एक exosome दवा वितरण वाहक की एक नई पीढ़ी है । हम उच्च उपज और सिरना वितरण के लिए पवित्रता के साथ एक exosome अलगाव प्रोटोकॉल की स्थापना की । हम भी exosomes में गैर विशिष्ट सिरना लेबल की गई और कैंसर की कोशिकाओं में सिरना-भरी exosomes के सेलुलर के बारे में जांच की ।
Extracellular बुलबुले, विशेष रूप से exosomes में, हाल ही में उपंयास दवा वितरण उनके जैविक मूल, बहुतायत, और विभिंन जैव अणुओं के सेलुलर प्रसव में आंतरिक क्षमता के कारण वैक्टर के रूप में ब्याज प्राप्त की है । यह काम सिरना डिलीवरी के लिए exosomes की उच्च उपज और उच्च शुद्धता प्राप्त करने के लिए एक आइसोलेशन प्रोटोकॉल स्थापित करता है । मानव भ्रूण गुर्दे की कोशिकाओं (HEK-२९३ कोशिकाओं) के लिए एक साप्ताहिक आधार पर काटा जाता है के लिए HEK-२९३ exosomes के संवर्धन के लिए अनुमति देने के लिए प्रतिक्रियात्मक कुप्पी और संस्कृति supernatant (वातानुकूलित माध्यम के रूप में संदर्भित hereon) में किया जाता है । वातानुकूलित मध्यम (सेमी) विभेदक केंद्रापसारक द्वारा मृत कोशिकाओं और सेलुलर मलबे के पूर्व मंजूरी दे दी है और एक सुक्रोज तकिया पर ultracentrifugation के अधीन है एक धुलाई कदम के बाद, exosomes इकट्ठा करने के लिए । पृथक HEK-२९३ exosomes क्रमशः nanoparticle ट्रैकिंग विश्लेषण, प्रोटीन ठहराव, इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी और फ्लो cytometry द्वारा उपज, आकृति विज्ञान और exosomal मार्कर अभिव्यक्ति के लिए विशेषता है । छोटे हस्तक्षेप आरएनए (सिरना), फ्लोरोसेंट Atto655 के साथ लेबल, electroporation द्वारा exosomes में भरी हुई है और अतिरिक्त सिरना जेल निस्पंदन द्वारा निकाल दिया जाता है । PANC में सेल तेज-1 कैंसर की कोशिकाओं, ३७ डिग्री सेल्सियस पर 24 ज मशीन के बाद, प्रवाह cytometry द्वारा की पुष्टि की है । HEK-२९३ exosomes व्यास में १०७.० ± ८.२ एनएम हैं । exosome उपज और कण करने के लिए प्रोटीन अनुपात (P:P) अनुपात ६.९९ ± ०.२२ × 1012 कण/एमएल और ८.३ ± १.७ × 1010 कण/µ जी, क्रमशः हैं । exosomes में सिरना के encapsulation दक्षता ~ 10-20% है । कोशिकाओं के ४० प्रतिशत 24 एच बाद में Atto655 के लिए सकारात्मक संकेत दिखा । अंत में, सुक्रोज कुशन पर ultracentrifugation द्वारा exosome अलगाव अच्छी उपज और पवित्रता का एक संयोजन प्रदान करता है । सिरना सफलतापूर्वक electroporation द्वारा exosomes में लोड किया जा सकता है और बाद में इन विट्रो में कैंसर कोशिकाओं में दिया । यह प्रोटोकॉल कैंसर कोशिकाओं को कुशल प्रसव के लिए सिरना-लोडेड exosomes के विकास के लिए एक मानक प्रक्रिया प्रदान करता है ।
