Bir eksozom ilaç teslim taşıyıcıları yeni nesil olduğunu. Bir eksozom yalıtım protokolü ile yüksek verim ve saflık siRNA teslimat için kurduk. Biz de fluorescently etiketli non-spesifik siRNA exosomes kapsüllenir ve siRNA yüklü exosomes kanser hücreleri hücresel alımını araştırıldı.
Hücre dışı veziküller, belirli exosomes, son zamanlarda onların biyolojik kökenli, bereket ve hücreler arası çeşitli biomolecules teslimini içsel yeteneği nedeniyle teslim vektörel çizimler roman uyuşturucu olarak ilgi kazanmıştır. Bu eser yüksek verimli ve exosomes siRNA teslimat için yüksek saflıkta elde etmek için bir yalıtım protokolü oluşturur. İnsan embriyonik böbrek hücreleri (HEK-293 hücreleri) biyoreaktör şişeler içinde kültürlü ve kültür süpernatant (Bu andan klimalı ortam olarak da adlandırılır) HEK-293 exosomes zenginleştirme için izin vermek için haftalık olarak hasat edilir. Klimalı Orta (CM) ölü hücreleri ve hücresel enkaz önceden tarafından fark Santrifüjü temizlenir ve ultrasantrifüj exosomes toplamak için bir yıkama adım gelir bir sükroz yastık üzerine tabi tutulur. İzole HEK-293 exosomes verim, Morfoloji ve exosomal işaret ifade için nanopartikül izleme analizi, protein miktar, elektron mikroskobu ve akış sitometresi, sırasıyla karakterizedir. Fluorescently etiketli Atto655 ile küçük müdahale RNA (siRNA), exosomes Elektroporasyon tarafından yüklenir ve aşırı siRNA jel filtrasyon tarafından kaldırılır. 37 ° C’de 24 saat kuluçka sonra PANC-1 kanser hücrelerinin hücre Anlamazdın akış sitometresi tarafından onaylanır. HEK-293 exosomes 107.0 ± 8.2 nm çapında vardır. Ya verim ve parçacık protein oranı (P:P) oranı are 6.99 ± 0,22 × 1012 parçacık/mL ve 8.3 ± 1,7 × 1010 parçacık/µg, anılan sıraya göre. Exosomes siRNA kapsülleme verimliliği ~ % 10-20. Hücreleri yüzde kırkı, 24 h Atto655 için olumlu sinyaller sonrası kuluçka göster. Sonuç olarak, ya yalıtım ultrasantrifüj sükroz yastık üzerine tarafından iyi verim ve saflık bir arada sunuyor. siRNA Elektroporasyon tarafından exosomes başarıyla yüklenmiş olabilir ve daha sonra kanser hücrelerinin teslim tüp bebek. Bu iletişim kuralı siRNA yüklü exosomes kanser hücreleri için verimli bir şekilde teslim geliştirmek için standart bir yordam sunar.
Exosomes bir alt türü hücre dışı veziküller (EV) çapında bağışıklık hücreleri1,2gibi çeşitli hücre tiplerinin tarafından salgılanan, 50-200 nm arasında değişen, kanser hücreleri3,4,5, 6 ve kök hücreleri7. Exosomes ayrıca çeşitli fizyolojik sıvıları8,9,10,11‘ in bulunması için gösterilmiştir. Exosomes doğal yeteneğini çeşitli biomolecules (Örneğin, RNA ve proteinler)12,13,14 taşımak ve bu biomolecules etkili teslim alıcı hücreye 15 , 16 , 17 nano ölçekli ilaç teslim vektör olarak potansiyellerini için ilgi çekici. Anti-kanser ve anti-inflamatuar ilaçlar exosomes başarıyla yüklenebilmesi için gösterdi ve hedef hücreleri18,19,20, teslim hizmet çeşitli küçük moleküller 21 , 22 , 23 , 24 , 25 , 26 , 27. ilginçtir, nükleik asitler siRNA28,29 ve mikroRNA30 gibi Ayrıca exosomes üzerinden Elektroporasyon başarıyla yüklendiğinde ve hedef hücrelere teslim.
