinning av en multisource DNA utvinning Kit (se Tabell for materiale) i henhold til produsentens protokoller.
    1. For eksempler fra høyt volum luft sampler med filtre, bruk 1/8 av hvert filter utvalg for DNA utvinning. Plasser filteret i en 50 mL tube med prøven vender innover og baksiden vender mot tube veggen. Legge til 10 perler i sentrale områder mot filteret inneholder utvalget.
    2. Vortex tube i 15 min ved romtemperatur. Pipetter væsken i røret i en ren 50 mL sentrifuge tube å fortsette utpakkingen DNA.
  2. Ekstra DNA fra utvalget av prosessene som følger.
    1. Sentrifuge bakterier prøven 2000 x g i 5 min, fjerne nedbryting og stoppe bakterier i 2 mL steril PBS buffer.
    2. Samle suspensjon av bakterier i en 2 mL sentrifuge rør og deretter virvel 2000 x g i 5 min forkaste supernatant løsningen.
    3. Legge til 350 μL sterilt PBS bufferen som inneholder suspendert bakterier løsningen.
    4. Legge til 0,8 mL RNase A.
    5. Tilsett 150 μL av Buffer CL og 8 μL proteinasen K, og bland umiddelbart av vortex rister for 1 min. Etter kort sentrifugering 1000 x g for 30 s (ingen rester på veggen), legge sentrifugal røret i 56 ° C vann i 10 min.
    6. Legge til 350 μL Buffer PD, og miks for 30 s og deretter sentrifuge for 10 min 12 000 x g.
    7. Sett DNA forberedelse røret i en 2 mL sentrifuge rør, og Overfør blandingen laget i trinn 4.2.6 til forberedelse røret. Deretter sentrifuge for 1 min 12 000 x g.
    8. Forkaste filtratet sette tilbake innholdet i forberedelse røret i opprinnelige 2 mL sentrifuge røret og tilsett 50 μL av Buffer W1. Sentrifuge blandingen for 1 min 12 000 x g.
    9. Forkaste filtratet, sette tilbake innholdet i forberedelse røret i opprinnelige 2 mL sentrifuge røret og legge 700 μL Buffer W2. Sentrifuger blandingen i 1 min på 12.000 x g. Gjenta dette trinnet å vaske igjen med 700 μL Buffer W2.
    10. Forkaste avfall væske, og sett tilbake innholdet i forberedelse røret i opprinnelige 2 mL sentrifuge røret. Sentrifuge blandingen for 1 min 12 000 x g.
    11. Sette innholdet av DNA forberedelse rør inn i en annen ren 1,5 mL sentrifuge rør og tilsett 100 μL av eluent eller deionisert vann til midten av membranen i forberedelse tube (deionisert vann eller eluent ble oppvarmet til 65 ° C). La blandingen stå ved romtemperatur for 1 min, og sentrifuge blandingen for 1 min 12 000 x g.
  3. Utføre kvantitativ sanntids polymerasekjedereaksjons (Q-RT-PCR) å kvantifisere den relative abundances av bakterier og sopp på prøvetaking filtre.
    1. Bruke primere som følger: for bakteriell 16S rDNA, 515F (5'-GTG CCA GCM GCC GCG GTA A-3) og 806R (5'-GGA CTA CHV GGG TWT CTA på-3); og fungal ITS, ITS1 (5'-TCC GTA GGT GAA CCT GCG G-3) og ITS1 (5'-GCT GCG TTC TTC ATC GAT GC-3 ").
    2. Kjøre Q-RT-PCR-analyser på en Real-Time PCR systemet (se Tabellen for materiale). RT PCR tilstand: predegeneration, 95 ° C, 10 min; degenerasjon, 95 ° C, 15 s; anneal og utvidelse, 60 ° C, 1 min; 40 sykluser fra degenerasjon å anneal og utvidelse.
  4. For bakterier og sopp samfunnet Strukturanalyse, forsterke V1-V3 regionen bakteriell 16S rDNA og dens regionen fungal rRNA operon av PCR.
    1. Bruke primerne som følger: for bakterier, V1-9F (5 '-CCT ATC CCC TGT GTG CCT TGG CAG TCT CAG ACG AGT TTG ATC MTG GCT CAG-3) og V3-541R (5 '-CCA TCT CAT CCC TGC GTG TCT CCG ACT CAG-strekkode-ACW TTA CCG CGG CTG CTG G-3); og sopp, ITS-3F (5'-CCT ATC CCC TGT GTG CCT TGG CAG TCT CAG CAC ATC GAT GAA GAA CGC AGC-3) og dens-4R (5'-CCA TCT CAT CCC TGC GTG TCT CCG ACT CAG-strekkode-GCT CCT CCG CTT ATT GAT ATG C-3 ").
    2. Sikre at 20 μL blanding av PCRene med 2 μL 2,5 dNTPs, 4 μL 5 × FastPfu Buffer, 0,8 μL av hver primer (5 μM), 0.4 μL FastPfu utvalg, og 10 ng av DNA (se Tabell for materiale).
    3. Bruker PCR-programmet som følger: 94 ° C i 5 min; etterfulgt av 10 sykluser av 94 ° C for 30 s, 55-60 ° C i 45 s og 72 ° C for 90 s; 20 sykluser av 94 ° C for 30 s, 55 ° C for 45 s og 72 ° C i 90 s; og en siste utvidelse ved 72 ° C i 5 minutter.
  5. Utfør rensing av DNA, DNA kvantifisering og pyrosequencing som beskrevet i forrige studie 21.

