Summary
L’exosome est une nouvelle génération d’entreprises de livraison de drogue. Nous avons établi un protocole d’isolement exosome avec rendement élevé et la pureté pour la livraison de siARN. Nous aussi encapsulés fluorescent étiqueté siARN non spécifique dans des exosomes et enquêté sur l’assimilation des exosomes chargé de siARN dans les cellules cancéreuses.
Abstract
Les vésicules extracellulaires, en particulier exosomes, ont récemment gagné l’intérêt comme nouveau médicament vecteurs de livraison en raison de leur origine biologique, l’abondance et la capacité intrinsèque dans livraison intercellulaire de diverses biomolécules. Cet ouvrage établit un protocole d’isolement pour atteindre un rendement élevé et haute pureté des exosomes d’ARNsi. Les cellules embryonnaires de rein humaines (cellules HEK-293) sont cultivées dans des flacons de bioréacteur et le surnageant de culture (ci-après dénommé milieu conditionné) est récolté sur une base hebdomadaire pour permettre l’enrichissement des exosomes HEK-293. Le milieu conditionné (CM) est l’objet d’une autorisation préalable des cellules mortes et les débris cellulaires par centrifugation différentielle et est soumis à l’ultracentrifugation sur un coussin de saccharose suivie d’une étape de lavage, pour recueillir les exosomes. Isolé des exosomes HEK-293 se caractérisent pour l’expression de marqueur de rendement, de morphologie et d’exosomal par analyse de suivi de nanoparticules, quantification des protéines, microscopie électronique et cytométrie en flux, respectivement. Petits ARN interférents (siARN), fluorescent marqué avec Atto655, est chargé dans les exosomes par électroporation et siRNA excès est éliminé par filtration sur gel. Apport des cellules dans les cellules cancéreuses de PANC-1, après 24 h d’incubation à 37 ° C, est confirmée par cytométrie en flux. HEK-293 exosomes sont 107,0 ± 8,2 nm de diamètre. L’exosome rendement et particules-à-protéine (Taekvando) rapport sont de 6,99 ± 0,22 × 1012 particules/mL et 8,3 ± 1,7 × 1010 particules/µg, respectivement. L’efficacité de l’encapsulation des siARN dans les exosomes est ~ 10 à 20 %. Quarante pour cent des cellules montrent des signaux positifs pour Atto655 après 24 h d’incubation après. En conclusion, exosome isolement par ultracentrifugation sur coussin de saccharose offre une combinaison de bons rendements et la pureté. siARN pouvaient être correctement chargé dans les exosomes par électroporation et envoyées par la suite dans les cellules cancéreuses in vitro. Ce protocole propose une procédure standard pour développer les exosomes siARN chargés pour une prestation efficace de cellules cancéreuses.
Introduction
Exosomes sont un sous-type de vésicules extracellulaires (EV) allant de 50 à 200 nm de diamètre, sécrétée par divers types de cellules comme les cellules immunitaires1,2,3,4,5, les cellules cancéreuses 6 et cellules souches7. Exosomes montrent également d’être présents dans divers liquides physiologiques8,9,10,11. La combinaison de la capacité intrinsèque des exosomes pour transporter diverses biomolécules (p. ex., RNA et protéines)12,13,14 et la prestation efficace de ces biomolécules dans les cellules réceptrices 15 , 16 , 17 attiré l’intérêt pour leur potentiel comme vecteurs de livraison de drogue-l’échelle du nanomètre. Diverses petites molécules qui servent de médicaments anticancéreux et anti-inflammatoires ont été démontrés pour être correctement chargés dans les exosomes et livrés à la cible les cellules18,19,20, 21 , 22 , 23 , 24 , 25 , 26 , 27. fait intéressant, les acides nucléiques tels que les siARN28,29 et microARN30 ont été correctement chargés dans les exosomes par électroporation et livrés aux cellules cibles.
Récemment, RNA interférence (ARNi) par petits ARN interférents (siARN) a gagné plus d’intérêt comme le mécanisme privilégié de silençage génique en raison de sa haute spécificité, effet puissant, des effets secondaires minimes et de siARN synthèse28, 29. siARN est des molécules d’ARN double-brin allant de 19 à 25 nucléotides de long cette précipitation d’ARNm catalytique déclencheurs séquence-spécifique. En raison de son poids moléculaire élevé et de la nature polyanioniques, absorption passive de nu siARN dans les cellules est empêchée28,29. Il n’est également pas possible de siARN nue être injecté dans la circulation systémique due à la dégradation rapide de plasma nucléases31. Ainsi, l’encapsulation des siARN dans nanocarrier faciliterait la prestation efficace et l’adoption des siARN dans les cellules cibles.
Exosomes sont un système idéal pour l’encapsulation de siARN car sa structure est composée d’un noyau creux, aqueux, enveloppé par une double couche phospholipidique. Exosomes non seulement ont la bonne stabilité dans le sang, mais ont également des propriétés naturelles de ciblage de livraison RNA fonctionnel aux cellules32. L’étude menée avec succès par Alvarez-Erviti et coll. ont démontré une prestation efficace des siARN sur le cerveau de souris à l’aide d’ingénierie exosomes avec pratiquement aucune complications31. Il est possible que la thérapie axée sur l’exosome est relativement plus sûre que d’autres thérapies comme les exosomes ne répliquent pas endogène comme cellules et par conséquent ne présentent pas de propriétés métastatique15.