Son zamanlarda, RNA müdahale (RNAi) yolu ile küçük müdahale RNA (siRNA) yüksek özgüllük, güçlü etkisi, en az yan etkileri ve siRNA sentez28kolaylığı nedeniyle gen suskunluğu tercih edilen mekanizması olarak daha fazla ilgi kazanmıştır, 29. Çift Çift iplikçikli RNA molekülleri 19 25 nükleotid uzunluğunda bu Tetikleyicileri fingerprinting katalitik mRNA nakavt arasında değişen vardır. Onun büyük molekül ağırlığı ve polyanionic doğa, hücre içine çıplak siRNA pasif alımını engel28,29gelir. Ayrıca plazma nükleaz31tarafından sistemik dolaşım hızlı yıkımı nedeniyle içine enjekte edilir çıplak siRNA mümkün değildir. Böylece, bir nanocarrier içinde siRNA encapsulation etkili teslim ve siRNA alımını hedef hücrelere yardım.
Fosfolipid bilayer tarafından zarflı bir içi boş, sulu çekirdek yapısı oluşan siRNA Kapsülleme için ideal bir sistemdir Exosomes şunlardır. Exosomes sadece iyi istikrar kan içinde var ama aynı zamanda işlevsel RNA hücre32sunmak için doğal hedefleme özellikleri vardır. Alvarez-Erviti ve ark. tarafından başarıyla yürütülen çalışma kullanarak farelerin beyinlerinin etkili teslim edilmesi siRNA, hemen hemen hiçbir komplikasyon31‘ le exosomes mühendislik gösterdi. Ya tabanlı terapisi hücreleri ve bu nedenle metastatik özellikleri15sergi değil exosomes endogenously çoğaltılmaz gibi diğer tedaviler nispeten daha güvenli olan.
Başarılı bir şekilde exosomes hücre kültürü veya fizyolojik sıvıları izole etmek için çeşitli yöntemler bildirilmiştir. En popüler yöntem ultrasantrifüj başlangıç malzeme31,32,33üzerinden exosomes cips için kullanır. Bu yöntem oldukça exosomes ve genellikle eş precipitates proteinler örnekten sert olabilir. Sükroz gradyan gibi Yoğunluk tabanlı ayırmalı ultrasantrifüj birleştirerek protein ve sigara exosomal kirlenme izole exosomes19,34azaltmak için daha yaygın hale geliyor. Boyut-dışlama Kromatografi (sn) boyutuna göre exosomes ayırma ekstraselüler veziküller (EV) diğer tür verir ve de en az protein kontaminasyonu neden olabilir ama35işleyebilir malzeme başlayan küçük miktarda sınırlıdır, 36. Exosomal tetraspanins veya EVs yerine exosomes özel yakalama sağlar diğer hücre özgü marker gibi yüzey proteinleri veya diğer proteinler bağlamak antikorlar ile kaplanmış gibi alt nüfusu yalıtma boncuk Immunoaffinity yakalamanın kullandığı exosomes gelen tüm örnekleri, ama tekrar malzeme başlayan miktarla sınırlı ve pahalı36,37. Polimer esaslı yağış exosomes, eskiden çok popüler olduğu, ama bu oldukça kaba bir yağış olduğundan, bir daha yüksek exosomal sigara vezikül ve protein kontaminasyonu38,39için yol açar.
