Summary
اكسوسومي جيل جديد من حاملات تسليم المخدرات. وأنشأنا بروتوكولا عزلة اكسوسومي مع عالية الغلة والنقاء لتسليم siRNA. ونحن أيضا مغلفة المسمى فلوريسسينتلي غير محددة siRNA في اكسوسوميس والتحقيق استيعاب الخلوية لتحميل siRNA اكسوسوميس في الخلايا السرطانية.
Abstract
حويصلات خارج الخلية، في اكسوسوميس معينة، قد اكتسبت في الآونة الأخيرة الاهتمام كالمخدرات رواية ناقلات التسليم نظراً لأصل بيولوجي، ووفرة، والقدرة الذاتية في التسليم بين الخلايا من الجزيئات الحيوية المختلفة. ويحدد هذا العمل بروتوكولا عزل لتحقيق المردود العالي ودرجة نقاء عالية من اكسوسوميس لإيصال siRNA. تستزرع خلايا "الكلي الجنينية" البشرية (الخلايا HEK-293) في قوارير مفاعل حيوي وحصاد الثقافة طافية (الممتلكات المشار إليها كوسيلة مشروطة) على أساس أسبوعي للسماح لإثراء اكسوسوميس HEK-293. قبل إلغاء تحديد الخلايا الميتة والحطام الخلوية بالطرد المركزي التفاضلي المتوسطة مكيفة (سم) وهي تتعرض تنبيذ فائق على وسادة سكروز تليها خطوة غسيل، جمع في اكسوسوميس. تتميز اكسوسوميس HEK-293 معزولة للتعبير علامة الغلة ومورفولوجيا واكسوسومال نانوحبيبات تتبع التحليل الكمي البروتين والمجهر الإلكتروني والتدفق الخلوي، على التوالي. تم تحميله صغيرة تدخل الجيش الملكي النيبالي (siRNA)، المسمى فلوريسسينتلي مع Atto655، في اكسوسوميس انهانسر ويتم إزالة siRNA الزائدة عن طريق الترشيح هلام. ويؤكد الإقبال الخلية في الخلايا السرطانية PANC-1، بعد 24 ساعة في الحضانة عند 37 درجة مئوية، التدفق الخلوي. اكسوسوميس HEK-293 من 107.0 شمال البحر الأبيض المتوسط ± 8.2 في القطر. اكسوسومي الغلة والجسيمات للبروتين نسبة نسبة (P:P) هي 6.99 ± 0.22 × 1012 الجسيمات مليلتر والجسيمات10 ± 8.3 1.7 × 10/ميكروغرام، على التوالي. يتم تغليف كفاءة siRNA في اكسوسوميس ~ 10-20%. أربعين بالمائة الخلايا إظهار إشارات إيجابية ل Atto655 في 24 ساعة بعد انتهاء الحضانة. وفي الختام، عزل اكسوسومي بواسطة تنبيذ فائق على وسادة السكروز يوفر مزيجاً من محصول جيد والنقاء. يمكن تحميلها بنجاح في اكسوسوميس التي انهانسر siRNA وتسليمها في وقت لاحق إلى الخلايا السرطانية في المختبر. ويوفر هذا البروتوكول إجراءات موحدة لتطوير اكسوسوميس محملة siRNA للتسليم الفعال للخلايا السرطانية.
Introduction
اكسوسوميس نوع فرعي حويصلات خارج الخلية (EV) تتراوح بين 50-200 نانومتر في القطر، ويفرز بواسطة مختلف أنواع الخلايا مثل الخلايا المناعية1،2، خلايا السرطان3،،من45، 6 والخلايا الجذعية7. وقد أظهرت أيضا اكسوسوميس أن يكون حاضرا في مختلف السوائل الفيزيولوجية8،،،من910،11. أن الجمع بين القدرة الكامنة من اكسوسوميس على تحمل مختلف الجزيئات الحيوية (مثل الحمض النووي الريبي والبروتينات)12،،من1314 والإنجاز الفعال لهذه الجزيئات الحيوية في الخلايا المتلقية 15 , 16 , 17 اجتذب اهتماما لامكاناتهم كمقياس نانو المخدرات تسليم ناقلات. مختلف الجزيئات الصغيرة التي تخدم كما قد أثبتت تحميلها بنجاح إلى اكسوسوميس العقاقير المضادة للسرطان والالتهابات وتسليمها إلى هدف خلايا18،،من1920، 21 , 22 , 23 , 24 , 25 , 26 , 27-من المثير للاهتمام، الأحماض النووية مثل siRNA،من2829 وميكرورنا30 أيضا تم تحميلها بنجاح في اكسوسوميس عن طريق انهانسر وتسليمها إلى الخلايا المستهدفة.
في الآونة الأخيرة، اكتسب الجيش الملكي النيبالي التدخل ([رني]) عن طريق رنا التدخل الصغيرة (siRNA) مزيدا من الاهتمام كآلية المفضل في إسكات الجينات نظراً لخصوصية عالية وتأثير قوي، والحد الأدنى من الآثار الجانبية وسهولة siRNA توليف28، 29. سيرناس جزيئات الحمض النووي الريبي مزدوج-الذين تقطعت بهم السبل تتراوح ما بين 19 إلى 25 النيوكليوتيدات في طول هذه المشغلات الخاصة بتسلسل الحفاز مرناً ضربة قاضية. نظراً للوزن الجزيئي كبير وطبيعة بوليانيونيك، هو السلبي الإقبال siRNA عارية في خلايا أعاقت28،29. كما أنها لا يمكن siRNA عاريا بالحقن إلى الدوران الجهازي بسبب التدهور السريع بالبلازما نوكليسيس31. وهكذا، سيساعد تغليف siRNA في nanocarrier الإنجاز الفعال والإقبال على siRNA في الخلايا الهدف.
اكسوسوميس نظام مثالي لتغليف siRNA هيكلها يتكون من نواة جوفاء، مائي يلفها ببلير فسفوليبيد. اكسوسوميس استقرار جيدة في الدم بل لها أيضا خصائص استهداف الطبيعية لتسليم الوظيفية الحمض النووي الريبي في الخلايا32. أظهرت الدراسة التي أجرتها ألفاريز-ارفيتي وآخرون بنجاح إيصال siRNA لأدمغة الفئران باستخدام إجراء هندسة عكسية اكسوسوميس مع تقريبا لا مضاعفات31. هو الافتراض بأن العلاج القائم على اكسوسومي نسبيا أكثر أماناً من العلاجات الأخرى كما لا النسخ المتماثل اكسوسوميس اندوجينوسلي كما أن الخلايا وذلك لا يحمل خصائص المنتشر15.
أبلغ عن أساليب مختلفة لعزل اكسوسوميس من زراعة الخلايا أو السوائل الفيزيولوجية بنجاح. يستخدم الأسلوب الأكثر شعبية تنبيذ فائق لبيليه اكسوسوميس من انطلاق المواد31،32،33. هذا الأسلوب يمكن أن تكون قاسية جداً على اكسوسوميس والبروتينات رواسب المشارك من العينة عادة. الجمع بين تنبيذ فائق مع فصل القائم على كثافة مثل التدرجات السكروز أصبحت أكثر شيوعاً، للحد من تلوث البروتين وغير اكسوسومال في19،اكسوسوميس معزولة34. حجم الاستبعاد اللوني (SEC) تسمح بفصل اكسوسوميس عن أنواع أخرى من حويصلات خارج الخلية (EV) بحجم ويمكن أن يؤدي أيضا إلى تلوث الحد الأدنى من البروتين غير محدودة بمقدار صغير من ابتداء من المواد فإنه يمكن معالجة35، 36. يستخدم إيمونوافينيتي التقاط الخرز المغلفة بالأجسام المضادة التي تربط بالبروتينات السطحية اكسوسومال مثل تيتراسبانينس أو علامة الخلية المحددة الأخرى التي تتيح التقاط محددة من اكسوسوميس بدلاً من المركبات الكهربائية أو غيرها من البروتينات، فضلا عن عزل السكان الفرعية اكسوسوميس من كل العينات، ولكن مرة أخرى محدودة بمقدار ابتداء من المواد و تكلفة36،37. هطول الأمطار على أساس البوليمر من اكسوسوميس اعتادت أن تكون شعبية جداً، ولكن نظراً هطول الأمطار بدلاً من النفط خام، فإنه يؤدي إلى أعلى غير اكسوسومال حويصلة والبروتين تلوث38،39.