Diverses méthodes ont été signalés à isoler avec succès les exosomes de culture de cellules ou des liquides physiologiques. La méthode la plus populaire utilise ultracentrifugation pour granuler exosomes depuis le départ de matériel31,32,33. Cette méthode peut être très sévère sur les exosomes et habituellement des précipités co protéines de l’échantillon. Combinant l’ultracentrifugation avec une séparation basée sur la densité comme les gradients de sucrose devient plus fréquent, à réduire la contamination protéique et non-exosomal dans les exosomes isolé19,34. Chromatographie d’exclusion stérique (SEC) permet la séparation des exosomes des autres types de vésicules extracellulaires (EV) selon la taille et peut également entraîner une contamination de protéine minime mais est limitée par la faible quantité de matière qu’il peut traiter35, première 36. Capture d’immunoaffinité utilise perles recouvertes d’anticorps qui se lient à des protéines de surface d’exosomal comme tetraspanins ou autre marqueur spécifique des cellules qui permet de capture spécifiques des exosomes plutôt que des véhicules électriques ou d’autres protéines, en plus d’isoler la sous-population de exosomes des échantillons entiers, mais est encore limitée par la quantité de matière première et est coûteux36,37. Base de polymères de précipitation des exosomes utilisé pour être populaire aussi, mais puisque c’est une précipitation assez sommaire, elle conduit à un supérieur non-exosomal vésicule et protéine contamination38,39.
Électroporation a été signalée pour son inefficacité en tant que méthode pour charger les exosomes avec siARN due à l’agrégation de protéines15,28,31. Approches axées sur la transfection ont démontré que le chargement mieux efficacité et stabilité des protéines, mais il n’est pas souhaitable en raison de sa toxicité et les effets secondaires des agents de transfection dans l’altération de gènes cellulaires expression28. Ainsi, électroporation a été plus largement utilisée en siARN chargeant dans exosomes comme c’est une méthode plus sûre. Toutefois, une méthode d’encapsulation optimisé doit être établi afin de fournir des quantités suffisantes d’ARNsi vers le site cible pour un knockdown gène puissant.
Ici, nous vous proposons un protocole d’isolement exosome aide axée sur la densité ultracentrifugation sur juste un coussin de saccharose 25 % (p/p) unique préparé dans l’oxyde de deutérium, plutôt qu’un gradient de densité de saccharose. Il s’agit d’une méthode peu coûteuse qui contourne la préparation de gradient de densité laborieux et permet de traiter de grandes quantités de matériel de départ, mais se traduit par les exosomes intact de rendement élevé et une pureté appropriée pour chargement ultérieur avec siARN. Fluorescent Atto655 conjugué non-spécifiques siARN a été chargé dans le rein embryonnaire humain (cellules HEK-293) dérivés exosomes par électroporation et livrés aux cellules cancéreuses humaines adénocarcinome pancréatique (PANC-1) in vitro.
Protocol
1. cellules de Culture dans une fiole de bioréacteur
Figure 1 : Culture de cellules en fiole de bioréacteur pour la production de l’exosome. (A) simplifié l’anatomie de la fiole de bioréacteur. (B) départ culture placé dans le bioréacteur. Voir Table des matières pour la composition des normal et appauvri exosome moyen (C) récolte conditionnée moyen (CM) et l’entretien de la culture dans la fiole de bioréacteur. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
- La culture de cellules HEK-293 dans un milieu normal (voir Table des matières ; 5 % CO2, 37 ° C) et développer en 4 flacons de x T75 (jusqu’au confluent de 90 %).
- Mouiller la membrane de la fiole de bioréacteur en ajoutant 50 à 100 mL de milieu normal dans le réservoir moyen de la fiole de bioréacteur.
- Collecter toutes les cellules HEK-293 du 4 x T75 et remettre dans 15 mL de milieu appauvri en exosome (voir Table des matières).
- Ajouter la suspension de cellules HEK-293 dans le compartiment de la cellule de la fiole de bioréacteur à l’aide d’une seringue de 20 mL reliée à un remplissage brutal d’aiguille (voir Table des matières), avec soin afin d’enlever toute bulle qui peut-être avoir formé.
- Remplir le réservoir moyen de la fiole de bioréacteur avec un milieu normal aux 500 mL et de garder le ballon dans l’incubateur (5 % de CO2, 37 ° C) pendant une semaine.
2. conditionnée moyen (CM) récolte du flacon de bioréacteur
- Après 1 semaine, jetez tout le milieu du réservoir moyen de la fiole de bioréacteur.
- Enlever tout le milieu dans le compartiment de la cellule (c'est-à-dire, le CM) à l’aide d’une seringue de 20 mL relié à une aiguille émoussée de remplissage.
- Ajouter 50-100 mL de milieu normal vers le réservoir moyen.
- Ajouter 15 mL de milieu appauvri en exosome dans le compartiment de la cellule en retrait du support ancien et en ajoutant des frais moyen exosome appauvri à l’aide d’une seringue de 20 mL reliée à une aiguille émoussée remplissage.
- Remplir le réservoir moyen de la fiole de bioréacteur avec un milieu normal aux 500 mL et de garder le ballon dans l’incubateur (5 % de CO2, 37 ° C) pour une autre semaine.
Remarque : La culture peut se poursuivre pendant plus d’un an. Pour l’étape 2.2, la CM de la première récolte ne servira pas pour l’isolement de l’exosome et est ignoré. Pour la 2ème et récolte ultérieure, le CM est maintenue pour l’isolement de l’exosome.
3. Exosome isolement sur un coussin de saccharose
Figure 2 : isolement et caractérisation des exosomes. (A) pré-défrichage récolté milieu conditionné (CM) de cellules mortes et les débris cellulaires. (B) isoler les exosomes de CM sur coussin de saccharose. (C) lavage pour éliminer les protéines contaminantes et saccharose. (D) les exosomes isolé a ensuite soumis à une caractérisation physico-chimiques, biochimique et morphologique. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
- Avance le CM (de l’étape 2.2) par centrifugation différentielle et filtration comme suit.
- Centrifuger à 500 x g pendant 5 min à 4 ° C. Transvaser le surnageant dans un nouveau tube et jeter le culot. Répéter une fois de plus, cette étape de centrifugation à récupérer le surnageant et jeter le culot.
- Centrifuger le surnageant de l’étape 3.1.1 à 2 000 g pendant 15 min et 4 ° C et ensuite éliminer pellet. Filtrer une fois surnageante récupérée sur 0,22 µm filtres.