5. Bioaerosol prøvetaking og dyrking

  1. Bruke en internasjonal standard Andersen seks-trinns sampler (se Tabell for materiale) å prøve culturable luftbårne bakterier og sopp på en strømningshastighet på 28.3 L/min. Bruk gangen prøvetaking av 35 min. sette kultur plate i hvert trinn i sampler. Tilstrekkelig Desinfiser sampler med 75% etylalkohol etter hvert utvalg.
    Merk: Sampler infusjonshastigheten er fast og samling tiden styres av håndbok tidsvisning.
    1. Prøven seks stadier med Andersen seks-trinns sampler, som er definert av de aerodynamisk diametere av luftbårne partikler, inkludert scenen VI (0.65-1.1 μm), scene V (1.1-2.1 μm), stage IV (2.1-3.3 μm), scene III (3.3-4.7 μm), stage II (4,7-7.0 μm) og trinn I (≥7.0 μm).
    2. Samle bakteriell partikler og innskudd på kultur plate i hver fase inneholder soyabønner-kasein Digest Agar (se Tabell for materiale). Det er en beholder med mange luftinntak øverst i hvert trinn i sampler.
    3. Kultur samlingen luftbårne bakterier plater ved 37 ° C i 24-48 h; deretter telle kolonien antallet bakterier på prøven parabolen for hvert trinn.
  2. For å hindre partikler samlet av Andersen seks-trinns sampler overlapper, rette antall kolonier på hvert sampler nivå ved følgende formel:
    Equation
    hvor Pr: korrigert antall kolonier på hvert nivå,
    N: mange prøvetaking hull i sampler på alle nivåer (400), og
    r: det faktiske antallet i koloniene.
  3. Beregne av koloniene per m3 av luft som følger:
    Equation
    der C: konsentrasjon (CFU/m3),
    N1-N6: korrigert antall kolonier på hvert nivå,
    T: prøvetidspunktet (min), og
    F: flyt samplingsfrekvens (28.3 L/min).
  4. Bruke metoder fra trinn 5.1 - 5.3 å studere bioaerosol i husdyr gården, inkludert fire typer piggeries.
    Merk: Husdyr gården ligger i Changchun, Kina. Sentral posisjon 2 meter over bakken i hver piggery dine ble valgt som prøvetaking plassering.) Etter kultur av bakterier, behandle alle koloniene i platene som beskrevet i fremgangsmåten 6.1 - 6.2.