أبلغ انهانسر لعدم الكفاءة، كأسلوب لتحميل اكسوسوميس مع siRNA بسبب بروتين التجميع15،،من2831. النهج القائم على تعداء أظهرت أن يكون تحميل أفضل كفاءة واستقرار البروتين، ولكن غير مرغوب فيه بسبب سميتها والآثار الجانبية لوكلاء تعداء في تغيير الجينات الخلوية التعبير28. وهكذا، انهانسر قد استخدمت على نطاق واسع في تحميل siRNA في اكسوسوميس، وطريقة أكثر أماناً. ومع ذلك، طريقة تغليف أمثل يلزم إنشاء بغية تسليم كميات كافية من siRNA إلى الموقع المستهدف لضربة قاضية جينات قوية.
هنا، فإننا نقترح بروتوكولا عزلة اكسوسومي استخدام المستندة إلى كثافة تنبيذ فائق على مجرد واحد 25% (w/w) سكروز وسادة أعدت في أكسيد الديوتريوم، بدلاً من أن تدرج كثافة سكروز. هذا هو أسلوب فعال من حيث التكلفة التي تلتف إعداد التدرج كثافة شاقة ويتيح تجهيز كميات كبيرة من ابتداء من المواد، ولكن النتائج في اكسوسوميس سليمة عالية الغلة ونقاء مناسبة لتحميل اللاحقة مع siRNA. تم تحميله إلى اكسوسوميس "الكلي الجنينية البشرية" خلايا (خلايا HEK-293) المتأتية عن طريق انهانسر siRNA غير محددة مترافق Atto655 نيون وتسليمها إلى الخلايا السرطانية البشرية غدية البنكرياس (PANC-1) في المختبر.
Protocol
1-خلية ثقافة في قارورة مفاعل حيوي
رقم 1: ثقافة خلايا في قارورة مفاعل حيوي لإنتاج اكسوسومي- (أ) تبسيط تشريح قارورة مفاعل حيوي. (ب) بدء الثقافة في قارورة مفاعل حيوي. انظر الجدول للمواد لتكوين المتوسطة (ج) حصاد مكيفة المتوسطة العادية واستنزفت اكسوسومي (سم)، والحفاظ على الثقافة في قارورة مفاعل حيوي. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
- الثقافة HEK-293 الخلايا في المتوسط العادي (انظر الجدول للمواد؛ 5% CO2, 37 درجة مئوية) وتوسيعها في قوارير x T75 4 (حتى روافد 90%).
- ويت غشاء قارورة مفاعل حيوي بإضافة 50-100 مل متوسط العادي في الخزان المتوسطة من قارورة مفاعل حيوي.
- جمع كافة الخلايا HEK-293 من 4 × T75 وريسوسبيند في 15 مل من متوسط المنضب اكسوسومي (انظر الجدول للمواد).
- أضف تعليق خلية HEK-293 إلى حجرة الخلية من قارورة مفاعل حيوي باستخدام حقنه 20 مل متصلاً بتعبئة كليلة إبرة (انظر الجدول للمواد)، مع الحرص على إزالة أي فقاعة قد شكلت.
- ملء الخزان المتوسطة من قارورة مفاعل حيوي مع المتوسطة العادية إلى 500 مل والاحتفاظ قارورة في الحاضنة (5% CO2، 37 درجة مئوية) لمدة أسبوع.
2-مكيفة المتوسطة (سم) الحصاد من قارورة مفاعل حيوي
- وبعد أسبوع واحد، تجاهل كل وسيلة في الخزان المتوسطة من قارورة مفاعل حيوي.
- إزالة كافة المتوسطة في حجرة الخلية (أي سم) باستخدام المحاقن 20 مل متصلة بإبرة تعبئة غير حادة.
- إضافة 50-100 مل من المتوسط العادي للخزان المتوسطة.
- إضافة 15 مل من متوسط المنضب اكسوسومي إلى حجرة الخلية عن طريق إزالة المتوسطة القديمة وإضافة جديدة متوسط المنضب اكسوسومي استخدام 20 مل حقنه متصلة بإبرة تعبئة غير حادة.
- ملء الخزان المتوسطة من قارورة مفاعل حيوي مع المتوسطة العادية إلى 500 مل والاحتفاظ قارورة في الحاضنة (5% CO2، 37 درجة مئوية) لمدة أسبوع آخر.
ملاحظة: الثقافة يمكن أن تستمر لأكثر من سنة. لخطوة 2، 2، سم من الحصاد الأول لن تستخدم لعزل اكسوسومي ويتم تجاهلها. 2nd والحصاد اللاحقة، يتم الاحتفاظ في سم لعزل اكسوسومي.
3-اكسوسومي العزلة على وسادة السكروز
رقم 2: عزل وتوصيف اكسوسوميس. (أ) قبل إزالة المقطوع مكيفة المتوسطة (سم) من الخلايا الميتة والخلية من الحطام. (ب) عزل اكسوسوميس من سم على وسادة السكروز. (ج) غسل خطوة لإزالة السكروز وتلويث البروتينات. (د) المعزولة اكسوسوميس ثم تعرضوا لتحديد الخصائص الفيزيائية والكيميائية الحيوية والمورفولوجية. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
- قبل مسح سم (من الخطوة 2، 2) بالطرد المركزي التفاضلي والترشيح كما يلي.
- أجهزة الطرد المركزي في 500 x ز لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية. نقل المادة طافية في أنبوب جديد وتجاهل بيليه. كرر هذا الطرد المركزي الخطوة مرة أخرى، استعادة المادة طافية ونبذ بيليه.
- الطرد المركزي المادة طافية من الخطوة 3.1.1 في س 2,000 ز لمدة 15 دقيقة و 4 درجات مئوية وتجاهل ثم بيليه. تصفية مرة طاف المستردة من خلال 0.22 ميكرون المرشحات.
- أثناء التخليص المسبق، بإعداد 25% من محلول السكروز (w/w) في أكسيد الديوتريوم بوزنها بدقة إلى 1.9 ز (± 0.001 غ) السكروز في أنبوب عالمي ومن ثم تغليفه مع أكسيد الديوتريوم حتى يصل الوزن 7.6 ز (± 0.001 غ).
- ملء أولتراسينتريفوجي أنبوب (انظر الجدول للمواد) مع 22.5 مل من المجازين سم. الماكياج سم إلى 22.5 مل مع 0.22 ميكرومتر تصفية برنامج تلفزيوني إذا كانت وحدة التخزين الحالية أقل من ذلك.
- مكان زجاج "الماصة؛" (انظر الجدول للمواد) في الأنبوب، ومن خلال ذلك، أضف 3 مل محلول السكروز حيث أن الحل الذي يشكل طبقة منفصلة تحت سم.
- بدقة مكان الأنبوبة التي تحتوي على الطبقات الحل سم/السكروز في الدلو من دوار البديل التدريجي (انظر الجدول للمواد)، وتأمين الدلو إلى الدوار.
- ضع الدوار إلى أولتراسينتريفوجي (انظر الجدول للمواد)، وتدور في 100,000 ز x 1.5 ح في 4 درجات مئوية.
- جمع 2 مل طبقة السكروز وهذا إضافة إلى زجاجة أولتراسينتريفوجي (انظر الجدول للمواد) التي تحتوي على 20 مل من تصفية برنامج تلفزيوني لخطوة غسيل.
- ضع الأنابيب في دوار زاوية ثابتة (انظر الجدول للمواد)، وتدور في 100,000 ز x 1.5 ح في 4 درجات مئوية.
- بعناية إزالة المادة طافية مع ماصة 10 مل مصلية وريسوسبيند بيليه مع 400 ميليلتر تصفية PBS. إبقاء هذا المخزون اكسوسومي في 4 درجات مئوية أو-80 درجة مئوية للتخزين القصير الأجل والطويل الأجل على التوالي.