Exosomes extracellular बुलबुले के एक उपप्रकार (EV) व्यास में 50-200 एनएम से लेकर, प्रतिरक्षा कोशिकाओं1,2, कैंसर कोशिकाओं3,4,5 के रूप में विभिंन प्रकार के सेल द्वारा स्रावित कर रहे हैं, 6 और स्टेम सेल7। Exosomes भी विभिन्न शारीरिक तरल पदार्थ में उपस्थित होने के लिए दिखाया गया है8,9,10,11. exosomes की अंतर्निहित क्षमता के संयोजन के लिए विभिंन अणुओं (जैसे, आरएनए और प्रोटीन)12,13,14 और प्राप्तकर्ता कोशिकाओं में इन अणुओं के प्रभावी वितरण ले जाने के लिए 15 , 16 , 17 नैनो पैमाने पर दवा वितरण वैक्टर के रूप में अपनी क्षमता के लिए ब्याज आकर्षित किया । विभिंन छोटे अणुओं है कि विरोधी के रूप में सेवा कैंसर और विरोधी भड़काऊ दवाओं के लिए सफलतापूर्वक exosomes में भरी हुई है और लक्ष्य कोशिकाओं को दिया18,19,20, प्रदर्शन किया गया है 21 , 22 , 23 , 24 , 25 , 26 , 27. दिलचस्प है, सिरना28,29 और microRNA30 के रूप में न्यूक्लिक एसिड भी सफलतापूर्वक electroporation के माध्यम से exosomes में लोड किया गया है और लक्ष्य कोशिकाओं को दिया ।
हाल ही में, आरएनए हस्तक्षेप (RNAi) छोटे हस्तक्षेप आरएनए (सिरना) के माध्यम से अपनी उच्च विशिष्टता के कारण जीन मुंह बंद करने में पसंदीदा तंत्र के रूप में अधिक रुचि प्राप्त की है, शक्तिशाली प्रभाव, कम से अधिक दुष्प्रभाव और सिरना संश्लेषण28में आसानी, 29. siRNAs की लंबाई में 19 से 25 न्यूक्लियोटाइड है कि अनुक्रम-विशिष्ट उत्प्रेरक mRNA पछाड़ना ट्रिगर से लेकर डबल-असहाय आरएनए अणु हैं । अपने बड़े आणविक वजन और polyanionic प्रकृति के कारण, कोशिकाओं में नग्न सिरना के निष्क्रिय सालभर28,29बाधा है । यह भी संभव के लिए नग्न सिरना प्लाज्मा nucleases31द्वारा तेजी से क्षरण के कारण प्रणालीगत संचलन में इंजेक्ट किया जा करने के लिए नहीं है । इस प्रकार, एक nanocarrier में सिरना के encapsulation प्रभावी वितरण सहायता और लक्ष्य कोशिकाओं में सिरना के ले जाएगा ।
Exosomes सिरना encapsulation के लिए एक आदर्श प्रणाली के रूप में अपनी संरचना एक खोखले, जलीय एक फॉस्फोलिपिड bilayer द्वारा ढंक कोर के शामिल है । Exosomes न केवल रक्त में अच्छी स्थिरता है, लेकिन यह भी कोशिकाओं३२में कार्यात्मक आरएनए देने के लिए प्राकृतिक लक्ष्यीकरण गुण है । अल्वारेज़ द्वारा किए गए अध्ययन-Erviti एट अल. सफलतापूर्वक लगभग कोई जटिलताओं के साथ इंजीनियर exosomes का उपयोग कर चूहों के दिमाग को सिरना के प्रभावी वितरण का प्रदर्शन किया31. यह कल्पना की है कि exosome-आधारित चिकित्सा अपेक्षाकृत अंय चिकित्सा की तुलना में सुरक्षित है के रूप में exosomes नहीं दोहराने endogenously कोशिकाओं के रूप में होता है और इसलिए मेटास्टेटिक गुण प्रदर्शित नहीं15।
विभिंन तरीकों को सफलतापूर्वक या तो सेल संस्कृति या शारीरिक तरल पदार्थ से exosomes को अलग करने के लिए सूचित किया गया है । सबसे लोकप्रिय विधि शुरू सामग्री31,३२,३३से गोली exosomes को ultracentrifugation का उपयोग करता है । इस विधि exosomes पर काफी कठोर हो सकता है और आम तौर पर सह नमूना से प्रोटीन हाला । इस तरह के सुक्रोज ढाल के रूप में एक घनत्व आधारित जुदाई के साथ ultracentrifugation संयोजन अधिक आम होता जा रहा है, अलग exosomes19,३४में प्रोटीन और गैर exosomal संदूषण को कम करने के लिए । आकार अपवर्जन क्रोमैटोग्राफी (एसईसी) extracellular बुलबुले के अंय प्रकार से exosomes के पृथक्करण (EV) आकार से अनुमति देता है और यह भी ंयूनतम प्रोटीन संदूषण में परिणाम कर सकते है लेकिन