- Au cours de la clairière avant, préparer solution de saccharose (w/w) de 25 % dans l’oxyde de deutérium de peser avec précision les 1,9 g (± 0,001 g) de saccharose dans un tube universel et ensuite recharger avec l’oxyde de deutérium jusqu'à ce que le poids atteint 7,6 g (± 0,001 g).
- Remplissez une ultracentrifugeuse tube (voir Table des matières) 22,5 ml de préapprouvés cm composent le CM à 22,5 mL avec 0,22 µm filtré PBS si le volume est inférieur à celui.
- Place un verre (voir Table des matières), déposer dans le tube et, à travers elle, ajouter 3 mL d’une solution de saccharose afin que la solution forme une couche distincte sous la CM.
- Soigneusement en place le tube contenant couches solution CM/saccharose dans le seau d’un rotor à balancier (voir Table des matières) et fixer le seau dans le rotor.
- Placer le rotor dans l’ultra-centrifugeuse (voir Table des matières) et un essorage à 100 000 x g pendant 1,5 h à 4 ° C.
- Recueillir 2 mL de la couche de saccharose et l’ajoute à une bouteille d’ultracentrifugeuse (voir Table des matières) contenant 20 mL de filtré PBS pour une étape de lavage.
- Placer les tubes dans un rotor à angle fixe (voir Table des matières) et un essorage à 100 000 x g pendant 1,5 h à 4 ° C.
- Avec précaution, retirez le surnageant avec une pipette sérologique de 10 mL et Resuspendre le culot avec 400 µL filtré PBS. Gardez ce stock exosome à 4 ° C ou à-80 ° C pour le stockage à court terme et à long terme respectivement.
4. caractérisation de l’Exosome taille et rendement de nanoparticules suivi d’analyse (NTA)
- Faire 1:1, 000-1:50, 000 dilutions du stock exosome en volume de 1 mL (minimum 750 µL) afin d’obtenir des particules de 20-80 dans le cadre de Regarde un de la LTN instrument d’affichage (voir Table des matières).
- Injecter le stock de l’exosome dilué dans le compartiment de mesure instrument NTA à l’aide d’une seringue de 1 mL et insérez la sonde de température d’un thermomètre dans l’entrée de sonde de température.
- Configurez le logiciel de la LNT (voir Table des matières) pour l’enregistrement comme suit : 3 mesures standards, 30 s chacune, option manuelle de la température non contrôlée ; et entrez le facteur de dilution sous l’onglet avancé .
- Réglez le niveau de la caméra sur 13 et exécutez le script de capture sur le logiciel NTA, injectant un nouveau lot d’échantillon et en entrant la température de la chambre de mesure lorsque vous y êtes invité après chaque lecture.
- Définissez le seuil sur 4 pour la partie de l’analyse ultérieure et notez la taille moyenne des modaux et particulaire du stock exosomes des mesures.
5. caractérisation de l’Exosome pureté de particules : protéine Ratio détermination
- Mesure de la teneur en protéines du stock exosome par un dosage de protéines (BCA) acid bicinchoninic kit (voir Table des matières) comme suit.
- Préparer les normes définies.
- Préparer le standard de la concentration la plus élevée (500 µg/mL) en ajoutant des 45 µL de la solution mère de BSA (2 mg/mL – fourni dans le kit de test) à un tube de microcentrifuge et font jusqu'à 180 µL avec du PBS.
- Remplir 8 tubes de microcentrifuge de 90 µL de PBS.
- Faire des dilutions successives (facteur : 0,5) en prenant 90 µL de la BSA plus haute standard et en ajoutant ceci dans la microcentrifugeuse 1st tube avec du PBS (bien mélanger), puis prendre 90 µL dans ce tube et en l’ajoutant dans le tube de microcentrifuge 2nd .
- Répétez cette procédure jusqu'à ce que le tube de microcentrifuge 7e. Le tube 8 sera juste PBS (c.-à-d., l’essai à blanc : 0 µg/mL).
- Préparer les échantillons de l’exosome grâce à la dilution de 1 / 2 des échantillons avec PBS dans un volume total de 90 µL (45 µL de l’échantillon, 45 µL de PBS).
- Préparer le BCA mélange réactif de travail.
- Calcule le volume total de BCA travail mélange réactif nécessaire (50 µL / puits, en double, y compris les normes).
- Mélanger les réactifs BCA individuels selon le ratio suivant : 25 pièces A: 24 pièces réactif b : 1 partie réactif C.
- Effectuer l’essai et l’analyse.
- Ajouter 40 µL de chaque échantillon standard et exosome préparé ci-dessus dans un puits d’une plaque de 96 puits (en double pour chaque étalon et l’échantillon).
Remarque : Puisqu’il s’agit d’un dosage colorimétrique, la technique appropriée de pipetage est cruciale pour obtenir des résultats précis. Pipettes de changement après avoir ajouté chaque réplicat norme/échantillon dans chacun des puits - Ajouter 50 µL de l’analyse de la protéine mélange réactif de travail dans chaque puits et incuber les plaques à 37 ° C pendant 30 min.
Remarque : Afin de minimiser les écarts entre les répétitions, ajouter le réactif de travail de dosage de protéines dans la réplique de 1st d’un norme/échantillon, suivie de la 2ème reprend le même échantillon/standard, avant de l’ajouter à la 1st reproduire un autre échantillon/norme. - Mesurer l’absorbance à 562 nm sur le lecteur (voir la Table des matières).
- Tracer une courbe d’étalonnage des valeurs d’absorbance des normes et travailler sur la concentration de protéines dans chaque échantillon à l’aide de l’équation de la courbe.
- Ajouter 40 µL de chaque échantillon standard et exosome préparé ci-dessus dans un puits d’une plaque de 96 puits (en double pour chaque étalon et l’échantillon).
- Préparer les normes définies.
- Calculer le ratio de la particule : protéine en divisant le rendement de l’exosome obtenu précédemment avec le taux protéique de l’exosome stock mesuré au-dessus.