4-توصيف حجم اكسوسومي والغلة التي نانوحبيبات تتبع تحليل (NTA)
- جعل 1:1، 000 1:50، 000 تخفيف المخزون اكسوسومي في حجم 1 مل (الحد الأدنى 750 ميليلتر) بغية الحصول على جسيمات 20-80 في الإطار عرض من الإدارة الوطنية للسياحة صك العرض (انظر الجدول للمواد).
- الأسهم اكسوسومي المخفف بحقن الدائرة عينة أداة الإدارة الوطنية للسياحة باستخدام المحاقن 1 مل، وإدراج التحقيق مقياس الحرارة درجة الحرارة في مدخل مسبار درجة الحرارة.
- مجموعة برامج الإدارة الوطنية للسياحة (انظر الجدول للمواد) لتسجيل ما يلي: القياسات الموحدة 3، 30 s كل، الخيار اليدوي درجة الحرارة دون رادع؛ وأدخل عامل إضعاف تحت علامة التبويب خيارات متقدمة .
- تعيين مستوى الكاميرا إلى 13 وتشغيل البرنامج النصي القبض على البرمجيات الإدارة الوطنية للسياحة، ودفعه جديدة من العينة بالحقن وإدخال درجة حرارة العينة الدائرة عند مطالبتك بذلك بعد كل قراءة.
- تعيين العتبة إلى 4 لجزء تحليل اللاحقة، وملاحظة أن متوسط حجم مشروط وتركيز الجسيمات من الأسهم اكسوسومي من القياسات.
5-وصف النقاء اكسوسومي بتحديد نسبة البروتين الجسيمات:
- قياس محتوى البروتين من الأسهم اكسوسومي بحمض بيسينتشونينيك (اتفاق التعاون الأساسي) بروتين الإنزيم كيت (انظر الجدول للمواد) على النحو التالي.
- تعد المعايير المحددة.
- إعداد معيار أعلى تركيز (500 ميكروغرام/مل) بإضافة 45 ميليلتر من جيش صرب البوسنة الحل الأسهم (2 ملغ/مل – قدمت في أدوات التحليل) إلى أنبوب ميكروسينتريفوجي، وجعلها تصل إلى 180 ميليلتر مع برنامج تلفزيوني.
- ملء 8 ميكروسينتريفوجي أنابيب مع 90 ميليلتر من برنامج تلفزيوني.
- جعل تخفيف المسلسل (عامل: 0.5) أخذ ميليلتر 90 من جيش صرب البوسنة أعلى القياسية وإضافة هذا إلى ميكروسينتريفوجي 1ش أنبوب مع برنامج تلفزيوني (المزيج جيدا)، ثم أخذ ميليلتر 90 من هذا الأنبوب وإضافته في أنبوب ميكروسينتريفوجي 2nd .
- كرر هذه العملية حتى أنبوب ميكروسينتريفوجي 7. أنبوب 8 سيكون مجرد برنامج تلفزيوني (أي، الفارغة: 0 ميكروغرام/مل).
- إعداد عينات اكسوسومي طريق تمييع 1:2 من عينات مع برنامج تلفزيوني في إجمالي حجم 90 ميليلتر (45 ميكروليتر من عينة، ميليلتر 45 من برنامج تلفزيوني).
- إعداد اتفاق التعاون الأساسي تعمل ميكس كاشف.
- حساب الحجم الإجمالي لاتفاق التعاون الأساسي يعمل كاشف مزيج اللازمة (50 ميليلتر الواحد جيدا، في التكرار، بما في ذلك المعايير).
- مزيج الكواشف اتفاق التعاون الأساسي الفردية وفقا لنسبة التالية: 25 أجزاء كاشف 24 ج: أجزاء الكاشف 1 باء: جزء كاشف جيم
- إجراء الفحص والتحليل.
- إضافة 40 ميليلتر من كل عينة المعيار واكسوسومي أعد أعلاه في بئر صفيحة 96-جيدا (التكرارات لكل معيار ونموذج).
ملاحظة: أن هذا مقايسة اللونية، الأسلوب بيبيتينج السليم أمر حاسم لتحقيق نتائج دقيقة. تغيير الماصات بعد إضافة كل تكرار القياسية/عينة في كل من الآبار - إضافة 50 ميليلتر من مقايسة البروتين تعمل ميكس الكاشف في كل بئر، واحتضان لوحة عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
ملاحظة: لتقليل الانحرافات بين replicates، إضافة الكاشف العامل مقايسة البروتين إلى تكرار 1st القياسية/عينة، متبوعة تكرار 2nd نفس العينة/المعيار، قبل إضافته إلى 1st إجراء نسخ متماثل للعينة/معيار آخر. - قياس امتصاص في 562 نانومتر على قارئ لوحة (انظر الجدول للمواد).
- ارسم منحنى قياسي من امتصاص قيم المعايير، والعمل على تركيز البروتين في كل عينة باستخدام معادلة المنحنى.
- إضافة 40 ميليلتر من كل عينة المعيار واكسوسومي أعد أعلاه في بئر صفيحة 96-جيدا (التكرارات لكل معيار ونموذج).
- تعد المعايير المحددة.
- حساب نسبة الجسيمات: البروتين بقسمة الغلة اكسوسومي التي تم الحصول عليها في وقت سابق مع تركيز البروتين المخزون اكسوسومي قياس أعلاه.
6-توصيف التعبير اكسوسومال ماركر بالتدفق الخلوي
- احتضان 40 ميليلتر من اكسوسوميس (≥1x1011 الجسيمات/mL) مع 10 ميليلتر من حبات مطاط ألدهيد/سلفات (مخفف من الأسهم) لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة (RT).
- إضافة 5 ميليلتر من 100 ميكرومتر جيش صرب البوسنة الحل (انظر الجدول للمواد) إلى الخليط حبة اكسوسومي لتحقيق تركيز نهائي 10 ملم واحتضان لمدة 15 دقيقة في الرايت
- أضف 1 مل من برنامج تلفزيوني واحتضان لمدة 75 دقيقة في RT في أنبوب ميكروسينتريفوجي مع الانفعالات خفيفة على شاكر هزاز (~ 150 لفة في الدقيقة).
- الطرد المركزي من التعليق على 580 x ز لمدة 5 دقائق في الرايت وتجاهل المادة طافية.
- ريسوسبيند بيليه مع 1 مل من محلول جليكاين 100 مم (انظر الجدول للمواد)، واحتضان لمدة 30 دقيقة في الرايت
- الطرد المركزي من تعليق لمدة 5 دقائق في 580 x زاي تجاهل المادة طافية وريسوسبيند بيليه مع 1 مل من 3% FBS/برنامج تلفزيوني (انظر الجدول للمواد).
- كرر هذه الخطوة الغسيل وريسوسبيند بيليه في 350 ميليلتر من 3% FBS/برنامج تلفزيوني.
- تقسيم التعليق إلى أنابيب 7، كل منها يحتوي على 50 ميليلتر من تعليق واحتضانها لهم مع fluorophore مترافق مكافحة--CD81 والأجسام المضادة-CD9 ومكافحة CD63 وضوابطها ايستب المقابلة (01:10 إضعاف)، على التوالي، لمدة 45 دقيقة في 4 درجات مئوية. تبقى 1 الأنابيب كعنصر تحكم أونستينيد ولكن يجري تجهيز نفسه.
- أضف 1 مل من 3% FBS/برنامج تلفزيوني لكل أنبوب والطرد المركزي لمدة 5 دقائق في ز 580 x وتجاهل المادة طافية.
- ريسوسبيند بيليه مع 200-400 ميليلتر من 3% FBS/برنامج تلفزيوني وتحليل العينة في سيتوميتير تدفق (انظر الجدول للمواد) تحت القنوات المناسبة.
7-تحديد خصائص مورفولوجية اكسوسومي مجهر إلكتروني (TEM)
- فيكس اكسوسومي تشتت مائي بتركيزات مناسبة مثل 1010 ف/مل في تحديد الحل (انظر الجدول للمواد) لمدة 15 دقيقة.