Elektroporasyon exosomes siRNA nedeniyle protein toplama15,28,31ile yüklemek için bir yöntem olarak onun verimsizlik için bildirilmiştir. Transfection tabanlı yaklaşımlar daha iyi verim ve protein istikrar yükleme için gösterdi ama toksisite ve hücresel gen ifade28değiştiren içinde transfection ajanların yan etkileri nedeniyle istenmeyen. Böylece, Elektroporasyon daha güvenli bir yöntem olduğu gibi exosomes siRNA yüklenirken daha yaygın olarak kullanılmıştır. Ancak, bir en iyi duruma getirilmiş sarma yöntemi hedef site için güçlü gen köşenize siRNA yeterli miktarda sunmak amacıyla kurulan gerekir.
Burada, yoğunluk tabanlı ultrasantrifüj döteryum oksit yerine sukroz yoğunluğu degrade hazır sadece bir tek %25 (w/w) sükroz yastık üzerine bir eksozom yalıtım iletişim kuralı’nı öneriyorum. Bu zahmetli yoğunluk gradient hazırlık kaçınmanızı sağlar ve malzeme başlayan geniş hacimli işleme izin verir, yine de yüksek verim ve saflık siRNA ile sonraki yükleme için uygun olduğu gibi exosomes sonuçlanan düşük maliyetli bir yöntemdir. Floresan Atto655 Birleşik non-spesifik siRNA insan embriyonik böbrek hücreleri (HEK-293 hücreleri) elde edilen exosomes üzerinden Elektroporasyon yüklenen ve insan pankreas adenokarsinom (PANC-1) kanser hücrelerinin teslim tüp bebek.
Bir terbiyeli eksozom verim kültürlü hücrelerinden elde etme, hangi içinde vitro veya in vivo çalışmalar, birkaç tur için yeterli olmasıdır hala bir meydan okuma. Üreticiye göre biyoreaktör şişeler üretim antikorlar ve proteinler çeşitli ölümsüzleştirdi hücre hatları kültüründen yüksek verim ile için amaçlı olduğunu. Bu sürekli bir konsantre klimalı ortamda (CM) hücre kompartımanda kaynaklanan istenen ürün ile kültür orta zenginleştirmek için hücreleri sağlar. Teorik olarak, aynı kavram çeşitli hücre satırlarını eksozom üretiminde faydalı olacağını ve gerçekten biyoreaktör şişeler bu hücreler kültür eksozom verim40önemli ölçüde artırmak için gösterilmiştir. Büyük Orta rezervuar sürekli besin kaynakları ve uzun süreli kültür hücreleri ile temas halinde olmak orta veya normal çok fazla gerek kalmadan sağlayan 10 kDa yarı geçirgen membran aracılığıyla hücre bölme atıkların kaldırır Şişeler, değişen hangi sonuçta genel maliyet ve yüksek ölçekli eksozom üretim40emek kaydedebilirsiniz. Ayrıca morfolojisi, fenotip yanı sıra exosomes immunomodulatory fonksiyonları uzun vadeli biyoreaktör şişeler kültürler içinde düzenli 75 cm2 şişe40kültürlü hücrelerden kaynaklı benzer hücreleri izole gösterilmiştir. Kültür biyoreaktör şişeye eksozom kaynağı olarak diğer ölümsüzleştirdi hücre satırlarının bu nedenle kendi bütünlüğü ve işlev koruyarak kendi eksozom verim artışı yardımcı olacaktır. Bu tür kültür ancak sınırlı bölümü döngüleri ve bu ile primer hücre için geçerli değildir bu yüksek yoğunluklu kültürlü değil göre.
