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Cancer Research

用于向癌细胞输送 sirna 的外质体的制备

Published: December 5, 2018 doi: 10.3791/58814
Automatic Translation
*1, *1, 1
1Institute of Pharmaceutical Science, King's College London
* These authors contributed equally

Summary

外显子是新一代的药物输送载体。我们建立了一个具有高产量和纯度的非连续分离协议, 用于 sirna 的传递。我们还将荧光标记的非特异性 sirna 封装到外显子体中, 并研究了癌细胞中含有 sirna 的外显子体的细胞吸收情况。

Abstract

细胞外囊泡, 特别是外质体, 由于其生物来源、丰度和各种生物分子在细胞间传递的内在能力, 最近成为新的药物传递载体。本工作建立了一个分离方案, 以实现高产量和高纯度的外质体的 sirna 交付。人类胚胎肾细胞 (hek-293 细胞) 在生物反应器瓶中培养, 每周收获培养上清液 (以下简称条件培养基), 以丰富 hek-293 外显子。经调理的培养基 (cm) 通过差动离心预先清除死细胞和细胞碎片, 并在蔗糖垫上进行超离心, 然后再进行洗涤步骤, 以收集外渗。分离的 hek-293 外显子分别通过纳米粒子跟踪分析、蛋白质定量、电子显微镜和流式细胞仪进行了产量、形态和外染色体标记表达的表征。小干扰 rna (sirna), 荧光标记为 atto655, 通过电穿孔加载到外显子中, 通过凝胶过滤去除多余的 sirna。流式细胞仪通过流式细胞仪证实了 panc-1 癌细胞在37°c 孵育24小时后的细胞吸收。hek-293 外显子的直径为107.0±8.2 纳米。外相产率和颗粒蛋白比 (p:p) 分别为 6.99±0.22x10 12 表和 8.3±1.7x10 10 表.sirna 在外质体中的包封效率约为10-20。40% 的细胞在培养后24小时显示 atto655 的积极信号。总之, 超离心分离蔗糖垫提供了良好的产量和纯度的组合。sirna 可以通过电穿孔成功地加载到外显子中, 然后在体外传递到癌细胞中。该协议为开发装有 sirna 的外显子体提供了一个标准程序, 以便有效地传递给癌细胞。

Introduction

外质体是细胞外囊泡 (ev) 的亚型, 直径从50-200 纳米不等, 由各种细胞类型分泌, 如免疫细胞1,2, 癌细胞3,4,5 ,6和干细胞7。外质体也被证明存在于各种生理液体8,9,10,11。外显子体携带各种生物分子 (如rna 和蛋白质)的内在能力与将这些生物分子有效传递到接受细胞的组合15,16,17. 它们作为纳米药物传递载体的潜力引起了人们的兴趣。各种小分子, 作为抗癌和抗炎药已被证明被成功地加载到外显子体, 并提供给目标细胞18,19,20,21,22,23,24,25,26,27. 有趣的是, sirna28、29和 m微 rna30等核酸也通过电穿孔成功地加载到外显子体中, 并传递给目标细胞。

近年来,通过小干扰 rna (sirna) 进行的 rna 干扰 (rnai) 由于其特异性高、有效、副作用小、易于 sirna 合成28等优点, 成为基因沉默的首选机制, 29岁sirna 是双链 rna 分子, 长度从19到25个核苷酸不等, 触发序列特异性催化 mrna 敲除。由于其分子量大、多阴离子性质, 裸 sirna 被被动吸收到细胞中受到阻碍28,29.由于血浆核酸酶31的快速降解, 赤裸 sirna 也不可能注入全身循环。因此, 将 sirna 封装在纳米载体中, 将有助于将 sirna 有效地传递和吸收到目标细胞中。

外质体是一个理想的系统 sirna 封装, 因为它的结构是由一个中空的, 含水的核心包住了磷脂双层。外质体不仅在血液中具有良好的稳定性, 而且具有自然的靶向特性, 可将功能 rna 传递到细胞32中。alvarez-erviti等人进行的研究成功地证明了使用工程外显子有效地将 sirna 传递到小鼠的大脑, 几乎没有并发症31。据推测, 外显子治疗相对比其他疗法更安全, 因为外显子不会像细胞那样内生复制, 因此不会表现出转移性 15.