6. identifikasjon av Culturable bakterier

  1. Etter 48 timer eller 72 h dyrking, plassere bakterier i en 2 mL sentrifuge rør. Ekstra DNA av disse bakterier eller sopp av benytter en multisource DNA utvinning Kit (se Tabell for materiale). DNA utpakkingen er beskrevet i delen 4.2.
  2. Bruke 200 μL DNA utvinning eksempel 16S rDNA sekvenser. Bruk de samme prosessene som beskrevet i fremgangsmåten 4.2 4.3 og 4.4 på biologiske komposisjon analyse.

Representative Results

I denne studien utført vi en vurdering av total PM distribusjon og en omfattende analyse av bioaerosols i et meieri gård fra September til desember. Mange miljømessige faktorer bidrar til distribusjon av aerosol partikler. Vi studerte konsentrasjon og størrelse distribusjonen av PM i en ku huset ved hjelp av en TSI laser partikkel teller. Som vist i figur 1A, var konsentrasjonen av aerosol partikler høyest i desember og laveste i oktober, som kan være forårsaket av endringer i temperatur og luftfuktighet (tabell 1). Konsentrasjonen av inhalable aerosol partikler (0,3 3,0 µm) sto for mer enn 99% av den totale partikkel konsentrasjonen (figur 1B) og partikler i dette området kan komme dypt luftveiene, forårsaker alvorlige farer for mennesker og dyr.

Biologiske komposisjon analyse av eksempler kan utføres av DNA utvinning, bakteriell 16SrDNA og sopp ITS regionen sekvenser i stedet for microorganism kultur. Fra biologiske analyse av bioaerosol prøver innsamlet ved hjelp av en virvlende aerosol sampler eller en høyt volum luft sampler med filtre, kan vi foreløpig sammenligne effektiviteten av disse to metodene innsamling bakterier og sopp. Figur 2 viste analyseresultatene bioaerosol prøvene samlet i Beijing tåkete dager i campus ved Beijing Institute of Technology i 20 desember 2016. Bakterier samling indikerte resultatene at den virvlende aerosol sampler samlet mange flere slekter enn den høy volum luft sampler med filtre (figur 2A). For sopp kolleksjon viste disse samplere lik samling effektivitet og nesten samme slekten krillens (figur 2B). Fra resultatene presentert i figur 2, kunne vi måle ulike samling effektiviteten av disse to metoder for bakterier og sopp. For bakterier samling, den virvlende aerosol sampler utført mye bedre enn høy-volum luft sampler med filtre fordi prøvene fra den tidligere viste en høyere slekten overflod (figur 2A). Men fungal sekvensering analyse av de to utvalgene fra ulike Prøvetaking metoder viste nesten identisk samfunnet strukturer (figur 2B).

Vi studerte luftbårne culturable bakterier ved hjelp av en Andersen seks-trinns sampler. Som vist i Figur 3, redusert kolonien antallet culturable bakterier for scenen I-VI partikler. Stadium I partikler (partikkel størrelse > 8.2 µm) hadde de høyeste tallene for culturable bakterier kolonier. Andelen stadium I koloniene i fire typer piggeries inkludert farrowing house, gravid sår hus, fetende hus og avvenning huset var 33%, 30%, 26% og 34%, henholdsvis. Prosentandelen av fase II koloniene i fire typer piggeries var 20%, 22%, 19% og 20% henholdsvis. Prosentandelen av fase III koloniene i fire typer piggeries var 18%, 18%, 18% og 19% henholdsvis. Prosentandelen av fase IV koloniene i fire typer piggeries var 17%, 16%, 16% og 16% henholdsvis. Prosentandelen av scenen V koloniene i fire typer piggeries var 10%, 10%, 14% og 6% henholdsvis. Scenen VI partikler (partikkel størrelse < 1.0 µm) hadde lavest antallet culturable bakterier kolonier. Prosentandelen av scenen VI kolonier i fire forskjellige typer piggeries var 3%, 5%, 6% og 5%, henholdsvis.