Hasat cm haftalık yapılır ve kültür hücrelerde asla pasajlı beri Bu biyoreaktör şişeye hücrelerde bir monolayer normal hücre kültür gibi içinde büyüyen değil kabul edilebilir. Onlar nekrotik merkezleri olan kümeleri oluşturmak veya hücreleri bir monolayer için çok konfluent olduğunda sadece yüzeyi ve die ayırmak büyük olasılıkla vardır. Biyoreaktör şişeye hücre bölmesinin görsel muayene Bu varsayım onaylamak mümkün değil ama ölü hücreleri CM hasat sırasında elde edilen çok sayıda yansıtır. Biyoreaktör şişeye kötü yapışık ve uygun olmayan hücre düzenli temizleme malzemeleri, besin ve hücre bölmesi ve orta arasında atık gaz Satım olumsuz yönde etkilenebilir yarı geçirgen membran üzerinde birikmesi engelleyebilirsiniz Depo, böylece uzun süreli kültür biyoreaktör şişeler için izin > 6 ay40. Bu bağlamda, Sigara bu düzenlilik biyoreaktör şişeler hücre büyüme biz spekülasyon tümör büyüme vivo içinde gerçek durumunu geleneksel monolayer hücre kültürü daha yakından taklit eder, ve bu ümit ediliyor olarak idealdir bu exosomes Biyoreaktör şişeye hücrelerde-cekti var olmak daha benzer tümörleri içinde vivotarafından salgılanan kanser tarafından üretilir. Bu çalışmalarda tümör kaynaklı exosomes tümör patoloji ilerleme rolü bakarak özellikle yararlı olacaktır. Tümör kaynaklı exosomes özünde ve tercihen ev sahipliği doku kökenli32bildirilmiştir, bu nedenle kendi içinde vivo taklit eden bir sistemde üretilen exosomes sahip üretim bakarak çalışmalarda arzu cekti da var olmak exosomes pasif hedefleme yeteneği uyuşturucu nanocarriers olarak keşfetmek.
P:P oranı proteinler–dan hangi41kimden exosomes kaynaklı fizyolojik sıvıların kültür çevre kirletici dan izole exosomes saflığı değerlendirmek için bir parametre olarak bildirildi. Çalışmada önerilen yüksek saflıkta Aralık içinde 8.3 ± 1,7 × 1010 p/Bu çalışmada elde edilen µg P:P oranı düşüyor. Bu oran verim veya izole veya bu exosomes protein problemini verilen örnekte kullanılabilir gerçek tutar yansıtmak zorunda değildir gibi akış yönündeki çalışmalar sırasıyla, kullanılan exosomes doz ifade etmek için protein konsantrasyonu kullanarak tehlikesi vurgulamaktadır yalıtım sırasında kirlenme. NTA üzerinden aletleri exosomes parçacık sayısı açısından konsantrasyon ölçer, NanoSight gibi exosomes miktarının daha mantıklı ve doğru bir şekilde var.
Döteryum oksit % 25 sükroz çözümde hazırlanması sırasında son derece hassas tartım yoğunluğu tabanlı yalıtım bu yöntem olduğu gibi çok önemlidir. Sükroz yastık doğru hazırlanması sırasında yalıtım42apoptotik organları gibi sigara exosomal veziküller veya veziküller Golgi kaynaklı kirlenme azaltır bu yüzden Exosomes sükroz çözümde flotasyon yoğunluğu oldukça dar bir aralığı vardır. Bu artık sükroz çözüm ve böylece risk faktörlerin yoğunluğu kaybı gibi değiştirebilir veya çözümde su ilavesi önlemek için bile bir gün sonra kullanmaya aldırmaya buharlaşma ya da tüp havada yoğunlaşma tarafından tavsiye edilir. Santrifüjü exosomes bile göç CM sükroz çözüm için izin vermek için sükroz yastık üzerine sırasında bir swing-out rotor kullanımı önemlidir.