据报道, 各种方法可以成功地从细胞培养或生理流体中分离出体细胞。最常用的方法是使用超离心从起始材料31,32,33中颗粒外显子。这种方法可以是相当苛刻的外显子, 通常共同沉淀蛋白质从样本。将超离心与密度为基础的分离 (如蔗糖梯度) 相结合, 变得越来越普遍, 以减少分离外显子 19、34的蛋白质和非外染色体污染。分片排除色谱 (sec) 允许从其他类型的细胞外囊泡 (ev) 的大小分离外质, 也可以导致最小的蛋白质污染, 但受到限制的少量起始材料, 它可以处理35, 36岁免疫亲和力捕获使用与体外表面蛋白 (如四帕辛素或其他细胞特异性标记物) 结合的抗体的珠子, 这些标记允许特定的外显子体捕获, 而不是 ev 或其他蛋白质, 以及分离亚群。外显子从整个样品, 但再次受到起始材料的数量限制, 是昂贵的36,37。聚合物为基础的外显子沉淀也很流行, 但由于它是一个相当粗糙的沉淀, 它导致一个较高的非外质囊泡和蛋白质污染38,39。

电穿孔由于其效率低下的方法, 以加载外显子与 sirna 由于蛋白质聚集15, 28, 31。基于转化的方法具有较好的加载效率和蛋白质稳定性, 但由于其毒性和转染剂在改变细胞基因表达方面的副作用而不受欢迎。因此, 电穿孔在 sirna 加载到外显子中得到了更广泛的应用, 因为它是一种更安全的方法。然而, 需要建立一个优化的封装方法, 以便向目标部位提供足够数量的 sirna, 从而实现有效的基因敲除。

在这里, 我们提出了一个外显子分离协议, 使用密度为基础的超离心, 只在一个 25% (w/w) 蔗糖垫准备在氧化铀, 而不是蔗糖密度梯度。这是一种经济高效的方法, 它可以避免费力的密度梯度制备, 并允许处理大量的起始材料, 但却产生了适合后续使用 sirna 的高产纯度完整的外质体。荧光 atto655 结合非特异性 sirna 通过电穿孔导入人胚胎肾细胞 (hek-293 细胞), 并在体外输送到人胰腺癌 (panc-1) 癌细胞。

Protocol

1. 生物反应器瓶中的细胞培养

Figure 1
图 1: 生物反应器瓶中细胞的培养, 用于外源生产.(a) 简化生物反应器瓶的解剖结构。(b) 在生物反应器烧瓶中开始养殖。有关生物反应器瓶中正常和外部消耗的培养基 (c) 收集条件介质 (cm) 的组成和培养的维护, 请参见材料表。请点击这里查看此图的较大版本.

  1. 在正常培养基中培养 hek-293 细胞 (见材料表;5% co2, 37°c), 并将其扩展到 4 x t75 烧瓶 (直到90% 融合)。
  2. 在生物反应器瓶的介质储层中加入50-100 毫升的正常介质, 将生物反应器瓶的膜弄湿。
  3. 从 4 x t75 中收集所有 hek-293 细胞, 并在15毫升的外代耗尽介质中重新悬浮 (见材料表)。
  4. 使用连接到钝器填充针的20毫升注射器 (见材料表) 将 hek-293 细胞悬浮液添加到生物反应器瓶的细胞隔间 (见材料表), 并注意去除可能形成的任何气泡。
  5. 用正常介质填充生物反应器瓶的介质库, 并将烧瓶保存在孵化器 (5% co2, 37°c) 一周。

2. 从生物反应器瓶中收集有条件的介质 (cm)

  1. 1周后, 丢弃生物反应器瓶中的所有介质。
  2. 使用连接到钝器填充针的20毫升注射器取出细胞室 (即 cm) 中的所有介质。
  3. 在中储层中加入50-100毫升的正常介质。
  4. 将15 毫升的外用培养基添加到细胞隔间, 方法是取出旧培养基, 并使用连接到钝器填充针的20毫升注射器添加新的外用体耗尽培养基。
  5. 用正常介质填充生物反应器瓶的介质库, 并将烧瓶保存在孵化器 (5% co2, 37°c) 中一周。
    注: 该文化可以持续一年以上。对于步骤 2.2, 第一次收获时的 cm 将不会用于外部隔离, 并被丢弃。对于第2和后续的收获, cm 被保留为外生分离。

3. 蔗糖垫上的外生分离

Figure 2
图 2: 外显子的分离和鉴定.(a) 从死细胞和细胞碎片中预先清除已收获的条件介质。(b) 将外质体从 cm 隔离到蔗糖垫上。(c) 清洗步骤去除蔗糖和污染蛋白质。(d) 分离的外显子随后进行理化、生化和形态学表征。请点击这里查看此图的较大版本.