शुरू सामग्री यह३५प्रक्रिया कर सकते है की छोटी राशि से सीमित है, ३६. Immunoaffinity कैप्चर एंटीबॉडी के साथ लेपित मोती का उपयोग करता है कि इस तरह के tetraspanins या अंय सेल विशेष मार्कर कि exosomes के बजाय ईवीएस या अंय प्रोटीन के विशिष्ट कब्जा की अनुमति देता है के रूप में exosomal सतह प्रोटीन को बांध, के रूप में के रूप में अच्छी तरह से अलग उप जनसंख्या exosomes पूरे नमूनों से, लेकिन फिर से शुरू सामग्री की राशि से सीमित है और३६,३७महंगा है । exosomes के बहुलक आधारित वर्षण लोकप्रिय भी हुआ करते थे, लेकिन चूंकि यह एक जगह कच्चे तेल वर्षण है, यह एक उच्च गैर exosomal पुटिका और प्रोटीन संदूषण३८,३९की ओर जाता है ।
Electroporation प्रोटीन एकत्रीकरण के कारण सिरना के साथ exosomes लोड करने के लिए एक विधि के रूप में अपनी अक्षमता के लिए सूचित किया गया है15,28,31. अभिकर्मक आधारित दृष्टिकोण बेहतर लदान दक्षता और प्रोटीन स्थिरता के लिए प्रदर्शन कर रहे थे, लेकिन अपनी विषाक्तता और अभिकर्मक एजेंटों के साइड इफेक्ट के कारण अवांछनीय सेलुलर जीन अभिव्यक्ति28फेरबदल में । इस प्रकार, electroporation गया है और अधिक व्यापक रूप से exosomes में सिरना लोडिंग में इस्तेमाल के रूप में यह एक सुरक्षित तरीका है । हालांकि, एक अनुकूलित encapsulation विधि के क्रम में एक शक्तिशाली जीन पछाड़ना के लिए लक्ष्य साइट के लिए सिरना की पर्याप्त मात्रा में वितरित करने के लिए स्थापित करने की जरूरत है ।
यहां, हम एक exosome अलगाव घनत्व का उपयोग कर प्रोटोकॉल का प्रस्ताव सिर्फ एक ही 25% (डब्ल्यू/डब्ल्यू) सुक्रोज ड्यूटेरियम ऑक्साइड में तैयार तकिया, बजाय एक सुक्रोज घनत्व ढाल पर ultracentrifugation आधारित है । यह एक लागत प्रभावी तरीका है कि श्रमसाध्य घनत्व ढाल तैयारी दरकिनार और सामग्री शुरू करने की बड़ी मात्रा के प्रसंस्करण की अनुमति देता है, अभी तक उच्च उपज और सिरना के साथ बाद में लदान के लिए उपयुक्त पवित्रता के बरकरार exosomes में परिणाम है । फ्लोरोसेंट Atto655-संयुग्मित गैर विशिष्ट सिरना मानव भ्रूण गुर्दे की कोशिकाओं में भरी हुई थी (HEK-२९३ कोशिकाओं) exosomes के माध्यम से electroporation व्युत्पंन और मानव अग्नाशय ग्रंथिकर्कटता को दिया (PANC-1) इन विट्रो में कैंसर की कोशिकाओं ।
प्रसंस्कृत कोशिकाओं से एक सभ्य exosome उपज प्राप्त करने, जो इन विट्रो में या vivo अध्ययन में कई दौर के लिए पर्याप्त हैं, अभी भी एक चुनौती है । निर्माता के अनुसार, प्रतिक्रियात्मक कुप्पी विभिंन अमर सेल लाइनों की संस्कृति से उच्च उपज के साथ एंटीबॉडी और प्रोटीन के उत्पादन के लिए इरादा कर रहे थे । यह कोशिकाओं को लगातार वांछित उत्पाद के साथ संस्कृति माध्यम को समृद्ध करने की अनुमति देता है, कोशिका-डिब्बे में एक केंद्रित वातानुकूलित मध्यम (सेमी) में जिसके परिणामस्वरूप । सैद्धांतिक रूप से, एक ही अवधारणा विभिंन सेल लाइनों से exosome उत्पादन में लाभप्रद होगा, और वास्तव में संवर्धन में इन कोशिकाओं को प्रतिक्रियात्मक कुप्पी में काफी exosome उपज४०वृद्धि का प्रदर्शन किया गया । बड़े मध्यम जलाशय लगातार पोषक तत्वों की आपूर्ति करने के लिए और सेल डिब्बे से एक 10 केडीए अर्द्ध पारगंय झिल्ली के माध्यम से अपशिष्टों को हटा, मध्यम की एक बड़ी मात्रा की आवश्यकता के बिना लंबे समय तक संस्कृति की अनुमति के लिए कोशिकाओं के संपर्क में है, या नियमित रूप से कुप्पी बदल रहा है, जो अंततः उच्च पैमाने पर exosome उत्पादन४०की कुल लागत और श्रम को बचा सकता है । यह भी प्रदर्शित किया गया था कि आकृति विज्ञान, phenotype के रूप में के रूप में अच्छी तरह से exosomes पृथक कोशिकाओं के इम्यूनोमॉड्यूलेटरी कार्य लंबे समय तक प्रतिक्रिया की कुप्पी संस्कृतियों नियमित रूप से ७५ सेमी2 कुप्पी४०में प्रसंस्कृत कोशिकाओं से स्रोत के समान हैं । exosome सूत्रों के रूप में प्रतिक्रियात्मक कुप्पी में अन्य अमर कोशिका लाइनों की संस्कृति इसलिए उनकी अखंडता और समारोह को बनाए रखते हुए उनके exosome उपज में वृद्धि में मदद करेगा । संस्कृति का यह रूप है लेकिन सीमित विभाजन चक्र के साथ प्राथमिक कोशिकाओं के लिए लागू नहीं है, और उन है कि उच्च घनत्व में नहीं किया जा सकता है ।
मुख्यमंत्री की फसल के बाद से साप्ताहिक किया जाता है, और संस्कृति में कोशिकाओं पारित कभी नहीं थे, यह माना जा सकता है कि एक monolayer में नियमित सेल संस्कृति की तरह प्रतिक्रियात्मक कुप्पी में कोशिकाओं नहीं बढ़ रहे हैं । वे सबसे अधिक है, या बस सतह से अलग है और मर जाते है जब कोशिकाओं को भी एक monolayer के लिए धाराप्रवाह हैं । प्रतिक्रियात्मक कुप्पी के कक्ष डिब्बे का दृश्य निरीक्षण इस धारणा की पुष्टि करने के लिए संभव नहीं है, लेकिन मुख्यमंत्री संचयन के दौरान प्राप्त मृत कोशिकाओं की बड़ी संख्या से परिलक्षित होता है. से खराब अनुयाई और गैर व्यवहार्य कोशिकाओं के नियमित रूप से हटाने के लिए प्रतिक्रिया की कुप्पी के निर्माण को रोकने के कर सकते है अर्द्ध पारगंय झिल्ली पर सामग्री की है कि प्रतिकूल गैस, पोषक तत्वों और सेल डिब्बे और मध्यम के बीच अपशिष्ट के आदान प्रदान को प्रभावित कर सकते है जलाशय, इस प्रकार की अनुमति के लिए लंबे समय तक संस्कृति के लिए प्रतिक्रियात्मक कुप्पी में > 6 महीने४०। इस संदर्भ में, इस गैर-प्रतिक्रियात्मक कुप्पी में सेल विकास की नियमितता के रूप में हम सोचते है कि यह vivo में ट्यूमर के विकास की वास्तविक स्थिति की नकल और अधिक बारीकी से पारंपरिक monolayer सेल संस्कृति की तुलना में आदर्श है, और यह आशा व्यक्त की है कि exosomes इस में कैंसर की कोशिकाओं द्वारा उत्पादित प्रतिक्रियात्मक कुप्पी और अधिक है कि vivo मेंट्यूमर द्वारा स्रावित करने के लिए समान होगा । यह ट्यूमर विकृति की प्रगति में ट्यूमर व्युत्पंन exosomes की भूमिका में देख अध्ययन में विशेष रूप से लाभप्रद होगा । ट्यूमर-व्युत्पंन exosomes को आंतरिक रूप से और तरजीही घर३२मूल के अपने ऊतक को सूचित किया गया है, इसलिए एक प्रणाली में उत्पादित exosomes होने vivo उत्पादन में उनके नकल उतार भी अध्ययन में वांछनीय होगा देख ड्रग nanocarriers के रूप में exosomes की निष्क्रिय लक्ष्यीकरण क्षमता की खोज.
P:P अनुपात एक पैरामीटर के रूप में सूचित किया गया था अलग exosomes की शुद्धता का आकलन करने के लिए शारीरिक तरल पदार्थ के संस्कृति माध्यम से जो exosomes से४१स्रोत थे दूषित प्रोटीन से । इस अध्ययन में प्राप्त ८.३ ± १.७ × 1010 P/µ g का P:P अनुपात अध्ययन में प्रस्तावित उच्च शुद्धता सीमा के भीतर आता है । यह अनुपात प्रोटीन एकाग्रता का उपयोग करने के लिए उपज या exosomes की खुराक अलग या नीचे के अध्ययन में क्रमशः इस्तेमाल व्यक्त करने के खतरे पर प्रकाश डाला गया, के रूप में यह exosomes की सही मात्रा में प्रोटीन की समस्या को देखते हुए नमूने में उपलब्ध नहीं दर्शाती है अलगाव के दौरान संदूषण । NanoSight के रूप में उपकरणों के माध्यम से ंत्, जो कण संख्या के मामले में exosomes की एकाग्रता उपाय, exosomes को बढ़ाता का एक अधिक समझदार और सही तरीका है ।
ड्यूटेरियम ऑक्साइड में 25% सुक्रोज समाधान की तैयारी के दौरान अत्यधिक सटीक वजन इस विधि के रूप में महत्वपूर्ण है एक घनत्व आधारित अलगाव है । Exosomes सुक्रोज समाधान में प्लवनशीलता घनत्व के एक जगह संकीर्ण रेंज है सुक्रोज तकिया की तो सटीक तैयारी गैर exosomal बुलबुले जैसे अपोप्तोटिक शरीर या Golgi-४२अलगाव के दौरान बुलबुले व्युत्पंन को कम करेगा । यह बचा हुआ सुक्रोज समाधान रखने के लिए और यह भी एक दिन के बाद इतनी के रूप में कारकों के जोखिम से बचने के लिए है कि इस तरह के नुकसान या पानी के अलावा या तो वाष्पीकरण या ट्यूब में हवा का उपयोग करके समाधान में उसके घनत्व में परिवर्तन कर सकते हैं की सलाह दी जाती है नहीं है । एक स्विंग बाहर रोटर का उपयोग भी सुक्रोज तकिया पर केंद्रापसारक के दौरान आवश्यक है सुक्रोज समाधान के लिए CM से exosomes के प्रवास की अनुमति है ।
सुक्रोज समाधान के बाद वापस लेने-केंद्रापसारक भी एक नाजुक कदम है, और यह बरामद exosomes की मात्रा को अधिकतम करने के बीच एक समझौता खोज शामिल है, और बहुत ज्यादा नहीं है कि संस्कृति माध्यम से प्रोटीन exosome नमूना वापस लिया पेश किया है . सुक्रोज समाधान और हालत मध्यम के बीच इंटरफेस है, जहां संस्कृति माध्यम से प्रोटीन पोस्ट-केंद्रापसारक इकट्ठा होता है, और आम तौर पर एक गहरे भूरे रंग की अंगूठी है कि इंटरफेस पर बैठता है के रूप में देखा जा सकता है । हमारे हाथ में, प्रारंभिक 3 मिलीलीटर से सुक्रोज तकिया के 2 मिलीलीटर वापस लेने जोड़ा इष्टतम मात्रा है कि ऊपर उल्लेख किया समझौते के साथ सहमत है । इस प्रोटोकॉल में वर्णित खंड उपयोग किए गए विशिष्ट रोटर के लिए हैं; इसलिए, विभिन्न सुविधाओं में उपलब्ध रोटर्स के प्रकारों के लिए वॉल्यूम को स्केलिंग करते समय वापस ले जाने के लिए सुक्रोज की मात्रा ऑप्टिमाइज़ करने की सलाह दी जाती है । यह भी ट्यूब के नीचे के केंद्र पर क्षेत्र सही से बचने के लिए महत्वपूर्ण है जब सुक्रोज वापस लेने, के रूप में यह वह स्थान है जहां सुक्रोज से उच्च घनत्व के कणों तलछट होगा और आम तौर पर एक बंद सफेद गोली के रूप में देखा जा सकता है ।