- مكان العينات على 300 مش الكربون المغلفة النحاس الشبكات، وترك للهواء الجاف.
- سلبا على وصمة عار العينات مع خلات اليورانيل مائي تصفيتها ميكرومتر 0.22 (انظر الجدول للمواد) 4 دقيقة تليها هما 50 ٪ الميثانول/ح2س يغسل (انظر الجدول للمواد).
- الهواء الجاف للعينة.
- مراقبة العينات تحت تيم (انظر الجدول للمواد). تعيين الجهد المتسارع في 80 كيلو فولت وحجم بقعة في 2. استخدام الفتحة موضوعية مع جميع العينات.
8-siRNA التغليف في اكسوسوميس التي انهانسر
- قبل chill ومبومو انهانسر (انظر الجدول للمواد) على الجليد لمدة 30 دقيقة قبل انهانسر.
- ميكروغرام 7.0 مزيج من اكسوسوميس (ميكروليتر 32 من 7 × 1012 مل ف/المخزون في برنامج تلفزيوني) مع 0.33 ميكروغرام من siRNA (12 ميليلتر من 2 ميكرومتر المخزون في المياه خالية من رناسي) في أنبوب ميكروسينتريفوجي. جعل وحدة التخزين إلى 150 ميليلتر مع المخزن المؤقت لحمض الستريك (انظر الجدول للمواد). اكسوسومي إلى نسبة المولى siRNA هو 1:60 في هذه القضية.
- نقل الخليط إلى ومبومو انهانسر. كاب ومبومو ثم ضعه في حامل ومبومو اليكتروبوراتور (انظر الجدول للمواد). قم بتدوير عجلة تحول 180 درجة عكس اتجاه عقارب الساعة.
ملاحظة: العجلة يجب تشغيل تماما لموقف مؤمن، كي ومبومو الاتصال بأقطاب كهربائية. - حدد البرنامج المطلوب انهانسر (مثلاً، X-01، X-05، A-20، T-20، T-30، إلخ) وبدء انهانسر بالضغط على الزر ابدأ .
ملاحظة: يرد نبض ناجحة بعرض "موافق" على الشاشة. - مرة اليكتروبوراتيد، إزالة ومبومو بعد رجوع العجلة 180° عقارب الساعة. سحب العينة من ومبومو مع ماصة بلاستيكية لمزيد من المعالجة.
9-إزالة siRNA الحرة استخدام حجم الاستبعاد اللوني (ثانية)
- حجته العمود ثانية (2.9 سم [ح] × 1.3 سم [ث]؛ انظر الجدول للمواد) بتمرير مل 3.5 من برنامج تلفزيوني المصفاة مرتين.
- حل 150 ميكروليتر من عينة اليكتروبوراتيد في ميكروليتر 350 من برنامج تلفزيوني تم تصفيتها ونقل هذا إلى العمود ثانية لإجراء عملية إزالة siRNA مجاناً.
- جمع الكسر 500 ميكروليتر الأولى التي الوتيد من العمود (F0).
- إضافة 500 ميكروليتر من برنامج تلفزيوني تم تصفيتها إلى العمود وجمع الكسر 500 ميكروليتر القادم (F1).
- كرر الخطوة أعلاه حتى يتم جمع إجمالي 10 × 500 ميكروليتر الكسور (تصل إلى F9). يجب أن تحتوي على F1 و F2 اكسوسوميس siRNA مغلفة.
- أغسل العمود مع برنامج تلفزيوني تم تصفيتها (مرتين على الأقل) لإزالة أي بقايا العينة.
10-الإقبال في المختبر على تحميل siRNA اكسوسوميس في "خلايا" PANC-1
- دراسة البذور PANC-1 الخلايا في لوحات 24-جيدا مسطحة القاع (انظر الجدول للمواد) في كثافة الخلايا 50,000 الواحدة وكذلك 24 ساعة قبل الاستيعاب واحتضان الخلايا في الحاضنة (5% CO2، 37 درجة مئوية).
- اكسوسوميس HEK اليكتروبوراتي-293 (7.0 ميكروغرام) مع Atto655-siRNA (0.33 ميكروغرام) وفقا الخطوة 8.
- تنقية اكسوسومي اليكتروبوراتيد حسب الخطوة 9 وريسوسبيند في 100 ميكروليتر من برنامج تلفزيوني.
- إضافة 50 ميكروليتر من اكسوسوميس اليكتروبوراتيد إلى خلية PANC-1 واحتضان في 37 درجة مئوية و 5% CO2 لح 4.
- جمع الخلايا بعد الحضانة.
- تغسل الخلايا مع 1 مل PBS العقيمة وريسوسبيند في 200 ميكروليتر من برنامج تلفزيوني في القاع المستديرة البوليستيرين أنبوب (انظر الجدول للمواد).
- تحليل الخلايا بتدفق سيتوميتير (انظر الجدول للمواد) مع الأحداث 10,000 اكتسبت كل عينة.
ملاحظة: استخدمت الأمم المتحدة-اليكتروبوراتيد اكسوسومي-siRNA خليط عينات والخلايا غير المعالجة مع برنامج تلفزيوني تم تصفيتها كعناصر تحكم.
Representative Results
ويرد في الجدول 1توصيف الفيزيائية اكسوسوميس المعزولة من الخلايا HEK-293 (Exo HEK-293). وكان حجم تقاس باستخدام نانوحبيبات تتبع أداة التحليل (NTA) 107.0 ± 8.2 نانومتر. اكسوسومي العائد من الخلايا HEK-293، وتحليلها أيضا باستخدام أداة الإدارة الوطنية للسياحة، التي كانت 6.99 ± 0.22 × 1012 ف مليلتر من مل ~ 24 سم (التي تم الحصول عليها من جولتين من الحصاد). وكان نقاء "أكسو" HEK-293 بحساب نسبة الجسيمات للبروتين (P:P) تقييم 8.3 ± 1.7 × 1010 ف/ميكروغرام.
توزيع حجم معزولة HEK-293 "أكسو" يرد في الشكل 3 ألف. وأظهر التحليل المورفولوجي باستخدام مجهر إلكتروني (TEM) Exo HEK-293 كانت هياكل كروية قليلاً فوق 100 نانومتر في الحجم (الشكل 3B). هذه النتيجة تتفق مع ذلك من قياس جاتا (الشكل 3A). Exo HEK-293 معزولة كانت إيجابية بالنسبة CD81 و CD9 و CD63، وعلامات متعارف عليه يستخدم لتعريف حويصلات اكسوسوميس (الشكل 3).
لتنقية اكسوسوميس استخدام حجم الاستبعاد اللوني (الشكل 4)، استرداد النسبة المئوية اكسوسوميس تم حسابها بقسمة عدد الجسيمات اكسوسومي مجموع المستردة في 10 الكسور جمعها (F0-F9) مع اكسوسومي الأولى عدد الجسيمات المستخدمة، بينما نسبة استرداد siRNA تم حسابها بقسمة كثافة مجموع الأسفار التي تم الحصول عليها من F3 و F4 و F5 مع كثافة مجموع الأسفار التي تم الحصول عليها من جميع الكسور 10 التي تم جمعها. استعادة اكسوسومي و siRNA بعد تنقية حسبت ك 75.0% و 80.4 في المائة، على التوالي. وكان كفاءة تغليف siRNA في اكسوسوميس ~ 10-20%، محسوبة باستخدام siRNA القياسية المنحنى المنشأ (الشكل 4).