  1. 通过差动离心和过滤, 预先清除 cm (从步骤2.2 开始), 如下所示。
    1. 在4°c 下以 500 x g 离心5分钟。将上清液转移到新管中, 并丢弃颗粒。再次重复此离心步骤, 回收上清液并丢弃颗粒。
    2. 将3.1.1 的步进中清液以 2, 000xg 离心15分钟和 4°c, 然后丢弃颗粒。通过0.22μm 过滤器对回收的上清液进行一次过滤。
  2. 在预清除过程中, 通过在万能管中准确称重 1.9 g (±0.001 g) 蔗糖, 制备 25% (w/w) 氧化二铵中的蔗糖溶液, 然后在一起, 再加装上氧化锆, 直到重量达到7.6 克 (±0.001 g)。
  3. 用22.5 毫升的预清 cm 填充超离心管 (见材料表), 如果电流体积小于此量, 则用0.22μm 过滤的 pbs 将 cm 到 22.5 ml 组成。
  4. 将玻璃移液器 (见材料表) 放入试管中, 并通过它添加3毫升蔗糖溶液, 使溶液在 cm 下方形成单独的层。
  5. 小心地将含有分层 cmcme/sucrose 溶液的管放入摆动转子的桶中 (见材料表), 并将桶固定在转子中。
  6. 将转子放入超离心机 (见材料表), 在4°c 下以 100, 000 x 克的速度旋转1.5 小时。
  7. 收集2毫升的蔗糖层, 并将其添加到含有20毫升过滤 pbs 的超离心机瓶 (见材料表) 中, 用于清洗步骤。
  8. 将管放入固定角度的转子 (见材料表), 并以 100, 000 x 克的速度旋转1.5 小时, 4°C。
  9. 用10毫升血清学移液器小心去除上清液, 用400μl 过滤的 pbs 重新悬浮颗粒。将此外质库存保持在4°c 或-80°c, 以便分别进行短期和长期储存。

4. 纳米粒子跟踪分析 (nta) 表征外生体大小和产量

  1. 使 1:1000-1: 50000 在1毫升 (最小750微米) 体积的外生物库存中稀释, 以便在 nta 仪器 (见材料表) 显示的观察框架中获得20-80 粒颗粒。
  2. 使用1毫升注射器将稀释后的外溶体库存注入 nta 仪器样品室, 并将温度计的温度探头插入温度探头入口。
  3. 将 nta 软件 (见材料表) 设置为记录, 如下所示: 3个标准测量, 每个测量 30秒, 手动温度选项未选中;并在 "高级" 选项卡下输入稀释系数。
  4. 将相机电平设置为 13, 并在 nta 软件上运行捕获脚本, 注入一批新的样品, 并在每次读取后提示时输入样品室的温度。
  5. 将后续分析部件的阈值设置为 4, 并从测量中注意外源库存的平均模态大小和颗粒浓度。

5. 颗粒法表征超小型纯度: 蛋白质比的测定

  1. 用双氯酸 (bca) 蛋白质检测试剂盒 (见材料表) 测量外显子库存的蛋白质含量, 如下所示。
    1. 准备定义的标准.
      1. 在微离心管中加入45μl 的 bsa 库存溶液 (2 mg/ml (在检测试剂盒中提供), 并使用 pbs 使其达到 180μl, 从而制备最高浓度的标准 (500μg/ml)。
      2. 在8个微离心管中加入90μl 的 pbs。
      3. 通过从最高 bsa 标准中提取90μl 并将其添加到带有 pbs (混合良好) 的第1微离心管中, 使串行稀释 (系数: 0.5), 然后从该管中提取90μl 并将其添加到第2微离心管中。
      4. 重复此操作, 直到第7微离心管。第8管将只是 pbs (即空白: 0μg/ml)。
    2. 用 pbs 对样品进行1-2 稀释, 使其在总体积为 90μl (45μl 的样品, 45μl 的 pbs) 中制备外生样品。
    3. 准备 bca 工作试剂混合物。
      1. 计算所需的 bca 工作试剂混合物的总体积 (每口50微米, 以重复为单位, 包括标准)。
      2. 根据以下比例混合单个 bca 试剂: 25个部分试剂 a:24 种试剂 b:1 份试剂 c。
    4. 进行分析和分析。
      1. 将每个标准和上面制备的外显物样品加入96孔板的井 (每个标准和样品的重复) 中。
        注: 由于这是一种比色测定, 适当的移液技术是实现准确结果的关键。在将每个标准/样本复制到每个油井后更改移液器
      2. 将50微米的蛋白质检测试剂混合到每口井中, 在37°c 下孵育板30分钟。
        注: 为了最大限度地减少复制之间的偏差, 在标准/样品的第1个复制中添加蛋白质检测工作试剂, 然后再将其添加到 1.复制另一个样本标准。
      3. 测量板读取器上562纳米的吸收率 (参见材料表)。
      4. 从标准的吸收值中绘制出一个标准曲线, 并利用曲线方程计算出每个样本中的蛋白质浓度。
  2. 通过将较早获得的外显子产量与上面测量的外生体库存的蛋白质浓度除以粒子: 蛋白质比来计算。