Sükroz çözüm sonrası Santrifüjü çekilmesi aynı zamanda hassas bir adımdır ve exosomes kurtarılan ve çok fazla protein kültür ortamdan eksozom örnek içine kapanık giriliyor miktarını en üst düzeye çıkarma arasında bir uzlaşma bulmak içerir . Sükroz çözüm ve koşul orta arasındaki nerede proteinler kültür ortamdan sonrası Santrifüjü toplayacak ve genellikle arabirimde oturur bir koyu kahverengi halka olarak görülebilir arabirimdir. Bizim ellerde 2 mL sukroz yastık eklendi ilk 3 mL çekilmesi yukarıda belirtilen uzlaşma ile aynı fikirde optimum birimdir. Bu protokol için açıklanan birimleri kullanılan belirli rotorlar için vardır; Bu nedenle, bu birimler rotor farklı tesislerde kullanılabilir türleri için aşağı ve yukarı ölçeklerken geri sükroz hacmi optimize etmek için tavsiye edilir. Bu parçacıkların sükroz daha yüksek yoğunluğu tortu nerede olacak ve genellikle sukroz, çekilmesi bir off-beyaz Pelet görülebilir alan sağ tüp alt ortasına önlemek önemlidir.
PBS nispeten büyük miktarda çamaşır adımla daha fazla protein kontaminasyonu eksozom yalıtım41sırasında derecesini azaltmaya yardımcı olur. Bu adımı da aşırı sükroz kendileri veya biomolecules exosomal lümen içinde exosomes için ozmotik zarar görmemesi için exosomes kaldırarak hem bakteriyel ve/veya mantar büyüme ya hisse senedi riskini azaltır esastır. Yerine su yalıtım için eksozom flotasyon yoğunluğu elde etmek için gerekli sükroz azaltmak için yardımcı olur döteryum oksit sükroz çözümde hazırlanıyor, bu nedenle ozmotik hasar ve mikrobiyal kontaminasyon riskini azaltır. Sükroz eksozom içeren yastık üzerine ilk Santrifüjü sonra geri çekildi ve PBS için eklendi sükroz katman 4 ° C’de depolanan ve zaman kısıtlamaları ile karşı karşıya ertesi gün işlenen.
Bizim bilgi en iyi şekilde eksozom/siRNA molar oranı Elektroporasyon etkinliğini belirlemede önemli bir faktördür. Bu protokol için eksozom siRNA molar oranı olarak 1:60 kullanılır. Kapsülleme yetenek exosomes farklı türleri farklı olduğundan, bu bir harf tarafından ayrı ayrı optimize için öneririz. Ancak, burada önerilen kapsülleme verimliliği her zaman en iyi Elektroporasyon koşulları seçmek için bir parametre olabilir.
Buna ek olarak, toplama siRNA Elektroporasyon’en yaygın bir sorun biri olduğuna inanılıyor. Bu o Elektroporasyon siRNA, yapım o daha da zor exosomes girmek güçlü agregasyon tetikleyebilir kanıtlanmıştır. siRNA toplamları oluşumu sırasında Elektroporasyon28kaçınılmaz olduğu gibi bu çalışmada siRNA kapsülleme ya bu nedenle uygun denetimlere kullanıldı gibi siRNA toplamalardan çoğu zaman yanlışlıkla yorumlanır. Bizim arıtma yöntemi yüzde kapsülleme verimliliğini veri güvenilirliğini etkileyebilir arka plan gürültü, ya ve siRNA toplamalardan gibi diğer kaynaklardan etkisi en aza indirmek için normalleştirilmiş değerleri kullanarak hesaplanır. Bizim bulgularına dayanarak, electroporated ve BM-electroporated siRNA kullanarak denetim örnek Yani, içinde gözlenen ihmal edilebilir siRNA toplamalardan vardı.
Bu iletişim kuralı başarıyla siRNA kapsülleme exosomes içine göstermiştir ve içinde vitrosiRNA onların sonraki hücre içi teslim kanser hücreleri. Bu nedenle, farklı hücre satırlarından exosomes türleri olabilir izole ve önerilen iletişim kuralı kullanılarak karakterize ve daha sonra farklı kanser aşırı ifade oncogenic hedeflerinden farklı türleri için çeşitli tedavi siRNA yüklü. İlginç bir uygulama çeşitli eksozom kaynak-hedef hücre çift içinde vitropermütasyon kullanarak siRNA teslim ve alımı verimliliği keşfetmek olacaktır. Bu o zaman hayvan modelleri hem teslim verimliliğini ve siRNA kapsüllü exosomes tedavi edici verimliliğini değerlendirmek için tercüme edilebilir içinde vivo.