पंजाबियों की अपेक्षाकृत बड़ी मात्रा के साथ धुलाई कदम exosome अलगाव४१के दौरान प्रोटीन संदूषण की डिग्री को और कम करने में मदद करता है । यह कदम exosomes से अतिरिक्त सुक्रोज को हटाने में भी जरूरी है ताकि exosomes खुद को या exosomal लुमेन के भीतर मौजूद आसमाटिक क्षति से बचा जा सके, साथ ही exosome शेयर में जीवाणु और/या फंगल ग्रोथ के खतरे को कम कर सके । ड्यूटेरियम ऑक्साइड में सुक्रोज समाधान की तैयारी के बजाय पानी के लिए अलगाव के लिए exosome प्लवनशीलता घनत्व को प्राप्त करने के लिए आवश्यक सुक्रोज की मात्रा को कम करने में मदद करता है, इसलिए दोनों आसमाटिक क्षति और माइक्रोबियल संदूषण के जोखिम को कम करने । सुक्रोज तकिया पर पहले केंद्रापसारक के बाद, exosome-सुक्रोज परत से युक्त वापस ले लिया और पंजाबियों को जोड़ा 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है और अगले दिन संसाधित अगर समय की कमी के साथ सामना करना पड़ा ।
हमारे ज्ञान का सबसे अच्छा करने के लिए, exosome/सिरना दाढ़ अनुपात electroporation की क्षमता का निर्धारण करने में एक महत्वपूर्ण कारक है । इस प्रोटोकॉल में, हम दाढ़ अनुपात सिरना करने के लिए exosome के रूप में 1:60 का इस्तेमाल किया । के रूप में exosomes के विभिंन प्रकार के encapsulation की क्षमता अलग हैं, हम दृढ़ता से सुझाव है कि यह एक मामला दर मामले के आधार पर अनुकूलित किया जाएगा । हालांकि, encapsulation क्षमता के साथ साथ प्रस्तावित हमेशा इष्टतम electroporation शर्तों का चयन करने के लिए एक पैरामीटर हो सकता है ।
इसके अलावा, सिरना का एकत्रीकरण electroporation में सबसे आम समस्या में से एक माना जा रहा है । यह साबित होता है कि electroporation सिरना के मजबूत एकत्रीकरण पैदा कर सकता है, यह भी कठिन exosomes में प्रवेश करने के लिए बना । सिरना एग्रीगेट अक्सर exosome में सिरना के encapsulation के रूप में व्याख्या कर रहे हैं इसलिए उचित नियंत्रण सिरना समुच्चय के गठन के रूप में इस अध्ययन में इस्तेमाल किया गया28electroporation के दौरान अपरिहार्य है. प्रतिशत encapsulation दक्षता हमारी शुद्धि विधि का उपयोग करके परिकलित की गई थी अंय स्रोतों जैसे पृष्ठभूमि शोर, exosome और सिरना एग्रीगेट से प्रभाव को कम करने के लिए सामान्यीकृत मान डेटा विश्वसनीयता को प्रभावित करेगा । हमारे निष्कर्षों के आधार पर, वहां नगण्य सिरना समुच्चय था नियंत्रण नमूना अर्थात् में मनाया , electroporated और संयुक्त राष्ट्र electroporated सिरना का उपयोग कर ।
इस प्रोटोकॉल को सफलतापूर्वक exosomes में सिरना के encapsulation का प्रदर्शन किया है और उनके सिरना के बाद intracellular वितरण इन विट्रो मेंकैंसर की कोशिकाओं को । इसलिए, विभिंन प्रकार के सेल लाइनों से exosomes अलग किया जा सकता है और प्रस्तावित प्रोटोकॉल का उपयोग विशेषता है, और बाद में विभिंन चिकित्सीय सिरना के साथ oncogenic लक्ष्यों के विभिंन प्रकार के लिए भरी हुई विभिंन तरह के कैंसर में व्यक्त की । एक दिलचस्प आवेदन सिरना वितरण का पता लगाने और exosome स्रोत-लक्ष्य सेल जोड़ी के विभिंन परिवर्तन इन विट्रो मेंउपयोग करने के लिए दक्षता होगी । यह तो vivo में सिरना-encapsulated exosomes के वितरण और चिकित्सीय दक्षता दोनों की दक्षता का आकलन करने के लिए पशु मॉडलों के लिए अनुवाद किया जा सकता है ।
The authors have nothing to disclose.