6. 流式细胞仪检测外质标记表达

  1. 在室温下 (rt)将40μl 外显子 (≥1x10 11/ml) 与10μl 的醛-硫酸盐乳胶珠 (未从库存中稀释) 培养15分钟。
  2. 在外圈混合物中加入 5μl 100μm bsa 溶液 (见材料表), 以达到 10 mm 的最终浓度, 并在 rt 孵育15分钟。
  3. 在摇椅上进行微搅拌 (~ 150 转/分) 的微离心管中加入1毫升的 pbs 和在 rpm 孵育75分钟。
  4. 在 rt 以 580 x g 离心悬浮液 5分钟, 并丢弃上清液。
  5. 用 100 mm 甘氨酸溶液1毫升的颗粒 (见材料表) 重新注射颗粒, 并在 rt 孵育30分钟。
  6. 在 580 x g 的情况下离心悬浮液 5分钟, 将上清液丢弃, 并以 3% fbse/pbs 的1毫升重新悬浮颗粒 (见材料表)。
  7. 重复此洗涤步骤, 并在 350μl 3% 的 fbsw pbs 中重新悬浮颗粒。
  8. 将悬浮液分成7个管, 每个管含有50μl 的悬浮液, 并在4°c 下分别用氟共轭抗 cd81、抗 cd9 和反 cd63 抗体及其相应的同型对照 (1:10 稀释) 孵育45分钟。保持1管作为一个未染色的控制, 但正在经历相同的处理。
  9. 在每管中加入1毫升3% 的 fbsp b, 离心 5分钟, 580 x 克, 并丢弃上清液。
  10. 用200-400μl 的 3% fbsw pbs 重新选择颗粒, 并在适当的通道下对流动细胞仪 (见材料表) 上的样品进行分析。

7. 透射电子显微镜 (tem) 对外显体形态的表征

  1. 将外显子水分散体固定在适当的浓度下, 如固定溶液中的 1010 p/ml (见材料表), 时间为15分钟。
  2. 将样品放在300目碳涂层铜网上, 并保持空气干燥。
  3. 用0.22μm 过滤的醋酸水溶液对样品进行否定染色 (见材料表), 然后用两个50% 的甲醇 2 o 清洗 (见材料表)。
  4. 空气干燥样品。
  5. 观察 tem 下的样品 (见材料表)。将加速电压设置为 80kv, 将光斑大小设置为2。对所有样本使用目标光圈。

8. 通过电穿孔将 sirna 封装到外显体中

  1. 在电穿孔前, 将电穿孔杯 (见材料表) 在冰上预冷却30分钟。
  2. 将7.0 微克的外质体 (pbs 中 7 x 10 12 pml 库存的 32μl) 与微离心管中0.33 微克的 sirna (来自无 rnase-wis 水中的2μm 库存的 12μl) 混合在一起.用柠檬酸缓冲液将体积弥补为 150μl (见材料表)。在这种情况下, 从细胞到 sirna 的摩尔比是1:60。
  3. 将混合物转移到电穿孔材料中。将其盖上, 并将其放置在电陶瓷的杯架中 (见材料表)。顺时针旋转转动轮180°。
    注: 车轮必须完全转动到锁定的位置, 以便立方接触电极。
  4. 选择所需的电穿孔程序 (例如, x-01、x-05、a-20、t-20、t-30等), 然后按"开始" 按钮启动电穿孔。
    注: 通过在显示屏上显示 "ok" 来指示成功的脉冲。
  5. 一旦电穿孔, 在逆时针旋转滚轮180°后取出立方。用塑料移液器从切割机中提取样品进行进一步加工。

9. 使用大小排除色谱法去除游离 sirna (sec)

  1. 通过两次通过 3.5 ml 的过滤 pbs, 平衡 sec 柱 (2.9 厘米 [h] x 1.3 厘米 [ w]; 见材料表)。
  2. 在350μl 的过滤 pbs 中溶解150μl 的电穿孔样品, 并将其转移到 sec 柱, 以实现自由 sirna 去除。
  3. 收集从色谱柱 (f0) 中洗脱的第一个500μl 分数。
  4. 在色谱柱中加入500μl 过滤 pbs, 并收集下500μl 分数 (f1)。
  5. 重复上述步骤, 直到收集到总共 10x 500μl 分数 (最多 f9)。f1 和 f2 应包含 sirna 封装的外显子。
  6. 用经过过滤的 pbs 清洗柱 (至少两次), 以去除任何样品残留物。

10.体外吸收环状外显子进入 panc-1 细胞

  1. 在吸收研究之前, 24 井平底板 (见材料表) 中的种子 panc-1 细胞的密度为每口 24小时, 并在孵化器中孵育细胞 (5% co2, 37°c)。
  2. 按步骤 8用 atto655-sirna (0.33 微克) 电孔 hek-293 外显素 (7.0 微克)。
  3. 按照步骤9纯化电穿孔外生体, 并在100μl 的 pbs 中重新悬浮。
  4. 将电穿孔外显子加入50μl 到 panc-1 细胞中, 在37°c 孵育, 在 5% co 2 孵育 4小时。
  5. 孵育后收集细胞。
  6. 用1毫升无菌 pbs 清洗细胞, 并在聚苯乙烯圆底管中重新悬浮在200μl 的 pbs 中 (见材料表)。
  7. 通过流式细胞仪 (见材料表) 分析细胞, 每个样本可获得 10, 000个事件。
    注: 使用未电处理的外源-sirna 混合物样品和经过过滤的 pbs 的未经处理的细胞作为对照。

Representative Results

表 1总结了从 hek-293 细胞 (hek-293 exo) 中分离出体的物理化学特性。纳米粒子跟踪分析 (nta) 仪的尺寸为107.0±8.2 纳米。hek-293 细胞的外相产量, 也使用 nta 仪器进行了分析, 为 6.99±0.22 x 10 12 p/ml,来自 ~ 24 毫升 cm (从2轮收获中获得)。通过计算粒子与蛋白质的比率 (p:p) 对 hek-293 exo 的纯度进行了 8.3±1.7 x10 pμg.