Air prøvene ble samlet i fire typer piggeries ved hjelp av en Andersen seks-trinns sampler og så kultivert i riktig forhold. Hele-genome DNA av culturable bakterier fra hver partikkel scenen var trukket ut og oppdaget av bakteriell 16S rDNA og fungal ITS regionen sekvenser. Totalt 91 slekter og 158 arter av bakterier ble identifisert i culturable bakterier i piggeries. Culturable bakterier samfunnet strukturer i fire forskjellige typer piggeries, inkludert farrowing house, gravid sår hus, fetende hus og avvenning huset er vist i Figur 4 med data fra scenen jeg scenen VI . Innholdet i forskjellige dominerende bakteriell slekter er ikke det samme mellom forskjellige piggeries.

Figure 1
Figur 1: konsentrasjon og størrelse distribusjon av PM i fire ulike måneder. (A) Bokstegning PM antall under studietiden. Hver Bokstegning inkluderer maksimum, minimum, median, to kvartiler og abnormal salgsverdi av databasen. (B) gjennomsnittlig størrelse distribusjon kart PM. Det var åtti kyr i huset fra September til desember. Prosentandelen av PM (≥ 3 µm) i fire måneder (September, oktober, November og desember) var 0.005, 0.005, 0,002 og 0,002 henholdsvis. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2: biologisk analyse av bioaerosol prøver innsamlet av to samplere. (A) og (B) viser antall av bakterier og sopp slekter i bioaerosol prøver med forskjellige samling metoder. Wetted-vegg Air Sampler representerer den virvlende aerosol sampler. Quartz-filtre representerer den høy volum luft sampler med filtre. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3: gjennomsnittlig hierarkisk fordelingen kart culturable bakterier i fire typer piggeries. De fire typene piggeries er farrowing house, gravid sår hus, fetende hus og avvenning hus. S1 til S6 representerer seks partikkel trinnene (jeg vi) samlet av Andersen seks-trinns sampler. Etappene ble definert av de aerodynamisk diametere av luftbårne partikler, inkludert scenen VI (0.65-1.1 µm), scene V (1.1-2.1 µm), stage IV (2.1 3,3 µm), scene III (3.3-4.7 µm), stage II (4.7 7.0 µm) og medeier (7.0 µm). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 4
Figur 4: bakterielle samfunnet strukturer med forskjellige antall i luften utvalgene. Air prøvene ble samlet i fire typer piggeries ved hjelp av en Andersen seks-trinns sampler og så kultivert i riktig forhold. Hele-genome DNA av culturable bakterier i hver partikkel scenen inn av Andersen seks-trinns sampler var trukket ut og oppdaget av bakteriell 16S rDNA sekvenser. Tallene 1 til 6 i hver piggery dine representerer partikkel stadier eg målt ved den Andersen seks-trinns sampler. Teksten til høyre inneholder slekten navn for hver bakterie. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Discussion

I denne studien gitt vi noen representant resultatene som ble oppnådd under tåkete dager og husdyr gårder. Resultatene fra bioaerosol prøver tatt under Beijing tåkete dager tilrettelagt en bedre forståelse av biologisk komposisjonene biologiske sammensetningen av PM uten PM under Beijing tåkete dager. Resultatene fra prøver tatt fra husdyr gårder vil også gi grunnleggende data for miljømessige luft quality control i piggeries og teoretisk fundament og kundestøtte for sunn formering og trygg produksjon i husdyr gårder. Mange miljømessige faktorer, som temperatur og fuktighet, vindhastighet, kan bidra til distribusjon av aerosol partikler i ku huset (figur 1). Tidligere studier har avdekket at PM i husdyr gårder hovedsakelig kommer fra fôr, avføring, pels og fjær, som kan være relatert til dyr aktiviteter. Miljømessige faktorer kan påvirke ikke bare dyr aktiviteter, men også aggregering og spredningen av PM i et relativt lukket ku hus. Derfor merker vi ulike konsentrasjoner og størrelse distribusjoner av PM i fire ulike måneder. Dessuten sanitære tilstanden, fôring metoden og dyr aktivitet var annerledes mellom fire typer piggeries, som kan også påvirke samfunnet strukturen av culturable bakterier i luften (Figur 4).