6. caractérisation des marqueur Exosomal Expression par cytométrie en flux
- Incuber 40 µL d’exosomes (≥1x1011 particules/mL) avec 10 µL de billes de latex aldéhyde/sulfate (non dilué sur stock) pendant 15 min à température ambiante (RT).
- Ajouter 5 µL de la solution de BSA 100 µM (voir Table des matières) pour le mélange de l’exosome-perle pour obtenir une concentration finale de 10 mM et incuber pendant 15 min à température ambiante.
- Ajouter 1 mL de PBS et incuber pendant 75 min à ta dans un tube de microcentrifuge avec agitation légère sur un agitateur basculant (~ 150 tr/min).
- Centrifuger la suspension à 580 x g pendant 5 min à RT et éliminer le surnageant.
- Resuspendre le culot avec 1 mL de solution de glycine 100 mM (voir Table des matières) et incuber 30 min à température ambiante.
- Centrifuger la suspension pendant 5 min à 580 x g. jeter le surnageant et Resuspendre le culot avec 1 mL de 3 % FBS/PBS (voir Table des matières).
- Répétez cette étape de lavage et de resuspendre le culot dans 350µl de 3 % FBS/PBS.
- Diviser la suspension en 7 tubes, chacun contenant 50 µL de la suspension et les incuber avec un fluorophore conjugué anti-CD81, anticorps anti-CD9 et anti-CD63 et leurs contrôles d’isotype correspondants (01:10 dilution), respectivement, pendant 45 min à 4 ° C. Garder 1 des tubes comme un contrôle non colorée mais subissant le même traitement.
- Ajouter 1 mL de 3 % FBS/PBS à chaque tube, centrifuger pendant 5 min à x 580 g et éliminer le surnageant.
- Resuspendre le culot avec 200-400 µL de 3 % FBS/PBS et d’analyser l’échantillon sur le cytomètre en flux (voir Table des matières) dans les voies appropriées.
7. caractérisation de la morphologie Exosome par microscopie électronique à Transmission (TEM)
- Difficulté exosome dispersions aqueuses à des concentrations appropriées telles que 1010 p/mL en solution de fixation (voir Table des matières) pendant 15 min.
- Place les échantillons sur 300 mesh carbone enduit grilles de cuivre et de laisser à l’air sec.
- Détachant négativement les échantillons avec 0.22 acétate d’uranyle aqueux filtré µm (voir Table des matières) pendant 4 min, suivie de deux 50 % méthanol/H2O laver (voir Table des matières).
- Sécher l’échantillon à l’air.
- Observer les échantillons sous TEM (voir Table des matières). La valeur de la tension d’accélération à 80 kV et la taille du spot à 2. Utilise aperture objectif avec tous les échantillons.
8. siRNA Encapsulation dans les Exosomes par électroporation
- Refroidir avant la cuvette d’électroporation (voir Table des matières) sur la glace pendant 30 min avant l’électroporation.
- Mix 7.0 µg d’exosomes (32 µL de 7 x 1012 stock de p/mL dans du PBS) à 0,33 µg de siARN (12 µL de 2 stock µM dans l’eau sans RNase) dans le tube de microcentrifuge. Compléter le volume à 150 µL de tampon de l’acide citrique (voir Table des matières). L’exosome siARN ratio molaire est 1/60 en l’espèce.
- Transvaser le mélange dans la cuve d’électroporation. Cap de la cupule et placez-le dans le support de cuvette de l’électroporateur (voir la Table des matières). Faire tourner la roue de rotation 180° vers la droite.
Remarque : La roue doit tourner à fond vers la position verrouillée, afin que la cuvette contacter les électrodes. - Sélectionnez le programme désiré électroporation (p. ex., X-01, X-05, A-20, T-20, T-30, etc.) et commencez l’électroporation en appuyant sur le bouton Démarrer .
Remarque : Une impulsion de succès est représentée par « OK » sur l’écran. - Une fois l’électroporation, retirer la cuvette après le retour en arrière la roue 180° en sens anti-horaire. Retirer l’échantillon de la cuvette avec la pipette en plastique pour un traitement ultérieur.
9. enlèvement des siARN libre utilisant chromatographie d’Exclusion (s)
- Équilibrer la colonne SEC ([H] à 2,9 cm x 1,3 cm [W] ; Voir Table des matières) en passant de 3,5 mL de PBS filtrée deux fois.
- Dissoudre 150 μL d’échantillon d’électroporation dans 350 μL de PBS filtrée et cela transvaser dans la colonne de SEC pour effectuer l’enlèvement gratuit de siARN.
- Recueillir la première fraction de 500 μL éluée de la colonne (F0).
- Ajouter 500 μl de PBS filtrée à la colonne et recueillir la fraction suivante de 500 μL (F1).
- Répétez l’étape précédente jusqu'à ce qu’un total de fractions de 10 x 500 μL (jusqu'à F9) est collecté. F1 et F2 devraient contenir les exosomes siARN encapsulé.
- Laver la colonne avec PBS filtrée (deux fois, au moins) pour éliminer les résidus de n’importe quel échantillon.
10. in Vitro l’absorption des Exosomes chargé de siARN dans les cellules PANC-1
- Les cellules PANC-1 graine en plaques 24 puits à fond plat (voir Table des matières) à une densité de 50 000 cellules par bien 24h avant l’absorption étudient et incuber les cellules dans un incubateur (5 % de CO2, 37 ° C).
- Electroporate HEK-293 exosomes (7,0 μg) avec Atto655-siARN (0,33 μg) selon les directives de l’étape 8.
- Purifier l’électroporation exosome selon l’étape 9 et remettre en suspension dans 100 μl de PBS.
- Ajouter 50 μL de l’électroporation exosomes à PANC-1 cellule et incuber à 37 ° C et 5 % de CO2 pendant 4 h.
- Prélever des cellules après incubation.
- Laver les cellules avec 1 mL de PBS stérile et remettre en suspension dans 200 μl de PBS en polystyrène fond rond tube (voir Table des matières).