孤立的 hek-293 exo 的尺寸分布如图 3 a所示。利用透射电子显微镜 (tem) 进行的形态分析显示, hek-293 exo 是尺寸稍大于 100 nm的球形结构 (图 3b)。这一结果与 nta 测量结果一致 (图 3 a)。孤立的 hek-293 exo 对 cd81、cd9 和 cd63 呈阳性, 它们是用来鉴定囊泡作为外显子的规范标记 (图 3c)。

对于使用大小排除色谱法纯化外显子 (图 4), 通过将收集到的10个分数 (f0-f9) 中回收的外质颗粒总数与初始外显子体数除以外显子的百分比回收计算所使用的粒子数, 而 sirna 的百分比回收是通过将从 f3、f4 和 f5 中获得的总荧光强度与从收集到的所有10个分数中获得的总荧光强度除以计算的。纯化后外显子和 sirna 的回收率分别为750% 和80.4。利用建立的 sirna 标准曲线 (图 4c) 计算, sirna 在外质体中的包封效率约为10-20。

流式细胞术对荧光 Atto655-sirna 负载外显子体的体外吸收进行定性分析, 发现用 sirna 封装的外显子处理的 panc-1 细胞记录的荧光信号变化最大 (图 5a). 使用 sirna 封装外显子体处理的 panc-1 细胞对 atto655 信号呈阳性的人口百分比 (39.4%) 高于使用卸载外质和 sirna 混合物处理的 nanc-1 细胞 (0.56), 这证实了上述观察 (图 5b).在使用 sirna 包封外生体 (mfi 折叠剂) 处理的 panc-1 细胞中, sirna 的细胞吸收程度 (表示为平均荧光强度 (mfi) 值与未经处理的细胞的倍差) 也显著高于差异 = 5.1) 与外有症-sirna 混合物治疗相比 (mfi 折叠差异 = 1.1) (图 5c)。这些观察表明, sirna 包封的外显子体被 panc-1 细胞内化, 并有效地传递了 sirna 内腔内。

Figure 3
图 3: hek-293 外显子体的生化和形态分析.(a) 利用纳米粒子跟踪分析 (nta) 对 hek-293 外显子的大小分布。曲线显示了一个叠加直方图, 分别来自 3. s 的间隔, 红色区域表示测量之间的标准偏差 (n = 3)。(b) 传输电子显微镜 (tem) 图像的天真 hek-293 外显体。刻度栏: 100 纳米。(c) 利用 hek-293 外显子体流式细胞仪检测外染色体标记 cd81、cd9 和 cd63。外质体在被检测前被连接到醛/硫酸盐乳胶珠。随后, 外磁复合物被氟化物共轭抗 cd81、抗 cd9 和抗 cd63 抗体染色。标记的表达程度表示为中位荧光强度 (mfi) 值与对照值的倍差 (外皮珠复合物染色与相应的同型)。值表示为平均值±sd, 其中 n = 3。请点击这里查看此图的较大版本.

Figure 4
图 4: 电穿孔后的外显子纯化.(a) atto655-sirna 的洗脱剖面 (f0-f9) 和电穿孔外显子使用尺寸排除脉络膜。(b) 利用尺寸排除脉络膜对 atto655-sirna 和 f0 至 f9 的外显体进行 nta 分析。(c) atto655 标记 sirna 的校准曲线。在 exeem:640-10/680 nm 的平板读取器中获得了荧光强度;获得2800。值表示为平均值±sd (n = 3)。请点击这里查看此图的较大版本.

Figure 5
图 5: 在4小时内, sirna 包封的外显子体在 panc-1 细胞中的细胞吸收.(a) 比较细胞吸收未加载外质体 + sirna 混合物和 sirna 封装外显子的直方图。(b) 伪彩色图在4h 时吸收卸载外质体 + sirna 混合物的比较。(c) 与未经处理的细胞相比, 所测试样品的平均荧光强度 (mfi) 值的折叠差异。值表示为平均值±sd, 其中 n = 3。p & lt; 0.001。ns: 不重要。采用单向方差分析进行统计分析。请点击这里查看此图的较大版本.