وأظهر تحليل نوعي للإقبال في المختبر على اكسوسوميس محملة بنيون Atto655-siRNA بالتدفق الخلوي أن PANC-1 الخلايا تعامل مع تغليف siRNA اكسوسوميس تسجيل التحول الأكبر في إشارة الفلورية (الشكل 5A) . PANC-1 الخلايا تعامل مع تغليف siRNA اكسوسوميس تسجيل نسبة أعلى من السكان إيجابية بالنسبة Atto655 إشارة (39.4 في المائة) مقارنة بأن تعامل مع تفريغ اكسوسوميس و siRNA خليط (0.56%)، مما يؤكد الملاحظة أعلاه ( الشكل 5B). درجة امتصاص الخلوية من siRNA (معبراً عنها كحظيرة الفرق في قيم الكثافة (MFI) الأسفار يعني من أن الخلايا غير المعالجة) ولوحظ أيضا أن يكون أعلى بكثير في PANC-1 الخلايا تعامل مع تغليف siRNA اكسوسوميس (مؤسسة مونتانيار حظيرة الفرق = 5.1) مقارنة بأن تعامل مع خليط اكسوسومي-siRNA (مؤسسة مونتانيار إضعاف الفرق = 1.1) (الشكل 5). أظهرت هذه الملاحظات أن كانت مستوعبة اكسوسوميس siRNA مغلفة بالخلايا PANC-1 وأن سلموا فعلياً في siRNA إينتراسيلولارلي.
الشكل 3: الكيمياء الحيوية وتحليل مورفولوجيا اكسوسوميس HEK-293- (أ) حجم توزيع اكسوسوميس HEK-293 باستخدام تحليل تتبع نانوحبيبات (NTA). المنحنى يبين الرسم بياني فرضه من 3 مختلفة يلتقط في 30 ثانية الفاصل مع المناطق الحمراء تدل على الانحراف المعياري بين القياسات (n = 3). (ب) انتقال الميكروسكوب الإلكتروني (TEM) صور السذاجة اكسوسوميس HEK-293. شريط الحجم: 100 نانومتر. (ج) الكشف عن علامات اكسوسومال CD81 و CD9 و CD63 باستخدام التدفق الخلوي في اكسوسوميس HEK-293. اكسوسوميس اقترنت إلى ألدهيد/سلفات الخرز مطاط قبل الكشف. في وقت لاحق تم الملون مجمع اكسوسومي-الخرز مع الأجسام المضادة CD81 و CD9 المضادة ومكافحة CD63 fluorophore مترافق. يتم التعبير عن درجة من تعبير العلامات كحظيرة الفرق في الأسفار متوسط قيم الكثافة (MFI) من أن عنصر التحكم (مجمع اكسوسومي-الخرز الملون مع ايستب المقابلة). يتم التعبير عن القيم كما يعني ± التنمية المستدامة، حيث n = 3. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 4: اكسوسومي تنقية بوست-انهانسر. (أ) شطف التشكيلات الجانبية (F0-F9) من اكسوسوميس Atto655-siRNA واليكتروبوراتيد باستخدام حجم الاستبعاد تشورماتوجرافي. (ب) الإدارة الوطنية للسياحة التحليل Atto655-siRNA واكسوسومي من F0 إلى F9 استخدام حجم الاستبعاد تشورماتوجرافي. (ج) المعايرة منحنى Atto655 المسمى siRNA. تم الحصول على كثافة الأسفار بقارئ لوحة في ت/م: 640-10/680 نانومتر؛ اكتساب 2800. يتم التعبير عن القيم كما يعني ± SD (n = 3). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الرقم 5: استيعاب الخلوية لتغليف siRNA اكسوسوميس في خلايا PANC-1 في 4 ﻫ. (أ) رسوم بيانية تقارن امتصاص الخلوية لتفريغ اكسوسوميس + خليط siRNA وتغليف siRNA اكسوسوميس. (ب) مقارنة الإقبال على تفريغ اكسوسوميس + خليط siRNA في ح 4 بالأرض بسيودوكولور. (ج) إضعاف الفرق يعني في الأسفار (مؤسسة مونتانيار) قيم الكثافة للعينات التي تم اختبارها مقارنة بالخلايا غير المعالجة. يتم التعبير عن القيم كما يعني ± التنمية المستدامة، حيث n = 3. ف < 0.001. NS: ليس كبيرا. تم استخدام ANOVA في اتجاه واحد للتحليل الإحصائي. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
| اكسوسومي | حجم1، 2 (نيو مكسيكو) |
العائد1,2,3 (p/mL) |
[بروتين] 2، 4 (ميكروغرام/مل) |
الجسيمات للبروتين (P:P) نسبة5 (p/ميكروغرام) |
| HEK-293 | 107.0 ± 8.2 | ± 6.99 0.22 × 1012 | 84.3 ± 9.8 | 8.3 ± 1.7 × 1010 |
|
Measured 1 استخدام نانوحبيبات تتبع تحليل (NTA الصك) 2 يتم التعبير عن القيم كما يعني ± التنمية المستدامة، حيث n = 3 3 تم الحصول على عائد بالمتوسطة مكيفة الخلايا المجمعة من جولتين من الحصاد من قوارير مفاعل حيوي (~ 24 مل) ميسوريد 4 باستخدام مجموعة أدوات مقايسة البروتين 5 القيمة التي تم الحصول عليها باستخدام الصيغة: نسبة P:P = العائد/[بروتين] |
||||
الجدول 1: توصيف الفيزيائية من اكسوسوميس.
Discussion
الحصول على عائد اكسوسومي لائق من الخلايا المزروعة، التي تكفي لعدة جولات من الدراسات في المختبر أو في الجسم الحي ، لا يزال يمثل تحديا. ووفقا للشركة المصنعة، ترمي قوارير مفاعل حيوي لإنتاج الأجسام المضادة، والبروتينات مع عالية الغلة من الثقافة من مختلف خطوط الخلايا مخلدة. وهذا يسمح للخلايا باستمرار إثراء الثقافة المتوسطة مع المنتج المطلوب، أسفر عن وسيلة مكيفة مركزة (سم) في الخلية-المقصورة. نظرياً، سيكون مفيداً في إنتاج اكسوسومي من خطوط الخلايا المختلفة نفس المفهوم، وتجلى الواقع استزراع هذه الخلايا في قوارير مفاعل حيوي زيادة الغلة اكسوسومي40. إمدادات المواد المغذية للخزان المتوسطة الكبيرة باستمرار، وإزالة النفايات من حجرة الخلية من خلال غشاء شبه منفذ 10 كاتشين، السماح للثقافة فترات طويلة دون الحاجة إلى كمية كبيرة من المتوسط لتكون على اتصال بالخلايا، أو العادية قوارير المتغيرة، التي يمكن في نهاية المطاف إنقاذ التكلفة الإجمالية والعمل اكسوسومي عالية-حجم الإنتاج40. كما اتضح أن مورفولوجية والنمط الظاهري، فضلا عن وظائف إيمونومودولاتوري اكسوسوميس عزل الخلايا الثقافات قوارير مفاعل حيوي طويل الأجل مماثلة للتي مصدرها الخلايا المستزرعة في العادية 75 سم2 قوارير40. ولذلك سيساعد ثقافة أخرى خطوط خلية مخلدة كمصادر اكسوسومي في قارورة مفاعل حيوي زيادة الغلة اكسوسومي بهم مع الحفاظ على سلامتهن والدالة. لا هذا النموذج من الثقافة ولكن لا ينطبق على الخلايا الأولية مع دورات شعبة محدودة، وتلك التي لا يمكن مثقف في كثافة عالية.
حيث يتم الحصاد سم أسبوعيا، وكانت ابدأ باساجيد الخلايا في الثقافة، يمكن الافتراض بأن الخلايا في قارورة مفاعل حيوي لا تنمو في أحادي الطبقة مثل ثقافة الخلية العادية. هم الأكثر احتمالاً تشكيل مجموعات مع مراكز نخرية، أو ببساطة فصل من السطح وتموت عند المتلاقية جداً لأحادي الطبقة الخلايا. الفحص البصري لحجرة الخلية من قارورة مفاعل حيوي لا يمكن تأكيد هذا الافتراض، ولكن ينعكس من خلال عدد كبير من الخلايا الميتة التي تم الحصول عليها أثناء الحصاد سم. إزالة منتظمة من الخلايا ملتصقة ضعيف وغير قادر على الاستمرار في قارورة مفاعل حيوي يمكن منع تراكم المواد المتعلقة شبه نفاذية الأغشية التي يمكن أن تؤثر سلبا على تبادل الغاز والمواد الغذائية والنفايات بين حجرة الخلية والمتوسطة الخزان، مما يسمح للثقافة المطولة في قوارير مفاعل حيوي > 6 أشهر40. وفي هذا السياق، هذا عدم انتظام نمو الخلايا في قوارير مفاعل حيوي مثالي كما يمكننا التكهن بأنه يقلد الحالة الفعلية للورم النمو في فيفو أوثق من ثقافة الخلية أحادي الطبقة التقليدية، ومن المأمول أن اكسوسوميس ينتج سرطان خلايا في قارورة مفاعل حيوي سيكون أكثر مماثلة للتي تفرزها الأورام في فيفو. وهذا سيكون مفيداً بصورة خاصة في دراسات تبحث في دور اكسوسوميس المستمدة من ورم في تطور علم الأمراض السرطانية. اكسوسوميس المستمدة من الورم قد أبلغت إلى المنزل ارتباطاً وثيقا، وترتبط بشكل تفضيلي إلى تلك الأنسجة من أصل32، وذلك بعد اكسوسوميس المنتجة في نظام محاكاة بهم في فيفو الإنتاج المرغوب فيه أيضا في دراسات تبحث في استكشاف قدرة الاستهداف السلبي اكسوسوميس نانوكاريرس المخدرات.