- Analyser les cellules par cytomètre de flux (voir Table des matières) avec 10 000 événements acquis par échantillon.
NOTE : ONU-électroporation exosome-siARN échantillons de mélange et des cellules non traitées avec du PBS filtrée ont été utilisés comme témoins.
Representative Results
La caractérisation physico-chimique des exosomes isolés des cellules HEK-293 (Exo HEK-293) sont résumées dans le tableau 1. La taille mesurée en utilisant des nanoparticules suivi d’instrument d’analyse (NTA) était 107,0 ± 8,2 nm. Exosome rendement des cellules HEK-293, également analysées à l’aide de l’instrument NTA, était 6.99 ± 0,22 x 1012 p/mL de mL ~ 24 cm (obtenu à partir de 2 tours de récolte). Pureté de l’Exo HEK-293 évalué en calculant le rapport entre la particule-à-protéine (Taekvando) était de 8,3 ± 1,7 × 1010 p/µg.
La distribution granulométrique des isolés HEK-293 Exo est illustrée à la Figure 3 a. Analyse morphologique à l’aide de la microscopie électronique à transmission (TEM) a montré l’Exo HEK-293 étaient des structures sphériques légèrement supérieur à 100 nm en taille (Figure 3 b). Ce résultat est conforme à celle de mesure NTA (Figure 3 a). L’Exo HEK-293 isolés étaient positifs pour CD81, CD9 et CD63, qui sont des marqueurs canoniques utilisées pour identifier des vésicules comme exosomes (Figure 3).
Pour la purification des exosomes utilisant la chromatographie d’exclusion (Figure 4), le pourcentage de récupération des exosomes a été calculé en divisant le nombre de particules totales exosome récupéré dans les 10 fractions collectées (F0-F9) avec l’exosome initiale nombre de particules utilisé, tandis que le pourcentage de récupération de siARN a été calculé en divisant l’intensité de fluorescence total obtenue de F3, F4 et F5 avec l’intensité de fluorescence total provenant de toutes les 10 fractions collectées. La récupération de l’exosome et siRNA après la purification a été calculée comme 75,0 % et 80,4 %, respectivement. L’efficacité de l’encapsulation des siARN dans les exosomes était environ 10 à 20 %, calculée à l’aide de la courbe d’étalonnage siARN établie (Figure 4).
Analyse qualitative des in vitro l’absorption des exosomes chargé avec des Atto655-siARN fluorescent par cytométrie en flux a montré que cellules PANC-1 traitées avec siARN encapsulé exosomes a enregistré le plus grand changement dans le signal de fluorescence (Figure 5 a) . Cellules PANC-1 traitées avec siARN encapsulé exosomes enregistrement un pourcentage plus élevé de population positive pour le Atto655 signal (39,4 %), comparé à que traités avec déchargé exosomes et siRNA mélange (0,56 %), qui corrobore l’observation ci-dessus ( Figure 5 b). Le degré d’assimilation de siARN (exprimé comme la différence de pli en valeurs d’intensité (IFM) de fluorescence moyenne de celle des cellules non traitées) a été observé aussi à être significativement plus élevée dans les cellules PANC-1 traitées avec les exosomes siARN encapsulé (pli IFM différence = 5.1) par rapport à ceux traités avec le mélange de l’exosome-siARN (IFM plier différence = 1.1) (Figure 5). Ces observations démontrent que les exosomes encapsulé siARN étaient internalisés par les cellules PANC-1 et qu’ils livrés efficacement des siARN dans les cellules.
Figure 3 : biochimiques et l’analyse de la morphologie des exosomes HEK-293. (A) taille répartition des exosomes HEK-293 en utilisant des nanoparticules Tracking Analysis (NTA). La courbe montre un histogramme superposé de 3 différents capture intervalles de 30 s avec des zones rouges indiquant l’écart entre les mesures (n = 3). (B) des images de microscopie électronique à Transmission (TEM) de la naïve exosomes HEK-293. Echelle : 100 nm. (C) détection de marqueurs exosomal CD81, CD9 et CD63 utilisant l’écoulement cytometry sur exosomes HEK-293. Exosomes sont couplés aux billes de latex aldéhyde/sulfate avant la détection. Complexe de l’exosome-perles ont été par la suite colorées avec des anticorps anti-CD81, anti-CD9 et anti-CD63 conjugué à un fluorophore. Degré d’expression des marqueurs sont exprimé comme la différence de pli en valeurs d’intensité (IFM) de fluorescence médian de celle du contrôle (le complexe exosome-perles coloré avec l’isotype correspondante). Les valeurs sont exprimées en moyenne ± écart-type, où n = 3. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 4 : Exosome purification post-électroporation. (A) les profils d’élution (F0-F9) de Atto655-siARN et électroporation exosomes utilisant taille exclusion chormatography. (B) NTA analyse des Atto655-siRNA et exosome de F0 à F9 à l’aide de taille exclusion chormatography. Courbe (C), l’étalonnage de Atto655 étiqueté siRNA. Intensités de fluorescence ont été obtenues par lecteur Ex / Em : 640-10/680 nm ; Gain de 2800. Les valeurs sont exprimées en moyenne ± écart-type (n = 3). S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 5 : assimilation des exosomes encapsulé siARN dans les cellules PANC-1 à 4 h. Histogrammes (A) en comparant la capture cellulaire de déchargée d’exosomes + mélange de siARN et encapsulé siARN exosomes. (B) la comparaison de la capture de déchargée d’exosomes + mélange de siARN à 4 h par parcelle Pseudo-couleur. (C) la différence de pli en moyenne intensité (MFI) valeurs de fluorescence des échantillons testés par rapport à celle des cellules non traitées. Les valeurs sont exprimées en moyenne ± écart-type, où n = 3. P < 0,001. NS : non significatif. ANOVA à a été utilisé pour l’analyse statistique. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
| Exosome | Taille1, 2 (nm) |
Rendement1,2,3 (p/mL) |
[Protéine] 2, 4 (µg/mL) |
Particule-à-protéine (Taekvando) rapport /5 (p/µg) |
| HEK-293 | 107,0 ± 8,2 | 6.99 ± 0,22 x 1012 | 84.3 ± 9,8 | 8,3 ± 1,7 x 1010 |
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1 mesuré à l’aide de nanoparticules suivi d’analyse (instrument NTA) 2 les valeurs sont exprimées en moyenne ± écart-type, où n = 3 3 rendement a été obtenu par milieu conditionné par cellules regroupé à partir de 2 tours de la récolte de flacons de bioréacteur (~ 24 mL) 4 mesuré à l’aide d’un kit de dosage des protéines 5 valeur obtenue à l’aide de la formule : Taekvando ratio = rendement / [protéine] |
||||
Tableau 1 : Caractérisation physico-chimique des exosomes.