外观 尺寸1, 2
(海里)		 产量1, 2, 3
(p/ml)		 [蛋白质]2, 4
(μgml)		 粒子-蛋白质 (p:p) 比率5
(微克)
hek-293 107.7±8。2 6.99±0.22 x 1012 843点9。8 8.3±1.7 x 1010 
1使用纳米粒子跟踪分析 (nta 仪器) 测量
2值表示为平均值±sd, 其中 nts3
3产量是通过细胞条件下的培养基从2轮生物反应器中收获获得的 (~ 24 毫升)
4使用蛋白质检测试剂盒测量
5通过使用公式获得的值: p:p 比率 = 产量/[蛋白质]

表 1: 外显子的理化表征。

Discussion

从培养的细胞中获得像样的外生细胞产量, 足以进行几轮体外或体内研究, 仍然是一个挑战。据制造商介绍, 生物反应器瓶的目的是生产各种不朽细胞系培养产生高产的抗体和蛋白质。这使得细胞能够不断地用所需的产品丰富培养基, 从而在细胞室中形成一个浓缩的条件培养基 (cm)。从理论上讲, 同样的概念将有利于从不同的细胞系产生外体细胞, 事实上, 在生物反应器瓶中培养这些细胞被证明可以显著提高外生体产量 40。大型中型水库不断向细胞隔间提供营养物质, 并通过 10 kda 半透膜将废物清除出去, 允许长时间培养, 而不需要大量的培养基与细胞接触, 或定期接触烧瓶更换, 最终可以节省大规模外生生产的总成本和劳动力 40。研究还表明, 外显子分离细胞长期生物反应器烧瓶培养的形态、表型以及免疫调节功能与在常规75厘米2烧瓶40中培养的细胞相似。因此, 在生物反应器瓶中培养其他不朽的细胞系作为外生物来源, 将有助于提高其外生细胞产量, 同时保持其完整性和功能。然而, 这种培养形式不适用于分裂周期有限的原代细胞, 也不适用于密度不高的原代细胞。

由于 cm 的收获是每周进行的, 而培养中的细胞从未被传代, 因此可以假定生物反应器瓶中的细胞并不像常规细胞培养那样在单层中生长。它们最有可能形成有坏死中心的星团, 或者只是从表面分离出来, 当细胞对单层来说过于融合时死亡。对生物反应器瓶的细胞室进行目视检查是不可能证实这一假设的, 但在 cm 收获过程中获得的大量死亡细胞反映了这一点。定期从生物反应器瓶中去除粘附不良和不可行的细胞, 可以防止半透膜上的物质积聚, 从而对细胞隔间和培养基之间的气体、营养物质和废物的交换产生不利影响水库, 从而允许长时间培养在生物反应器瓶 & gt;6 月40。在这种背景下, 生物反应器瓶中细胞生长的这种非规律性是理想的, 因为我们推测, 它比传统的单层细胞培养更密切地模仿肿瘤在体内生长的实际情况, 希望外质体生物反应器瓶中的癌细胞所产生的细胞将与体内肿瘤分泌的更相似。这将是特别有益的研究, 研究肿瘤衍生外显子在肿瘤病理进展的作用。据报道, 肿瘤衍生外显子体本质上和优先地回到其起源组织 32, 因此,在一个系统中产生的外显子体模仿它们在体内的生产, 在研究中也是可取的。探索外显子作为药物纳米载体的被动靶向能力。

p:p 比被报道为一个参数, 以评估分离的外显子从污染蛋白质从生理流体培养基中的纯度, 从这些培养基中获得的外质体来自41。本研究得到的 p:p 比为 8.3±1.7x10 pμg, 在本研究中提出的高纯度范围内. 这一比例突出了使用蛋白质浓度来表达在下游研究中分离或使用的外显子的产量或剂量的危险, 因为考虑到蛋白质问题, 这并不能反映样本中可获得的外显子的真实数量隔离过程中的污染。nta通过纳米视觉等仪器, 测量外显子的浓度, 以粒子数, 是一种更合理和准确的方法来量化外显子。

在制备25% 的蔗糖溶液的过程中, 高精度称重至关重要, 因为这种方法是基于密度的隔离。外质体在蔗糖溶液中的浮选密度范围相当狭窄, 因此准确制备蔗糖垫将减少非外质囊泡 (如凋亡体或 golgi-b义囊) 在分离42期间的污染。建议不要保留剩余的蔗糖溶液, 即使在一天后也不要使用, 以避免可能改变其密度的因素的风险, 如通过蒸发或冷凝管道中的空气, 在溶液中增加水。在离心到蔗糖垫上的过程中, 使用摆动转子也是必不可少的, 这样即使外质体从 cm 迁移到蔗糖溶液。

在离心后提取蔗糖溶液也是一个微妙的步骤, 它涉及到在最大限度地减少回收的外显子数量和不要过多地将培养基中的蛋白质引入提取的外显子样本之间找到一个妥协方案.蔗糖溶液和条件介质之间的界面是培养基中的蛋白质收集离心后的情况, 通常可以被看作是位于界面上的深棕色环。在我们手中, 从最初的3毫升添加的蔗糖垫的2毫升是符合上述妥协的最佳体积。本协议中描述的卷适用于所使用的特定转子;因此, 建议在扩大或减少不同设施中可提供的转子类型的体积时, 优化要提取的蔗糖体积。在提取蔗糖时, 避免在管底中心的区域也很重要, 因为这是密度高于蔗糖的颗粒会沉积的地方, 通常可以被看作是一个离白的颗粒。