Men i denne studien fokusert vi hovedsakelig på de tilgjengelige metodene vi kan bruke til å studere komposisjon og distribusjon av bioaerosols under ulike miljøforhold. Sammenlignet med andre mikrobiell prøver, de av luftbårne mikroorganismer har svært lave konsentrasjoner og er blandet med mange urenheter, for eksempel uorganisk støvpartikler, som innføre visse problemer under innsamling og registrering av slike mikroorganismer21. Aktuelle metoder for innsamling og gjenkjenning skal derfor velges for mikrobiell aerosoler. Samlingen av mikrobielle aerosol prøver utføres vanligvis ved hjelp av nedbør metoden eller spesialisert utstyr for å samle mikroorganismer i flytende, halvfaste eller robust utvalg middels22,23,24 . Så, noen tilsvarende teknisk behandling og bestemt testing og analyse senere utføres25. Prøvetaking medium bør holde mikroorganismer intakt å redusere forbundet med oppdagelsen og analyse26. Men har forskjellige aerosol microorganism samplere ulike effekter på integriteten til prøver deres forskjellige prøveplanene prinsipper og media. Folk har utviklet mange typer bioaerosol samplere som bruker forskjellige prøveplanene prinsipper, som treghet impaction, filtrering motstand og elektrostatiske nedbør27.

Påvirker samplere kan presse luftbårne PM til prøvetaking medium i høy hastighet ved hjelp av utvinning utstyr. Det finnes to typer påvirker samplere: faste og flytende. Solid påvirker samplere kan brukes til å prøve bioaerosols på en lav konsentrasjon og kan være nesten ugjennomtrengelig til luft strømme28. Aerosol partikler av forskjellige størrelser kan screenes foreløpig, og mikrober kan prøves direkte til kultur medium, som øker overlevelse culturable mikroorganismer10. På grunn av treghet innvirkning, mikrobielle aerosol partikler kolliderer lett på samme sted, og koloniene kan overlappe lett etter kultur. I dag er den vanligste solid påvirker sampler Andersen-6 mikrobiell aerosol sampler. I denne studien brukte vi en Andersen seks-trinns sampler for å studere culturable bakterier distribuert i luftbårne PM av forskjellige størrelser.

Virvlende aerosol samplere bruk sykloner til spiral luft i høy hastighet i en sylinder eller kjegle. Bioaerosol partikler kan skilles fra luftstrømmen av sentrifugalkraften, som betyr at mikrober kan støte inn i indre veggen av sampler og deretter samles inn av prøvetaking bufferen. Denne metoden er praktisk og kan brukes for lenge prøvetaking ganger i store flyten og prøvetaking operasjoner. Men kan ikke denne metoden implementeres ved lave temperaturer fordi operasjonen er avhengig av flytende. Den virvlende aerosol sampler brukt i denne studien er en virvlende wetted vegg aerosol sampler som kan trekke og overføre luftbårne patogener og partikler fra samplet luft inn i en liten mengde vann analyse29.

Filteret samplere kan arbeide under lave temperaturer og kan smake partikler over en viss størrelse. Men de har en stor innvirkning på mikrobiell aktivitet og er utsatt for skade, som vil sterkt påvirke studier på prøvetaking aktivitet. I denne studien innhentet bioaerosol prøver fra Beijing tåkete dager ved hjelp en høyt volum luft sampler med filtre og en virvlende aerosol sampler. Målet med dette eksperimentet skulle analyserer biologiske sammensetningen av PM uten separasjon og dyrking av luftbårne mikrober. Derfor var disse to Prøvetaking metoder egnet for denne studien. For metoden virvlende aerosol sampler luftbårne mikrober på en lav konsentrasjon kan lett ut inn i kjører buffer og deretter kan analyseres beleilig uten ekstra behandling som vanligvis brukes for filteret prøver. I denne studien, disse to Prøvetaking metoder, virvlende aerosol sampler og filteret sampler, viste forskjellige prøveplanene effektivitet. Ekstra behandling som er brukt for filteret utvalgene, for eksempel gjenopprette prøven fra filteret, er en av hovedforskjellene mellom disse to metodene. Dessuten ble luft prøvene samlet direkte inn i kjører buffer av virvlende aerosol sampler mens den andre metoden samlet prøver på filtre. Egenskapene til ulike typer sampling metoden kan bidra til dette forskjellige prøveplanene effektivitet. Vi kan anta at den virvlende aerosol sampler er det beste valget for microorganism samling, og forutsetningen må videre bekreftelse.