Discussion
Obtenir un rendement décent exosomes des cellules cultivées, qui suffisent pour plusieurs séances d’études in vitro ou in vivo , est toujours un défi. Selon le fabricant, les fioles de bioréacteur étaient destinés à la production d’anticorps et de protéines à haut rendement de la culture de diverses lignées cellulaires immortalisées. Ceci permet aux cellules d’enrichir en permanence le milieu de culture avec le produit désiré, résultant en un milieu concentré conditionné (CM) dans le compartiment de la cellule. Théoriquement, le même concept serait bénéfique dans l’exosome production de diverses lignées cellulaires, et cultivant en effet ces cellules dans les fioles de bioréacteur a été démontrée pour augmenter sensiblement l’exosome rendement40. Le grand réservoir moyen continuellement fournit des nutriments à et élimine les déchets du compartiment de la cellule à travers une membrane semi-perméable 10 kDa, permettant la culture prolongée sans nécessiter une grande quantité de moyen d’être en contact avec les cellules, ou ordinaire flacons, changeant, qui peuvent sauver en fin de compte le coût global et le travail de grande échelle exosome production40. On a également démontré que la morphologie, de phénotype, mais aussi les fonctions immunomodulatrices des exosomes isolement des cellules, cultures de flacons de bioréacteur à long terme sont similaires à celles provenant de cellules cultivées en régulier 75 cm2 flacons40. La culture des autres lignées cellulaires immortalisées comme sources de l’exosome dans la fiole de bioréacteur aiderait donc augmenter leur rendement exosome tout en conservant leur intégrité et leur fonction. Cette forme de culture est toutefois pas applicable aux cellules primaires avec des cycles de division limitée et ceux qui ne peuvent pas être cultivées en haute densité.
Étant donné que la récolte de la CM est fait chaque semaine, et les cellules en culture ont été repiquées jamais, on peut supposer que les cellules dans la fiole de bioréacteur ne grandissent pas dans une monocouche comme la culture de cellules régulières. Ils sont plus susceptibles de former des grappes avec des centres nécrotiques, ou simplement détacher de la surface et meurent quand les cellules sont trop confluentes pour une monocouche. Inspection visuelle du compartiment cellulaire de la fiole de bioréacteur n’est pas possible de confirmer cette hypothèse, mais se traduite par le grand nombre de cellules mortes obtenues au cours de la récolte de CM. Éloignement régulier des cellules mal adhérentes et non viables de la fiole de bioréacteur peut prévenir l’accumulation de matériaux sur la membrane semi-perméable qui peuvent nuire à l’échange de gaz, de nutriments et de déchets entre le compartiment de la cellule et le milieu réservoir, permettant ainsi une culture prolongée dans les fioles de bioréacteur pour > 6 mois40. Dans ce contexte, cette non-régularité de la croissance cellulaire dans les fioles de bioréacteur est idéale car nous croyons qu’elle imite l’état réel de la croissance tumorale in vivo plus étroitement que la culture cellulaire monocouche conventionnel, et il est à espérer que les exosomes produites par le cancer des cellules dans la fiole de bioréacteur serait plus semblables à celle sécrétée par les tumeurs in vivo. Cela serait particulièrement utile dans les études sur le rôle des exosomes dérivées de tumeurs dans la progression de la pathologie tumorale. Les exosomes dérivées de tumeurs ont été signalés à intrinsèquement et préférentiellement abritent leur tissu d’origine32, donc avoir des exosomes produite par un système imitant leur en vivo production serait également souhaitable dans les études en regardant Explorer la capacité de ciblage passive des exosomes comme médicament nanocarriers.
Le ratio de Taekvando a été rapporté en tant que paramètre pour évaluer la pureté des exosomes isolés de contaminer des protéines à partir du milieu de culture des fluides physiologiques d'où les exosomes provenaient de41. Le ratio Taekvando de 8,3 ± 1,7 × 1010 p/µg obtenus dans cette étude se situe dans la fourchette de haute pureté proposée dans l’étude. Ce rapport met en évidence le danger de l’utilisation de la concentration de protéines pour exprimer le rendement ou la dose d’exosomes isolé ou utilisés dans des études en aval respectivement, car cela ne reflète pas le montant réel des exosomes disponible dans l’échantillon étant donné le problème de la protéine contamination lors de l’isolation. NTA via des instruments tels que NanoSight, qui mesure la concentration des exosomes en termes de nombre de particules, est une manière plus sensible et plus précise de quantifier les exosomes.
Haute précision de pesage lors de la préparation de la solution de saccharose de 25 % dans l’oxyde de deutérium est crucial car cette méthode est un isolement basé sur la densité. Exosomes ont une gamme assez étroite de la densité de flottaison dans une solution de saccharose pour préparation précise du coussin de saccharose réduira la contamination des vésicules non-exosomal comme corps apoptotiques ou vésicules de Golgi dérivés au cours de l’isolement42. Il est conseillé de ne pas garder une solution de saccharose de restes et de l’utiliser même après une journée afin d’éviter le risque de facteurs pouvant modifier sa densité tels que la perte ou l’ajout d’eau dans la solution par évaporation ou condensation de l’air dans le tube. Utilisation d’un rotor à balancier est également essentielle lors de la centrifugation sur le coussin de saccharose pour permettre la migration même des exosomes de la CM à la solution de saccharose.