使用相对较大的 pbs 量的洗涤步骤有助于进一步降低外生体分离过程中的蛋白质污染程度41。这一步骤也是必不可少的, 以消除多余的蔗糖从外质体, 以避免渗透损害外体本身或外膜腔内的生物分子, 以及减少细菌和/或真菌生长在外体细胞股票的风险。在氧化锆而不是水中制备蔗糖溶液有助于减少实现分离所需的蔗糖含量, 从而降低渗透损伤和微生物污染的风险。第一次离心到蔗糖垫上后, 提取并添加到 pbs 中的含蔗糖层可以储存在 4°c, 如果面临时间限制, 第二天就可以进行处理。

据我们所知, 外显子/rna 摩尔比是决定电穿孔效率的重要因素。在这个协议中, 我们使用了1:60 作为 sirna 摩尔比。由于不同类型外显子的封装能力不同, 我们强烈建议在个案基础上对其进行优化。然而, 本文提出的封装效率始终是选择最佳电穿孔条件的参数。

此外, sirna 的聚集被认为是电穿孔中最常见的问题之一。事实证明, 电穿孔可以诱导强的 sirna 聚集, 使其更难进入外显子体。sirna 聚集体通常被错误地解释为将 sirna 封装到外显子体中, 因此在本研究中使用了适当的控制, 因为在电穿孔28过程中,sirna 聚集体的形成是不可避免的。我们的纯化方法的百分比封装效率是通过使用归一化值计算的, 以最大限度地减少其他来源 (如背景噪声、外显子和 sirna 聚合等影响数据可靠性) 的影响。根据我们的发现, 在对照样本中观察到的 sirna 聚集体可以忽略不计,即使用电穿孔和非电穿孔 sirna。

该协议已成功地证明了 sirna 封装到外显子体及其随后的细胞内传递 sirna 到癌细胞在体外。因此, 不同细胞系的各种类型的外显子可以使用拟议的方案进行分离和表征, 然后为不同类型的致癌靶点加载不同类型的致癌靶点。一个有趣的应用将是探索 sirna 的传递和吸收效率使用各种排列体外源-目标细胞对的体外。然后可以将其转化为动物模型, 以评估 sirna 封装的外显子在体内的传递效率和治疗效率.