I denne studien ble bakteriell 16S rDNA og fungal ITS regionen sekvenser brukt til å utføre biologiske analyse av bioaerosols. 16SrDNA sekvensering er fastsettelse av 16S rDNA segmenter i mikrobiell genomet30. Det finnes mye 16S rDNA i prokaryoter med høy bevaring og spesifisitet, som gjør det nyttig for identifikasjon av mikrobielle arter31. Hele-genome sekvensering krever bare utvinning av genomisk DNA og påfølgende sekvensering. I tillegg produserer en stor mengde data, gir denne prosessen også for en mer omfattende analyse av mikrobielle samfunn struktur. Dessuten kan metagenomics også brukes i dette feltet studium ved å gi mer informasjon i fremtiden. Handelsman et al. først foreslått begrepet metagenome i en 1998 papir på mikrober i jord32. I studier, begrepet metagenome ble gradvis akseptert og mye forskning ble gjennomført på mikrober i den menneskelige tarmen, hav og jord33,34,35. Med støtte fra høy gjennomstrømming sekvensering teknologi, metagenomics har utviklet seg raskt, og det spiller en stadig viktigere rolle i studiet av patogen gjenkjenning. Tradisjonelle mikrobiell forskningsmetoder i hovedsak stole på kultur for separasjon og rensing. Men mange studier kan ikke utføres fordi mer enn 99% av mikrober kan kultivert. I motsetning til tradisjonelle metoder, kan metagenomics ta den genetiske informasjonen av alle mikrober i miljøet som helhet uten behovet å skille individuelle organismer36. En omfattende analyse av alle resulterende mikroorganismer kan utføres direkte.

I sammendraget, denne studien viste flere deteksjon, prøvetaking og analyse metoder som kan brukes til studier av biologisk sammensetningen av miljømessige PM, inkludert PM overvåking; PM prøvetaking med en Andersen seks-trinns sampler, en høy-volum luft sampler med filtre eller virvlende aerosol sampler; og påfølgende biologiske analyse basert på DNA sekvensering. I praksis, kan disse metodene brukes under ulike miljøforhold, som mange typer av husdyr gårder. Våre protokoller og resultatene kan hjelpe andre forskere over hele verden utforske ytterligere helseeffektene av sopp og bakteriell bioaerosols i miljøet.

Disclosures

Forfatterne ikke avsløre.

Acknowledgments

Økonomisk støtte til denne studien kom fra National Natural Science Foundation av Kina (nr. 41775148). Fond ikke hadde noen rolle i studien design, innsamling og analyse, beslutningen om å publisere eller utarbeidelse av manuskriptet.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
airborne laser particle counter TSI Inc, MN, USA model 9306
Andersen six-stage sampler Tisch Inc, USA TE-20-600
AxyPrep multisource DNA Miniprep Kit Axygen, NY, USA AP-MN-MIS-GDNA-50G
FastPfu Polymerase TransGen Inc., Beijing, China AP221-01
High-volume air sampler Beijing HuaRui HeAn Technology Co., Ltd., China HH02-LS120
Real-Time PCR System Thermo Fisher Scientific, USA Applied Biosystems® 7500
Soybean-Casein Digest Agar Becton, Dickinson and company, MD, USA 211043
Tissuquartz filters Pall, NY, USA 7204
Wetted-Wall Air Sampler Research International, Inc. 17161 Beaton Road SE
Monroe, Washington 98272-1034 USA		 SASS 2300