Retrait de la centrifugation après de solution de saccharose est également une étape délicate, et il consiste à trouver un compromis entre maximiser le montant des exosomes récupérés et pas trop que protéine de milieu de culture est introduit à l’échantillon de l’exosome retirée . L’interface entre la solution de saccharose et le milieu de l’État est où les protéines à partir du milieu de culture recueillent après centrifugation et peuvent généralement être considérées comme un anneau brun foncé qui se trouve sur l’interface. Dans nos mains, retirer 2 mL du coussin de saccharose de la mL 3 initial ajouté est le volume optimal qui est en accord avec le compromis mentionné ci-dessus. Les volumes décrits dans le présent protocole sont pour les rotors spécifiques utilisés ; par conséquent, il est conseillé pour optimiser le volume de saccharose à être retirée lorsque l’échelle vers le haut ou vers le bas les volumes pour les types de rotors disponibles dans différents établissements. Il est également important éviter le droit de la zone au centre de la partie inférieure du tube en retirant le saccharose, car cela est où des particules de densité plus élevée que le saccharose aura des sédiments et peut généralement être considérée comme une pastille écru.
L’étape de lavage avec une quantité relativement grande de PBS contribue à réduire encore le degré de contamination de protéines au cours de l’exosome isolement41. Cette étape est également essentielle à retirer les exosomes afin d’éviter d’endommager les exosomes osmotique de saccharose excès eux-mêmes ou les biomolécules dans la lumière d’exosomal, mais aussi de réduire le risque de croissance bactérienne ou fongique dans le stock de l’exosome. Préparation de la solution de saccharose dans l’oxyde de deutérium plutôt que l’eau contribue à réduire la quantité de saccharose nécessaire pour atteindre la densité de flottaison exosome pour l’isolation, ce qui réduira le risque de dommages osmotique et de contamination microbienne. Après la première centrifugation sur le coussin de saccharose, contenant de l’exosome couche de saccharose retiré et on ajoute le PBS peut être conservée à 4 ° C et traitée le lendemain lorsqu’ils sont confrontés à des contraintes de temps.
Au meilleur de notre connaissance, le rapport molaire de l’exosome/siARN est un facteur important pour déterminer l’efficacité de l’électroporation. Dans ce protocole, nous avons utilisé 1/60 comme l’exosome siARN ratio molaire. Comme la capacité d’encapsulation de différents types d’exosomes sont différentes, nous vous suggérons fortement de cela pour être optimisé sur une base de cas-par-cas. Cependant, l’efficacité de l’encapsulation ici proposée peut toujours être un paramètre pour sélectionner les conditions optimales d’électroporation.
En outre, agrégation des siARN est censée être l’un des problème plus fréquent dans l’électroporation. Il est prouvé qu’électroporation peut induire forte agrégation des siARN, rendant encore plus difficile d’entrer dans les exosomes. agrégations de siARN sont interprétées souvent à tort comme l’encapsulation de siARN dans exosome contrôles donc appropriés ont été utilisées dans cette étude comme la formation d’agrégats de siARN est inévitable au cours de l’électroporation28. L’efficacité d’encapsulation de pourcentage de notre méthode de purification a été calculée en utilisant les valeurs normalisées pour minimiser l’influence d’autres sources comme les agrégations de bruit, exosome et siRNA de fond qui auraient une incidence sur la fiabilité des données. D’après nos constatations, il y avait des agrégations de siARN négligeable observées dans le contrôle échantillon soit à l’aide de siARN électroporation et ONU-électroporation.
Ce protocole a démontré avec succès l’encapsulation des siARN dans les exosomes et leur livraison intracellulaire des siARN au cancer des cellules in vitro. Par conséquent, différents types d’exosomes de différentes lignées cellulaires peuvent être isolé et caractérisée en utilisant le protocole proposé et par la suite chargé avec des siARN thérapeutiques différentes pour différents types de cibles oncogènes surexprimées dans différents cancers. Une application intéressante serait d’étudier l’efficacité de livraison et absorption siARN utilisant diverses permutations de l’exosome source cible cellulaire paire in vitro. Ceci puis peut se traduire de modèles animaux pour évaluer l’efficacité de la livraison et l’efficacité thérapeutique des siARN encapsulé exosomes in vivo.
Disclosures
Les auteurs déclarent qu’ils n’ont aucun intérêt financier concurrentes.