The authors have nothing to disclose.
F. N. Faruqu Meclis Amanah Rakyat (MARA) Malezya hükümeti ajansı tarafından finanse edilmektedir. L. Xu Marie Sklodowska-Curie bireysel Burslar (ufuk 2020) (H2020-MSCA-Eğer-2016) bir alıcı var. K. T. Al-Jamal BBSRC (1/J008656/BB) ve Wellcome Trust (WT103913) fon kabul eder. Yazarlar ayrıca Dr Paul lavanta ve Dr David Fear (solunum tıp bölümü ve alerji, Londra’daki King’s College) electroporator sağlamak için teşekkür etmek istiyorum.
Material | |||
Sterile Newborn Calf Serum Heat Inactivated | First Link | 08-05-850 | 500 ml |
EMEM medium | Thermo Fisher Scientific | 11090081 | 500 ml |
Penicillin/Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140-122 | 100 ml |
GlutaMax | Thermo Fisher Scientific | 35050-038 | 100 ml |
Sucrose | Fisher Scientific | S/8600/60 | 1 kg |
Deuterium oxide (D2O) | Sigma-Aldrich | 151882 | 250 g |
1X Phosphate Buffered Saline | Thermo Fisher Scientific | 10010015 | 500 ml |
Glycine | VWR Chemicals | 101196X | 1 kg |
Sepharose CL-2B | GE Healthcare Life Sciences | 17-0140-01 | 1 L; Particle Size 60 μm-200 μm |
Trypsin-EDTA 0.05% | Thermo Fisher Scientific | 25300096 | 100 ml |
Aldehyde/sulfate latex beads | Thermo Fisher Scientific | A37304 | 4% w/v, 4 µm, 15 ml |
MicroBCA kit | Thermo Fisher Scientific | 23235 | |
CD81 antibody (APC) | Thermo Fisher Scientific | 17-0819-42 | Lot: E15950-104. RRID: AB_11150235. 1:10 dilution in 50 µl sample |
CD81 isotype (APC) | Thermo Fisher Scientific | 17-4714-81 | Lot: 4291563. RRID: AB_763650. 1:10 dilution in 50 µl sample |
CD9 antibody (FITC) | Thermo Fisher Scientific | 11-0098-41 | Lot: 4345870. RRID: AB_10698007. 1:10 dilution in 50 µl sample |
CD9 isotype (FITC) | Thermo Fisher Scientific | 11-4714-41 | Lot: 4299784. RRID: AB_10598647. 1:10 dilution in 50 µl sample |
CD63 antibody (PE) | Thermo Fisher Scientific | 12-0639-41 | Lot: 1930435. RRID: AB_2572564. 1:10 dilution in 50 µl sample |
CD63 isotype (PE) | Thermo Fisher Scientific | 12-4714-81 | Lot: 1937696. RRID: AB_470059. 1:10 dilution in 50 µl sample |
Atto655-siRNA | Eurogentec | SQ-SIRNA | (Labelled-S) UGC-GCU-ACG-AUC-GAC-GAU-G55; (Unlabelled-AS) CAU-CGU-CGA-UCG-UAG-CGC-A55. |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Equipment | |||
Millex-GP Syringe Filter Unit 0.22 µm | Millipore | SLGP033RS | |
CELLine AD1000 bioreactor flasks | Wheaton | WCL1000ad | |
Ultracentrifuge | Beckman Coulter | Optima XPN-80 | |
Swing-out rotor | Beckman Coulter | SW45 Ti | |
Fixed-angle rotor | Beckman Coulter | Type 70 Ti | |
Ultracentrifuge tubes | Beckman Coulter | 355631 | Polycarbonate. Max. fill 32 ml |
Ultracentrifuge bottles | Beckman Coulter | 355618 | Polycarbonate. Min. fill 16 ml, max. fill 25 ml |
NanoSight | Malvern | LM10 | Software: NanoSight NTA v3.2 |
Flow Cytometer | BD Biosciences | FACSCalibur | |