وذكر نسبة P:P كمعلمة لتقييم نقاء اكسوسوميس المعزولة من تلويث البروتينات من المتوسط الثقافة من السوائل الفسيولوجية التي كان مصدرها اكسوسوميس41. نسبة P:P ± 1.7 × 10 8.310 ف/ميكروغرام تم الحصول عليها في هذه الدراسة يقع ضمن النطاق عالية النقاء المقترحة في الدراسة. ويبرز هذا النسبة خطر استخدام تركيز البروتين للتعبير عن العائد أو جرعة من اكسوسوميس معزولة أو المستخدمة في الدراسات النهائية على التوالي، كما لا يعكس هذا المبلغ الحقيقي من اكسوسوميس المتوفرة في العينة نظراً لمشكلة البروتين التلوث أثناء العزلة. الإدارة الوطنية للسياحة عن طريق الصكوك مثل نانوسايت، الذي يقيس تركيز اكسوسوميس من حيث عدد الجسيمات، طريقة أكثر منطقية وأكثر دقة لقياس اكسوسوميس.
موازنة دقيقة للغاية أثناء إعداد محلول 25% في أكسيد الديوتريوم أمر حاسم بهذا الأسلوب عزلة على أساس كثافة. وقد اكسوسوميس مجموعة ضيقة من كثافة التعويم في محلول السكروز حتى إعداد دقيقة لوسادة السكروز سيتم الحد من تلوث من حويصلات غير اكسوسومال مثل الهيئات apoptotic أو حويصلات غولجي-مشتقة خلال عزل42. ينصح لا للحفاظ على بقايا محلول واستخدامه حتى بعد يوم واحد تجنبا لمخاطر عوامل التي يمكن أن تغير كثافته مثل فقدان أو إضافة المياه في الحل بالتبخر أو التكثيف في الهواء في الأنبوب. استخدام دوار البديل التدريجي ضروري أيضا أثناء الطرد المركزي على وسادة السكروز للسماح بالهجرة حتى من اكسوسوميس من مجلس الوزراء حل السكروز.
سحب الطرد المركزي بعد حل السكروز أيضا خطوة حساسة، وأنها تنطوي على إيجاد حل وسط بين تعظيم مقدار اكسوسوميس المستردة، وليس كثيرا أن البروتين من الثقافة المتوسطة عرض لسحب العينة اكسوسومي . هي الواجهة بين محلول السكروز والمتوسطة شرط فيها البروتينات من المتوسط الثقافة بجمع بعد الطرد المركزي، وعادة ما يمكن اعتباره حلقة بني داكن أن يجلس على الواجهة. في أيدينا، هو سحب 2 مل وسادة السكروز من الأولى 3 مل إضافة وحدة التخزين الأمثل الذي يتفق مع الحل التوفيقي المشار إليها أعلاه. الكميات المبينة في هذا البروتوكول للدوارات المحددة المستخدمة؛ ولذلك، فإنه ينصح لتحسين حجم السكروز سحب عند القياس أعلى أو أسفل وحدات التخزين لأنواع الدوارات المتاحة في مرافق مختلفة. من المهم أيضا تجنب حق المنطقة في وسط أسفل الأنبوبة عند سحب السكروز، هذا هو حيث سيتم الجسيمات من أعلى كثافة من السكروز الرواسب ويمكن عادة اعتبار بيليه البيض.
خطوة الغسيل بكمية كبيرة نسبيا من برنامج تلفزيوني يساعد على الحد من زيادة درجة التلوث البروتين خلال العزلة اكسوسومي41. هذه الخطوة ضروري أيضا في إزالة الزائدة السكروز من اكسوسوميس لتفادي الضرر ناضح اكسوسوميس أنفسهم أو الجزيئات الحيوية داخل التجويف اكسوسومال، فضلا عن الحد من خطر النمو البكتيرية أو الفطرية في الأسهم اكسوسومي. إعداد محلول السكروز في أكسيد الديوتريوم بدلاً من الماء يساعد على تقليل كمية السكروز اللازمة لتحقيق كثافة تعويم اكسوسومي للعزلة، ومن ثم تقليل خطر الضرر ناضح والتلوث الميكروبي. بعد الطرد المركزي الأول على وسادة السكروز، المحتوية على اكسوسومي يمكن تخزينها في 4 درجات مئوية طبقة السكروز سحب وإضافة إلى برنامج تلفزيوني ومعالجتها في اليوم التالي إذا واجهت مع ضيق الوقت.
على حد علمنا، نسبة المولى اكسوسومي/siRNA عاملاً هاما في تحديد كفاءة انهانسر. في هذا البروتوكول، استخدمنا 1:60 اكسوسومي إلى نسبة siRNA المولى. كما قدرة التغليف لأنواع مختلفة من اكسوسوميس مختلفة، ونحن نقترح بقوة هذا الأمثل على أساس حالة بحالة. ومع ذلك، يمكن كفاءة التغليف المقترح هنا دائماً معلمة لتحديد شروط انهانسر الأمثل.
وباﻹضافة إلى ذلك، تجميع siRNA يعتقد أن واحدة من المشاكل الأكثر شيوعاً في انهانسر. وقد ثبت أن انهانسر يمكن الحث على تجميع قوي من siRNA، مما يجعل من الصعب حتى إدخال اكسوسوميس. كثير من الأحيان عن طريق الخطأ تفسير المجموعات siRNA كما تغليف siRNA إلى اكسوسومي الضوابط المناسبة لذلك استخدمت في هذه الدراسة كتشكيل المجاميع siRNA أمر لا مفر منه خلال انهانسر28. وحسبت نسبة كفاءة التغليف لدينا طريقة تنقية باستخدام قيم طبيعية للتقليل من التأثير من مصادر أخرى مثل تجمعات الضوضاء واكسوسومي و siRNA الخلفية التي سوف يؤثر على موثوقية البيانات. استناداً إلى النتائج التي توصلنا إليها، كان هناك تجميعات siRNA لا يعتد بها مراعاة مراقبة العينة أي استخدام siRNA اليكتروبوراتيد والأمم المتحدة--اليكتروبوراتيد.
هذا البروتوكول قد أثبت نجاح تغليف siRNA إلى اكسوسوميس وإيصالها داخل الخلايا اللاحقة siRNA لسرطان الخلايا في المختبر. ولذلك، يمكن أن تكون أنواع مختلفة من اكسوسوميس من خطوط الخلايا المختلفة معزولة وتتميز باستخدام البروتوكول المقترح، وبعد ذلك محملة siRNA علاجية مختلفة لأنواع مختلفة من الأهداف النمطان أعرب عن الإفراط في أنواع مختلفة من السرطان. سيكون تطبيق مثيرة لاهتمام لاستكشاف siRNA التسليم والإقبال على كفاءة استخدام التباديل المختلفة من اكسوسومي مصدر-هدف خلية الزوج في المختبر. ويمكن أن يترجم هذا ثم إلى نماذج حيوانية لتقييم كفاءة عملية التسليم والفعالية العلاجية لتغليف siRNA اكسوسوميس المجراة في.