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Jones, A. M., Harrison, R. M. The effects of meteorological factors on atmospheric bioaerosol concentrations--a review. The Science of the total environment. 326 (1-3), 151-180 (2004).
  2. Ko, G., et al. Investigation of bioaerosols released from swine farms using conventional and alternative waste treatment and management technologies. Environmental science & technology. 42 (23), 8849-8857 (2008).
  3. Seagrave, J., et al. Lung toxicity of ambient particulate matter from southeastern U.S. sites with different contributing sources: relationships between composition and effects. Environmental health perspectives. 114 (9), 1387-1393 (2006).
  4. Janssen, N. A., et al. Black carbon as an additional indicator of the adverse health effects of airborne particles compared with PM10 and PM2.5. Environmental health perspectives. 119 (12), 1691-1699 (2011).
  5. Langrish, J. P., et al. Reducing personal exposure to particulate air pollution improves cardiovascular health in patients with coronary heart disease. Environmental health perspectives. 120 (3), 367-372 (2012).
  6. Haas, D., et al. The concentrations of culturable microorganisms in relation to particulate matter in urban air. Atmospheric Environment. 65 (Supplement C), 215-222 (2013).
  7. Stahlhofen, W., Gebhart, J., Heyder, J. Experimental determination of the regional deposition of aerosol particles in the human respiratory tract. American Industrial Hygiene Association. 41 (6), 385-398 (1980).
  8. Abba, E. J., Unnikrishnan, S., Kumar, R., Yeole, B., Chowdhury, Z. Fine aerosol and PAH carcinogenicity estimation in outdoor environment of Mumbai City, India. International journal of environmental health research. 22 (2), 134-149 (2012).
  9. Dybwad, M., Skogan, G., Martha Blatny, J. Temporal Variability of the Bioaerosol Background at a Subway Station. Concentration Level, Size Distribution, and Diversity of Airborne Bacteria. 80, (2013).
  10. Harper, T. A., et al. Bioaerosol sampling for airborne bacteria in a small animal veterinary teaching hospital. Infection ecology & epidemiology. 3, (2013).
  11. Hall, R. J., et al. Metagenomic detection of viruses in aerosol samples from workers in animal slaughterhouses. PloS one. 8 (8), e72226 (2013).
  12. Wery, N. Bioaerosols from composting facilities--a review. Frontiers in cellular and infection microbiology. 4, 42 (2014).
  13. Skora, J., Gutarowska, B., Stepien, L., Otlewska, A., Pielech-Przybylska, K. The evaluation of microbial contamination in the working environment of tanneries. Medycyna pracy. 65 (1), 15-32 (2014).
  14. Brandl, H., et al. Distribution and identification of culturable airborne microorganisms in a Swiss milk processing facility. Journal of dairy science. 97 (1), 240-246 (2014).
  15. Wei, M., Yu, Z., Zhang, H. Molecular characterization of microbial communities in bioaerosols of a coal mine by 454 pyrosequencing and real-time PCR. Journal of environmental sciences. 30, 241-251 (2015).
  16. Polednik, B. Aerosol and bioaerosol particles in a dental office. Environmental research. 134, 405-409 (2014).
  17. Veillette, M., et al. Microbial contents of vacuum cleaner bag dust and emitted bioaerosols and their implications for human exposure indoors. Applied and environmental microbiology. 79 (20), 6331-6336 (2013).
  18. Cao, C., et al. Inhalable microorganisms in Beijing's PM2.5 and PM10 pollutants during a severe smog event. Environmental science & technology. 48 (3), 1499-1507 (2014).
  19. Lippmann, M., Chen, L. C. Health effects of concentrated ambient air particulate matter (CAPs) and its components. Critical reviews in toxicology. 39 (10), 865-913 (2009).
  20. Kunzli, N., et al. Comparison of oxidative properties, light absorbance, total and elemental mass concentration of ambient PM2.5 collected at 20 European sites. Environmental health perspectives. 114 (5), 684-690 (2006).
  21. Wei, K., et al. Ambient bioaerosol particle dynamics observed during haze and sunny days in Beijing. The Science of the total environment. 550, 751-759 (2016).