Centrifuge | Eppendorf | 5810R | |
Plate reader | BMG Labtech | FLUOstar Omega | |
Flow cytometry tubes | BD Biosciences, Falcon | 352052 | |
Microfuge tubes | Starlab | S1615-5500 | 1.5 ml |
Cell culture flasks | Fisher Scientific | 156499 | 75 cm2 |
Transmission electron microscope | FEI Electron Optics | Philips CM 12 | with Tungsten filament and a Veleta – 2k × 2k side-mounted TEM CCD Camera (Olympus, Japan) |
Amaxa Nucleofector I | Lonza | Nucleofector I | with Amaxa’s Nucleofector Kits |
24-well flat-bottom plates | Corning | Costar | |
Blunt fill needle | BD Biosciences | 305180 | 18G x 1 1/2" (1.2 mm x 40 mm) |
Glass pipettes | Fisher Scientific | 1156-6963 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Reagents | Composition | ||
Normal medium | Eagle's Minimum Essential Medium supplemented with 10% foetal bovine serum (FBS), 1% penicillin/streptomycin and 1% GlutaMax. | ||
Exosome-depleted medium | Eagle's Minimum Essential Medium supplemented with 10% exosome-depleted FBS (see below), 1% penicillin/streptomycin and 1% GlutaMax. | ||
Exosome-depleted FBS | Subject FBS to ultracentrifugation at 100,000 g for 18 h at 4°C. The FBS supernatant post-centrifugation was collected and sterile-filtered using 0.22 µm filters. | ||
25% w/w sucrose cushion | Add 1.9 g (± 0.001 g) of sucrose in a universal tube, and top up with D2O until the weight reaches 7.6 g (± 0.001 g). This makes ~6ml of the 25% w/w sucrose cushion. | ||
3% FBS/PBS | Add 1.5 ml exosome-depleted FBS to 48.5 ml 1X PBS to prepare 50 ml of 3% FBS/PBS. | ||
100 µM BSA solution | Prepare 1mM BSA solution by adding 0.3325 g to 50 ml PBS. Make 1:10 dilution of this stock to obtain 100 µM BSA solution. Make 5-10 µl aliqouts of this 100 µM BSA solution (for single use) and store them at -20°C. All BSA solution should be stored at -20°C, and discard solutions that have undergone ≥2 freeze-thaw cycles. | ||
100 mM glycine solution | Add 0.375 g of glycine to 50 ml PBS to obtain 100 mM glycine solution, store at 4°C. | ||
Citric acid buffer with EDTA | Mix 0.1954 g citric acid and 0.2087 g disodium phosphate in 50 mL of deionised water. Add EDTA to 0.1 mM. Adjust pH to 4.4. | ||
Fixing solution | Prepare formaldehyde/glutaraldehyde, 2.5% (w/v) each in 0.1 M sodium cacodylate buffer, and adjust pH to 7.4. | ||
Aqueous uranyl acetate | Prepare 25% (v/v) uranyl acetate in methanol. | ||
50% methanol/H2O | Mix methanol and H2O 1:1 (v/v). | ||
SEC Column packed with Sepharose CL-2B | Dilute 37.5 ml Sepharose CL-2B resin with 12.5 ml PBS to obtain 75% Sepharose CL-2B solution. Pour the Sepharose CL-2B solution into a column of dimension 2.9 cm [H] x 1.3 cm [W]. Pour the Sepharose CL-2B to 3-4 mm above the stated height, and then press it down to the stated height with the filter for optimal packing. |