एफ एन Faruqu मलेशियाई सरकारी एजेंसी मजलिस Amanah Rakyat (मारा) द्वारा वित्त पोषित है । एल Xu Marie Sklodowska के एक प्राप्तकर्ता है-क्यूरी व्यक्तिगत फैलोशिप (क्षितिज २०२०) (H2020-MSCA-अगर-२०१६) । के. टी. अल जमाल ने BBSRC (BB/J008656/1) और वेलकम ट्रस्ट (WT103913) से फंडिंग स्वीकार की । लेखक भी dr पॉल लैवेंडर और डॉ डेविड डर (श्वसन चिकित्सा और एलर्जी, राजा कॉलेज लंदन के विभाग) electroporator प्रदान करने के लिए शुक्रिया अदा करना चाहूंगा ।
Material | |||
Sterile Newborn Calf Serum Heat Inactivated | First Link | 08-05-850 | 500 ml |
EMEM medium | Thermo Fisher Scientific | 11090081 | 500 ml |
Penicillin/Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140-122 | 100 ml |
GlutaMax | Thermo Fisher Scientific | 35050-038 | 100 ml |
Sucrose | Fisher Scientific | S/8600/60 | 1 kg |
Deuterium oxide (D2O) | Sigma-Aldrich | 151882 | 250 g |
1X Phosphate Buffered Saline | Thermo Fisher Scientific | 10010015 | 500 ml |
Glycine | VWR Chemicals | 101196X | 1 kg |
Sepharose CL-2B | GE Healthcare Life Sciences | 17-0140-01 | 1 L; Particle Size 60 μm-200 μm |
Trypsin-EDTA 0.05% | Thermo Fisher Scientific | 25300096 | 100 ml |
Aldehyde/sulfate latex beads | Thermo Fisher Scientific | A37304 | 4% w/v, 4 µm, 15 ml |
MicroBCA kit | Thermo Fisher Scientific | 23235 | |
CD81 antibody (APC) | Thermo Fisher Scientific | 17-0819-42 | Lot: E15950-104. RRID: AB_11150235. 1:10 dilution in 50 µl sample |
CD81 isotype (APC) | Thermo Fisher Scientific | 17-4714-81 | Lot: 4291563. RRID: AB_763650. 1:10 dilution in 50 µl sample |
CD9 antibody (FITC) | Thermo Fisher Scientific | 11-0098-41 | Lot: 4345870. RRID: AB_10698007. 1:10 dilution in 50 µl sample |
CD9 isotype (FITC) | Thermo Fisher Scientific | 11-4714-41 | Lot: 4299784. RRID: AB_10598647. 1:10 dilution in 50 µl sample |
CD63 antibody (PE) | Thermo Fisher Scientific | 12-0639-41 | Lot: 1930435. RRID: AB_2572564. 1:10 dilution in 50 µl sample |
CD63 isotype (PE) | Thermo Fisher Scientific | 12-4714-81 | Lot: 1937696. RRID: AB_470059. 1:10 dilution in 50 µl sample |
Atto655-siRNA | Eurogentec | SQ-SIRNA | (Labelled-S) UGC-GCU-ACG-AUC-GAC-GAU-G55; (Unlabelled-AS) CAU-CGU-CGA-UCG-UAG-CGC-A55. |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Equipment | |||
Millex-GP Syringe Filter Unit 0.22 µm | Millipore | SLGP033RS | |
CELLine AD1000 bioreactor flasks | Wheaton | WCL1000ad | |
Ultracentrifuge | Beckman Coulter | Optima XPN-80 | |
Swing-out rotor | Beckman Coulter | SW45 Ti | |
Fixed-angle rotor | Beckman Coulter | Type 70 Ti | |
Ultracentrifuge tubes | Beckman Coulter | 355631 | Polycarbonate. Max. fill 32 ml |
Ultracentrifuge bottles | Beckman Coulter | 355618 | Polycarbonate. Min. fill 16 ml, max. fill 25 ml |
NanoSight | Malvern | LM10 | Software: NanoSight NTA v3.2 |
Flow Cytometer | BD Biosciences | FACSCalibur | |