  22. Nehme, B., Letourneau, V., Forster, R. J., Veillette, M., Duchaine, C. Culture-independent approach of the bacterial bioaerosol diversity in the standard swine confinement buildings, and assessment of the seasonal effect. Environmental microbiology. 10 (3), 665-675 (2008).
  23. Riemenschneider, L., et al. Characterization of reaerosolization from impingers in an effort to improve airborne virus sampling. Journal of applied microbiology. 108 (1), 315-324 (2010).
  24. Mehta, S. K., Bell-Robinson, D. M., Groves, T. O., Stetzenbach, L. D., Pierson, D. L. Evaluation of portable air samplers for monitoring airborne culturable bacteria. AIHAJ : a journal for the science of occupational and environmental health and safety. 61 (6), 850-854 (2000).
  25. Sun, Z., Mu, Y., Liu, Y., Shao, L. A comparison study on airborne particles during haze days and non-haze days in Beijing. The Science of the total environment. , 1-8 (2013).
  26. Lednicky, J., et al. Highly efficient collection of infectious pandemic Influenza H1N1 virus (2009) through laminar-flow water based condensation. 50, (2016).
  27. Verreault, D., Moineau, S., Duchaine, C. Methods for sampling of airborne viruses. Microbiology and molecular biology reviews : MMBR. 72 (3), 413-444 (2008).
  28. Dybwad, M., Skogan, G., Blatny, J. M. Temporal variability of the bioaerosol background at a subway station: concentration level, size distribution, and diversity of airborne bacteria. Applied and environmental microbiology. 80 (1), 257-270 (2014).
  29. Hietala, S. K., Hullinger, P. J., Crossley, B. M., Kinde, H., Ardans, A. A. Environmental air sampling to detect exotic Newcastle disease virus in two California commercial poultry flocks. Journal of veterinary diagnostic investigation: official publication of the American Association of Veterinary Laboratory Diagnosticians, Inc. 17 (2), 198-200 (2005).
  30. Logares, R., et al. Metagenomic 16S rDNA Illumina tags are a powerful alternative to amplicon sequencing to explore diversity and structure of microbial communities. Environmental microbiology. 16 (9), 2659-2671 (2014).
  31. Kogawa, M., Hosokawa, M., Nishikawa, Y., Mori, K., Takeyama, H. Obtaining high-quality draft genomes- from uncultured microbes by cleaning and co-assembly of single-cell amplified genomes. Scientific reports. 8 (1), 2059 (2018).
  32. Handelsman, J., Rondon, M. R., Brady, S. F., Clardy, J., Goodman, R. M. Molecular biological access to the chemistry of unknown soil microbes: a new frontier for natural products. Chemistry & biology. 5 (10), R245-R249 (1998).
  33. Moon, C. D., Young, W. Metagenomic insights into the roles of Proteobacteria in the gastrointestinal microbiomes of healthy dogs and cats. MicrobiologyOpen. , e00677 (2018).
  34. Ribicic, D., et al. Microbial community and metagenome dynamics during biodegradation of dispersed oil reveals potential key-players in cold Norwegian seawater. Marine pollution bulletin. 129 (1), 370-378 (2018).
  35. Vera-Gargallo, B., Navarro-Sampedro, L., Carballo, M., Ventosa, A. Metagenome Sequencing of Prokaryotic Microbiota from Two Hypersaline Soils of the Odiel Salt Marshes in Huelva, Southwestern Spain. Genome announcements. 6 (9), (2018).
  36. Lloyd-Price, J., et al. Strains, functions and dynamics in the expanded Human Microbiome Project. Nature. 550 (7674), 61-66 (2017).

Tags

Miljøfag problemet 143 PM nummer overvåking Bioaerosol innsamling bakteriell 16S rDNA og fungal ITS regionen sekvensering miljømessige patogener luftbårne mikrobielle samfunn ulike miljøforhold.
Sammensetning og distribusjon analyse av Bioaerosols Under ulike miljøforhold
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Wang, Z., Li, J., Qian, L., Liu, L., … More

Wang, Z., Li, J., Qian, L., Liu, L., Qian, J., Lu, B., Guo, Z. Composition and Distribution Analysis of Bioaerosols Under Different Environmental Conditions. J. Vis. Exp. (143), e58795, doi:10.3791/58795 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter