Förstå den biologiska sammansättningen av miljömässiga partiklar är viktigt för studien av dess betydande effekter på människors hälsa och sjukdom som sprids. Här använde vi tre typer av bioaerosol provtagningsmetoder och en biologisk analys av luftburna mikrober för att utforska luftburna mikrobiella samhällen under olika miljöförhållanden.
Variabel mikroorganismer i partiklar (PM) under olika miljöförhållanden kan ha betydande påverkan på människors hälsa. I denna studie beskrev vi ett protokoll för flera analyser av biologiska kompositioner i miljömässiga PM. fem experiment presenteras: (1) PM nummer övervakning med hjälp av en laser partikelräknare; (2) PM samling genom att använda en cykloniska aerosol sampler; (3) PM samling genom att använda en hög volym air sampler med filter; (4) odlingsbara mikrober samling av Andersen sex-stegs sampler; och (5) upptäckt av biologiska sammansättning av miljömässiga PM av bakteriell 16SrDNA och svamp ITS regionen sekvensering. Vi valde dimmiga dagar och en boskap gård som två typiska exempel av ansökan i detta protokoll. I denna studie, dessa två provtagningsmetoder, cyklonisk aerosol sampler och filter sampler, visade olika provtagning effektivitet. Cykloniska aerosol sampler presterade mycket bättre när det gäller att samla bakterier, medan dessa två metoder visade samma effektivitet i att samla svampar. Filter provtagare kan fungera under låg temperatur medan cykloniska aerosol provtagare har en provtagning begränsning för temperatur. En solid påverkar sampler, såsom en Andersen sex-stegs sampler, kan användas till exempel bioaerosoler direkt i odlingsmediet, vilket ökar överlevnaden av odlingsbara mikroorganismer. Den här metoden kräver dock främst kultur medan mer än 99% av mikrober inte kan vara odlade. DNA extraheras från de odlingsbara bakterier som samlas in av Andersen sex-stegs sampler och prover som samlats in av cykloniska aerosol sampler och filter sampler upptäcktes av bakteriell 16S rDNA och svamp ITS regionen sekvensering. Alla metoderna ovan kan ha bred tillämpning i många ämnesområden, till exempel miljöövervakning och upptäckt av airborne patogen. Från dessa resultat kan vi konstatera att dessa metoder kan användas under olika förhållanden och kan hjälpa andra forskare ytterligare utforska miljön bioaerosoler hälsoeffekter.
I naturliga miljöer finns olika typer av mikroorganismer i bioaerosoler, inklusive svampar, bakterier, virus och andra mikroorganismer1. Luftburna mikroorganismer som kan avges från vissa mänskliga aktiviteter såsom djurens utfodring operationer på gårdar med husdjursskötsel, är viktiga innehållet i den stämningsfulla miljö2. Dessa mikroorganismer kan inte bara spela viktiga roller i den stämningsfulla miljön men också har betydande påverkan på människors hälsa och sjukdomar sprids.
Som ett viktigt sätt för spridning av sjukdomar, har mikrobiella aerosoler uppmärksammats stort i hela världen. I färska studier befanns många sjukdomar vara associerade med den komplexa sammansättningen av miljömässiga partiklar (PM) på olika platser, såsom kemiska fabriker, djurgårdar och avgasfyllda städer3,4. PM biologiska sammansättning kan bidra till vissa respiratoriska och kardiovaskulära sjukdomar i PM-exponerade människor5. Olika organ regioner, såsom slemhinnor, hud, mag-tarmkanalen och luftvägarna, kan vara potentiella mål av mikrober som bifogas PM6,7. En ökad risk för lungcancer kan orsakas av långvarig exponering för PM2.58.
Luftburna bakterier har besiktigats på olika platser i flera länder runt om i världen, inklusive tunnelbanestationer, veterinärmedicinska sjukhus, slakterier, kompostering faciliteter, garverier, mjölk-och-eller bearbetningsanläggningar, kolgruvor, tandvårdskliniker och inomhusmiljöer9,10,11,12,13,14,15,16,17, generera en stort antal rapporter om biologiska aerosoler. Trånga platser associerade med campus, boskap gårdar och stora städer under dimmiga dagar är tre särskilt viktiga allmänna villkor som vi behöver undersöka kopplingarna mellan människors hälsa och de potentiella effekterna av PM exponering. Dessutom under vinterdagar i de norra städerna i Kina, kan höga PM2.5 värden påverka människors hälsa. Även om PM2.5 kan generera toxiska effekter genom att rikta andnings ytor och upplösning i blod18, är det fortfarande inte klart om och hur mikroberna bifogas PM2.5 potentiellt kan påverka människors hälsa19 ,20. Djurgårdar är en av de viktigaste källorna till PM och mikrobiella aerosoler i luften. Det stora antalet patogener, såsom influensavirus och Brucella melitensis, som bärs av aerosoler i fälten runt djurgårdar är viktiga faktorer orsakar luftvägssjukdomar i både boskap och fjäderfä arbetstagare.
I denna studie utforskade vi flera typer av analyser av bioaerosoler, inklusive PM nummer övervakning, bioaerosol insamling och biologiska sammansättning analys. Luftprover samlades in genom en cykloniska aerosol sampler, en hög volym air sampler med filter och en Andersen sex-stegs sampler. Sedan analyserades proverna samlas in av dessa tre provtagare av biologisk analys inklusive bakteriell 16S rDNA och svamp ITS sekvensering att bestämma deras biologiska kompositioner. Häri, visar vi representativa resultat från bioaerosol proven uppsamlade under Beijing dimmiga dagar och djurgårdar som anger att bioaerosoler kan ha stor inverkan på människors och djurs hälsa. Jämförelsen mellan vätska och filter provtagningsmetoder undersöktes också i denna studie främst baserat på data från 16S DNA och svamp ITS sekvensering.
I denna studie gett vi några representativa resultat som erhölls under dimmiga dagar och på gårdar med husdjursskötsel. Resultaten från bioaerosol Prover tagna under Beijing dimmiga dagar underlättat en bättre förståelse av de biologiska kompositionerna av biologiska sammansättningen av PM utan PM närvarande under Beijing dimmiga dagar. Resultaten från prover tagna från djurgårdar ska också ge grundläggande data för ventilationsutrymmen quality control i svinhus och en teoretisk grund och teknisk support för sund avel och säker produktion på gårdar med husdjursskötsel. Många miljömässiga faktorer, såsom temperatur, fuktighet och vindhastighet, kan bidra till fördelningen av aerosolpartiklar i Ko huset (figur 1). Tidigare studier har visat att PM på gårdar med husdjursskötsel kommer främst från foder, avföring, päls och fjäder, som kan vara relaterade till djurens verksamhet. Miljöfaktorer kan påverka inte bara djurens aktiviteter, men också aggregering och diffusion av PM i en relativt sluten kostallet. Därför, vi upptäcker olika koncentrationer och storlek distributioner av PM i fyra olika månader. Dessutom var det sanitära villkoret, utfodring metod och djurens aktivitet olika mellan fyra typer av svinhus, som också kan påverka deras gemenskapens struktur av odlingsbara bakterier i luften (figur 4).
Men i denna studie fokuserat vi främst på de tillgängliga metoderna som vi kunde använda för att studera komposition och distribution av bioaerosoler under olika miljöförhållanden. Jämfört med andra mikrobiella prover, de av luftburna mikroorganismer har mycket låga koncentrationer och blandas med ett stort antal föroreningar, såsom oorganiska dammpartiklar, som inför vissa svårigheter under insamling och identifiering av sådana mikroorganismer21. Lämpliga metoder för insamling och identifiering bör därför väljas för mikrobiella aerosoler. Mikrobiella aerosoler provtagning utförs vanligtvis med hjälp av nederbörd metod eller specialutrustning för att samla mikroorganismerna i fast, halvfasta eller flytande provtagning medium22,23,24 . Sedan, några motsvarande teknisk behandling och specifik provning och analys därefter genomförs25. Provtagning medium bör hålla mikroorganismer intakt att minska felet är associerad med detektion och analys26. Men har olika aerosol mikroorganism provtagare olika effekter på integriteten i prover på grund av deras olika provtagning principer och media. Människor har designat många sorters bioaerosol provtagare som använder olika provtagning principer, såsom tröghetsbaserad impaktion, filtrering motstånd och elektrostatisk utfällning27.
Påverkar provtagare kan driva luftburna PM till provtagning medium i hög hastighet med hjälp av utvinning utrustning. Det finns två typer av påverkar provtagare: fasta och flytande. Fast påverkar provtagare kan användas för att provet bioaerosoler vid låga koncentrationer och kan vara nästan ogenomtränglig för air flow28. Aerosolpartiklar i olika storlekar kan undersökas preliminärt, och mikrober kan avnjutas direkt i odlingsmediet, vilket ökar överlevnaden av odlingsbara mikroorganismer10. På grund av tröga inverkan, mikrobiell aerosolpartiklar kolliderar enkelt på samma plats, och kolonier kan överlappa enkelt efter kultur. För närvarande är den vanligaste solida påverkar sampler Andersen-6 mikrobiella aerosoler sampler. I denna studie använde vi en Andersen sex-stegs sampler för att studera odlingsbara bakterierna distribueras i luftburna PM av olika storlekar.
Cykloniska aerosol provtagare använda cykloner till spiral luft med hög hastighet in i en cylinder eller en kon. Bioaerosol partiklar kan skiljas från luftflödet genom centrifugalkraften, vilket innebär att mikrober kan stöta på den inre väggen av provtagaren och sedan samlas in genom provtagning bufferten. Denna metod är bekvämt och kan användas för provtagning långa tider i stort flöde och provtagning verksamhet. Dock inte kan denna metod genomföras vid låga temperaturer eftersom operationen är beroende av vätska. Den cykloniska aerosol sampler används i denna studie är en cykloniska befuktas-vägg aerosol sampler som kan extrahera och överföra luftburna patogener och partiklar från samplade luften i en liten volym vatten för analys29.
Filter provtagare kan arbeta under låg temperatur och kan prova partiklar över en viss storlek. Men de har en stor inverkan på mikrobiell aktivitet och är benägna att skada, som kommer att kraftigt påverka efterföljande studier på provtagning aktivitet. I denna studie samlades bioaerosol prover från Beijing dimmiga dagar in med hjälp av både en hög volym air sampler med filter och en cykloniska aerosol sampler. Syftet med detta experiment var att analyserar PM utan avskiljandet biologiska sammansättning och odling av luftburna mikrober. Dessa två provtagningsmetoder var därför lämplig för denna studie. Cykloniska aerosol sampler metoden, luftburna mikrober vid låga koncentrationer kan extraheras enkelt in i rinnande bufferten och sedan kan analyseras bekvämt utan ytterligare behandling som ofta används för filterprov. I denna studie, dessa två provtagningsmetoder, cyklonisk aerosol sampler och filter sampler, visade olika provtagning effektivitet. Ytterligare behandling som ofta används för filter prover, såsom återhämtar sig provet från filtret, är en av de viktigaste skillnaderna mellan dessa två metoder. Dessutom samlades luftprover direkt in i rinnande bufferten av cykloniska aerosol sampler medan den andra metoden samlade prover på filter. Egenskaperna hos olika typer av provtagningsmetod kan bidra till denna olika provtagning effektivitet. Vi kan anta att den cykloniska aerosol provtagaren är ett bättre val för mikroorganism samling, och detta antagande måste ytterligare bekräftelse.
I denna studie användes bakteriell 16S rDNA och svamp ITS regionen sekvensering att utföra den biologiska analysen av bioaerosoler. 16SrDNA -sekvensering är bestämning av 16S rDNA segment i mikrobiell genomet30. 16s rDNA finns allmänt i prokaryoter med höga naturvärden och specificitet, vilket gör det användbart för identifiering av mikrobiell Art31. Helgenom-sekvensering kräver bara utvinning av genomisk DNA och efterföljande sekvensering. Förutom att producera en stor mängd data, kan denna process också för en mer omfattande analys av mikrobiell gemenskapens struktur. Förutom, metagenomik kan också användas inom detta ämnesområde genom att tillhandahålla mer information i framtiden. Handelsman et al. först föreslog begreppet metagenome i 1998 papper på mikrober i jord32. Begreppet metagenome accepterades gradvis i efterföljande studier och mycket forskning utfördes på de bakterier som ingår i den mänskliga tarmen, hav och jord33,34,35. Med stöd av hög genomströmning sekvensering teknik, metagenomik har utvecklats snabbt och den spelar en allt viktigare roll i studiet av upptäckt av patogen. Traditionella mikrobiell forskningsmetoder är främst beroende av kultur för separation och rening. Många studier inte kan dock utföras eftersom mer än 99% av mikrober inte kan vara odlade. I motsats till traditionella metoder, kan metagenomik ta den genetiska informationen för alla mikrober i miljön som helhet utan att behöva separera enskilda organismer36. En omfattande analys av alla de resulterande mikroorganismerna kan utföras direkt.
Sammanfattningsvis visade denna studie flera detektering, provtagning och analysmetoder som kan användas för studier av biologiska sammansättningen av miljömässiga PM, inklusive PM övervakning. PM provtagning av en Andersen sex-stegs sampler, en hög volym air sampler med filter eller cykloniska aerosol sampler; och efterföljande biologisk analys baserad på DNA-sekvensering. I praktiken kan dessa metoder användas under olika miljöförhållanden, såsom många typer av djurgårdar. Våra protokoll och resultaten kan hjälpa andra forskare över hela världen ytterligare undersöka hälsoeffekter av svamp och bakteriella bioaerosoler i miljön.
The authors have nothing to disclose.
Ekonomiskt stöd till denna studie kom från National Natural Science Foundation i Kina (nr. 41775148). Finansiärerna hade ingen roll i studiedesign, datainsamling och analys, beslut om att offentliggöra eller beredning av manuskriptet.
airborne laser particle counter | TSI Inc, MN, USA | model 9306 | |
Andersen six-stage sampler | Tisch Inc, USA | TE-20-600 | |
AxyPrep multisource DNA Miniprep Kit | Axygen, NY, USA | AP-MN-MIS-GDNA-50G | |
FastPfu Polymerase | TransGen Inc., Beijing, China | AP221-01 | |
High-volume air sampler | Beijing HuaRui HeAn Technology Co., Ltd., China | HH02-LS120 | |
Real-Time PCR System | Thermo Fisher Scientific, USA | Applied Biosystems® 7500 | |
Soybean-Casein Digest Agar | Becton, Dickinson and company, MD, USA | 211043 | |
Tissuquartz filters | Pall, NY, USA | 7204 | |
Wetted-Wall Air Sampler | Research International, Inc. 17161 Beaton Road SE Monroe, Washington 98272-1034 USA |
SASS 2300 |