Disclosures

提交人声明, 他们没有相互竞争的经济利益。

Acknowledgments

f. n. faruqu 由马来西亚政府机构 majlis amanah rakyat (mara) 提供资金。徐先生是 marie sklolowska-curie 个人研究金 ("地平线 2020") (h2020-msca-if-2016) 的获得者。k. t. al-jamal 感谢 bbsrc (bb/j008656/1) 和 wellcome 信托 (wt103913) 提供的资金。作者还要感谢保罗·拉文德博士和大卫·恐惧博士 (伦敦国王学院呼吸医学和过敏系) 提供了电控剂。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Material
Sterile Newborn Calf Serum Heat Inactivated First Link 08-05-850 500 ml
EMEM medium Thermo Fisher Scientific 11090081 500 ml
Penicillin/Streptomycin Thermo Fisher Scientific 15140-122 100 ml
GlutaMax Thermo Fisher Scientific 35050-038 100 ml
Sucrose Fisher Scientific S/8600/60 1 kg
Deuterium oxide (D2O) Sigma-Aldrich 151882 250 g
1X Phosphate Buffered Saline  Thermo Fisher Scientific 10010015 500 ml
Glycine VWR Chemicals 101196X 1 kg
Sepharose CL-2B GE Healthcare Life Sciences 17-0140-01 1 L; Particle Size 60 μm-200 μm
Trypsin-EDTA 0.05% Thermo Fisher Scientific 25300096 100 ml
Aldehyde/sulfate latex beads Thermo Fisher Scientific A37304 4% w/v, 4 µm, 15 ml
MicroBCA kit Thermo Fisher Scientific 23235
CD81 antibody (APC) Thermo Fisher Scientific 17-0819-42 Lot: E15950-104. RRID: AB_11150235. 1:10 dilution in 50 µl sample
CD81 isotype (APC) Thermo Fisher Scientific 17-4714-81  Lot: 4291563. RRID: AB_763650. 1:10 dilution in 50 µl sample
CD9 antibody (FITC) Thermo Fisher Scientific 11-0098-41 Lot: 4345870. RRID: AB_10698007. 1:10 dilution in 50 µl sample
CD9 isotype (FITC) Thermo Fisher Scientific 11-4714-41 Lot: 4299784. RRID: AB_10598647. 1:10 dilution in 50 µl sample
CD63 antibody (PE) Thermo Fisher Scientific 12-0639-41 Lot: 1930435. RRID: AB_2572564. 1:10 dilution in 50 µl sample
CD63 isotype (PE) Thermo Fisher Scientific 12-4714-81 Lot: 1937696. RRID: AB_470059. 1:10 dilution in 50 µl sample
Atto655-siRNA Eurogentec     SQ-SIRNA (Labelled-S) UGC-GCU-ACG-AUC-GAC-GAU-G55; (Unlabelled-AS) CAU-CGU-CGA-UCG-UAG-CGC-A55.
Name Company Catalog Number Comments
Equipment
Millex-GP Syringe Filter Unit 0.22 µm Millipore SLGP033RS
CELLine AD1000 bioreactor flasks Wheaton WCL1000ad
Ultracentrifuge Beckman Coulter Optima XPN-80
Swing-out rotor Beckman Coulter SW45 Ti
Fixed-angle rotor Beckman Coulter Type 70 Ti
Ultracentrifuge tubes Beckman Coulter 355631 Polycarbonate. Max. fill 32 ml
Ultracentrifuge bottles Beckman Coulter 355618 Polycarbonate. Min. fill 16 ml, max. fill 25 ml
NanoSight Malvern LM10 Software: NanoSight NTA v3.2
Flow Cytometer BD Biosciences FACSCalibur
Centrifuge Eppendorf 5810R
Plate reader BMG Labtech FLUOstar Omega
Flow cytometry tubes BD Biosciences, Falcon 352052
Microfuge tubes Starlab S1615-5500 1.5 ml
Cell culture flasks Fisher Scientific 156499 75 cm2
Transmission electron microscope FEI Electron Optics Philips CM 12 with Tungsten filament and a Veleta - 2k × 2k side-mounted TEM CCD Camera (Olympus, Japan)
Amaxa Nucleofector I Lonza Nucleofector I with Amaxa’s Nucleofector Kits
24-well flat-bottom plates Corning Costar
Blunt fill needle BD Biosciences 305180 18G x 1 1/2" (1.2 mm x 40 mm)
Glass pipettes Fisher Scientific 1156-6963
Name Company Catalog Number Comments
Reagents Composition
Normal medium Eagle's Minimum Essential Medium supplemented with 10% foetal bovine serum (FBS), 1% penicillin/streptomycin and 1% GlutaMax.
Exosome-depleted medium Eagle's Minimum Essential Medium supplemented with 10% exosome-depleted FBS (see below), 1% penicillin/streptomycin and 1% GlutaMax.
Exosome-depleted FBS Subject FBS to ultracentrifugation at 100,000 g for 18 h at 4°C. The FBS supernatant post-centrifugation was collected and sterile-filtered using 0.22 µm filters.
25% w/w sucrose cushion Add 1.9 g (± 0.001 g) of sucrose in a universal tube, and top up with D2O until the weight reaches 7.6 g (± 0.001 g). This makes ~6ml of the 25% w/w sucrose cushion.
3% FBS/PBS Add 1.5 ml exosome-depleted FBS to 48.5 ml 1X PBS to prepare 50 ml of 3% FBS/PBS.
100 µM BSA solution Prepare 1mM BSA solution by adding 0.3325 g to 50 ml PBS. Make 1:10 dilution of this stock to obtain 100 µM BSA solution. Make 5-10 µl aliqouts of this 100 µM BSA solution (for single use) and store them at -20°C. All BSA solution should be stored at -20°C, and discard solutions that have undergone ≥2 freeze-thaw cycles.
100 mM glycine solution Add 0.375 g of glycine to 50 ml PBS to obtain 100 mM glycine solution, store at 4°C.
Citric acid buffer with EDTA Mix 0.1954 g citric acid and 0.2087 g disodium phosphate in 50 mL of deionised water. Add EDTA to 0.1 mM. Adjust pH to 4.4.
Fixing solution Prepare formaldehyde/glutaraldehyde, 2.5% (w/v) each in 0.1 M sodium cacodylate buffer, and adjust pH to 7.4.
Aqueous uranyl acetate Prepare 25% (v/v) uranyl acetate in methanol.
50% methanol/H2O Mix methanol and H2O 1:1 (v/v).
SEC Column packed with Sepharose CL-2B Dilute 37.5 ml Sepharose CL-2B resin with 12.5 ml PBS to obtain 75% Sepharose CL-2B solution. Pour the Sepharose CL-2B solution into a column of dimension 2.9 cm [H] x 1.3 cm [W]. Pour the Sepharose CL-2B to 3-4 mm above the stated height, and then press it down to the stated height with the filter for optimal packing.

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癌症研究 第142期 外生 分离 鉴定 sirna 传递 细胞吸收 纳米载体
用于向癌细胞输送 sirna 的外质体的制备
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Faruqu, F. N., Xu, L., Al-Jamal, K. T. Preparation of Exosomes for siRNA Delivery to Cancer Cells. J. Vis. Exp. (142), e58814, doi:10.3791/58814 (2018).

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