Acknowledgments
F. N. Faruqu est financé par l’Agence du gouvernement malaisien Majlis Amanah Rakyat (MARA). L. Xu est récipiendaire des bourses individuelles Marie Sklodowska-Curie (Horizon 2020) (H2020-ACEM-IF-2016). K. T. Al-Jamal reconnaît financement du BBSRC (BB/J008656/1) et Wellcome Trust (WT103913). Les auteurs tiens également à remercier le Dr Paul Lavender et Dr David Fear (département de médecine respiratoire et allergie, College London Kings) pour la fourniture de l’électroporateur.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Material | |||
| Sterile Newborn Calf Serum Heat Inactivated | First Link | 08-05-850 | 500 ml |
| EMEM medium | Thermo Fisher Scientific | 11090081 | 500 ml |
| Penicillin/Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140-122 | 100 ml |
| GlutaMax | Thermo Fisher Scientific | 35050-038 | 100 ml |
| Sucrose | Fisher Scientific | S/8600/60 | 1 kg |
| Deuterium oxide (D2O) | Sigma-Aldrich | 151882 | 250 g |
| 1X Phosphate Buffered Saline | Thermo Fisher Scientific | 10010015 | 500 ml |
| Glycine | VWR Chemicals | 101196X | 1 kg |
| Sepharose CL-2B | GE Healthcare Life Sciences | 17-0140-01 | 1 L; Particle Size 60 μm-200 μm |
| Trypsin-EDTA 0.05% | Thermo Fisher Scientific | 25300096 | 100 ml |
| Aldehyde/sulfate latex beads | Thermo Fisher Scientific | A37304 | 4% w/v, 4 µm, 15 ml |
| MicroBCA kit | Thermo Fisher Scientific | 23235 | |
| CD81 antibody (APC) | Thermo Fisher Scientific | 17-0819-42 | Lot: E15950-104. RRID: AB_11150235. 1:10 dilution in 50 µl sample |
| CD81 isotype (APC) | Thermo Fisher Scientific | 17-4714-81 | Lot: 4291563. RRID: AB_763650. 1:10 dilution in 50 µl sample |
| CD9 antibody (FITC) | Thermo Fisher Scientific | 11-0098-41 | Lot: 4345870. RRID: AB_10698007. 1:10 dilution in 50 µl sample |
| CD9 isotype (FITC) | Thermo Fisher Scientific | 11-4714-41 | Lot: 4299784. RRID: AB_10598647. 1:10 dilution in 50 µl sample |
| CD63 antibody (PE) | Thermo Fisher Scientific | 12-0639-41 | Lot: 1930435. RRID: AB_2572564. 1:10 dilution in 50 µl sample |
| CD63 isotype (PE) | Thermo Fisher Scientific | 12-4714-81 | Lot: 1937696. RRID: AB_470059. 1:10 dilution in 50 µl sample |
| Atto655-siRNA | Eurogentec | SQ-SIRNA | (Labelled-S) UGC-GCU-ACG-AUC-GAC-GAU-G55; (Unlabelled-AS) CAU-CGU-CGA-UCG-UAG-CGC-A55. |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Millex-GP Syringe Filter Unit 0.22 µm | Millipore | SLGP033RS | |
| CELLine AD1000 bioreactor flasks | Wheaton | WCL1000ad | |
| Ultracentrifuge | Beckman Coulter | Optima XPN-80 | |
| Swing-out rotor | Beckman Coulter | SW45 Ti | |
| Fixed-angle rotor | Beckman Coulter | Type 70 Ti | |
| Ultracentrifuge tubes | Beckman Coulter | 355631 | Polycarbonate. Max. fill 32 ml |
| Ultracentrifuge bottles | Beckman Coulter | 355618 | Polycarbonate. Min. fill 16 ml, max. fill 25 ml |
| NanoSight | Malvern | LM10 | Software: NanoSight NTA v3.2 |
| Flow Cytometer | BD Biosciences | FACSCalibur | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5810R | |
| Plate reader | BMG Labtech | FLUOstar Omega | |
| Flow cytometry tubes | BD Biosciences, Falcon | 352052 | |
| Microfuge tubes | Starlab | S1615-5500 | 1.5 ml |
| Cell culture flasks | Fisher Scientific | 156499 | 75 cm2 |
| Transmission electron microscope | FEI Electron Optics | Philips CM 12 | with Tungsten filament and a Veleta - 2k × 2k side-mounted TEM CCD Camera (Olympus, Japan) |
| Amaxa Nucleofector I | Lonza | Nucleofector I | with Amaxa’s Nucleofector Kits |
| 24-well flat-bottom plates | Corning | Costar | |
| Blunt fill needle | BD Biosciences | 305180 | 18G x 1 1/2" (1.2 mm x 40 mm) |
| Glass pipettes | Fisher Scientific | 1156-6963 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | Composition | ||
| Normal medium | Eagle's Minimum Essential Medium supplemented with 10% foetal bovine serum (FBS), 1% penicillin/streptomycin and 1% GlutaMax. | ||
| Exosome-depleted medium | Eagle's Minimum Essential Medium supplemented with 10% exosome-depleted FBS (see below), 1% penicillin/streptomycin and 1% GlutaMax. | ||
| Exosome-depleted FBS | Subject FBS to ultracentrifugation at 100,000 g for 18 h at 4°C. The FBS supernatant post-centrifugation was collected and sterile-filtered using 0.22 µm filters. | ||
| 25% w/w sucrose cushion | Add 1.9 g (± 0.001 g) of sucrose in a universal tube, and top up with D2O until the weight reaches 7.6 g (± 0.001 g). This makes ~6ml of the 25% w/w sucrose cushion. | ||
| 3% FBS/PBS | Add 1.5 ml exosome-depleted FBS to 48.5 ml 1X PBS to prepare 50 ml of 3% FBS/PBS. | ||
| 100 µM BSA solution | Prepare 1mM BSA solution by adding 0.3325 g to 50 ml PBS. Make 1:10 dilution of this stock to obtain 100 µM BSA solution. Make 5-10 µl aliqouts of this 100 µM BSA solution (for single use) and store them at -20°C. All BSA solution should be stored at -20°C, and discard solutions that have undergone ≥2 freeze-thaw cycles. | ||
| 100 mM glycine solution | Add 0.375 g of glycine to 50 ml PBS to obtain 100 mM glycine solution, store at 4°C. | ||
| Citric acid buffer with EDTA | Mix 0.1954 g citric acid and 0.2087 g disodium phosphate in 50 mL of deionised water. Add EDTA to 0.1 mM. Adjust pH to 4.4. | ||
| Fixing solution | Prepare formaldehyde/glutaraldehyde, 2.5% (w/v) each in 0.1 M sodium cacodylate buffer, and adjust pH to 7.4. | ||
| Aqueous uranyl acetate | Prepare 25% (v/v) uranyl acetate in methanol. | ||
| 50% methanol/H2O | Mix methanol and H2O 1:1 (v/v). | ||
| SEC Column packed with Sepharose CL-2B | Dilute 37.5 ml Sepharose CL-2B resin with 12.5 ml PBS to obtain 75% Sepharose CL-2B solution. Pour the Sepharose CL-2B solution into a column of dimension 2.9 cm [H] x 1.3 cm [W]. Pour the Sepharose CL-2B to 3-4 mm above the stated height, and then press it down to the stated height with the filter for optimal packing. |
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