Disclosures
الكتاب يعلن أن لديهم لا تضارب المصالح المالية.
Acknowledgments
ف. أ. فاروقو هو تموله وكالة الحكومة الماليزية مجلس أمانة راكيات (مارا). شو لام متلقي لماري سكلودوفسكا كوري "زمالات فردية" (أفق 2020) (H2020-مسكاً-لو-2016). ك. ت. جمال تعترف بتمويل من مؤسسة ويلكوم ترست (WT103913) وبسرك (BB/J008656/1). المؤلفون أيضا يود أن يشكر الدكتور بول خزامي والدكتور ديفيد الخوف (قسم طب الجهاز التنفسي والحساسية، كوليدج لندن كينغز) توفير اليكتروبوراتور.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Material | |||
| Sterile Newborn Calf Serum Heat Inactivated | First Link | 08-05-850 | 500 ml |
| EMEM medium | Thermo Fisher Scientific | 11090081 | 500 ml |
| Penicillin/Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140-122 | 100 ml |
| GlutaMax | Thermo Fisher Scientific | 35050-038 | 100 ml |
| Sucrose | Fisher Scientific | S/8600/60 | 1 kg |
| Deuterium oxide (D2O) | Sigma-Aldrich | 151882 | 250 g |
| 1X Phosphate Buffered Saline | Thermo Fisher Scientific | 10010015 | 500 ml |
| Glycine | VWR Chemicals | 101196X | 1 kg |
| Sepharose CL-2B | GE Healthcare Life Sciences | 17-0140-01 | 1 L; Particle Size 60 μm-200 μm |
| Trypsin-EDTA 0.05% | Thermo Fisher Scientific | 25300096 | 100 ml |
| Aldehyde/sulfate latex beads | Thermo Fisher Scientific | A37304 | 4% w/v, 4 µm, 15 ml |
| MicroBCA kit | Thermo Fisher Scientific | 23235 | |
| CD81 antibody (APC) | Thermo Fisher Scientific | 17-0819-42 | Lot: E15950-104. RRID: AB_11150235. 1:10 dilution in 50 µl sample |
| CD81 isotype (APC) | Thermo Fisher Scientific | 17-4714-81 | Lot: 4291563. RRID: AB_763650. 1:10 dilution in 50 µl sample |
| CD9 antibody (FITC) | Thermo Fisher Scientific | 11-0098-41 | Lot: 4345870. RRID: AB_10698007. 1:10 dilution in 50 µl sample |
| CD9 isotype (FITC) | Thermo Fisher Scientific | 11-4714-41 | Lot: 4299784. RRID: AB_10598647. 1:10 dilution in 50 µl sample |
| CD63 antibody (PE) | Thermo Fisher Scientific | 12-0639-41 | Lot: 1930435. RRID: AB_2572564. 1:10 dilution in 50 µl sample |
| CD63 isotype (PE) | Thermo Fisher Scientific | 12-4714-81 | Lot: 1937696. RRID: AB_470059. 1:10 dilution in 50 µl sample |
| Atto655-siRNA | Eurogentec | SQ-SIRNA | (Labelled-S) UGC-GCU-ACG-AUC-GAC-GAU-G55; (Unlabelled-AS) CAU-CGU-CGA-UCG-UAG-CGC-A55. |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Millex-GP Syringe Filter Unit 0.22 µm | Millipore | SLGP033RS | |
| CELLine AD1000 bioreactor flasks | Wheaton | WCL1000ad | |
| Ultracentrifuge | Beckman Coulter | Optima XPN-80 | |
| Swing-out rotor | Beckman Coulter | SW45 Ti | |
| Fixed-angle rotor | Beckman Coulter | Type 70 Ti | |
| Ultracentrifuge tubes | Beckman Coulter | 355631 | Polycarbonate. Max. fill 32 ml |
| Ultracentrifuge bottles | Beckman Coulter | 355618 | Polycarbonate. Min. fill 16 ml, max. fill 25 ml |
| NanoSight | Malvern | LM10 | Software: NanoSight NTA v3.2 |
| Flow Cytometer | BD Biosciences | FACSCalibur | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5810R | |
| Plate reader | BMG Labtech | FLUOstar Omega | |
| Flow cytometry tubes | BD Biosciences, Falcon | 352052 | |
| Microfuge tubes | Starlab | S1615-5500 | 1.5 ml |
| Cell culture flasks | Fisher Scientific | 156499 | 75 cm2 |
| Transmission electron microscope | FEI Electron Optics | Philips CM 12 | with Tungsten filament and a Veleta - 2k × 2k side-mounted TEM CCD Camera (Olympus, Japan) |
| Amaxa Nucleofector I | Lonza | Nucleofector I | with Amaxa’s Nucleofector Kits |
| 24-well flat-bottom plates | Corning | Costar | |
| Blunt fill needle | BD Biosciences | 305180 | 18G x 1 1/2" (1.2 mm x 40 mm) |
| Glass pipettes | Fisher Scientific | 1156-6963 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | Composition | ||
| Normal medium | Eagle's Minimum Essential Medium supplemented with 10% foetal bovine serum (FBS), 1% penicillin/streptomycin and 1% GlutaMax. | ||
| Exosome-depleted medium | Eagle's Minimum Essential Medium supplemented with 10% exosome-depleted FBS (see below), 1% penicillin/streptomycin and 1% GlutaMax. | ||
| Exosome-depleted FBS | Subject FBS to ultracentrifugation at 100,000 g for 18 h at 4°C. The FBS supernatant post-centrifugation was collected and sterile-filtered using 0.22 µm filters. | ||
| 25% w/w sucrose cushion | Add 1.9 g (± 0.001 g) of sucrose in a universal tube, and top up with D2O until the weight reaches 7.6 g (± 0.001 g). This makes ~6ml of the 25% w/w sucrose cushion. | ||
| 3% FBS/PBS | Add 1.5 ml exosome-depleted FBS to 48.5 ml 1X PBS to prepare 50 ml of 3% FBS/PBS. | ||
| 100 µM BSA solution | Prepare 1mM BSA solution by adding 0.3325 g to 50 ml PBS. Make 1:10 dilution of this stock to obtain 100 µM BSA solution. Make 5-10 µl aliqouts of this 100 µM BSA solution (for single use) and store them at -20°C. All BSA solution should be stored at -20°C, and discard solutions that have undergone ≥2 freeze-thaw cycles. | ||
| 100 mM glycine solution | Add 0.375 g of glycine to 50 ml PBS to obtain 100 mM glycine solution, store at 4°C. | ||
| Citric acid buffer with EDTA | Mix 0.1954 g citric acid and 0.2087 g disodium phosphate in 50 mL of deionised water. Add EDTA to 0.1 mM. Adjust pH to 4.4. | ||
| Fixing solution | Prepare formaldehyde/glutaraldehyde, 2.5% (w/v) each in 0.1 M sodium cacodylate buffer, and adjust pH to 7.4. | ||
| Aqueous uranyl acetate | Prepare 25% (v/v) uranyl acetate in methanol. | ||
| 50% methanol/H2O | Mix methanol and H2O 1:1 (v/v). | ||
| SEC Column packed with Sepharose CL-2B | Dilute 37.5 ml Sepharose CL-2B resin with 12.5 ml PBS to obtain 75% Sepharose CL-2B solution. Pour the Sepharose CL-2B solution into a column of dimension 2.9 cm [H] x 1.3 cm [W]. Pour the Sepharose CL-2B to 3-4 mm above the stated height, and then press it down to the stated height with the filter for optimal packing. |
References
- Zitvogel, L., et al. Eradication of established murine tumors using a novel cell-free vaccine: dendritic cell derived exosomes. Nature Medicine. 4 (5), 594-600 (1998).
- Raffai, R., Li, K., Wong, D., Hong, J. Therapeutic control of systemic inflammation & atherosclerosis with ApoE-polarized macrophage exosomes. Atherosclerosis. , e5-e6 (2017).
- Masamune, A., et al. Exosomes derived from pancreatic cancer cells induce activation and profibrogenic activities in pancreatic stellate cells. Biochemical and Biophysical Research Communications. 495 (1), 71-77 (2018).