Centrifuge | Eppendorf | 5810R | |
Plate reader | BMG Labtech | FLUOstar Omega | |
Flow cytometry tubes | BD Biosciences, Falcon | 352052 | |
Microfuge tubes | Starlab | S1615-5500 | 1.5 ml |
Cell culture flasks | Fisher Scientific | 156499 | 75 cm2 |
Transmission electron microscope | FEI Electron Optics | Philips CM 12 | with Tungsten filament and a Veleta – 2k × 2k side-mounted TEM CCD Camera (Olympus, Japan) |
Amaxa Nucleofector I | Lonza | Nucleofector I | with Amaxa’s Nucleofector Kits |
24-well flat-bottom plates | Corning | Costar | |
Blunt fill needle | BD Biosciences | 305180 | 18G x 1 1/2" (1.2 mm x 40 mm) |
Glass pipettes | Fisher Scientific | 1156-6963 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Reagents | Composition | ||
Normal medium | Eagle's Minimum Essential Medium supplemented with 10% foetal bovine serum (FBS), 1% penicillin/streptomycin and 1% GlutaMax. | ||
Exosome-depleted medium | Eagle's Minimum Essential Medium supplemented with 10% exosome-depleted FBS (see below), 1% penicillin/streptomycin and 1% GlutaMax. | ||
Exosome-depleted FBS | Subject FBS to ultracentrifugation at 100,000 g for 18 h at 4°C. The FBS supernatant post-centrifugation was collected and sterile-filtered using 0.22 µm filters. | ||
25% w/w sucrose cushion | Add 1.9 g (± 0.001 g) of sucrose in a universal tube, and top up with D2O until the weight reaches 7.6 g (± 0.001 g). This makes ~6ml of the 25% w/w sucrose cushion. | ||
3% FBS/PBS | Add 1.5 ml exosome-depleted FBS to 48.5 ml 1X PBS to prepare 50 ml of 3% FBS/PBS. | ||
100 µM BSA solution | Prepare 1mM BSA solution by adding 0.3325 g to 50 ml PBS. Make 1:10 dilution of this stock to obtain 100 µM BSA solution. Make 5-10 µl aliqouts of this 100 µM BSA solution (for single use) and store them at -20°C. All BSA solution should be stored at -20°C, and discard solutions that have undergone ≥2 freeze-thaw cycles. | ||
100 mM glycine solution | Add 0.375 g of glycine to 50 ml PBS to obtain 100 mM glycine solution, store at 4°C. | ||
Citric acid buffer with EDTA | Mix 0.1954 g citric acid and 0.2087 g disodium phosphate in 50 mL of deionised water. Add EDTA to 0.1 mM. Adjust pH to 4.4. | ||
Fixing solution | Prepare formaldehyde/glutaraldehyde, 2.5% (w/v) each in 0.1 M sodium cacodylate buffer, and adjust pH to 7.4. | ||
Aqueous uranyl acetate | Prepare 25% (v/v) uranyl acetate in methanol. | ||
50% methanol/H2O | Mix methanol and H2O 1:1 (v/v). | ||
SEC Column packed with Sepharose CL-2B | Dilute 37.5 ml Sepharose CL-2B resin with 12.5 ml PBS to obtain 75% Sepharose CL-2B solution. Pour the Sepharose CL-2B solution into a column of dimension 2.9 cm [H] x 1.3 cm [W]. Pour the Sepharose CL-2B to 3-4 mm above the stated height, and then press it down to the stated height with the filter for optimal packing. |