- Gangoda, L., et al. Proteomic Profiling of Exosomes Secreted by Breast Cancer Cells with Varying Metastatic Potential. Proteomics. 17 (23-24), 1600370 (2017).
- Wozniak, M., Peczek, L., Czernek, L., Düchler, M. Analysis of the miRNA Profiles of Melanoma Exosomes Derived Under Normoxic and Hypoxic Culture Conditions. Anticancer Research. 37 (12), 6779-6789 (2017).
- Salimu, J., et al. Dominant immunosuppression of dendritic cell function by prostate-cancer-derived exosomes. Journal of Extracellular Vesicles. 6 (1), 1368823 (2017).
- Lankford, K. L., et al. Intravenously delivered mesenchymal stem cell-derived exosomes target M2-type macrophages in the injured spinal cord. PLoS ONE. 13 (1), e0190358 (2018).
- Khalyfa, A., et al. Plasma Exosomes and Improvements in Endothelial Function by Angiotensin 2 Type 1 Receptor or Cyclooxygenase 2 Blockade following Intermittent Hypoxia. Frontiers in Neurology. 8, 709 (2017).
- Manek, R., et al. Protein Biomarkers and Neuroproteomics Characterization of Microvesicles/Exosomes from Human Cerebrospinal Fluid Following Traumatic Brain Injury. Molecular Neurobiology. 55 (7), 6112-6128 (2018).
- Pathare, G., et al. Changes in V-ATPase subunits of human urinary exosomes reflect the renal response to acute acid/alkali loading and the defects in distal renal tubular acidosis. Kidney International. 93 (4), 871-880 (2018).
- Liao, Y., Du, X., Li, J., Lönnerdal, B. Human milk exosomes and their microRNAs survive digestion in vitro and are taken up by human intestinal cells. Molecular nutrition & food research. 61 (11), 1700082 (2017).
- Kim, J., et al. Cyclooxygenase-2 expression is induced by celecoxib treatment in lung cancer cells and is transferred to neighbor cells via exosomes. International Journal of Oncology. 52 (2), 613-620 (2017).
- Sterzenbach, U., et al. Engineered Exosomes as Vehicles for Biologically Active Proteins. Molecular Therapy. 25 (6), 1269-1278 (2018).
- Conigliaro, A., Fontana, S., Raimondo, S., Alessandro, R. Exosomes: Nanocarriers of Biological Messages. In Exosomes in Cardiovascular Diseases. 998, 23-43 (2017).
- El Andaloussi, S., Lakhal, S., Mäger, I., Wood, M. J. A. Exosomes for targeted siRNA delivery across biological barriers. Advanced Drug Delivery Reviews. 65 (3), 391-397 (2013).
- Simhadri, V. R., et al. Dendritic cells release HLA-B-associated transcript-3 positive exosomes to regulate natural killer function. PLoS ONE. 3 (10), e3377 (2008).
- Santos, J. C., et al. Exosome-mediated breast cancer chemoresistance via miR-155 transfer. Scientific Reports. 8 (1), 829-829 (2018).
- Hadla, M., et al. Exosomes increase the therapeutic index of doxorubicin in breast and ovarian cancer mouse models. Nanomedicine. 11 (18), 2431-2441 (2016).
- Smyth, T., et al. Biodistribution and delivery efficiency of unmodified tumor-derived exosomes. Journal of Controlled Release. 199, 145-155 (2015).
- Tian, Y., et al. A doxorubicin delivery platform using engineered natural membrane vesicle exosomes for targeted tumor therapy. Biomaterials. 35 (7), 2383-2390 (2014).
- Kim, M. S., et al. Engineering macrophage-derived exosomes for targeted paclitaxel delivery to pulmonary metastases: in vitro and in vivo evaluations. Nanomedicine: Nanotechnology, Biology and Medicine. 14 (1), 195-204 (2018).
- Bellavia, D., et al. Interleukin 3- receptor targeted exosomes inhibit in vitro and in vivo Chronic Myelogenous Leukemia cell growth. Theranostics. 7 (5), 1333-1345 (2017).
- Sun, D., et al. A novel nanoparticle drug delivery system: The anti-inflammatory activity of curcumin is enhanced when encapsulated in exosomes. Molecular Therapy. 18 (9), 1606-1614 (2010).
- Tian, T., et al. Surface functionalized exosomes as targeted drug delivery vehicles for cerebral ischemia therapy. Biomaterials. 150, 137-149 (2017).
- Zhuang, X., et al. Treatment of brain inflammatory diseases by delivering exosome encapsulated anti-inflammatory drugs from the nasal region to the brain. Molecular Therapy. 19 (10), 1769-1779 (2011).
- Iessi, E., et al. Acridine Orange/exosomes increase the delivery and the effectiveness of Acridine Orange in human melanoma cells: A new prototype for theranostics of tumors. Journal of Enzyme Inhibition and Medicinal Chemistry. 32 (1), 648-657 (2017).
- Aqil, F., et al. Exosomal delivery of berry anthocyanidins for the management of ovarian cancer. Food & Function. 8 (11), 4100-4107 (2017).
- Shtam, T. A., et al. Exosomes are natural carriers of exogenous siRNA to human cells in vitro. Cell Communication and Signaling. 11 (1), 1-10 (2013).
- Wahlgren, J., et al. Plasma exosomes can deliver exogenous short interfering RNA to monocytes and lymphocytes. Nucleic Acids Research. 40 (17), e130-e130 (2012).
- Yang, J., Zhang, X., Chen, X., Wang, L., Yang, G. Exosome Mediated Delivery of miR-124 Promotes Neurogenesis after Ischemia. Molecular Therapy - Nucleic Acids. 7, 278-287 (2017).
- Alvarez-Erviti, L., et al. Delivery of siRNA to the mouse brain by systemic injection of targeted exosomes. Nature Biotechnology. 29 (4), 341-345 (2011).
- Wiklander, O. P. B., et al. Extracellular vesicle in vivo biodistribution is determined by cell source, route of administration and targeting. Journal of Extracellular Vesicles. 4 (1), 1-13 (2015).
- Varga, Z., et al. Radiolabeling of Extracellular Vesicles with 99m Tc for Quantitative In Vivo Imaging Studies. Cancer Biotherapy and Radiopharmaceuticals. 31 (5), 168-173 (2016).
- Smyth, T. J., Redzic, J. S., Graner, M. W., Anchordoquy, T. J. Examination of the specificity of tumor cell derived exosomes with tumor cells in vitro. Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Biomembranes. 1838 (11), 2954-2965 (2014).
- Boing, A. N., et al. Single-step isolation of extracellular vesicles by size-exclusion chromatography. Journal of Extracellular Vesicles. 3, 23430 (2014).
- Sharma, P., et al. Immunoaffinity-based isolation of melanoma cell-derived exosomes from plasma of patients with melanoma. Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1435138 (2018).
- Clayton, A., et al. Analysis of antigen presenting cell derived exosomes, based on immuno-magnetic isolation and flow cytometry. Journal of Immunological Methods. 247 (1), 163-174 (2001).
- Taylor, D. D., Zacharias, W., Gercel-Taylor, C. Exosome Isolation for Proteomic Analyses and RNA Profiling. In Serum/Plasma Proteomics: Methods and Protocols. , 235-246 (2011).
- Alvarez, M. L., Khosroheidari, M., Kanchi Ravi, R., DiStefano, J. K. Comparison of protein, microRNA, and mRNA yields using different methods of urinary exosome isolation for the discovery of kidney disease biomarkers. Kidney International. 82 (9), 1024-1032 (2012).
- Mitchell, J. P., Mason, M. D., Tabi, Z., Clayton, A. Increased exosome production from tumour cell cultures using the Integra CELLine Culture System. Journal of Immunological Methods. 335 (1-2), 98-105 (2008).
- Webber, J., Clayton, A. How pure are your vesicles? Journal of Extracellular Vesicles. 2 (1), 1-6 (2013).
- Chiou, N. -T., Ansel, K. M. Improved exosome isolation by sucrose gradient fractionation of ultracentrifuged crude exosome pellets. Nature Protocol Exchange. , (2016).
